HU226915B1 - Sebocytes, sebocyte cell lines and applications thereof - Google Patents
Sebocytes, sebocyte cell lines and applications thereof Download PDFInfo
- Publication number
- HU226915B1 HU226915B1 HU0200048A HUP0200048A HU226915B1 HU 226915 B1 HU226915 B1 HU 226915B1 HU 0200048 A HU0200048 A HU 0200048A HU P0200048 A HUP0200048 A HU P0200048A HU 226915 B1 HU226915 B1 HU 226915B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- sebum
- producing cells
- human
- cells
- sebum producing
- Prior art date
Links
- 210000004378 sebocyte Anatomy 0.000 title description 3
- 210000002374 sebum Anatomy 0.000 claims description 146
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 26
- 210000001732 sebaceous gland Anatomy 0.000 claims description 25
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 22
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 20
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 15
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 13
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 11
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 10
- 208000002874 Acne Vulgaris Diseases 0.000 claims description 9
- 206010000496 acne Diseases 0.000 claims description 9
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 9
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 5
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 claims description 5
- 206010039792 Seborrhoea Diseases 0.000 claims description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 4
- 230000007310 pathophysiology Effects 0.000 claims description 4
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 claims description 4
- 208000008742 seborrheic dermatitis Diseases 0.000 claims description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000003098 androgen Substances 0.000 claims description 2
- 229940030486 androgens Drugs 0.000 claims description 2
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 claims description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 215
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 15
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 11
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 10
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 10
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 10
- 101710128836 Large T antigen Proteins 0.000 description 9
- 210000005175 epidermal keratinocyte Anatomy 0.000 description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 description 7
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 7
- VOFUROIFQGPCGE-UHFFFAOYSA-N nile red Chemical compound C1=CC=C2C3=NC4=CC=C(N(CC)CC)C=C4OC3=CC(=O)C2=C1 VOFUROIFQGPCGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000021588 free fatty acids Nutrition 0.000 description 6
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 6
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 6
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 6
- 101100289792 Squirrel monkey polyomavirus large T gene Proteins 0.000 description 5
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000003972 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 description 4
- 108090000385 Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 description 4
- SHGAZHPCJJPHSC-NUEINMDLSA-N Isotretinoin Chemical compound OC(=O)C=C(C)/C=C/C=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-NUEINMDLSA-N 0.000 description 4
- 102100040487 Keratin, type I cytoskeletal 13 Human genes 0.000 description 4
- 108010065070 Keratin-13 Proteins 0.000 description 4
- 239000004164 Wax ester Substances 0.000 description 4
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 150000001840 cholesterol esters Chemical class 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 4
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 4
- 229960005280 isotretinoin Drugs 0.000 description 4
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 4
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 4
- 235000019386 wax ester Nutrition 0.000 description 4
- BALLJDWBMKIZEF-FSPLSTOPSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-acetamidopropanoyl]amino]-5-amino-5-oxopentanoic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O BALLJDWBMKIZEF-FSPLSTOPSA-N 0.000 description 3
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 description 3
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 3
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000007298 Mucin-1 Human genes 0.000 description 3
- 108010008707 Mucin-1 Proteins 0.000 description 3
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 3
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 3
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 description 3
- 210000004251 human milk Anatomy 0.000 description 3
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 3
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 3
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 3
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003760 tallow Substances 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- NVKAWKQGWWIWPM-ABEVXSGRSA-N 17-β-hydroxy-5-α-Androstan-3-one Chemical compound C1C(=O)CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CC[C@H]21 NVKAWKQGWWIWPM-ABEVXSGRSA-N 0.000 description 2
- LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 2,3-bis[(z)-octadec-9-enoxy]propyl-trimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCOCC(C[N+](C)(C)C)OCCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC LDGWQMRUWMSZIU-LQDDAWAPSA-M 0.000 description 2
- JRHMPHMGOGMNDU-UHFFFAOYSA-N 2-(bromomethyl)-1-methoxy-4-nitrobenzene Chemical compound COC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1CBr JRHMPHMGOGMNDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 101710186901 Globulin 1 Proteins 0.000 description 2
- 101710186898 Globulin 2 Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 102100033420 Keratin, type I cytoskeletal 19 Human genes 0.000 description 2
- 102100023974 Keratin, type II cytoskeletal 7 Human genes 0.000 description 2
- 108010066302 Keratin-19 Proteins 0.000 description 2
- 108010070507 Keratin-7 Proteins 0.000 description 2
- SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N N-acetyl-beta-neuraminic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 102000012010 Sialomucins Human genes 0.000 description 2
- 108010061228 Sialomucins Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 235000010724 Wisteria floribunda Nutrition 0.000 description 2
- 229960005339 acitretin Drugs 0.000 description 2
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 2
- IHUNBGSDBOWDMA-AQFIFDHZSA-N all-trans-acitretin Chemical compound COC1=CC(C)=C(\C=C\C(\C)=C\C=C\C(\C)=C\C(O)=O)C(C)=C1C IHUNBGSDBOWDMA-AQFIFDHZSA-N 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 2
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 2
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- CAHGCLMLTWQZNJ-RGEKOYMOSA-N lanosterol Chemical compound C([C@]12C)C[C@@H](O)C(C)(C)[C@H]1CCC1=C2CC[C@]2(C)[C@H]([C@H](CCC=C(C)C)C)CC[C@@]21C CAHGCLMLTWQZNJ-RGEKOYMOSA-N 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- 201000010879 mucinous adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000035778 pathophysiological process Effects 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 2
- 206010040882 skin lesion Diseases 0.000 description 2
- 231100000444 skin lesion Toxicity 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BQPPJGMMIYJVBR-UHFFFAOYSA-N (10S)-3c-Acetoxy-4.4.10r.13c.14t-pentamethyl-17c-((R)-1.5-dimethyl-hexen-(4)-yl)-(5tH)-Delta8-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren Natural products CC12CCC(OC(C)=O)C(C)(C)C1CCC1=C2CCC2(C)C(C(CCC=C(C)C)C)CCC21C BQPPJGMMIYJVBR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FOIAQXXUVRINCI-LBAQZLPGSA-N (2S)-2-amino-6-[[4-[2-[bis(carboxymethyl)amino]-3-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]propyl]phenyl]carbamothioylamino]hexanoic acid Chemical compound N[C@@H](CCCCNC(=S)Nc1ccc(CC(CN(CCN(CC(O)=O)CC(O)=O)CC(O)=O)N(CC(O)=O)CC(O)=O)cc1)C(O)=O FOIAQXXUVRINCI-LBAQZLPGSA-N 0.000 description 1
- CHGIKSSZNBCNDW-UHFFFAOYSA-N (3beta,5alpha)-4,4-Dimethylcholesta-8,24-dien-3-ol Natural products CC12CCC(O)C(C)(C)C1CCC1=C2CCC2(C)C(C(CCC=C(C)C)C)CCC21 CHGIKSSZNBCNDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QYIXCDOBOSTCEI-QCYZZNICSA-N (5alpha)-cholestan-3beta-ol Chemical compound C([C@@H]1CC2)[C@@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]2(C)CC1 QYIXCDOBOSTCEI-QCYZZNICSA-N 0.000 description 1
- XYTLYKGXLMKYMV-UHFFFAOYSA-N 14alpha-methylzymosterol Natural products CC12CCC(O)CC1CCC1=C2CCC2(C)C(C(CCC=C(C)C)C)CCC21C XYTLYKGXLMKYMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FPTJELQXIUUCEY-UHFFFAOYSA-N 3beta-Hydroxy-lanostan Natural products C1CC2C(C)(C)C(O)CCC2(C)C2C1C1(C)CCC(C(C)CCCC(C)C)C1(C)CC2 FPTJELQXIUUCEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NVKAWKQGWWIWPM-MISPCMORSA-N 5beta-dihydrotestosterone Chemical compound C1C(=O)CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CC[C@@H]21 NVKAWKQGWWIWPM-MISPCMORSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 238000000035 BCA protein assay Methods 0.000 description 1
