PL194865B1 - Unieśmiertelnione komórki łojowe pochodzenia ludzkiego i ich zastosowania oraz linia komórkowa ludzkich komórek łojowych i jej zastosowania - Google Patents

Unieśmiertelnione komórki łojowe pochodzenia ludzkiego i ich zastosowania oraz linia komórkowa ludzkich komórek łojowych i jej zastosowania

Info

Publication number
PL194865B1
PL194865B1 PL350191A PL35019199A PL194865B1 PL 194865 B1 PL194865 B1 PL 194865B1 PL 350191 A PL350191 A PL 350191A PL 35019199 A PL35019199 A PL 35019199A PL 194865 B1 PL194865 B1 PL 194865B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
lnb
cells
sebaceous
sebocytes
immortalized
Prior art date
Application number
PL350191A
Other languages
English (en)
Other versions
PL350191A1 (en
Inventor
Christos Zouboulis
Original Assignee
Christos Zouboulis
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Christos Zouboulis filed Critical Christos Zouboulis
Publication of PL350191A1 publication Critical patent/PL350191A1/xx
Publication of PL194865B1 publication Critical patent/PL194865B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
    • C12N5/0633—Cells of secretory glands, e.g. parotid gland, salivary glands, sweat glands, lacrymal glands
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/08—Antiseborrheics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/10—Anti-acne agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0653—Adipocytes; Adipose tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/305—Growth hormone [GH], aka. somatotropin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/33—Insulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/395—Thyroid hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C12N2503/02—Drug screening
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/04—Immortalised cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

1. Uniesmiertelnione komórki lojowe pochodzenia ludzkiego uzyskiwane przez transfekcje komórek lojowych przy uzyciu DNA, który oddzialuje na tworzenie stabilnych, nieaktywnych komplek- sów z genami hamujacymi proliferacje, znamienne tym, ze wykazuja cechy prawidlowych, nietrans- fekowanych i róznicujacych sie komórek lojowych. 10. Zastosowanie uniesmiertelnionych komórek lojowych jak okreslono w zastrz. 1, do wytwa- rzania leku lub preparatu do badania powstawania tradziku i/lub lojotoku i/lub innych chorób. 11. Zastosowanie komórek lojowych wedlug zastrz. 10, znamienne tym, ze inne choroby, sta- nowia choroby skóry w których odgrywa role funkcja gruczolów lojowych. 21. Zastosowanie linii komórkowej ludzkich komórek lojowych DSM ACC2383, do wytwarzania leku lub preparatu do celów diagnostycznych, terapeutycznych lub kosmetycznych. PL PL PL

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są unieśmiertelnione komórki łojowe pochodzenia ludzkiego i ich zastosowania oraz linia komórkowa ludzkich komórek łojowych i jej zastosowania.
Komórki łojowe nadają się doskonale do wielu użytecznych zastosowań, na przykład do badań fizjologii i patofizjologii ludzkich albo zwierzęcych gruczołów łojowych, do badania powstawania trądziku, łojotoku względnie innych schorzeń, do badania działania różnych substancji i środków leczniczych, do opracowania układów kultur komórkowych z dwuwymiarowych albo trójwymiarowych skupisk komórek i konstrukcji organopodobnych struktur oraz do wytwarzania produktów, które pochodzą z tych komórek.
Coraz więcej wskazówek przemawia za tym, że komórki łojowe odgrywają krytyczną rolę w procesach patofizjologicznych oraz w chorobach aparatu gruczołów łojowych włosów, a zwłaszcza w przypadku trądziku (Gollnick et al., J. Dermatol. 1991, 18:489-499, Brown i Shalita, Lancet 1998, 351:1871-1978, Cunliffe, Dermatology, 1998, 196:9-15, Strauss, Dermatology, 1998, 196:182-184). Większa część naszego rozumienia fizjologii i patofizjologii gruczołów łojowych pochodzi z doświadczalnych modeli zwierzęcych (Pochi, w: Models in Dermatology, tom, 2, N. Lowe i H. Maibach, redaktorzy, Bazylea, 1985, 70-75). Ustalono jednak, że modele zwierzęce nie dają żadnych rozsądnych przesłanek co do oceny działania środków leczniczych przeciw trądzikowi u ludzi (Geiger, Dermatology 1995, 191:305-310). Fakt, że trądzik występuje tylko u ludzi oraz że aktywność wydzielnicza gruczołów łojowych jest związana silnie specyficznie z gatunkiem (Nikkari, J. Invest. Dermatol. 1974, 257-267), prowadził do poszukiwań modeli ludzkich. Początkowe badania w kierunku wyeliminowania tych niedogodności odbywały się za pomocą próbek ludzkiej skóry, które poddawano inkubacji in vitro (Hsia et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1970, 135:285-291, Cooper et al., Br. J. Dermatol. 1976, 94:165-172, Sharp et al. J. Endocrinol. 1976, 70:491-499) albo poddawano transplantacji na obnażonych myszach (Petersen et al., J. Clin. Invest. 1984, 74:1358-1365). Gruntowne badania aktywności ludzkich komórek łojowych oraz ich regulacji możliwe jednak były dopiero w minionym dziesięcioleciu, gdy wydzielono zdolne do życia ludzkie gruczoły łojowe (Kealey et al., Br. J. Dermatol. 1986, 114:181-188) i można było ustalić model hodowli ludzkich komórek łojowych in vitro (Xia et al., J. Invest. Dermatol. 1989, 93:315-321).
W ciągu minionych lat drogą modyfikacji techniki hodowli według Xia et al. uzyskano poprawę hodowli ludzkich komórek łojowych in vitro pod względem jej powtarzalności. W ten sposób Zouboulis et al. (Skin. Pharmacol. 1991, 4:74-83) dzięki dodaniu ludzkiej surowicy zrezygnowali w pożywce hodowlanej z hydrokortyzonu. Lee (w: Epithelia: Advances in Celi Physiology and Cell Culture, C. J. Jones, redaktorzy: Kluwer, Dordrecht, 1990, 333-350) opisali traktowanie gruczołów łojowych kolagenazą, przed ich hodowlą w pożywce bez surowicy, wzbogaconej substancjami dodatkowymi. W ten sposób pierwotne hodowle komórek łojowych można było otrzymać bez warstewki fibroblastów 3T3, służącej jako podłoże przyczepne (Akamatsu et al., J. Invest. Dermatol. 1992, 99:509-511). Hodowle wtórne można otrzymać w pożywce uzupełnionej odtłuszczoną surowicą (Zouboulis et al. J. Invest. Dermatol. 1993, 101:628-633), oraz w podstawowej pożywce do keratynocytów wolnej od surowicy i bez dodatków (Akamatsu et al., J. Invest. Dermatol. 1992, 99:509-511. Ponadto wykazano, że keratynocytowy czynnik wzrostu (KGF) polepszał znacznie wydajność otrzymywania i proliferację ludzkich komórek łojowych (Chen et al. J. Invest. Dermatol. 1998, 110:84-89).
Pomimo tych ulepszeń technicznych dalszy postęp jest silnie hamowany tym, że hodowanie dużej liczby komórek łojowych z wyizolowanych ludzkich gruczołów łojowych jest trudne. Istnieje zwłaszcza trudność w utrzymywaniu materiału komórkowego w hodowli przez długi okres czasu. Jako przyczynę tego przyjmuje się skłonność komórek łojowych do różnicowania się i zamierania na skutek samorzutnego rozrywania się błon komórkowych i uwalniania ich zawartości. Najlepszy wynik został uzyskany dotychczas przez Fujie et al. (Arch. Dermatol. Res. 1996, 288:703-708), którzy wydzielili gruczoły łojowe z użyciem techniki Xia et al. (1989) i hodowali komórki łojowe metodą hodowli zdyspergowanych komórek sześciu subkultur w pożywce wzrostowej do keratynocytów bez surowicy i bez warstwy komórek przyczepnych.
Przedmiotem wynalazku są unieśmiertelnione komórki łojowe pochodzenia ludzkiego uzyskiwane przez transfekcję komórek łojowych przy użyciu DNA, który oddziałuje na tworzenie stabilnych, nieaktywnych kompleksów z genami hamującymi proliferację, znamienne tym, że wykazują cechy prawidłowych, nie-transfekowanych i różnicujących się komórek łojowych.
PL 194 865 B1
Korzystnie komórki te stanowią komórki łojowe pochodzące z ludzkiego gruczołu łojowego.
Korzystniej komórki łojowe pochodzące z ludzkiego gruczołu łojowego stanowią komórki łojowe pochodzące z ludzkiego gruczołu łojowego twarzy.
Korzystnie komórki stanowią linię komórkową.
Korzystnie komórki wykazują ekspresję dużego antygenu T z SV-40.
Korzystnie proliferacja komórek modyfikowana jest przez androgeny i/lub retinoidy.
Korzystnie komórki stanowią komórki klonowane.
Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie unieśmiertelnionych komórek łojowych określonych powyżej do wytwarzania leku lub preparatu do celów diagnostycznych, terapeutycznych lub kosmetycznych.
Przedmiotem wynalazku jest też zastosowanie unieśmiertelnionych komórek łojowych określonych powyżej do wytwarzania leku lub preparatu do badania fizjologii lub patofizjologii ludzkich lub zwierzęcych gruczołów łojowych.
Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie unieśmiertelnionych komórek łojowych określonych powyżej do wytwarzania leku lub preparatu do badania powstawania trądziku i/lub łojotoku i/lub innych chorób.
Korzystnie inne choroby stanowią choroby skóry, w których odgrywa rolę funkcja gruczołów łojowych.
Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie unieśmiertelnionych komórek łojowych określonych powyżej do wytwarzania leku lub preparatu do testowania związków lub środków anty-trądzikowych i/lub anty-łojotokowych.
Przedmiotem wynalazku jest też zastosowanie unieśmiertelnionych komórek łojowych określonych powyżej do wytwarzania leku lub preparatu do testowania związków lub środków do leczenia chorób.
Korzystnie inne choroby stanowią choroby skóry, w których odgrywa rolę funkcja gruczołów łojowych.
Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie unieśmiertelnionych komórek łojowych określonych powyżej o rozwoju prostego lub kompleksowego systemu kultur komórkowych.
Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie unieśmiertelnionych komórek łojowych określonych powyżej do wytwarzania leku lub preparatu do wytwarzania lub odtwarzania trójwymiarowych układów komórkowych, lub konstruowania struktur organopodobnych.
Przedmiotem wynalazku jest też zastosowanie unieśmiertelnionych komórek łojowych określonych powyżej do wytwarzania leku lub preparatu do wytwarzania produktów pochodzących z tych komórek.
Korzystnie produkty komórkowe stanowią lipidy, plazmidy, wektory, białka, które są ekspresjonowane przez komórki, i/lub sekwencje DNA lub RNA tych białek.
Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie unieśmiertelnionych komórek łojowych określonych powyżej do wytwarzania leku lub preparatu do modyfikowania innych komórek lub modyfikowania organizmów nie będących człowiekiem.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto Linia komórkowa ludzkich komórek łojowych DSM ACC2383.
Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie linii komórkowej ludzkich komórek łojowych DSM ACC2383, do wytwarzania leku lub preparatu do wytwarzania leku lub preparatu do celów diagnostycznych, terapeutycznych lub kosmetycznych.
Przedmiotem wynalazku jest też zastosowanie linii komórkowej ludzkich komórek łojowych DSM ACC2383, do wytwarzania leku lub preparatu do badania fizjologii lub patofizjologii ludzkich lub zwierzęcych gruczołów łojowych.
Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie linii komórkowej ludzkich komórek łojowych DSM ACC2383, do wytwarzania leku lub preparatu do badania powstawania trądziku i/lub łojotoku i/lub innych chorób.
Korzystnie inne choroby stanowią choroby skóry, w których odgrywa rolę funkcja gruczołów łojowych.
Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie linii komórkowej ludzkich komórek łojowych DSM ACC2383, do wytwarzania leku lub preparatu do testowania związków lub środków anty-trądzikowych i/lub anty-łojotokowych.
PL 194 865 B1
Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie linii komórkowej ludzkich komórek łojowych DSM ACC2363, do wytwarzania leku lub preparatu do testowania związków lub środków do leczenia chorób.
Korzystnie inne choroby stanowią choroby skóry, w których odgrywa rolę funkcja gruczołów łojowych.
Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie linii komórkowej ludzkich komórek łojowych DSM ACC2383 do rozwoju prostego lub kompleksowego systemu kultur komórkowych.
Przedmiotem wynalazku jest też zastosowanie linii komórkowej ludzkich komórek łojowych DSM ACC2383, do wytwarzania leku lub preparatu do wytwarzania lub odtwarzania trójwymiarowych układów komórkowych, lub konstruowania struktur organopodobnych.
Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie linii komórkowej ludzkich komórek łojowych DSM ACC2383, do wytwarzania leku lub preparatu do wytwarzania produktów pochodzących z tych komórek.
Korzystnie produkty komórkowe stanowią lipidy, plazmidy, wektory, białka, które są ekspresjonowane przez komórki, i/lub sekwencje DNA lub RNA tych białek.
Komórki według wynalazku stanowią komórki skóry i błony śluzowej, zawierające tłuszcze i wytwarzające łój, nazywane komórkami łojowymi.
Zgodnie z wynalazkiem uzyskano komórki łojowe, które można utrzymywać w hodowli przez większą liczbę subkultur, przy czym otrzymane komórki łojowe powinny przypominać swoim obrazem charakterystyczne cechy morfologiczne, fenotypowe i funkcyjne żywych, normalnych, ludzkich komórek łojowych, względnie być do nich zbliżone w takim stopniu, aby nadawały się one dobrze jako model komórkowy, względnie model hodowli komórek dla zawierających tłuszcze, produkujących łój komórek, a zwłaszcza komórek łojowych do badań fizjologicznych, patofizjologicznych i farmaceutycznych.
Postawiony problem techniczny rozwiązano przez otrzymanie unieśmiertelnionych komórek łojowych. Ze względu na fakt, że komórki według wynalazku są interesujące przede wszystkim dla użytecznych zastosowań, to pochodzą one od ludzi. Komórki łojowe tego rodzaju występują w linii komórkowej ludzkich komórek łojowych SZ95, którą zdeponowano w Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), pod numerem dostępu DSM ACC2383.
Figura 1 i Fig. 2 pokazują, że otrzymane, unieśmiertelnione komórki łojowe SZ95 zachowują nabłonkowy, polimorficzny wygląd pierwotnych normalnych komórek łojowych, z których pochodzą (w tym przypadku od człowieka). Poza tym otrzymane unieśmiertelnione komórki łojowe i ich klony także i w późniejszych subkulturach wykazują ekspresję (klon = komórki, które na pewno pochodzą z pojedynczej komórki) charakterystycznego dużego antygenu T o wielkości 94 kD z SV-40, za pomocą którego sekwencji kodującej DNA zostały one poddane transfekcji. Na Fig. 1 przedstawiono (a) normalne, ludzkie komórki łojowe drugiej subkultury, z których pochodzą otrzymane unieśmiertelnione komórki łojowe, (b) przywierającą hodowlę komórek łojowych z otrzymanych unieśmiertelnionych komórek łojowych w pierwszej hodowli, (c) otrzymane unieśmiertelnione komórki łojowe (50-siąta subkultura klonu). Wszystkie komórki przypominają strukturę nabłonkową, polimorficzną. Na Fig. 2 przedstawiono (a) odwirowane preparaty komórkowe otrzymanych unieśmiertelnionych komórek łojowych i (b) hodowlę komórek nabłonkowych HMEC-1, służących jako kontrola dodatnia, wybarwionych z użyciem przeciwciała monoklonalnego względem dużego antygenu T z SV-40. Obydwa preparaty są wybarwione dodatnio i pokazują, że duży antygen T z SV-40 jest umiejscowiony głównie w jądrze komórkowym, a częściowo także w cytoplazmie komórkowej. W (c) przedstawiono ekspresję dużego antygenu T z SV-40 w otrzymanych ludzkich unieśmiertelnionych komórkach łojowych z użyciem hybrydyzacji typu Western. O ile dużego antygenu T z SV-40 nie można wykryć w przypadku ludzkich nie poddanych transfekcji, normalnych komórek łojowych (tor 1) i normalnych ludzkich, nabłonkowych keratynocytów (tor 2), to można wykryć charakterystyczne białko o wielkości 94 kD w wyciągach białkowych z otrzymanych unieśmiertelnionych komórek łojowych w 34 subkulturze (tor 3) oraz trzech wyizolowanych klonów (tor 4, 5 względnie 6).
Unieśmiertelnione komórki łojowe według wynalazku stanowią korzystnie komórki łojowe pochodzenia ludzkiego.
Znaczenie wyrażenia „komórki łojowe” należy rozumieć w najszerszym sensie, to jest w odniesieniu do wszystkich komórek, które w mniejszym lub większym stopniu zawierają tłuszcze i wytwarzają łój. Łój składa się przeważnie z różnych tłuszczów, przy czym zawartość tłuszczów w komórkach zmienia się zarówno pod względem frakcji tłuszczowych, jak i zawartości frakcji tłuszczowych.
PL 194 865 B1
Z reguły, jednak niekoniecznie, zawarte w komórkach tłuszcze obejmują wolne kwasy tłuszczowe, triglicerydy, woski, skwaleny, wolną cholesterynę, estry cholesteryny, dihydroksycholesterynę oraz inne steroidy i inne węglowodory. Zalecane są zwłaszcza takie unieśmiertelnione łojowe, które pochodzą z ludzkich komórek gruczołów łojowych. Szczególnie przydatne do celów medycznych są komórki łojowe, które pochodzą z ludzkiego gruczołu łojowego twarzy.
Ważna cecha charakterystyczna komórek łojowych według wynalazku polega na ich nieuśmiertelnieniu.
Unieśmiertelniony oznacza w kontekście niniejszego wynalazku zasadnicze zachowanie stanu witalności komórek przez dużą liczbę subkultur. Unieśmiertelnione komórki łojowe SZ95 według wynalazku mogły być utrzymane w hodowli w czasie obserwacji wynoszącym około 4,5 roku, przez ponad 50 subkultur, podczas gdy normalne ludzkie komórki łojowe mogą rozwijać się przed zamarciem tylko poprzez trzy do sześciu subkultur.
Unieśmiertelnione komórki łojowe według wynalazku można otrzymać poddając normalne komórki łojowe pochodzenia ludzkiego, a zwłaszcza z ludzkiego gruczołu łojowego transfekcji z użyciem DNA, który tworzy trwałe, nieczynne kompleksy z genami hamującymi proliferację. Szczególnie udane unieśmiertelnione komórki uzyskano zgodnie z wynalazkiem poprzez transfekcję normalnych ludzkich komórek łojowych, zwłaszcza pochodzących z gruczołów łojowych twarzy, za pomocą DNA, zawierającego sekwencje DNA kodujące duży antygen T z SV-40. Unieśmiertelniające działanie dużego antygenu T z SV-40 (białko) oraz odpowiednie zastosowanie kodującej sekwencji DNA do transfekcji ludzkich komórek jest znane. Zatem otrzymano na przykład linie unieśmiertelnionych komórek poprzez transfekcję za pomocą DNA kodującego duży antygen T z SV-40, na przykład z innych komórek pochodzenia nabłonkowego (patrz Tohyama et al., Tohoku, J. Exp. Med. 1997, 182:75-82, Bae et al., Prostate 1998, 34:275-282) oraz pochodzenia śródbłonkowego (patrz Ades et al., J. Invest. Dermatol. 1992, 99:683-690 i dokument patentowy nr WO-A-92/17569).