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 1
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- 241000409898 Empodisma minus Species 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- BKLIAINBCQPSOV-UHFFFAOYSA-N Gluanol Natural products CC(C)CC=CC(C)C1CCC2(C)C3=C(CCC12C)C4(C)CCC(O)C(C)(C)C4CC3 BKLIAINBCQPSOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylethanolamin Natural products NCCOP(O)(=O)OCC(O)CO JZNWSCPGTDBMEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 1
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- LOPKHWOTGJIQLC-UHFFFAOYSA-N Lanosterol Natural products CC(CCC=C(C)C)C1CCC2(C)C3=C(CCC12C)C4(C)CCC(C)(O)C(C)(C)C4CC3 LOPKHWOTGJIQLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100034256 Mucin-1 Human genes 0.000 description 1
- 102000001621 Mucoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010093825 Mucoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- UFWIBTONFRDIAS-UHFFFAOYSA-N Naphthalene Chemical compound C1=CC=CC2=CC=CC=C21 UFWIBTONFRDIAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- CAHGCLMLTWQZNJ-UHFFFAOYSA-N Nerifoliol Natural products CC12CCC(O)C(C)(C)C1CCC1=C2CCC2(C)C(C(CCC=C(C)C)C)CCC21C CAHGCLMLTWQZNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000272534 Struthio camelus Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-NJFSPNSNSA-N acetic acid Chemical compound [14CH3]C(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- QYIXCDOBOSTCEI-UHFFFAOYSA-N alpha-cholestanol Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(C)CCCC(C)C)C1(C)CC2 QYIXCDOBOSTCEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003473 androstanolone Drugs 0.000 description 1
- 230000003255 anti-acne Effects 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- -1 cationic lipid Chemical class 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000036978 cell physiology Effects 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000012303 cytoplasmic staining Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- QBSJHOGDIUQWTH-UHFFFAOYSA-N dihydrolanosterol Natural products CC(C)CCCC(C)C1CCC2(C)C3=C(CCC12C)C4(C)CCC(C)(O)C(C)(C)C4CC3 QBSJHOGDIUQWTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000012202 endocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000001815 facial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000011990 functional testing Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000000762 glandular Effects 0.000 description 1
- 210000003780 hair follicle Anatomy 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 210000001821 langerhans cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940058690 lanosterol Drugs 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- QCQYVCMYGCHVMR-AAZUGDAUSA-N n-[(2r,3r,4s,5r)-4,5,6-trihydroxy-1-oxo-3-[(2r,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyhexan-2-yl]acetamide Chemical compound CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)CO)O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O QCQYVCMYGCHVMR-AAZUGDAUSA-N 0.000 description 1
- IPSIPYMEZZPCPY-UHFFFAOYSA-N new fuchsin Chemical compound [Cl-].C1=CC(=[NH2+])C(C)=CC1=C(C=1C=C(C)C(N)=CC=1)C1=CC=C(N)C(C)=C1 IPSIPYMEZZPCPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000010422 painting Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001991 pathophysiological effect Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 150000008104 phosphatidylethanolamines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 239000001044 red dye Substances 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 150000004492 retinoid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 150000003421 squalenes Chemical class 0.000 description 1
- 238000012289 standard assay Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000003860 topical agent Substances 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/16—Animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
- C12N5/0633—Cells of secretory glands, e.g. parotid gland, salivary glands, sweat glands, lacrymal glands
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/08—Antiseborrheics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/10—Anti-acne agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
- A61Q19/00—Preparations for care of the skin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0653—Adipocytes; Adipose tissue
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/62—Carboxylic acid esters
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
- C12N2501/305—Growth hormone [GH], aka. somatotropin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
- C12N2501/33—Insulin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
- C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
- C12N2501/395—Thyroid hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
- C12N2503/02—Drug screening
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
- C12N2510/04—Immortalised cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
A találmány a bőr és nyálkahártya zsírtartalmú és faggyútermelő sejtjeire (Sebozyten; adipose cells; sebocytes) vonatkozik. A találmány főképpen faggyúmirigysejtekre és egy olyan faggyúmirigy-sejtvonalra vonatkozik, amelynek az a tulajdonsága, hogy sok szubkultúrán át tovább tenyészthető. A faggyútermelő sejtek kiválóan megfelelnek hasznos alkalmazásoknál, például az emberi vagy az állati faggyúmirigy fiziológiájának és patofiziológiájának vizsgálatára, az akne (pattanás), a seborrhoea, illetve más megbetegedések vizsgálatára, különböző anyagok és gyógyszerek hatásának tesztelésére, kétdimenziós vagy háromdimenziós sejthalmazok kifejlesztésére, valamint szervazonos struktúrák szerkesztésére és olyan termékek előállítására, amelyek ezekből a sejtekből származnak.
Egyre több előjel mutat arra, hogy a faggyútermelő sejtek meghatározó szerepet játszanak a patofiziológiás folyamatokban és a faggyúmirigy-szőrzetapparátus betegségeiben, főképpen az akne esetében [Gollnick et al., J. Dermatol., 18, 489-499 (1999); Brown and Shalita, Láncét, 351, 1871-1876 (1998); Cunliffe, Dermatology, 196, 9-15 (1998); Strauss, Dermatology, 196, 182-184 (1998)]. A faggyúmirigy fiziológiájával és patofiziológiájával kapcsolatos ismereteink nagy része kísérleti állatmodellekből származik [Poehi közlése a „Models in Dermatology” című kiadványban; 2. kötet, 70-75 oldal, szerk.: N. Lowe és H. Maibach, Bázel (1985)]. Azonban azt találták, hogy az állatmodellek az akne elleni gyógyszerek hatásának megítélésére nem adnak értelmezhető prognózist [Geiger, Dermatology, 191, 305-310 (1995)] embereknél. Az a tény, hogy az akne egyedül embereknél lép fel és hogy a faggyúmirigy szekréciós aktivitása erősen fajspecifikus [Nikkari, J. Invest. Dermatol., 257-267 (1974)], embermodellek kereséséhez vezetett. Ezen hátrányok kiküszöböléséhez a kezdeti vizsgálatokat emberi bőrminták segítségével végezték, amelyeket vagy in vitro inkubáltak [Hsia et al., Proc. Soc. Exp. Bioi. Med., 135, 285-291 (1970); Cooper et al., Br. J. Dermatol., 94, 165-172 (1976); Sharp et al., J. Endocrinol., 70, 491-499 (1976)], vagy csupasz egerekre transzplantáltak [Petemen et al., J. Clin. Invest., 74, 1358-1365 (1984)]. Az emberi faggyútermelő sejtek aktivitására, valamint ennek szabályozására vonatkozó alapvető vizsgálatokra azonban először az elmúlt évtizedben nyílt lehetőség, amikor életképes emberi faggyúmirigyeket izoláltak [Kealey et al., Br. J. Dermatol., 114, 181-188 (1986)] és amikor az emberi faggyútermelő sejtek in vitro tenyésztési modelljét kidolgozták [Xia et al., J. Invest. Dermatol., 93, 315-321 (1989],
A múlt év folyamán a tenyésztési technika módosításai révén Xia és munkatársai (1989) javulást értek el a faggyútermelő sejtek in vitro tenyésztésének reprodukálhatóságát illetően. így Zouboulis és munkatársai [Skin. Pharmacol., 4, 74-83 (1991] elálltak a hidrokortizon alkalmazásától a táptalajban, emberi szérum hozzáadása révén. Lee [Epithelie: Advances in Cell Physiology and Cell Culture; (C. J. Jones); szerk.: Kluwer, Dordrecht, 333-350 oldal (1990)] a faggyúmirigyeket kollagenázzal kezelte, mielőtt ezeket szérummentes táptalajban - amelyet adalék anyagokkal egészített ki tenyésztette. Ugyancsak fenn lehetett tartani primer faggyútermelő sejttenyészeteket, amelyekben a 3T3fibroblaszt-réteget, amely a tapadás alapjául szolgál, elhagyták [Akamatsu et al., J. Invest. Dermatol., 99, 509-511 (1992)]. Szekunder tenyészeteket olyan táptalajban tartottak fenn [Zouboulis et al., J. Invest. Dermatol., 101, 628-633 (1993)], amelyet zsírtalanított szérummal egészítettek ki, valamint szérummentes keratinocita alaptáptalajban (Basalmedium) kiegészítés nélkül [Akamatsu et al., J. Invest. Dermatol., 99, 509-511 (1992)]. Kimutatták továbbá, hogy a keratinocitanövekedési faktor (KGF) az emberi faggyútermelő sejtek kitermelését és proliferációját jelentékenyen javította [Chen et al., J. Invest. Dermatol., 110, 84-89 (1998)].
Ezen technikai javítások ellenére a további fejlődést az hátráltatta, hogy az izolált emberi faggyúmirigyekből származó faggyútermelő sejtek nagy számban való tenyésztése nehézkes. Különösen a sejtanyag hosszú ideig való tenyészetben tartása okozza a nehézséget. Feltételezzük, hogy ennek oka a faggyútermelő sejtek hajlama a differenciálódásra és hogy egy spontán sejtmembránrepedés és a sejtek tartalmának kiszabadulása folytán hajlamosak a pusztulásra. A legjobb eredményt eddig Fuji és munkatársai érték el [Arch. Dermatol., Rés., 288, 703-708 (1996)], akik a Xia és munkatársai (1989) szerinti technika alapján izolálták a faggyúmirigyeket és a faggyútermelő sejteket diszperziós sejttenyésztő módszerrel hat szubkultúrán át szérummentes, keratinocitanövekedést elősegítő táptalajban, tapadó sejtréteg nélkül tenyésztették.
A találmánynak az a feladata, hogy olyan emberi faggyútermelő sejteket állítson elő, amelyeket több szubkultúrán keresztül tenyésztésben lehet tartani. Az előállított faggyútermelő sejteknek megjelenésükben az élő, normál emberi faggyútermelő sejtek morfológiai, fenotípusos és működésbeli jellemző vonásaira kell hasonlítaniuk, illetve ezeket annyira megközelíteniük, hogy a zsírtartalmú, faggyútermelő sejtek és főként a faggyútermelő sejtek számára celluláris, illetve sejttenyésztési modellként fiziológiai, patofiziológiai és gyógyszerészeti vizsgálatokhoz jól alkalmazhatók legyenek.
A feladatot olyan faggyútermelő sejtek rendelkezésre bocsátásával oldjuk meg, amelyeket halhatatlanná tettünk és embertől származnak, és amelyek előállíthatok faggyútermelő sejtek olyan transzfekciójával, amelyet SV-40 nagy-T-proteinjét kódoló szekvenciát tartalmazó DNS-sel végzünk, és amelyek a normál, nem transzfektált és differenciálódó faggyútermelő sejtek ismertetőjegyeit viselik. Ilyenfajta faggyútermelő sejteket az SZ95 számú faggyúmirigysejtvonal tartalmaz, amelyet DSM ACC2383 letéti szám alatt a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH-nál (DSM) helyeztünk letétbe.
A találmányt a következő ábrák segítségével világítjuk meg közelebbről. Az 1. és a 2. ábrán látható, hogy az előállított, halhatatlan SZ95 faggyútermelő sejtek a primer normál faggyútermelő sejtek - ahonnan
HU 226 915 Β1 származnak (itt emberektől) - epiteliális, polimorf külsejét megtartották. Az előállított, halhatatlanná tett faggyútermelő sejtek és kiónjai (klón=olyan sejtek, amelyek bizonyosan egyetlen sejttől származnak) a jellemző, 94 kD SV-40-nagy-T-antigént - ennek kódoló DNS-szekvenciájával voltak transzfektálva - fejezik ki a későbbi szubkultúrákban is. Az 1a. ábra normál emberi faggyútermelő sejteket mutat a második szubkultúrából, amelyből az előállított, halhatatlanná tett faggyútermelő sejtek származnak. Az 1b. ábrán az előállított, halhatatlanná tett faggyútermelő sejtektől származó adherens faggyútermelő sejttenyészet látható az első szubkultúrában, az 1c. ábra előállított, halhatatlanná tett faggyútermelő sejteket mutat (egy klón 50. szubkultúrája). Minden sejt hasonlóan epiteliális, polimer struktúrát mutat. A 2a. ábra az előállított, halhatatlanná tett faggyútermelő sejtek citocentrifuga-készítményét mutatja, a 2b. ábrán a HMEC-1 endoteliális sejttenyészet látható - amely pozitív kontrollként szolgált -, amelyet egy emberi SV-40-nagy-T-antigén elleni monoklonális antitesttel festettünk meg. Mindkét preparátum pozitívan festődött és azt mutatják, hogy az emberi SV-40nagy-T-antigén főképpen a sejtmagban és részben a citoplazmában helyezkedik el. A 2c. ábrán az emberi SV-40-nagy-T-antigénnek az előállított, halhatatlanná tett faggyútermelő sejtekben való expressziójának Western biot módszerrel végzett kimutatását ábrázoljuk. Míg az emberi SV-40-nagy-T-antigén a nem transzfektált, normál emberi faggyútermelő sejteknél (1-es nyomsáv) és a normál emberi epidermális keratinocitáknál (2-es nyomsáv) nem volt kimutatható, a jellemző 94 kD proteint a 34. szubkultúrában előállított, halhatatlanná tett faggyútermelő sejtek (3-as nyomsáv), valamint három izolált klón (4-es, 5-ös, illetve 6-os nyomsáv) proteinextraktumaiban kimutattuk.
A találmány szerinti, halhatatlanná tett faggyútermelő sejtek emberi eredetűek. A „faggyútermelő sejtek” kifejezés jelentése a legtágabb értelemben értendő, azaz minden olyan sejtre vonatkozik, amelyek többé-kevésbé zsírt tartalmaznak és faggyút termelnek. A faggyú (sebum) túlnyomórészt különböző zsírokból áll. Tehát a sejtek zsírtartalma mind a zsírfrakciókat tekintve, mind a zsírfrakciók tartalmát tekintve, változhat. Rendszerint, de nem szükségszerűen, a sejtek zsírtartalma szabad zsírsavakat, triglicerideket, viaszokat, szkvaléneket, szabad koleszterint, koleszterin-észtert, dihidro-koleszterint és egyéb szteroidokat, valamint más szénhidrogéneket foglal magában. Különösen azokat a halhatatlanná tett faggyútermelő sejteket részesítjük előnyben, amelyek emberi faggyúmirigysejtekből származnak. Gyógyászati célokra különösen jó alkalmazást találnak az olyan faggyútermelő sejtek, amelyek emberi arc faggyúmirigy sejt eredetűek.
A találmány szerinti faggyútermelő sejtek lényeges jellemzőjét halhatatlanná tételük adja meg. A találmány értelmezése szerint a halhatatlan azt jelenti, hogy a sejtek számos szubkultúrán keresztül alapvetően megtartják életképességüket. A találmány szerinti SZ95 faggyútermelő sejteket az eddig eltelt megfigyelési idő alatt körülbelül négy és fél éven át, több mint szubkultúrán keresztül tenyésztésben tudtuk tartani, holott a normál emberi faggyútermelő sejtek csak
3-6 szubkultúrán keresztül tudnak növekedni, mielőtt elpusztulnak.
A találmány szerinti, halhatatlanná tett faggyútermelő sejtek előállíthatok úgy, hogy normál faggyútermelő sejteket olyan DNS-sel transzfektálunk, amely tartalmaz SV-40 eredetű nagy-T-proteint kódoló DNSszekvenciákat. Az SV-40-nagy-T-antigén (protein) halhatatlanságot biztosító hatása, valamint a kódolószekvencia megfelelő alkalmazása emberi sejtek transzfekciójára, ismert eljárás. így állítottak elő halhatatlanná tett sejtvonalakat egy SV-40 T kódoló DNS-sel való transzfekció révén epiteliális eredetű [lásd: Tohyama et al., Tohoku J. Exp. Med., 182, 75-82 (1997); Bacetal., Prostate, 34, 275-282 (1998)], valamint endoteliális eredetű [lásd: Ades et al., J. Invest. Dermatol., 99, 683-690 (1992); WO-A-92/17569 számon közzétett nemzetközi szabadalmi bejelentés] más sejtekből.