Okazało się, że transfekcja komórek łojowych metodą przenoszenia genów z zastosowaniem lipidów kationowych (odczynnik LIPOFECTIN, który zawiera 1:1 (wagowo) kompozycję liposomową kationowych lipidów DOTMA [chlorek 1,2-diolilooksypropylo-3-trimetyloamoniowy] i DOPE [diolilofosfatydyloetanoloamina] w wodzie przefiltrowanej przez membranę [1 mg/ml], w której obcy DNA wchłania się do komórek poprzez kationowe kompleksy lipidy-DNA drogą endocytozy (patrz Wang et al., In. Vitro. Celi. Dev. Biol., 1991, 27A:63-74, Staedel et al., J. Invest. Dermatol. 1994, 102:768-772), dawała dobre wyniki przy unieśmiertelnianiu, przy czym w mieszaninie transfekcyjnej zastosowano dogodnie od 0,25 do 2,0% objętościowo, a zwłaszcza 2,0% objętościowo odczynnika LIPOFECTIN oraz od 0,05 do 0,5 % wagowo, a zwłaszcza 0,5% wagowo obcego DNA w odpowiednim buforze transfekcyjnym. Obcy DNA, podobnie jak DNA kodujący duży antygen T z SV-40, poddaje się insercji w odpowiednim wektorze, w którym ekspresję dużego antygenu T z SV-40 zwiększa się dogodnie za pomocą sekwencji promotora i wzmacniacza. W przypadku gdy normalne ludzkie komórki łojowe poddaje się w zalecanym rozwiązaniu transfekcji za pomocą DNA, kodującego duży antygen T z SV-40 należy oczekiwać, że otrzymane komórki łojowe po udanej transfekcji i unieśmiertelnieniu dadzą ekspresję dużego antygenu T z SV- 4G. Potwierdzono to w przypadku otrzymanych unieśmiertelnionych komórek łojowych według wynalazku drogą immunocytochemiczną oraz analizami drogą hybrydyzacji typu Western z zastosowaniem przeciwciała monoklonalnego względem dużego antygenu T z SV-40.
Otrzymane tak unieśmiertelnione komórki łojowe według wynalazku występują korzystnie w postaci linii komórkowej i mogą w tej postaci być doskonale wykorzystywane do celów zastosowania.
Unieśmiertelnione komórki łojowe według wynalazku wzrastały po dostosowaniu do pożywki hodowlanej bez surowicy lepiej niż niepoddane transfekcji, normalne ludzkie komórki łojowe i zachowywały swoją zdolność do syntezy specyficznych lipidów gruczołów łojowych, w przeciwieństwie do niepoddanych transfekcji, normalnych ludzkich komórek łojowych zawartych w pożywce bez surowicy. Unieśmiertelnione komórki łojowe według wynalazku mogą w ten sposób służyć jako stale odnawialne, zdolne do rozmnażania się linie komórkowe i wzrastać w określonych pożywkach hodowlanych.
Szczególna wartość unieśmiertelnionych komórek łojowych według wynalazku polega na tym, że pod względem morfologicznym, fenotypowym i funkcyjnym wykazują one cechy nie poddanych transfekcji, normalnych i różnicujących komórek łojowych. Dzięki temu unieśmiertelnione komórki łojowe według wynalazku nadają się doskonale jako model do badań fizjologicznych, patofizjologicznych i farmakologicznych. Jednocześnie unika się niedogodności związanych z ograniczoną żywotnością
PL 194 865 B1 konwencjonalnych, zawartych w hodowlach, normalnych komórek łojowych pochodzenia ludzkiego. Zatem można było potwierdzić, że unieśmiertelnione komórki łojowe według wynalazku zachowywały w bardzo dużym stopniu normalny fenotyp komórek łojowych i mogły zachowywać się pod względem funkcyjnym podobnie jak niepoddane transfekcji, normalne ludzkie komórki łojowe twarzy.
Ustalono, że unieśmiertelnione komórki łojowe według wynalazku, względnie linia komórek łojowych (linia komórkowa komórek łojowych) wykazują polimorficzny, nabłonkowy obraz, który przypomina obraz niepoddanych transfekcji, normalnych, ludzkich komórek łojowych. W hodowli komórkowej pojawiły się komórki o różnej wielkości i strukturze wewnątrzkomórkowej, co wskazywało na różne stadia dojrzewania komórek. Zatem zaobserwowano na przykład komórki o różnej wielkości, przeciętnie o wielkości do pięciu, względnie sześciu wielkości przy konfluentnym wzroście, co w zasadzie odpowiada wzrostowi wielkości nie poddanych transfekcji, normalnych ludzkich komórek łojowych z postępującym różnicowaniem się in vitro (przeciętnie 4-krotnych do 5,5-krotnych różnic wielkości). W cytoplazmie unieśmiertelnionych komórek łojowych według wynalazku bez trudu stwierdzono obfite występowanie cząstek tłuszczowych, tak jak ma to miejsce w przypadku nie poddanych transfekcji, normalnych ludzkich komórek łojowych. Zgodnie z wynalazkiem doświadczalnie potwierdzono syntezę charakterystycznych lipidów gruczołów łojowych, skwalenów i estrów woskowych, jak ma to miejsce w przypadku normalnych ludzkich komórek łojowych. Ponadto unieśmiertelnione komórki łojowe według wynalazku syntezowały wolne kwasy tłuszczowe, co ponownie koreluje z wiedzą o nie poddanych transfekcji, normalnych ludzkich komórkach łojowych in vitro, nawet już po dużej liczbie subkultur.
W przypadku unieśmiertelnionych komórek łojowych według wynalazku, względnie linii komórkowej ludzkich komórek łojowych według wynalazku stwierdzono również występowanie typowych markerów ekspresji, potwierdzających pochodzenie komórek łojowych i wykazujących nienaruszone różnicowanie. W ten sposób unieśmiertelnione komórki łojowe według wynalazku względnie linia komórkowa ludzkich komórek łojowych wykazywały ekspresję typowych dla komórek łojowych antygenów ludzkiej, polimorficznej, nabłonkowej grupy mukoprotein, takich jak antygen gruczołów łojowych, ludzka globulina 1 i 2 z tłuszczu mleka, ludzka nabłonkowa sialomucyna, antygen Thomsena-Friedenreicha, antygen związany z rakiem mucynopodobnym oraz nabłonkowy antygen błonowy. Zgodnie z wynalazkiem potwierdzono to immunocytochemicznie oraz analizą hybrydyzacji typu Western. Poza tym unieśmiertelnione komórki łojowe według wynalazku, względnie linia komórkowa ludzkich komórek łojowych według wynalazku wykazywały ekspresję antygenu keratynowego typowego dla nie poddanych transfekcji, normalnych ludzkich komórek łojowych, takich jak antygeny subklas 7, 13 i 19. Fenotyp antygenu obejmował zatem pochodzenie komórek łojowych i różnicowanie się komórek łojowych.
Pod względem funkcyjnym unieśmiertelnione komórki łojowe według wynalazku, względnie linia komórkowa ludzkich komórek łojowych według wynalazku również zachowywały się podobnie do nie poddanych transfekcji, normalnych ludzkich komórek łojowych. Zgodnie z tym wydaje się, że na unieśmiertelnione komórki łojowe według wynalazku oddziaływują androgeny, takie jak na przykład 5a-diwodorotestosteron, zwiększając ich proliferację in vitro. Ponadto unieśmiertelnione komórki łojowe według wynalazku, względnie linia komórkowa ludzkich komórek łojowych według wynalazku wykazywały zdolność do zmiany proliferacji w odpowiedzi na działanie retinoidów, zwłaszcza typu niearomatycznego (na przykład kwas 13-cis-retinowy, kwas retinowy o całkowitej konfiguracji trans).
W korzystnym rozwiązaniu unieśmiertelnione ludzkie komórki łojowe są sklonowane. Ma to tę zaletę, że unieśmiertelnione komórki łojowe względnie powstająca z nich linia komórkowa komórek łojowych są dobrze zdefiniowane i specyficznie scharakteryzowane w oparciu o jednolitą strukturę genomową. Linię sklonowanych i unieśmiertelnionych ludzkich komórek łojowych otrzymywano dogodnie w ten sposób, że unieśmiertelnione komórki łojowe rozcieńczano w naczyniu hodowlanym do uzyskania tylko jednej komórki na naczynie hodowlane. Można to śledzić i kontrolować drogą obserwacji mikroskopowych.
W ten sposób zgodnie z wynalazkiem stwierdzono, że otrzymane unieśmiertelnione ludzkie komórki łojowe, względnie powstająca z nich linia komórkowa ludzkich komórek łojowych uzyskały swoją tożsamość łojową w porównaniu z nie poddanymi transfekcji, normalnymi ludzkimi komórkami łojowymi. Zostało to potwierdzone za pomocą kontroli charakterystyk i testów funkcyjnych.
Linia komórkowa komórek łojowych z oznaczeniem SZ95 łączy w sobie wyżej wymienione zalety niniejszego wynalazku, i stanowi linię komórkową komórek ludzkich gruczołów łojowych, zdeponowaną w DSMZ pod numerem dostępu ACC2383.
PL 194 865 B1
W ten sposób unieśmiertelnione komórki łojowe, względnie linia komórkowa komórek łojowych według wynalazku stwarzają doskonałe możliwości wykorzystania w użytecznych zastosowaniach. Na ogół komórki łojowe względnie linię komórek łojowych według wynalazku wykorzystuje się do celów diagnostycznych, terapeutycznych albo kosmetycznych. Wyżej opisane komórki łojowe względnie linia komórek łojowych służą specjalnie do fizjologicznych albo patofizjologicznych badań komórek zawierających lipidy, produkujących łój, a zwłaszcza ludzkich albo zwierzęcych komórek gruczołów łojowych, oraz ich roli w patofizjologicznych procesach skóry i w chorobach skóry, takich jak trądzik. Za pomocą wynalazku można w ten sposób badać powstawanie trądzika i ewentualnie łojotoku i ewentualnie innych schorzeń, a zwłaszcza chorób skóry, w których pewną rolę odgrywa albo może odgrywać działanie gruczołów łojowych. Przedmioty niniejszego wynalazku służą ponadto jako doskonałe modele do badania i oceny związków i środków przeciw trądzikowi i ewentualnie przeciw łojotokowi, a także środków przeciw schorzeniom, a zwłaszcza chorobom skóry, w których pewną rolę odgrywa albo może odgrywać działanie gruczołów łojowych. Właśnie przed przeprowadzeniem badań klinicznych są użyteczne takie badania in vitro farmakologicznych właściwości środków leczniczych.