Kiderült, hogy a faggyútermelő sejtek transzfekciója kationos lipidek alkalmazásával [LIPOFECTIN reagens, amely a DOTMA (1,2-diolil-oxi-propil-3-trimetilammónium-klorid) és a DOPE (diolil-foszfatidil-etanolamin) 1:1 (tömeg/tömeg) arányú liposzomális formulázásával készül, membránon szűrt vízben (1 mg/ml)], egy olyan génátviteli módszer szerint, amelyben az idegen DNS-t kationos-lipid-DNS-komplexen keresztül a sejtek endocitózis révén felveszik [lásd: Wang et al., In Vitro Cell. Dev. Biok, 27A, 63-74 (1991); Staedel et al., J. Invest. Dermatol., 102, 768-772 (1994)]. A halhatatlanná tételnél jó eredményeket szolgáltatott, amikor a transzfekciós keverék a LIPOFECTIN reagensből előnyösen 0,25-2,0 térfogat%-ot és előnyösebben 2,0 térfogat%-ot és az idegen DNS-ből 0,05-0,5 tömeg%-ot és előnyösen 0,5 tömeg%-ot tartalmazott megfelelő transzfekciós pufferben. Az idegen DNS-t ilyen az SV-40-nagy-T-proteint kódoló DNS - rendszerint megfelelő vektorba építjük be, amelyben az SV-40-nagy-T-protein expresszióját promoter- és enhancerszekvenciák erősítik. Amennyiben a normál emberi faggyútermelő sejteket az előnyös kiviteli alakban azzal a DNS-sel transzfektáljuk, amely az SV-40nagy-T-antigént kódolja, akkor várható, hogy az előállított faggyútermelő sejtek az eredményes transzfekció és halhatatlanná tétel után, az SV-40 nagy-T-antigénjét fejezik ki. A találmány szerint előállított és halhatatlanná tett faggyútermelő sejteknél ezt immuncitokémiai módszerrel és Western biot analízissel, SV-40-nagy-Tantigén elleni monoklonális antitest alkalmazása segítségével igazoljuk.
Az így kapott, halhatatlanná tett faggyútermelő sejtek sejtvonal formában állnak rendelkezésre, és ilyen formában kiválóan használhatók alkalmazási célokra.
A találmány szerinti, halhatatlanná tett faggyútermelő sejtek szérummentes táptalajhoz való alkalmazkodásuk után jobban nőttek, mint a nem transzfektált normál emberi faggyútermelő sejtek, és fenntartották faggyúmirigy-specifikus lipidszintetizáló képességüket, a szérummentes táptalajban fenntartott, nem transzfektált normál emberi faggyútermelő sejtekkel ellentét3
HU 226 915 Β1 ben. A találmány szerinti faggyútermelő sejtek tehát állandóan megújítható és szaporodásra képes sejtvonalként szolgálhatnak és meghatározott táptalajokban növekedhetnek.
A találmány szerinti, halhatatlanná tett faggyútermelő sejtek különös értéke abban rejlik, hogy morfológiájuk, fenotípusuk és működőképességük tekintetében a nem transzfektált, normál és differenciálódó faggyútermelő sejtek jellegét mutatják. A találmány szerinti, halhatatlanná tett faggyútermelő sejtek ezáltal kiváló modellként kínálkoznak fiziológiai, patofiziológiai és farmakológiai vizsgálatokhoz. Egyidejűleg elkerüljük a hagyományos tenyészetben fenntartott, emberi eredetű normál faggyútermelő sejtek korlátolt életképességének hátrányát. Bizonyítani tudjuk, hogy a találmány szerinti, halhatatlanná tett faggyútermelő sejtek normális faggyútermelő sejt fenotípusukat messzemenően meg tudják tartani és működőképességük szempontjából hasonlóan tudnak viselkedni, mint az emberi arc nem transzfektált, normál faggyútermelő sejtjei.
Megállapítottuk, hogy a találmány szerinti, halhatatlanná tett faggyútermelő sejtek, illetve a faggyútermelő sejtvonalak (Sebozyten-Zellinie) polimorf, epiteliáiis megjelenést mutatnak, amely hasonlít a nem transzfektált, normál emberi faggyútermelő sejtek megjelenéséhez. A sejttenyészetben különböző méretű és intracelluláris struktúrájú sejtek jelennek meg, ami a sejtérés különböző stádiumára mutat. Összefolyt növekedésnél különböző méretű, átlag ötszörösen, illetve hatszorosan különböző nagyságú sejteket figyeltünk meg, ami lényegében az in vitro progresszíven differenciálódó, nem transzfektált, normál emberi faggyútermelő sejteknél a sejtméretek megnagyobbodásának (átlagosan négy-öt és félszeres nagyságbeli különbségek) felel meg. Továbbá ugyanúgy, mint a nem transzfektált, normál emberi faggyútermelő sejteknél, a találmány szerinti, halhatatlanná tett faggyútermelő sejtek citoplazmájában bőségesen találtunk zsírrészecskéket. A jellemző faggyúmirigylipidek, a szkvalén és viaszészter szintézisét - ahogyan ez a normál emberi faggyútermelő sejteknél szokásos - a találmány keretében kísérletileg igazoltuk. A találmány szerinti, halhatatlanná tett faggyútermelő sejtek ezenkívül szabad zsírsavakat szintetizáltak - amely a nem transzfektált normál emberi faggyútermelő sejtekről in vitro kapott ismereteinkkel megint csak korrelál - mégpedig akár nagyszámú szubkultúra után is.
A találmány szerinti, halhatatlanná tett faggyútermelő sejteknél, illetve sejtvonalaknál, az ilyen sejtekre jellemző jelekként, olyan expressziós markerek jelenlétét állapítottuk meg, amelyek faggyútermelő sejt eredetüket igazolják és intakt differenciálódásukat mutatják. A találmány szerinti, halhatatlanná tett faggyútermelő sejtek, illetve sejtvonalak a humán polimorf epiteliáiis mukoproteincsoport faggyútermelő sejtekre jellemző antigénjeit - ilyen a faggyúmirigy-antigén, a humán tejzsír-globulin-1 és -2, a humán epiteliáiis szialomucin, a Thomsen-Friedenreich-antigén, a mucinhoz hasonló karcinómával társult antigén, valamint az epiteliáiis membrán antigén - fejezték ki, amit a találmány keretében immuncitokémiai módszerrel és Western biot analízissel igazoltunk. A találmány szerinti, halhatatlanná tett faggyútermelő sejtek, illetve sejtvonalak ezenfelül a nem transzfektált, normál faggyútermelő sejtekre jellemző keratin antigéneket - ilyen a 7-es, 13-as és 19-es alosztály - is kifejezték. Az antigénfenotípus ezzel alátámasztotta a faggyútermelő sejt eredetét, valamint a faggyútermelő sejt differenciálódását.
A találmány szerinti, halhatatlanná tett faggyútermelő sejtek, illetve sejtvonalak működésük szempontjából is hasonlóan viselkednek, mint a nem transzfektált, normál emberi faggyútermelő sejtek. A találmány szerinti, halhatatlanná tett faggyútermelő sejtek az androgének, például az 5a-dihidro-tesztoszteron (5aDHT) hatására úgy válaszolnak, hogy in vitro proliferációjuk fokozódik. A találmány szerinti, halhatatlanná tett faggyútermelő sejtek, illetve sejtvonalak ezenfelül képesek arra, hogy proliferációjukat retinoidok hatására - főképpen a nem aromás típusúak (például: 13-cisz-retinsav, all-transz-retinsav) hatására - megváltoztassák.
A találmány egy előnyös alakjában a halhatatlanná tett és előnyösen emberi faggyútermelő sejteket klónozzuk. Ennek az az előnye, hogy a halhatatlanná tett faggyútermelő sejtek, illetve a belőlük származó sejtvonalak az egységes genomiális bázis révén jól definiálhatók és specifikusan jellemezhetők. Klónozott és halhatatlan emberi faggyútermelő sejtvonalat alkalmas módon úgy állítottunk elő, hogy a halhatatlan faggyútermelő sejteket a tenyésztőedényekben addig hígítottuk, amíg tenyésztőedényenként pusztán egy sejt sejtosztódása újból nem indult meg. Ezt mikroszkópos megfigyeléssel tudtuk követni és ellenőrizni.
A találmány szerint így állapítottuk meg, hogy a kapott, halhatatlan emberi faggyútermelő sejtek, illetve a belőlük származó sejtvonalak faggyútermelősejt-identitásukat, összehasonlítva a nem transzfektált, normál emberi faggyútermelő sejtekkel, megtartották. Ezt ellenőrző vizsgálatokkal és funkciós tesztekkel bizonyítottuk.
Az SZ95 jelű faggyútermelő sejtvonalat, amely a fent felsorolt találmány szerinti előnyöket magában egyesíti, képviseli az ACC2383 letéti szám alatt a DSMZ-nél letétbe helyezett faggyúmirigy-sejtvonal (Sebozyten-Linie).