Opisane powyżej komórki łojowe albo linia komórek łojowych według wynalazku mają ponadto tę zaletę, że za ich pomocą można ustalić dalsze układy kultur komórkowych. Obejmuje to rozwój prostych i złożonych układów kultur komórkowych. Proste układy kultur komórkowych oznaczają z reguły dwuwymiarowe, jednowarstwowo albo wielowarstwowo przywierające kultury albo nieprzywierające kultury, i tworzy się je na przykład mieszając wyżej opisane komórki łojowe z innymi rodzajami komórek albo hodując oddzielnie przez półprzepuszczalne albo nieprzepuszczalne błony (Schwartz et al., J. Surg. Res., 1998, 76:79-85, Nackman et al., 1998, 124:353-61). Złożone układy hodowli komórkowych oznaczają z reguły trójwymiarową hodowlę jednowarstwowych albo wielowarstwowych hodowli i tworzy się je na przykład hodując komórki jako sferoidy, na sferoidach, w kolagenie albo innych preparatach żelowych albo w sztucznej, skóropodobnej strukturze (Korff i Augustin, J. Celi. Biol. 1998, 143:1341-1352, Hamamoto et al., J. Biochem. (Tokio), 1998, 124:972-979, Desoize et al., Anticancer. Res., 1998, 18:4147-4158, Hamilton, Cancer. Lett. 1998; 131:29-34, Niemann et al., J. Cell. Biol. 1998, 143:533-545, Awata et al. J. Gastroenterol. Hepatol., 1998, 13 suppl:S55-61, Voura et al., Microsc. Res. Tech., 1998, 43:265-275, Pipili-Synetos et al., Br. J. Pharmacol., 1998, 125:1252-1257, Vasile et al., J. Histochem. Cytochem., 1999, 47:159-168, Michalopoulos et al., Hepatology, 1999, 29:80-100, Trent i Kirsner., Int. J. Clin. Pract., 1998, 52:408-413, Fransson et al., Br. J. Dermatol., 196, 139:598-604, Konstantinova et al., Arch. Dermatol. Res., 1998, 290:610-614, Black et al., FASEB. J., 1998, 12:1331-1340, Zhao et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999, 254:49-53).
Szczególnie użyteczne zastosowanie dotyczy tworzenia trójwymiarowych skupisk komórek albo struktur względnie rekonstrukcji organopodobnych struktur z komórek łojowych według wynalazku względnie z linii komórkowej komórek łojowych według wynalazku. Do tego celu stosuje się komórki łojowe, dogodnie jednak z dalszymi, budującymi skórę komórkami, a zwłaszcza z keratynocytami, fibroblastami, melanocytami, komórkami nabłonkowymi, komórkami Langerhansa i ewentualnie komórkami z mieszka włosowego. W celu utworzenia takich trójwymiarowych skupisk komórek albo konstrukcji albo rekonstrukcji struktur organopodobnych przygotowuje się początkowo korzystnie szkielet podporowy z kolagenem albo innymi preparatami żelowymi i ewentualnie z elementami dezaktywowanej tkanki, a następnie wymienione komórki nanosi się na ten szkielet podporowy względnie wprowadza do tego szkieletu. Ten sposób jest znany specjaliście i pierwsze preparaty są już dostępne w handlu (Trent i Kirsner, Int. J. Clin. Pract. 1998, 52:408-413, Fransson et al., Br. J. Dermatol., 1998, 139:598-604, Konstantinova et al., Arch. Dermatol. Res. 1998, 290:610-614, Black et al., FASEB. J., 1998, 12:1331-1340, Zhao et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1999, 254:49-53). W ten sposób wytwarza się „sztuczną skórę” albo namiastkę skóry, co stwarza doskonałe możliwości dla medycyny transplantacyjnej, rekonstrukcji uszkodzonych części skóry, takich jak skóra oparzona, albo do leczenia obrażeń skóry. Zgodnie z wynalazkiem ta „sztuczna skóra” może syntezować tłuszcz/łój w wystarczającej ilości, gdy do tej konstrukcji wprowadzi się komórki łojowe według wynalazku.
Dalszy obszar bardzo użytecznych zastosowań dotyczy wytwarzania produktów, które pochodzą z komórek łojowych według wynalazku albo z linii komórkowej komórek łojowych według wynalazku. Obejmuje to wydzielanie i oczyszczenie substancji komórkowych, takich jak lipidy, proteiny, DNA i ewentualnie RNA. Ze względu na to, że komórki są unieśmiertelnione, to stanowią one stałe źródło tego rodzaju substancji komórkowych. Specjalnymi przykładami takich bardzo użytecznych substancji,
PL 194 865 B1 które można w ten sposób otrzymać z komórek są lipidy skóry do stosowania w środkach do stosowania miejscowego i środkach leczniczych, które w poniższym Przykładzie 3 są wymienione w związku z fenotypową charakterystyką komórek łojowych, białka antygenowe, a ponadto wytwarzanie DNA plazmidu albo DNA wektora. Wytwarzanie DNA plazmidu albo DNA wektora przeprowadza się z użyciem znanej specjalistom inżynierii genetycznej. W ten sposób można otrzymać na przykład geny, które indukują wytwarzanie lipidów. Właśnie za pomocą takich odpowiednich konstrukcji plazmidów wektorów, przy czym można brać pod uwagę także tworzenie wektorów wirusowych, można ponownie modyfikować albo poddawać transfekcji inne komórki albo organizmy.
Niniejszy wynalazek wyjaśniony jest bliżej za pomocą nieograniczających przykładów.
Przykłady
Hodowle komórkowe
Jeżeli nie podano inaczej, to wszystkie komórki utrzymuje się w postaci hodowli przywierających w pożywce, która składała się z modyfikowanej DMEM/pożywki F12 Hama (1:1) (dostępne w firmie Biochrom, Berlin, Niemcy) z 2 mM N-acetylo-L-alanylo-L-glutaminą, które uzupełniano za pomocą 10%, aktywowanej cieplnie surowicy krwi cielęcej (FCS, Biochrom) oraz 50 mg/ml gentamycyny (dostępnej w firmie Gibco-BRL, Karlsruhe, Niemcy). Hodowlę utrzymywano w temperaturze 37°C w wilgotnej atmosferze, która zawierała 5% CO2, przy czym pożywkę hodowlaną odnawiano co każde do 3 dni.
Izolacja i hodowla normalnych ludzkich komórek łojowych
Normalne komórki łojowe izolowano ze skóry twarzy 87-letniej pacjentki, która została poddana operacji, w sposób opisany przez Xia et al. (J. Invest. Dermatol., 1989, 93:315-321). Wyizolowane gruczoły łojowe hodowano bez warstwy komórek przyczepnych w pożywce standardowej, którą uzupełniono 9 ng/ml nabłonkowego czynnika wzrostu (EGF), 9 ng/ml keratynocytowego czynnika wzrostu (KGF) (obydwa dostępne w firmie Boehringer Mannheim, Niemcy), 0,4 mg/ml hydrokortyzonu (dostępnego w firmie Sigma, Deisenhofen, Niemcy) oraz 109 M toksyny cholery (dostępnej w firmie Calbiochem, Bad Soden, Niemcy). Hodowle normalnych komórek łojowych pojawiły się jako narośl z obrzeża płacików gruczołów łojowych.
Badania immunocytochemiczne
Zdyspergowane komórki z subkonfluentnych normalnych hodowli komórek łojowych przyczepiano na nośnikach szklanych przez wirowanie komórek. Próbki suszono na powietrzu i utrwalano w ciągu 10 minut za pomocą zimnego acetonu. Preparaty poddawano następnie inkubacji przez 30 minut w temperaturze pokojowej z odpowiednim przeciwciałem monoklonalnym i przeciwciałem kontrolnym. Związane przeciwciała wykrywano drogą sprzęgania z produktem sprzężenia monoklonalnego przeciwciała w rozcieńczeniu 1:100 z króliczą/antymysią IgG (H+L) i kompleksem alkaliczna fosfataza/anty-alkaliczna fosfataza (dostępnym w firmie Dianova, Hamburg, Niemcy) przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Pierwotne i wtórne przeciwciała monoklonalne rozcieńczano w roztworach, które zawierały 10% RPMI-1640 i 10% FCS przy pH 7,4. Etapy przemywania prowadzono 3-krotnie za pomocą buforu PBS bez Ca2+ i Mg2+ (dostępnego w firmie Biochrom). Preparaty barwiono w ciągu 30 minut w buforowanym roztworze (pH 8,8) za pomocą nowej fuksyny jako środka przyczepnego i soli naftolu jako środka sprzęgającego (obydwa z firmy Sigma), barwiono przeciwstawnie za pomocą hematoksyliny Mayera (Merck, Darmstadt, Niemcy), przykryto i oceniano pod mikroskopem świetlnym.