A találmány szerinti, halhatatlanná tett faggyútermelő sejtek, illetve sejtvonalak tehát kiváló lehetőségeket kínálnak jól hasznavehető alkalmazásokhoz. A találmány szerinti faggyútermelő sejteket, illetve sejtvonalakat általánosságban diagnosztikai, terápiás vagy kozmetikai célokra lehet felhasználni. A fent leírt faggyútermelő sejtek, illetve sejtvonalak speciálisan lipidtartalmú sejtek, különösen az emberi és állati faggyúmirigysejtek fiziológiájának vagy patofiziológiájának a vizsgálatára, valamint a bőr és a bőrbetegségek, mint például az akne patofiziológiás folyamataiban játszott szerepük vizsgálatára szolgálnak. A találmány segítségével vizsgálható az akne és/vagy seborrhoea és/vagy más megbetegedések, főképpen olyan bőrbetegségek keletkezése, amelyeknél a faggyúmirigy mű4
HU 226 915 Β1 ködése játszik vagy játszhat szerepet. A találmány tárgyát képező sejtek továbbá kitűnő modellként szolgálnak akne- és/vagy seborrhoeaellenes vegyületek vagy szerek teszteléséhez, de olyan betegségek, főképpen bőrbetegségek elleni szerek teszteléséhez is, amelyeknél a faggyúmirigy működése szerepet játszik vagy játszhat. Éppen a klinikai kipróbálások elvégzése előtt hasznosak a gyógyszerek farmakológiai tulajdonságainak ilyen in vitro vizsgálatai.
A fent leírt, találmány szerinti faggyútermelő sejtek vagy sejtvonalak előnye ezenkívül az, hogy ezzel további sejttenyésztő rendszerek hozhatók létre, beleértve az egyszerű és komplex sejttenyésztő rendszerek kifejlesztését. Az egyszerű sejttenyésztő rendszer általában kétdimenziós egyrétegű vagy többrétegű adherens tenyészetekből vagy nem adherens tenyészetekből áll, és ezeket például úgy létesítjük, hogy a fent leírt faggyútermelő sejteket másféle sejttípusokkal keverve vagy félig áteresztő vagy nem áteresztő membránokkal elválasztva tenyésztjük [Schwartz et al., J. Surg. Rés., 76, 79-85 (1998); Nackman et al., Surgery, 124, 353-361 (1998)]. A komplex sejttenyésztő rendszer rendszerint egyrétegű vagy többrétegű tenyészetek háromdimenziós tenyésztéséből áll, és például úgy létesítjük, hogy a sejteket mint gömböket, gömbökön, kollagénben vagy más gélkészítményekben, vagy egy mesterséges, bőrhöz hasonló struktúrában tenyésztjük [Korff and Augustin, J. Cell. Bioi. 143, 1341-1352 (1998); Hamamoto et al., J. Biochem (Tokyo), 124, 972-979 (1998); Desoize et al., Anticancer. Rés., 18, 4147-4158 (1998); Hamilton, Cancer. Lett., 131, 29-34 (1998); Niemann et al., J. Cell. Bioi., 143, 533-545 (1998); Awata et al., J. Gastroenterol. Hepatol. 13, Kiég.: S55-61 (1998); Voura et al., Microsc. Rés. Tech., 43, 265-275 (1998); Pipili-Synetos et al., Br. J. Pharmacol., 125, 1252-1257 (1998); Vasile et al., J. Histochem. Citochem., 47, 159-168 (1999); Michalopoulos et al., Hepatology, 29, 90-100 (1999); Trent and Kirsner, Int. J. Clin. Pract., 52, 408-413 (1998); Fransson et al., Br. J. Dermatol., 139, 598-604 (1998); Konstantinova et al., Arch. Dermatol. Rés., 290, 610-614 (1998); black et al., FASEB J, 12, 1331-1340 (1998); Zhao et al., Biochem. Biophys. Rés. Comm., 254, 49-53 (1999)].
A találmány szerinti faggyútermelő sejtekből, illetve találmány szerinti sejtvonalakból a háromdimenziós sejthalmazok létesítése vagy a szerekhez hasonló struktúrák szerkesztése vagy rekonstrukciója különösen hasznavehető hasznosítással jár. Erre a célra a faggyútermelő sejtek egyedül vagy további, bőrt felépítő sejtekkel együtt - leginkább keratinocitákkal, fibroblasztokkal, melanocitákkal, endoteliális sejtekkel, Langerhans-sejtekkel és/vagy a haj follikulusaiból származó sejtekkel együtt - kerülnek felhasználásra. Az ilyen háromdimenziós sejthalmazok vagy szervhez hasonló szerkezetek konstrukciójának, illetve rekonstrukciójának előállításához alkalmas módon először egy tartót készítünk kollagénnel vagy más gélkészítménnyel és/vagy inaktivált szövetdarabokkal, és ezután bevisszük, illetve rávisszük az említett sejteket erre a tartóra. Ezeket a módszereket a szakemberek ismerik és az első készítmények a kereskedelemben kaphatók [Tranet and Kirsner, in. J. Clin. Pract., 52, 408-413 (1998); Frensson etal., Br. J. Dermatol., 139, 598-604 (1998); Konstantinova etal., Arch. Dermatol. Rés., 290, 610-614(1998); Black etal, FASEB J, 12, 1331-1340 (1998); Zhao et al, Biochem. Biophys. Rés. Commun, 254, 49-53 (1999)]. Ilyen módon előállítottunk egy „mesterséges bőrt” vagy bőrhelyettesítő anyagot, amely kitűnő lehetőséget nyújt a transzplantációs orvostudomány számára, a hiányzó bőrrészek - például égett bőr - rekonstrukciójához, vagy a bőrkárosodások (bőrléziók) terápiájához. A találmány segítségével ez a „mesterséges bőr” zsírt/faggyút elégséges mennyiségben tud szintetizálni, ha a találmány szerinti faggyútermelő sejteket bejuttatjuk ebbe a szerkezetbe.
A hasznos alkalmazások egy további területét érinti az olyan termékek előállítása, amelyek a találmány szerinti faggyútermelő sejtekből, illetve találmány szerinti sejtvonalakból származnak. Az eljárás magában foglalja celluláris anyagok, például lipidek, proteinek, DNS és/vagy RNS izolálását és tisztítását. Minthogy a sejtek halhatatlanok, állandó forrásként rendelkezésre állnak ilyen celluláris anyagok számára. A következő speciális példákat említjük az olyan nagyon hasznos anyagokra vonatkozóan, amelyeket ilyen módon a sejtekből elő lehet állítani: bőrlipidek topikus szerekben és gyógyszerekben való alkalmazáshoz, az alábbi 3. példában a faggyútermelő sejtek fenotípusvizsgálatával összefüggésben említett antigénhatású proteinek, valamint plazmid-DNS vagy vektor-DNS előállítása. A plazmid-DNS vagy vektor-DNS előállítása a szakemberek által ismert géntechnológiai úton történik; ilyen módon például olyan géneket tudunk kapni, amelyek a lipidtermelést indukálják. Éppen ilyen megfelelő plazmid- és vektorszerkezetekkel - amikor is virális vektorok előállítását ugyancsak számításba vehetjük - újból más sejteket vagy organizmusokat tudunk módosítani vagy transzfektálni.
A találmányt az alábbi példákkal részletesebben ismertetjük. A példákkal nem korlátozzuk a találmány oltalmi körét.
Példák
A következőkben leírt, anyagokra és metodikákra vonatkozó ismertetés az ezt követően leírt példákra alkalmazható.
Sejttenyészetek
Ha másképpen nem jelezzük, minden sejtet adherens tenyészetben olyan táptalajban tartunk fenn, amely 2 mM N-acetil-L-alanil-L-glutamin-tartalmú, módosított DMEM/Ham-féle F12 táptalajból (1:1) áll (Biochrom, Berlin, Németország), kiegészítve 10% hőinaktivált, fetális borjúszérummal (FCS; Biochrom) és 50 pg/ml gentamicinnel (Gibco-BRL, Karlsruhe, Németország). A tenyészetet 5% szén-dioxidot tartalmazó nedves atmoszférában, 37 °C hőmérsékleten tartottuk és a táptalajt minden második-harmadik napon kicseréltük.