Izolacja i ocena ilościowa protein
W celu izolacji białek komórkowych hodowle komórkowe, kultury komórek przemywano dwukrotnie PBS, bezpośrednio w naczyniach hodowlanych poddawano lizie z użyciem zimnego roztworu, składającego się z 50 mM HEPES, 1% Nonidet P-40 (dostępny w ICN, Aurora, OH, USA), 150 mM NaCl oraz inhibitora proteazy (Complete™ Mini, dostępny w firmie Boehringer Mannheim), a na koniec zeskrobywano je i zbierano w małych naczyniach do wirowania. Otrzymany materiał homogenizowano za pomocą działania ultradźwięków, wirowano, a klarowną ciecz trzymano na lodzie. Następnie dodano kwas bicynchoninowy (oznaczenie białek BCA, dostępne w firmie Pierce, Rochford, IL, USA) w celu uwidocznienia całego białka, a stężenie białka oceniano ilościowo drogą pomiaru absorpcji przy długości fali 550 nm.
Analiza hybrydyzacji typu Western
Porcje wyizolowanego białka (20 mg) ogrzewano przez 15 minut do temperatury 95°C. Jednowymiarową elektroforezę SDS/PAGE przeprowadzono w 7,5-procentowych żelach względem każdej próbki. Następnie białka przenoszono na błonę przenoszącą (Immobilon P z PVDF, dostępny w firmie
PL 194 865 B1
Millipore, Eschborn, Niemcy) z zastosowaniem standardowego układu hybrydyzacyjnego (dostępnego w firmie Bio-Rad, Monachium, Niemcy). Hybrydyzacje poddawano inkubacji z pierwotnym, przeciwciałem monoklonalnym przez 60 minut w temperaturze pokojowej, a następnie poddawano inkubacji z kozim/antymysim sprzężonym z peroksydazą chrzanową przeciwciałem monoklonalnym względnie kozim/antykróliczym przeciwciałem monoklonalnym (dostępnych w firmie Oncogene Science) w rozcieńczeniu 0,2 mg/ml przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Po dokładnym przemyciu uwidoczniano sygnały metodą chemiluminescencyjną z zastosowaniem oznaczenia standardowego (ECL, dostępny w firmie Amersham, Braunschweig) na błonach czułych na promienie rentgenowskie (XAR5, dostępne w firmie Kodak, Rochester, NY, USA), przy czym nastawiano kilka przedziałów napromieniania.
Barwienie czerwienią olejową i czerwienią „nil”
Komórki wzrastające w nośnikach obiektów kamery poddawano inkubacji albo z 0,6% roztworem czerwieni olejowej (Sigma) w 60% izopropanolu przez 15-120 minut albo z 1 mg/ml barwnika czerwieni „nil” (dostępnego w firmie Kodak) przez 15 minut w temperaturze pokojowej, tak jak zostało to opisane przez Xia et al. (1989) (patrz wyżej). Hodowle obserwowano następnie pod mikroskopem świetlnym (po zabarwieniu czerwienią olejową) albo pod mikroskopem fluorescencyjnym z zastosowaniem filtra wzbudzenia o przepuszczalności pasma 450-500 nm za pomocą emisji światła powyżej 528 nm (po zabarwieniu czerwienią „nil”).
Cytometria przepływowa
Zdyspergowane, nieznakowane komórki sortowano w celu określenia wielkości komórek za pomocą konwencjonalnego sortownika, natomiast komórki oznakowane barwnikiem czerwieni „nil” (dostępnej w firmie Kodak) oznaczano w celu określenia zawartości lipidów drogą cytometrii przepływowej na bazie fluorescencyjnej, przy czym badano 10000 komórek na próbkę.
Znakowanie i ekstrakcja lipidów
Hodowle komórkowe trzymano w pożywce hodowlanej przez dwa dni, a następnie poddawano je działaniu impulsu promieniotwórczego przez sól sodową [2- C]-kwasu octowego (45-60 mCi/mmol, dostępna w firmie Dupond-NEN, Boston, MA, USA) o stężeniu 0,5 mCi/ml w pożywce RPMI-1640, do której dodano 2 mM L-glutaminę, 10% inaktywowaną cieplnie FCS i 100 IU/ml penicyliny oraz 100 mg/ml streptomycyny. Następnie inkubację prowadzono przez kolejne 24 godziny.
Lipidy wyizolowano z wyhodowanych komórek i z klarownej cieczy pożywki hodowlanej i rozdzielano na lipidy obojętne, kwasy tłuszczowe i fosfolipidy (patrz Seifert et al., J. Invest. Dermatol., 1997, 108:375).
Podział na frakcje według wielkości oraz wizualizację obojętnych lipidów i wolnych kwasów tłuszczowych prowadzono drogą wysokosprawnej chromatografii cienko-warstwowej (HPLC), którą prowadzono na płytkach szklanych o wielkości 20 x 10 cm2 powleczonych żelem krzemionkowym (dostępnych w firmie Merck, Darmstadt, Niemcy). Płytki poddawano wstępnej obróbce za pomocą n-heksanu i suszono przez 24 godziny. Próbki nanoszono za pomocą automatycznego urządzenia do nakładania lipidów (Linomat IV, Camag, Berlin, Niemcy). Chromatogramy obojętnych lipidów wywoływano na 9 cm w roztworze n-heksan/eter dwuetylowy (9:1), suszono i wywoływano dodatkowo w roztworze chloroform/eter dwuetylowy/kwas octowy (80:4:16) na 4,5 cm. Do naświetlania wykorzystywano łuki świetlne (TR2040S, dostępne w firmie Fuji, Tokio, Japonia), które następnie poddawano skaningowi z zastosowaniem przyrządu do analizy obrazów („BAS 1000 Bio-Imaging Analyser”, Fuji). Jako próbki porównawcze stosowano wzorce lipidowe.
Badanie właściwości wzrostu
Komórki posiewano w płytkach hodowlanych z 96 wgłębieniami przy gęstościach od 0,5 do 4 x x 103 komórek/wgłębienie. Proliferację komórek oceniano za pomocą oznaczenia fluorescencyjnego z heksanokarboksylanem 4-metyloumbeli-ferylu i mierzono automatycznie (Zouboulis et al., Melanoma. Res., 1991, 1:91-95).
W tym celu usuwano w dniu oceny pożywki hodowlanej, komórki przemywano dwukrotnie za pomocą PBS i do każdego wgłębienia dodawano 100 ml 100 mg/ml roztworu heksanokarboksylanu 4-metyloumberyferylu (Sigma, Deisenhofen, Niemcy) w PBS. Następnie płytki poddawano inkubacji przez 30 minut w temperaturze 37°C, a wyemitowaną fluorescencję mierzono za pomocą odpowiedniego przyrządu fluorescencyjnego (Titertec Fluoroscan II, Flow, Meckenheim, Niemcy).
Jednostki fluorescencyjne otrzymywano przy filtrach o wzbudzeniu 355 nm i emisji 460 nm.
Obróbka za pomocą 5a-diwodorotestosteronu i retinoidów
5a-diwodorotestosteron (5a-DHT, Sigma) rozpuszczano w DMSO, a na koniec wprowadzano do wolnej od surowicy i fenolu, modyfikowanej pożywki DMEM/F12 Hama (1:1) (Gibco-BRL) z 2 mM
PL 194 865 B1 n-acetylo-L-alanylo-L-glutaminą, 5 ng/ml EGF, 50 mg/ml wyciągu z przysadki bydlęcej, 1 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej wolnej od kwasów tłuszczowych (Bohringer Mannheim) i 50 mg/ml gentamycyny, tak aby uzyskać stężeme koricowe 10 6m 5a-DHT i 0,1% DMSO. Sam 0,1% DMSO służył jato tontoota. Komórki (0,5 do 2 x 103 na wgłębienie) poddawano obróbce przez 18 dni za pomocą 5a-DHT.
W celu obróbki za pomocą retinoidów rozpuszczano w DMSO całkowicie kwas trans-retinowy, kwas 13-cis retinowy i acytretynę, a na koniec w modyfikowanej, wolnej od surowicy pożywce DMEM/pożywce F12 Hama (1:1) z 2 nM N-acetylo-L-alanylo-L-glutaminy, 5 ng/ml EGF, 50 mg/ml wyciągu z przysadki bydlęcej, 1 mg/ml albuminy z osocza krwi bydlęcej bez wolnych kwasów tłuszczowych i 50 mg/ml gentamycyny, tak aby uzyskać stężenie końcowe 107 retinoidów i 0,4% DMSO. Sam 0,1% DMSO służył jako kontrola. Retinoidami manipulowano w przyciemnionym żółtym świetle. Komórki (od 0,5 do 1 x 103 na wgłębienie) poddawano obróbce retinoidami przez 9 dni.
Analiza statystyczna
Badania wzrostu prowadzono w oparciu o sześciokrotne powtórzenia w płytkach z 96 wgłębieniami. Wszystkie inne badania prowadzono z powtórzeniami trzykrotnymi.
Przykład 1
Transfekcja normalnych ludzkich komórek łojowych
Wektor stosowany do transfekcji normalnych ludzkich komórek łojowych, oznaczony jako pSVT, był konstrukcją plazmidową na bazie PBR 322, którego sekwencje odpowiadały dużemu antygenowi T z SV-40, przy czym ekspresja białek napędzana była długimi końcowymi powtórzeniami wirusa mięsaka Rousa (patrz Dutt et al., Oncogene, 1990, 5:195-200, Wang et al., In. Vitro. Celi. Dev. Biol. 1991, 27A:63-74). Drugą subkulturę normalnych ludzkich komórek łojowych pozostawiono do wzrostu do konfluencji 50% w 35 mm naczyniach hodowlanych (Becton Dickinson, Plymouth, UK) i wykorzystano do transfekcji. Transfekcję prowadzono na bazie metody przenoszenia genów z zastosowaniem lipidów kationowych. W tym celu stosowano odczynnik LIPOFECTIN, który zawierał 1:1 (wagowo) kompozycję liposomową lipidów kationowych DOTMA (chlorek 1,2-dioliloo-ksypropylo-3-trójmetyloamoniowy) i DOPE (diolilofosfatydyloetanolo-amina) w wodzie przefiltrowanej przez membranę (1 mg/ml). W tym celu usuwano pożywkę hodowlaną, komórki hodowli przemywano dwukrotnie pożywką wolną od surowicy (Opti-MEM z firmy Gibco-BRL) i w tej pożywce poddawano inkubacji przez cztery godziny. Następnie pożywkę zastępowano mieszaniną transfekcyjną, która składała się z pewnej ilości wolnej od antybiotyków pożywki Opti-MEM (1,5 ml) z odpowiednią ilością odczynnika LIPOFECTIN (Gibco-BRL, 5-30 ml, najlepiej 1,5% objętościowo) oraz odpowiednią ilością pSVT-DNA (1-10 mg) w roztworze z 0,5 ml PBS (stężenie końcowe DNA najlepiej 0,5% wagowo). Hodowle poddawano inkubacji przez 24 godziny w temperaturze 37°C w wilgotnej atmosferze, zawierającej 5% CO2. Na koniec hodowle przemywano dwukrotnie za pomocą pożywki hodowlanej i, jak opisano wyżej, trzymano dalej w pożywce hodowlanej dla komórek łojowych.