HU 226 915 Β1
Normál emberi faggyútermelő sejtek (Sebocyten) izolálása és tenyésztése
A normál faggyútermelő sejteket egy 87 éves nő beteg - aki operáción esett át - arcbőréről izoláltuk úgy, ahogyan Xia és munkatársai [J. Invest. Dermatol., 93, 315-321 (1989] leírták. Az izolált faggyúmirigyeket tapadó sejtréteg nélkül, standard táptalajban tenyésztettük, amelyet a 9 ng/ml epidermális növekedési faktorral (EGF), 9 ng/ml keratinocitanövekedési faktorral (KGF) (mindkettőt a Boehringer Mannheim cégtől Németország - szereztük be), 0,4 pg/ml hidrokortizonnal (Sigma, Deisenhofen, Németország), valamint 10-9 M koleratoxinnal (Calbiochem, Bad Sódén, Németország) egészítettünk ki. A primer normál faggyútermelő sejtek tenyészetei a faggyúmirigylebenykék széléből kinövésként jelentek meg.
Immuncitokémiai vizsgálatok
Összefolyás előtti normál faggyútermelő sejttenyészetből diszpergált sejteket üveg tárgylemezekre kentünk citocentrifuga segítségével. A keneteket levegőn szárítottuk és hideg acetonnal 10 percig fixáltuk. A preparátumokat ezután a megfelelő monoklonális antitestekkel vagy egy kontrollantitesttel 30 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk. A megkötött antitestek kimutatását nyúl anti-egér IgG (H+L) monoklonális antitest konjugátummal (1:100 hígításban) és alkalikus foszfatáz/antialkalikus foszfatázkomplexszel (Dianova, Hamburg, Németország) 30 percig szobahőmérsékleten való inkubálással végeztük. Az első és második monoklonális antitestet olyan oldatokkal hígítottuk, amelyek 10% RPMI 1640-et és 10% FCS-t tartalmaztak, pH=7,4 mellett. A lemezeket háromszor mostuk Ca2+és Mg2+-mentes PBS pufferrel (Biochrom). A preparátumokat 30 percig festettük pufferolt (pH=8,8) oldatban újfukszinnal (new fuchsin) (rögzítőreagensként) és egy naftolsóval (kötőreagensként) - mindkét reagens Sigmától - ellenfestést pedig Mayer-féle Haemalummal (Merck, Darmstadt, Németország) végeztünk. A lemezeket lefedtük és fénymikroszkóp alatt értékeltük.
Proteinek izolálása és meghatározása
A celluláris proteinek izolálása céljából a sejttenyészeteket kétszer mostuk PBS-sel, magában a tenyésztőedényben lizáltuk egy 50 mM HEPES, 1% Nonidet P-40 (ICN, Aurora, OH., USA), 150 mM NaCI és proteázinhibitor (Complete Mini, Boehringer Mannheim) tartalmú hideg oldattal, végül lekapartuk és kis centirfugacsövekbe gyűjtöttük. A kapott anyagot ultrahangos kezeléssel homogenizáltuk, centrifugáltuk és a felülúszókat jégen tartottuk. Az összproteint bicin-koninsav (BCA-protein-assay; Pierce, Rochford, IL, USA) hozzáadásával tettük láthatóvá. A proteinkoncentrációt 550 nm-nél kapott abszorpció mérésével határoztuk meg.
Western-blot-analízis
Az izolált protein részleteit (20 pg) 15 percig 95 °C-on hevítettük. Minden mintát egydimenziós SDS/PAGE elektroforézissel - 7,5%-os gélben - vizsgáltunk. Ezután a proteineket transzfermembránra (Immobilon-P PVDF-ből; Millipore, Eschbom, Németország) vittük fel egy standard biotrendszer (BioRad, München, Németország) segítségével. A biotokat szobahőmérsékleten 60 percig az első monoklonális antitesttel inkubáltuk, azután torma-peroxidázzal konjugált kecske antiegér monoklonális antitesttel, illetve kecske antinyúl monoklonális antitesttel (Oncogene Science) - 0,2 pg/ml hígításban - 60 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk. Alapos mosás után egy standard-assay (ECL, Amersham, Braunschweig) alkalmazása mellett a kemilumineszcenciás módszer révén kapott szignálokat röntgensugár-érzékeny filmeken (XAR 5; Kodak, Rocherster, NY. USA) tettük láthatóvá, amikor is több besugárzási intervallumot állítottunk be.
Festés olajvörössel és nílusvörössel
A kamrás tárgylemezen növekedő sejteket vagy olajvörös (oil red; Sigma) 6%-os oldatával - 60%-os izopropil-alkoholban - inkubáltuk 15-120 percig, vagy pg/ml nílusvörös festékkel (Kodak) inkubáltuk 15 percig szobahőmérsékleten, ahogyan Xia és munkatársai (1989; lásd fentebb) leírták. A tenyészeteket ezután fénymikroszkóp alatt (olajvörös festésre) vagy fluoreszcens mikroszkóp alatt - egy 450-500 nm pályaátmenet-gerjesztő szűrő (Bandpass-Anregungsfilter) alkalmazása mellett - fényemisszió révén 528 nm-nél (nílusvörös festésre) figyeltük.
Folyadékcitometria
Diszpergált, nem festett sejteket a sejtméret meghatározása céljából hagyományos készülékkel (Sorter) szortíroztunk. Ugyanakkor a nílusvörössel (Kodak) festett sejteket a lipidtartalom meghatározása céljából fluoreszcencián alapuló folyadékcitometriával vizsgáltuk meg. Mintánként 10 000 sejtet vizsgáltunk.
Lipidek jelzése és extrakciója
A sejttenyészeteket két napig tartottuk táptalajban, ezután a sejteknek radioaktív pulzust adtunk a [2-14C]-ecetsav (45-60 mCi/mM) nátriumsóján (Dupond-NEN, Boston, MA., USA) keresztül, 0,5 pCi/ml koncentrációban, RPMI 1640 táptalajban, amelyet mM L-glutaminnal, 10% hőinaktivált FCS-sel és 100 NE/ml penicillinnel és 100 pg/ml sztreptomicinnel egészítettünk ki. A sejteket ezután további 24 óra hosszat inkubáltuk.
A lipideket a tenyésztett sejtekből és a felülúszó táptalajból izoláltuk, majd szétválasztottuk neutrális lipidekre, zsírsavakra és foszfolipidekre [lásd: Seifert et al., J. Invest. Dermatol., 108, 375 (1997].
A frakciókra való méret szerinti elválasztáshoz és a neutrális lipidek és szabad zsírsavak láthatóvá tételéhez nagy teljesítményű vékonyréteg-kromatográfiát (HPTLC=high-performance thinlayer chromatography) alkalmaztunk, amelyet 20x10 cm2-es, szilikagéllel bevont üveglemezeken (Merck, Darmstadt, Németország) végeztünk. A lemezeket n-hexánnal előkezeltük és 24 óra hosszat szárítottuk. A mintákat automata
HU 226 915 Β1 lipidapplikátorral (Linómat IV; Cmagag, Berlin, Németország) vittük fel. A neutrális lipidek kromatogramjait n-hexán/dietil-éter (9:1) oldatban 9 cm-ig fejlesztettük ki, megszárítottuk és kloroform/dietil-éter/etil-ecetsav (80:4:16) oldattal 4,5 cm-ig utókifejlesztést végeztünk. A megvilágításhoz ívlámpákat (Belichtungsbögen) (TR2040S; Fuji, Tokió, Japán) használtunk, a képet ezután egy képanalizáló készülék („BAS 1000 Bio-lmaging Analyser”, Fuji) tapogatta le. Összehasonlításul lipid standard mintákat használtunk.
Növekedési viselkedés vizsgálata
A sejteket 96 tartályos tenyésztölemezekre oltottuk le 0,5-4*103 sejt/tartály sűrűségben. A sejtproliferációt
4-metil-umbelliferil-heptanoát fluoreszcens assayvel értékeltük ki és automatizáltan mértük [Zouboulis et al., Melanoma. Rés., 1, 91-95 (1991)].
Úgy jártunk el, hogy a mérés napján a táptalajt eltávolítottuk, a sejteket kétszer mostuk PBS-ben és a 4-metil-umbelliferil-heptanoát 100 pg/ml koncentrációjú oldatából (Sigma, Deisenhofen, Németország) 100 pl-t adtunk minden tartályhoz. A lemezeket ezután 30 percig 37 °C-on inkubáltuk és a leadott fluoreszcenciát megfelelő, fluoreszcenciamérő készülékkel mértük (Titertec Fluoroscan II; Flow, Meckenheim, Németország). Fluoreszcenciaegységeket 355 nm-en gerjesztő- és 460 nm-en emissziós szűrővel kaptunk.