Po procedurze transfekcji obserwowano gwałtownie zmniejszoną żywotność komórek łojowych traktowanych za pomocą pSVT przez cztery tygodnie. Zwłaszcza jednak przy stosowaniu optymalnych ilości odczynnika LIPOFECTIN i pSVT-DNA następowało wynurzanie rozrastających kolonii komórek łojowych. Te komórki (SZ95) mogły być pasażowane aż do dzisiaj ponad 50 razy. Zarówno przedtem, jak i potem są one żywotne w ciągu czasu obserwacji wynoszącego 4,5 roku.
Przykład 2
Klonowanie unieśmiertelnionych ludzkich komórek łojowych
Unieśmiertelnione w ten sposób ludzkie komórki łojowe SZ95 posiewano na płytki hodowlane z 96 wgłębieniami w seryjnych rozcieńczeniach z geometrycznie malejącą liczbą komórek 1 x 102 komórek w pierwszej serii do osiągnięcia teoretycznie zera komórek w serii ostatniej (Zouboulis et al. w „Das maligne Melanom der Haut”, C. E. Orfanos i C. Garbe (redaktorzy), Zuckschwerdt, Monachium, Niemcy, 1990, 158-168). Komórki trzymano w standardowej pożywce hodowlanej, z 5 ng/ml EGF i 3 ng/ml KGF. Wzrastające komórki traktowano jako klony, jeżeli pochodziły od pojedynczej komórki na wgłębienie płytki, co można było zaobserwować drogą badań pod mikroskopem świetlnym. W ten sposób otrzymywano sklonowane komórki SZ95.
Przykład 3
Charakterystyka unieśmiertelnionych ludzkich komórek łojowych
Wykrywanie dużego antygenu T z SV-40
Ekspresję dużego antygenu T z SV-40 w unieśmiertelnionych komórkach łojowych wykrywano drogą immunocytochemiczną i za pomocą analizy hybrydyzacji typu Western z zastosowaniem
PL 194 865 B1 monoklonalnego, przeciwludzkiego przeciwko dużemu antygenowi T z SV-40 z surowicy krwi myszy (Oncogene Science, Cambridge, MA, USA), które do analizy immunocytochemicznej rozcieńczono do 1:1000, a do analizy hybrydyzacji typu Western rozcieńczono do 1:100. Do porównania stosowano ludzkie, normalne naskórkowe keratynocyty, fibroblasty skóry i, jako kontrolę pozytywną, komórki nabłonkowe HMEC-1, unieśmiertelnione dużym antygenem T z SV-40 (patrz WO-A-82/17569).
Badanie immunocytochemiczne unieśmiertelnionych komórek łojowych według Przykładu 1 z przeciwciałem monoklonalnym przeciwko dużemu antygenowi T z SV-40 wykazało silne zabarwienie, przeważnie jądrowe, a częściowo także cytoplazmatyczne (patrz Fig. 2a). Normalne keratynocyty i fibroblasty były w równym stopniu ujemne względem dużego antygenu T z SV-40, a komórki HMEC-1, jako kontrola pozytywna, wykazywały przeważnie jądrowe, a częściowo także cytoplazmatyczne zabarwienie dla dużego antygenu T z SV-40 (patrz Fig. 2b).
Na Fig. 2c przedstawiono wyniki analizy hybrydyzacji typu Western ekspresji dużego antygenu T z SV-40 w nie poddanych transfekcji, normalnych ludzkich komórkach łojowych (tor 1), w normalnych ludzkich, naskórkowych keratynocytach (tor 2), w unieśmiertelnionych komórkach łojowych według wynalazku (34 subkultura, tor 3) oraz w różnych sklonowanych komórkach łojowych według wynalazku (tory 4, 5 i 6). Pasmo przy 94 kD wykrywano w przypadku linii unieśmiertelnionych komórek łojowych oraz ich klonów, co potwierdzało ekspresję dużego antygenu T z SV-40 (patrz Harlow et al., J. Virol. 1981,39:861-869).
Charakterystyka fenotypowa unieśmiertelnionych komórek łojowych według wynalazku
Morfologia unieśmiertelnionych komórek łojowych SZ95 według Przykładu 1 była nabłonkowa i odznaczała się objawem polimorficznym z komórkami o różnej wielkości, przy czym w cytoplazmie można było obserwować liczne kropelki (patrz Fig. 1b i c).
Badania immunocytochemiczne z odpowiednimi przeciwciałami dawały w przypadku unieśmiertelnionych komórek łojowych według wynalazku pozytywny wynik względem antygenu gruczołów łojowych, w przeciwieństwie do normalnych naskórkowych keratynocytów, których nie barwiono za pomocą przeciwciała monoklonalnego względem antygenu gruczołów łojowych (patrz Fig. 3). Na Fig. 3 przedstawiono wyniki badań immunocytochemicznych na preparatach komórkowych z wirowania (a) unieśmiertelnionych komórek łojowych według wynalazku i (b) normalnych ludzkich naskórkowych keratynocytów. Preparaty były zabarwione z użyciem przeciwciała monoklonalnego względem antygenu gruczołów łojowych. O ile unieśmiertelnione komórki łojowe według wynalazku wykazywały pozytywne zabarwienie cytoplazmatyczne, to normalne, ludzkie, naskórkowe keratynocyty nie były zabarwione.
Poza tym za pomocą analizy hybrydyzacji typu Western wykrywano w unieśmiertelnionych komórkach łojowych ekspresję keratyny 7, 13 i 19 oraz kilku białek ludzkiej, polimorficznej, nabłonkowej grupy mucyn, natomiast ludzkie keratynocyty dawały ekspresję tylko keratyny 13 (patrz Fig. 4). W przypadku analizy hybrydyzacji typu Western według Fig. 4 nanoszono wyekstrahowaną całkowite białko unieśmiertelnionych komórek łojowych według wynalazku (34 subkultura, tor 1), różnych sklonowanych, unieśmiertelnionych komórek łojowych według wynalazku (tor 2, 3 i 4) oraz normalnych ludzkich, naskórkowych keratynocytów (tor 5), a mianowicie w celu identyfikacji ekspresji ludzkiej, nabłonkowej sialomucyny (ESM, >400 kD), ludzkiej globuliny 1 z tłuszczu mleka (HMFG-1, 400 kD), ludzkiej globuliny 2 z tłuszczu mleka (HMFG-2, 80-400 kD), mucynopodobnego antygenu związanego z rakiem (MCA, 350 kD), nabłonkowego antygenu błonowego (EMA, 250-400 kD), antygenu Thomsena-Friedenreicha (antygen TF, 155 kD), keratyny 7 (54 kD), keratyny 13 (54 kD), keratyny 19 (40 kD) oraz reduktazy 5a typu 1 (5a-red. 1,21-27 kD). Linia unieśmiertelnionych komórek według wynalazku oraz jej klony dawały ekspresję wszystkich badanych protein, natomiast keratynocyty dawały ekspresję tylko keratyny 13 i reduktazy 5a typu 1.
Synteza lipidów.
Barwienie za pomocą czerwieni „nil” i ocena za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej wykazały obecność lipidów w cytoplazmie. W unieśmiertelnionych komórkach łojowych SZ95 według wynalazku (patrz Fig. 5), które barwiono barwnikiem fluorescencyjnym czerwień „nil” ukierunkowanym na obojętne lipidy, pojawiły się pojedyncze albo występujące w grupach kropelki lipidów, które były dowolnie rozdzielone w cytoplazmie komórek łojowych. Unieśmiertelnione komórki łojowe według wynalazku zmniejszały swoją zawartość od 510 jednostek fluorescencyjnych na komórkę (wartość średnia) w pożywce zawierającej surowicę do 429 jednostek fluorescencyjnych na komórkę (wartość średnia, to jest minus 16%) w pożywce nie zawierającej surowicy, co wykrywano drogą badań fluorescencyjno-cytometrycznych komórek zabarwionych czerwienią „nil”.
PL 194 865 B1
Unieśmiertelnione komórki łojowe według wynalazku z Przykładu 1 syntezowały kilka frakcji obojętnych lipidów, wśród nich typowo lipidy gruczołów łojowych, skwalen i estry wosku, oraz triglicerydy, cholesterol, estry cholesterolu, diglicerydy, lanosterol i wolne kwasy tłuszczowe.
Obserwowano to poprzez 25 do 40 subkultur i jest to pokazane na Fig. 6, na której lipidy frakcjonowane drogą chromatografii HPLC, po przyjęciu impulsu promieniotwórcze znakowanego octanu sodowego, wykrywano drogą radiometrycznej oceny obrazu przy dwóch hodowlach wybranych, unieśmiertelnionych i sklonowanych komórek łojowych (patrz tory 3 i 4 względnie 5 i 6). Jak pokazują tory 3, 4 i 5, komórki syntezują kilka frakcji obojętnych lipidów, wśród nich skwalen (Sq), estry woskowe (WE) oraz triglicerydy (Tg), cholesterol (Cho), estry cholesterolu (ChE), diglicerydy (Dg), lanosterol (Lan) i wolne kwasy tłuszczowe (FFA). Wszystkie obojętne lipidy odnajdywano także, w mniejszym stopniu, w pozakomórkowych klarownych cieczach (patrz tor 6). W celu porównania w torze 1 nanoszono wzorce lipidów, w torze 2 ludzki łój, a w torze 4 wolne kwasy tłuszczowe, które wyekstrahowano z komórek. Jako dalsze porównanie tory 7 i 8 pokazują wyniki dla keratynocytów, przy czym tor 7 wskazuje na obecność w komórkach głównie cholesterolu i triglicerydów, natomiast w klarownej cieczy (tor 8) stwierdzano przeważnie cholesterynę.
Badania proliferacji komórek
Logarytmiczny wzorzec proliferacji unieśmiertelnionych komórek łojowych według wynalazku wykrywano w normalnych warunkach hodowli z czasami podwojenia populacji 52,4 ± 1,6 niezależnie od początkowych gęstości komórek w kulturze. W tym celu na Fig. 7 przedstawiono proliferację linii unieśmiertelnionych, sklonowanych komórek łojowych (SZ95) w ciągu 18 dni w pożywce dla komórek łojowych.
Proliferacja unieśmiertelnionych komórek łojowych była mniejsza po dodaniu pożywki wolnej od surowicy, przy czym został on jednak ponownie podniesiony po dodaniu 5a-DHT. Pokazane jest to na Fig. 8 dla przykładowego klonu łojowego, przy czym obserwowano proliferację komórek (wysiew 2000 na wgłębienie płytki) przez 18 dni w pożywce wolnej od surowicy (kontrola) oraz w pożywce wolnej od surowicy, z 106 M 5a-DHT. Po 8 dniu 5a-DHT zwiększał znacznie proliferację komórek, co odbiło się na ustalonym czasie podwojenia populacji komórek 136 godzin (kontrola) i 53,7 godziny (komórki potraktowane za pomocą 5a-DHT) (*, p<0,05, ** p<0,01).
Działanie retinoidów na unieśmiertelnione komórki pokazało różną reakcję zachowania się proliferacji komórek. O ile niektóre klony były hamowane przez retinoidy w czasie proliferacji (typowo o różnej sile w kolejności kwas 13-cis-retinowy > kwas retinowy o całkowitej konfiguracji trans » acytrecyna), to inne klony stymulowały w czasie proliferacji (na przykład kwas retinowy o całkowitej konfiguracji trans i 13-cis-kwas retinowy) zgodnie z reakcją proliferacji normalnych ludzkich, naskórkowych keratynocytów. Jest to pokazane na Fig. 9 (*, p, 0,05, **, p<0,01, ***, p<0,001).
0-1 0-1-1 Formularz-PCT/RO/134 (EASY) Wydawany w związku ze zdeponowanym mikroorganizmem i/lub innym zdeponowanym materiałem biologicznym, uzyskany w wyniku wykorzystywania PCT-EASY Wersja 2,90 (aktualizowana 15.10.1999)
0-2 Międzynarodowy numer akt PCT/EP99/09988
0-3 Numer akt Zgłaszającego lub rzecznika patentowego WO 25933
1 Niniejsze dane dotyczą mikroorganizmu i/lub
1-1 innego materiału biologicznego, który został
1-2 wymieniony w opisie na
stronie 3
linii 32
PL 194 865 Β1 ciąg dalszy
1-3 1-3-1 1-3-2 1-3-3 1-3-4 Dane dotyczące depozytu Nazwa Instytucji Depozytowej Adres Instytucji Depozytowej Data zdeponowania Numer dostępu DSM-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig, Germany 25 stycznia 1999 (25.01.1999) DSMZ ACC2383
1-4 dalsze dane żadne
1-5 kraje należące, których dotyczą uwagi szczególne wszystkie kraje należące
1-6 dostarczone szczególne uwagi uwagi te zostaną przekazane później do Biura Międzynarodowego żadne
WYPEŁNIA URZĄD PRZYJMUJĄCY
0-4 Ten formularz wpłynął wraz ze zgłoszeniem międzynarodowym 15 grudnia 1999 (15.12.1999)
0-4-1 Upoważniony Urzędnik M. Legendre
WYPEŁNIA BIURO MIĘDZYNARODOWE
0-5 Ten formularz wpłynął do Biura Międzynarodowego w dniu
0-5-1 Upoważniony Urzędnik
Zastrzeżenia patentowe

Claims (31)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Unieśmiertelnione komórki łojowe pochodzenia ludzkiego uzyskiwane przez transfekcję komórek łojowych przy użyciu DNA, który oddziałuje na tworzenie stabilnych, nieaktywnych kompleksów z genami hamującymi proliferację, znamienne tym, że wykazują cechy prawidłowych, nietransfekowanych i różnicujących się komórek łojowych.
  2. 2. Komórki łojowe według zastrz. 1, znamienne tym, że stanowią komórki łojowe pochodzące z ludzkiego gruczołu łojowego.
  3. 3. Komórki łojowe według zastrz. 2, znamienne tym, że komórki łojowe pochodzące z ludzkiego gruczołu łojowego stanowią komórki łojowe pochodzące z ludzkiego gruczołu łojowego twarzy.
  4. 4. Komórki łojowe według zastrz. 1, znamienne tym, że stanowią linię komórkową.
  5. 5. Komórki łojowe według zastrz. 1, znamienne tym, że wykazują ekspresję dużego antygenu T z SV-40.
  6. 6. Komórki łojowe zastrz. 1, znamienne tym, że ich proliferacja modyfikowana jest przez androgeny i/lub retinoidy.
  7. 7. Komórki łojowe według zastrz. 1, znamienne tym, że stanowią komórki klonowane.
  8. 8. Zastosowanie unieśmiertelnionych komórek łojowych jak określono w zastrz. 1, do wytwarzania leku lub preparatu do celów diagnostycznych, terapeutycznych lub kosmetycznych.
  9. 9. Zastosowanie unieśmiertelnionych komórek łojowych jak określono w zastrz. 1, do wytwarzania leku lub preparatu do badania fizjologii lub patofizjologii ludzkich lub zwierzęcych gruczołów łojowych.
    PL 194 865 B1
  10. 10. Zastosowanie unieśmiertelnionych komórek łojowych jak określono w zastrz. 1, do wytwarzania leku Inb preparato Os baOnnia psworawania OrąOaiOn i/lnb łsjsrsOn i/lnb innych hhsrób.
  11. 11. Zastonowysie komóreśłojowych wakłun zastrz. 10,znamienaatym. że i nnn chc>jeSb, stonswią hhsrsbc okórc w krórcch sOgtcwa rslę fnnkcja grnhasłów łsjswchh.
  12. 12. Zastonowysie uniekmiertolnionych Κοπίδι łojowych j oS ο^ι^ο w z^^tr^. 1, do ν^ν^raania lekn Inb prepararn Os rkorswania związków Inb śrsOków anty-rrąOaikswcch i/lnb anty-łsjsrskswcch.
  13. 13. Zastonowysie uniekmiertelnionych komórek Ζ^ον^^ j ak onreklono w zz-Coz. 1, do ν^ν>^raania lekn lnb prepararn Os ekoeswania awiąaków lnb śrsOków Os lecaenia chsrób.
  14. 14. Zastonowysie komórek łojawych w^ś^^u z^str^. 11, znamienna tym, Ze i nno zhojeSb ζΟοnswią chsrsbc okórc, w Oeótcch sOgrcwa rslę fnnkcja grncasłów łsjswcch.
  15. 15. Zastonowysie zniekmiertolnionoch Zomórek łojawych j oS ζ^ι^ο w z^str^. 1 Zo izsawis^J prsoekgs lnb OsmpIkOoswkgs ocoremn Onl·tnr ksmórkswcch.
  16. 16. Zastonowyrιie uniekmiertolnionnch łojawych ł oS o^oc^^Ic^s^o» w zastrz. 1, do ν^ν^raania lekn lnb prepararn Os wcrwaraania lnb sOrwaraania erójwcmiarswcch nkłaOów ksmórkswcch, lnb Osnoernswania οΟ^Ο^ srganspsOsbncch.
  17. 17. Zastonowysie unieśmiertelniokomórek łojawych j oS 0^1^0 w z^^te^. 1, do raania lekn lnb prepararn Os wyewaraania prsOnkrów pschsOaąccch a tych Osmórek.
  18. 18. Zastonowykiewyełuu zastiz. 11, znamienaatym. że zroScMy Zomóreowystakowią i ipido. plaamiOc, wekOsrc, białka, króre oą ekopreojsnswane praea ksmórki, i/lnb oekwencje DNA lnb RNA tych białek.
  19. 19. Z^^te^sc^s^^r^^^ uniekmiertolnionoch komórek 1ο(ο\λ^^ j ok oSreeioso w z^^te^. 1, do raania lekn lnb prepararn Os msOcfikswania inncch ksmórek lnb msOcfikswania srganiamów nie bęOąccch całswiekiem.
  20. 20. Linia ksmórkswa lnOakich ksmórek łsjswcch DSM ACC2383.
  21. 21. Zastonowykie i ino Zomóreowyr i zUoZOjc Zomórekłojawych DDM ACC2238, Zowytwyreakia lekn lnb prepararn Os celów Oiagnsotycancch, rerapentycancch lnb ksometycancch.
  22. 22. Zastonowykie i ino Zomóreowei i uUoZich Zonm>rek łojawych DDM ACC2238,dowytwyreakia lekn lnb prepararn Os baOania fiajslsgii lnb parsfiajslsgii lnOakich lnb awieraęccch grncasłów łsjswcch.
  23. 23. Zastonowykie i ino Zomóreowei i uUoZich Zonm>rek łojawych DDM ACC2238,dowytwyreakia lekn lnb prepararn Os baOania psworawania rrąOaikn i/lnb łsjsrskn i/lnb inncch chsrób.