Kezelés 5u-dihidro-tesztoszteronnal és retinoidokkal
Az 5a-dihidrotesztoszteront (5p-DHT; Sigma) DMSO-ban oldottuk fel és ezután 2 mM n-acetil-L-alanil-L-glutaminnal együtt szérum- és fenolmentes, módosított DMEM/Ham F12 (1:1) táptalajhoz adtuk, amely 5 ng/ml EGF-et, 50 pg/ml marhahipofízis-kivonatot, 1 mg/ml zsírsavmentes marha-szérumalbumint (Boehringer Mannheim) és 50 pg/ml gentamicint tartalmazott. Az 5a-DHT végkoncentrációja 10-6 M lett és a DMSO végkoncentrációja 0,1%. Kontroll gyanánt egyedül 0,1% DMSO szolgált. A sejteket (0,5-2* 103 sejt/tartály) 18 napon át 5a-DHT-vel kezeltük.
A retinoidokkal való kezeléshez az all-transz-retinsavat, 13-cisz-retinsavat és az acitretint DMSO-ban feloldottuk és ezután 2 mM N-acetil-L-alanil-L-glutaminnal együtt szérummentes, módosított DME-táptalaj/Ham F12 táptalaj 1:1 elegyéhez adtuk, amely még 5 ng/ml EGF-et, 50 pg/ml marhahipofízis-kivonatot, 1 mg/ml zsírsavmentes marha-szérumalbumint és 50 pg/ml gentamicint tartalmazott. Ilyen módon a retinoid-végkoncentráció 10-7 M és a DMSO végkoncentrációja 0,1% lett. A 0,1% DMSO egyedül szolgált kontrollként. A retinoidokat tompított sárga fény mellett kezeltük. A sejteket (0,5-1 *103 sejt/tartály) kilenc napig kezeltük retinoidokkal.
Statisztikai analízis
A növekedésre vonatkozó vizsgálatokat 96 tartályos lemezeken hatszor elvégzett kísérlet alapján értékeltük. Minden más vizsgálatot három párhuzamos menetben végeztünk.
1. példa
Normál emberi faggyútermelő sejtek (Sebozyten) transzfekciója
A normál emberi faggyútermelő sejtek transzfekciójára használt pSVT jelű vektor egy PBR 322 alapú plazmidszerkezet volt, amely SV-40 eredetű nagy-Tprotein szekvenciákat tartalmazott, amelyben a proteinexpressziót a Rous szarkómavírus hosszú ismétlődő végszakasza (long terminál repeat) vezérelte [lásd: Dutt et al., Oncogene, 5, 195-200 (1990); Wang et al., In Vitro Cell. Dev. Biok, 27A, 63-74 (1991], A normál emberi faggyútermelő sejtek második szubkultúráját 50%-os összefolyásig hagytuk növekedni 35 mm-es tenyésztőedényekben (Becton Dickinson, Plymouth, Egyesült Királyság) és ezt használtuk transzfekcióhoz. A transzfekciót egy génátviteli módszer alapján, kationos lipid alkalmazásával végeztük. Ehhez a LIPOFECTIN reagenst használtuk, amely a DOTMA (1,2-dioliloxi-propil-3-trimetil-ammónium-klorid) és a DOPE (diolil-foszfatidil-etanol-amin) 1:1 arányú (tömeg/tömeg) liposzomális formulázásával készült membránon szűrt vízben (1 mg/ml). Ekkor a táptalajt eltávolítottuk, a tenyésztett sejteket kétszer mostuk szérummentes táptalajban (Opti-MEM; Gibco-BRL) és ebben a táptalajban inkubáltuk 4 órán át. A táptalajt ezután olyan transzfekciós keverékre cseréltük, amely megfelelő mennyiségű antibiotikummentes Opti-MEM táptalajból (1,5 ml), megfelelő mennyiségű LIPOFECTIN reagensből (Gibco-BRL; 5-30 pl; legkedvezőbb a 1,5 térfogat%), valamint megfelelő mennyiségű pSVT-DNS-ből (1-10 pg) állt 0,5 ml PBS-t tartalmazó oldatban (a DNS végkoncentrációja legelőnyösebben 0,5 tömeg%). A tenyészeteket 24 óra hosszat 37 °C-on nedves atmoszférában inkubáltuk, amely 5% szén-dioxidot tartalmazott. Végül a tenyészeteket kétszer mostuk táptalajjal és mint fent leírtuk, a továbbiakban faggyútermelősejt-táptalajban tartottuk.
A transzfekciós eljárás utáni négy hét folyamán a pSVT-kezelt faggyútermelő sejtek életképességének drámai csökkenését figyeltük meg. Azonban, különösen a LIPOFECTIN reagens és a pSVT-DNS optimális mennyiségének alkalmazása esetén proliferáló faggyútermelősejt-kolóniák megjelenése következett be. Ezeket a sejteket (SZ95) máig több mint ötvenszer tudtuk passzálni. Ezek, mint ezelőtt, négy és fél év megfigyelési időn keresztül, életképesek.
2. példa
A halhatatlanná tett emberi faggyútermelő sejtek klónozása
Az említett módon halhatatlanná tett SZ95 faggyútermelő sejteket 96 tartályos tenyésztőlemezekre oltottuk le, geometriailag csökkenő sejtszámokat tartalmazó hígítási sorban, 1 *102 sejttel kezdve az első sorban, az utolsó sorban elméletileg nulla sejtet elérve [Zouboulis et al. közleménye a „Das maligne Melanom dér Haut” című kiadványban, C. E. Orfanos és C. Garble (kiadók) Zuckschwerdt, München, Németország; 1990; 158-158 oldal]. A sejteket standard táptalajban tartottuk fenn, amelyhez 5 ng/ml EGF-et és 3 ng/ml KGF-et
HU 226 915 Β1 adtunk. Azokat a növekedő sejteket tekintettük kiónnak, amelyek tartályonként egyetlen sejtből származtak. Ezt fénymikroszkópos vizsgálattal meg tudtuk figyelni. így kaptuk a klónozott SZ95 sejteket.
3. példa
Halhatatlanná tett emberi faggyútermelő sejtek vizsgálata
Az SV-40-nagy-T-antigén kimutatása
Az SV-40 nagy-T-antigénjének expresszióját a halhatatlan faggyútermelő sejtekben immuncitokémiai módszerrel és Western-blot-analízissel mutattuk ki, monoklonális anti-humán SV-40-nagy-T-Ag-antitestegér szérum alkalmazásával (Oncogene Science, Cambridge, MA., USA), amelyet az immuncitokémiai analízishez 1:1000-re és a Western-blot-analízishez 1:100-ra hígítottunk. Emberi normál epidermális keratinocitákat, dermális fibroblasztokat és - pozitív kontrollként - SV-40-nagy-T-antigénnel halhatatlanná tett HMEC-1 endoteliális sejteket (lásd a WO-A-92/17569 számú nemzetközi szabadalmi bejelentést) használtunk összehasonlításul.
Az 1. példa szerint az SV-40-nagy-T-antigén elleni monoklonális antitesttel halhatatlanná tett faggyútermelő sejtek immuncitokémiai vizsgálata alkalmával erős festődést kaptunk túlnyomórészt a sejtmagban, részben a citoplazmában is (lásd a 2a. ábrát). A normál keratinociták és fibroblasztok egyaránt negatívok voltak SV-40-nagy-T-proteinre a HMEC-1 sejtek pedig, mint pozitív kontrollok, túlnyomóan a sejtmagban, részben a citoplazmában is festődést mutattak SV-40nagy-T-proteinre (lásd a 2b. ábrát).
A 2c. ábrán az SV-40-nagy-T-antigén-expresszió Western-blot-analízisének eredménye látható a nem transzfektált normál emberi faggyútermelő sejteknél (1-es nyomsáv) a normál emberi epidermális keratinocitáknál (2-es nyomsáv), a találmány szerinti halhatatlan faggyútermelő sejteknél (34. szubkultúra; 3-as nyomsáv), valamint különböző találmány szerinti klónozott faggyútermelő sejteknél (4-es, 5-ös és 6-os nyomsáv). A halhatatlan faggyútermelő sejtvonalnál, valamint klónjainál 94 kD-nál egy sávot mutattunk ki, amely az SV-40-nagy-T-protein expresszióját igazolta [lásd: Harlow et al., J. Virol, 39, 861-869 (1981)].