  24. 24. Z^ktc^sc^s^^k^^ i ino Zomóreowyrwyełuu zastrz. Z2, znamienaa tym, Ze i nno zhoseSb ζΟειηοwią chsrsbc okórc, w krótych sOgrcwa rslę fnnkcja grncasłów łsjswcch.
  25. 25. Zastonowysie i ino Zomóreowei i uUoZich Zomórekłojawych DDM ACC22SS, Zo wytwysrasia lekn lnb prepararn Os reorswania awiąaków lnb śrsOków anty-rrąOaikswcch i/lnb anty-łsjsrskswcch.
  26. 26. Zastonowysie i ino Zomóreowei i uUoZich Zonm>rek łojawych DDM ACC2238,dowytwyreasia lekn lnb prepararn Os reorswania awiąaków lnb śrsOków Os lecaenia chsrób.
  27. 27. Z^ktc^sc^s^^k^^ i ino Zomóreowyrwyełuu zastrz. Z2, znamienaa tym, Ze i nno iłioroSb ζΟειηοwią chsrsbc okórc, w krórcch sOgrcwa rslę fnnkcja grncasłów łsjswcch.
  28. 28. Zastonowyrιie i ino Zomóreowei i uno^Ozrc Zomórek łojawych DDM ACC2338 Zo 1eswyja preoregs lnb ksmplekoswegs ocoremn knlrnr ksmórkswcch.
  29. 29. Zastonowykie i ino Zomóreowyr i uUoZich Zomórek łojawych DDM ACC2238, Zowytwyreakia lekn lnb prepararn Os wcrwaraania lnb sOrwaraania rrójwcmiarswcch nkłaOów ksmórkswcch, lnb ksnorrnswania orrnkrnr srganspsOsbncch.
  30. 30. Zastonowykie i ino Zomóreowyr i unoazjc Zomórekłojawych DDM ACC2238, Zowytwyreakia lekn lnb prepararn Os wcrwaraania prsOnkrów pschsOaąccch a tych ksmórek.
  31. 31. Zastonowyrιie w^e^^^n zastrz. Z3, znamienaa tym, Ze zreSuUty Zomóreowy ztasowią i plaamiOc, wektory, białka, króre oą ekopreojsnswane praea ksmórki, i/lnb oekwencje DNA lnb RNA tych białek.
PL350191A 1999-02-01 1999-12-15 Unieśmiertelnione komórki łojowe pochodzenia ludzkiego i ich zastosowania oraz linia komórkowa ludzkich komórek łojowych i jej zastosowania PL194865B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19903920A DE19903920B4 (de) 1999-02-01 1999-02-01 Sebozyten, Sebozyten-Zellinie und deren Verwendungen
PCT/EP1999/009988 WO2000046353A1 (de) 1999-02-01 1999-12-15 Sebozyten, sebozyten-zellinie und deren verwendungen

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL350191A1 PL350191A1 (en) 2002-11-18
PL194865B1 true PL194865B1 (pl) 2007-07-31

Family

ID=7896032

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL350191A PL194865B1 (pl) 1999-02-01 1999-12-15 Unieśmiertelnione komórki łojowe pochodzenia ludzkiego i ich zastosowania oraz linia komórkowa ludzkich komórek łojowych i jej zastosowania

Country Status (14)

Country Link
US (5) US20020034820A1 (pl)
EP (1) EP1151082B1 (pl)
JP (1) JP4514963B2 (pl)
KR (1) KR100689120B1 (pl)
CN (1) CN100366735C (pl)
AT (1) ATE319813T1 (pl)
AU (1) AU770518B2 (pl)
CA (1) CA2360762C (pl)
DE (2) DE19903920B4 (pl)
DK (1) DK1151082T3 (pl)
HU (1) HU226915B1 (pl)
IL (2) IL144683A0 (pl)
PL (1) PL194865B1 (pl)
WO (1) WO2000046353A1 (pl)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10141443B4 (de) * 2001-08-23 2007-02-01 Christos C. Prof. Dr. Zouboulis Verwendung von molekularbiologisch hergestellten, nicht-viralen Wirkstoffen zur Behandlung der Akne
FR2960549B1 (fr) * 2010-05-25 2015-06-19 Univ Paris Curie Procede de culture d'adipocytes
CN102668885B (zh) * 2012-05-30 2013-06-05 北京市农林科学院 一种黄伞新菌株及其子实体栽培方法
DE102013015560A1 (de) 2013-09-20 2015-03-26 Cutech Srl. Ex vivo Kulturen auf Basis humaner Talgdrüsen und deren Verwendung als Screening Werkzeug
CN107241908B (zh) * 2016-02-08 2021-02-26 花王株式会社 成熟皮脂腺细胞的制造方法
WO2017163391A1 (ja) 2016-03-25 2017-09-28 花王株式会社 皮脂腺又は毛包選択的アンドロゲン受容体活性制御剤の評価又は選択方法
EP3284817A1 (en) * 2016-08-18 2018-02-21 Phenocell Human sebocyte precursor cells, human sebocytes and in vitro methods for obtaining the same from human induced pluripotent stem cells (hipsc)
FR3061205A1 (fr) * 2016-12-22 2018-06-29 L'oreal Modele d'epithelium reconstruit sebocytaire differencie a partir de sebocytes humains primaires
CN109852576A (zh) * 2019-01-07 2019-06-07 施歌 一种永生化皮脂腺细胞株的构建方法
CN111088217B (zh) * 2019-12-20 2023-03-03 广东博溪生物科技有限公司 细胞培养基、细胞培养试剂盒及细胞培养方法
CN112608947B (zh) * 2020-12-28 2023-06-16 上海市皮肤病医院 一种永生化人皮脂腺细胞系的构建方法及其应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU1765992A (en) * 1991-04-04 1992-11-02 Emory University Immortalization of human endothelial cells
AU4233297A (en) * 1996-08-23 1998-03-06 Arch Development Corporation Identification of activators and inhibitors of sebum formation
IT1293484B1 (it) * 1997-06-11 1999-03-01 Fidia Advanced Biopolymers Srl Materiale biologico comprendente una efficiente coltura di cellule e una matrice tridimensionale biocompatibile e biodegradabile

Also Published As

Publication number Publication date
IL144683A (en) 2008-04-13
CA2360762A1 (en) 2000-08-10
HUP0200048A3 (en) 2006-02-28
US20120225445A1 (en) 2012-09-06
AU1980400A (en) 2000-08-25
JP2002535984A (ja) 2002-10-29
ATE319813T1 (de) 2006-03-15
DE59913210D1 (de) 2006-05-04
CN1344314A (zh) 2002-04-10
EP1151082A1 (de) 2001-11-07
CA2360762C (en) 2009-01-27
HU226915B1 (en) 2010-03-01
US20110065142A1 (en) 2011-03-17
AU770518B2 (en) 2004-02-26
DE19903920A1 (de) 2000-08-10
KR100689120B1 (ko) 2007-03-09
PL350191A1 (en) 2002-11-18
IL144683A0 (en) 2002-06-30
JP4514963B2 (ja) 2010-07-28
CN100366735C (zh) 2008-02-06
US20020034820A1 (en) 2002-03-21
KR20020013495A (ko) 2002-02-20
US20160237406A1 (en) 2016-08-18
DK1151082T3 (da) 2006-04-10
WO2000046353A1 (de) 2000-08-10
HUP0200048A2 (hu) 2002-05-29
US20140120569A1 (en) 2014-05-01
EP1151082B1 (de) 2006-03-08
DE19903920B4 (de) 2005-08-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20160237406A1 (en) Sebocytes, sebocyte cell lines and applications thereof
Zouboulis et al. Establishment and characterization of an immortalized human sebaceous gland cell line (SZ95) 1
Blomhoff et al. Isolation and cultivation of rat liver stellate cells
Kreisberg et al. Renal cell culture
Galfi et al. Influences of extracellular matrix components on the growth and differentiation of ruminal epithelial cells in primary culture
Sinensky Isolation of a mammalian cell mutant resistant to 25-hydroxy cholesterol
Jung et al. an optimized method to isolate, purify, and differentiate satellite cells from broiler chicks
Lash Phenotypic expression and differentiation: in vitro chondrogenesis
FLYNN et al. Growth and differentiation of primary cultures of mouse mammary epithelium embedded in collagen gel
Blair et al. Isolation and characterization of biliary epithelial cells from rainbow trout liver
US8735151B2 (en) Spontaneously contracting fish cell aggregates, use thereof and method for the production thereof
EP1747459A1 (de) Multizelluläre testsysteme
Neville et al. Morphogenesis and secretory activity of mouse mammary cultures on EHS biomatrix
Abdel‐Naser Selective cultivation of normal human sebocytes in vitro; a simple modified technique for a better cell yield
Hayes Jr The maturation of cortisone-treated embryonic duodenum in vitro. II. The striated border
Karam et al. Characterization of the rabbit gastric epithelial lineage progenitors in short-term culture
Echeverría et al. A rapid method for the isolation and culture of endometrial epithelial cells responsive to estradiol
Chailler et al. A new approach to primary culture of human gastric epithelium
JP4511929B2 (ja) バイオミメティック尿路上皮
Hasegawa et al. Establishment of pulmonary alveolar type II cell line from p53-deficient mice
Anderson et al. In vitro stimulation by prostate extracts of rat ventral prostate stromal and epithelial cell division
Sands et al. Medium calcium concentration determines keratin intermediate filament density and distribution in immortalized cultured thymic epithelial cells (TECs)
Shin et al. The effects of fetal bovine serum, epidermal growth factor, and retinoic acid on adult rat islets embedded in collagen gels
Geehan Morphological And Cytochemical Characterization Of Rat Adrenocortical Cells in vitro
Verma The development of a human cell culture assay for skin tumour promoters