A találmány szerinti, halhatatlanná tett faggyútermelő sejtek fenotípusának vizsgálata Az 1. példa szerinti halhatatlanná tett SZ95 faggyútermelő sejtek epiteliális morfológiát mutattak, ami különböző nagyságú, polimorf megjelenésű sejtekkel mutatkozott meg. Ezeknél a citoplazmában számos cseppecske volt megfigyelhető (lásd az 1b. és 1c. ábrát).
Megfelelő antitestekkel végzett immuncitokémiai vizsgálatokban a találmány szerinti, halhatatlanná tett faggyútermelő sejteknél pozitív eredményt kaptunk faggyúmirigy-antigénnel szemben, ellentétben a normál epidermális keratinocitákkal, amelyek nem festődtek faggyúmirigy elleni monoklonális antitesttel (lásd a 3. ábrát). A 3. ábra a) a találmány szerinti, halhatatlan faggyútermelő sejtek, valamint b) a normál emberi epidermális keratinociták citocentrifugált preparátumain kapott immuncitokémiai eredményeket mutatja. A preparátumokat egy faggyúmirigy elleni monoklonális antitesttel festettük meg. Míg a találmány szerinti, halhatatlan faggyútermelő sejtek pozitív citoplazmatikus festődést mutattak, addig a normál emberi epidermális keratinociták nem festődtek meg.
Ezután a halhatatlanná tett faggyútermelő sejtekben Western-blot-analízissel kimutattuk a keratin 7, 13 és 19 expresszióját, valamint a humán polimorf epiteliális mucincsoport több proteinjének expresszióját, ugyanakkor a keratinociták csupán a keratin 13-at fejezték ki (lásd a 4. ábrát). A 4. ábrán látható Westernblot-analízishez a találmány szerinti halhatatlan faggyútermelő sejtekből (34. szubkultúra, 1-es nyomsáv), a találmány szerinti különböző klónozott halhatatlan faggyútermelő sejtekből (2-es, 3-as és 4-es nyomsáv), valamint a normál emberi epidermális keratinocitákból (5-ös nyomsáv) extrahált proteint vittük fel, mégpedig hogy azonosítsuk a humán epiteliális szialomucin (ESM; >400 kD), a humán tejzsír-globulin-1 (HMFG-1; 400 kD), a humán tejzsír-globulin-2 (HMFG-2; 80^400 kD); a mucinhoz hasonló karcinómához társult antigén (MCA; 350 kD), az epiteliális membránantigén (EMA; 250-400 kD), a Thomsen-Friedenreich-antigén (TF-antigén; 155 kD), a keratin 7 (543 kD), keratin 13 (54 kD) keratin 19 (40 kD), valamint az 1 típusú 5a-reduktáz (5a-Red. 1, 21-27 kD) expresszióját. A találmány szerint halhatatlanná tett sejtvonal, valamint kiónjai mindegyik vizsgált proteint kifejezték, ezzel szemben a keratinociták csak a keratin 13-at és az 1 típusú 5a-reduktázt fejezték ki.
Lipidszintézis
A nílusvörössel való festődés és a fluoreszcens mikroszkóppal való kiértékelés lipidek jelenlétét mutatta a sejtcitoplazmában. A találmány szerinti, halhatatlan SZ95 faggyútermelő sejtekben (lásd az 5. ábrát), amelyeket a neutrális lipidekre ható nílusvörös fluoreszcens színezékkel festettünk meg, egyesével vagy csoportosan lipidcseppecskék mutatkoztak, amelyek a faggyútermelő sejtek citoplazmájában tetszés szerint oszlottak el. A találmány szerinti, halhatatlan faggyútermelő sejtek csökkentették lipidtartalmukat szérumtartalmú táptalajban sejtenként 510 fluoreszcens egységről szérummentes táptalajban sejtenként 429 fluoreszcens egységre (középérték; azaz mínusz 16%), amelyet nílusvörössel festett sejtek fluoreszcenscitometriai vizsgálatával mutattunk ki.
A találmány szerinti, 1. példa szerint halhatatlanná tett faggyútermelő sejtek a neutrális lipidek több frakcióját szintetizálták, köztük a tipikus faggyúmirigylipideket, a szkvalént és viasz-észtert, továbbá triglicerideket, koleszterint, koleszterin-észtert, diglicerideket, lanoszterolt és szabad zsírsavakat. Ezt 25-40 szubkultúra folyamán figyeltük meg és a 6. ábrán mutatjuk be. A HPTLC-frakcionált lipideket radiojelzett nátrium-acetáttal pulzáltuk és a felvett aktivitást radiometriás képkiértékeléssel detektáltuk két kiválasztott halhatatlan és klónozott faggyútermelő sejttenyészetnél (lásd a 3-as,
HU 226 915 Β1
4- es, illetve 5-ös és 6-os nyomsávot). A 3-as, 4-es és
5- ös nyomsávok azt mutatják, hogy a sejtek több neutrális lipidfrakciót szintetizáltak, köztük szkvalint (Sq), viasz-észtert (WE), valamint triglicerideket (Tg), koleszterint (Cho), koleszterin-észtert (ChE), diglicerideket (Dg), lanoszterolt (Lan), továbbá szabad zsírsavakat (FFA). Mindegyik neutrális lipidet, bár csekély mennyiségben, az extracelluláris felülúszókban is megtaláltuk (lásd a 6-os nyomsávot). Összehasonlításul az 1-es nyomsávra lipidstandardokat (LS), a 2-es nyomsávra emberi faggyút (sebum) es a 4-es nyomsávra sejtekből extrahált szabad zsírsavakat vittünk fel. További összehasonlításul a 7-es és 8-as nyomsávok keratinocitákkal kapott eredményeket mutatnak, azaz a sejtekben főként koleszterin és trigliceridek jelenléte mutatható ki, míg a felülúszóban (8-as nyomsáv) túlnyomórészt koleszterint találtunk.
Proliferációs vizsgálatok
A találmány szerinti, halhatatlanná tett faggyútermelő sejtekre logaritmikus proliferációs képet kaptunk normál tenyésztési feltételek mellett, amikor is a populáció 52,4±1,6 óra alatt kétszeresére szaporodott, függetlenül az eredeti tenyészet sejtsűrűségétől. A 7. ábra egy halhatatlan, klónozott faggyútermelő sejtvonal (SZ95) proliferációját mutatja 18 napon át, faggyútermelő sejtnek megfelelő táptalajban.
A halhatatlan faggyútermelő sejtek proliferációja szérummentes táptalaj hozzáadása után csökkent, de újból megemelkedett 5a-DHT hozzáadása után. Ezt a 8. ábrán egy olyan faggyútermelő sejtklón példáján mutatjuk be, amelynél a sejtek proliferációját (leoltva 2000 sejt/tartály) 18 napon át szérummentes táptalajban (kontroll), valamint 10-6 M 5a-DHT tartalmú szérummentes táptalajban figyeltük meg. A 8. nap után jelentékenyen megnövelte az 5a-DHT a sejtek proliferációját, amely a megállapított 136 órás (kontroll) populáció megkettőződési időt 53,7 órára (5a-DHT-kezelt sejtek) változtatta (*, p<0,01).
Retinoidok hatására a halhatatlan sejtek proliferációs viselkedésükben különböző válaszokat mutattak. Míg néhány klón proliferációját a retinoidok gátolták (jellemzően különböző erősséggel, a következő sorrendben: 13-cisz-retinsav>all-transz-retinsav»acitretin), más kiónok proliferációját stimulálták (például az all-transz-retinsav és 13-cisz-retinsav révén) a normál emberi epidermális keratinociták proliferációs válaszának megfelelően, amelyet a 9. ábrán mutatunk be (*, p<0,05; **, p<0,01;*** p<0,001).
Claims (18)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Faggyútermelő sejtek, amelyeket halhatatlanná tettünk és embertől származnak, és amelyek előállíthatók faggyútermelő sejtek olyan transzfekciójával, amelyet SV-40 nagy-T-proteinjét kódoló szekvenciát tartalmazó DNS-sel végzünk, azzal jellemezve, hogy a normál, nem transzfektált és differenciálódó faggyútermelő sejtek ismertetőjegyeit viselik.
- 2. Az 1. igénypont szerinti faggyútermelő sejtek, azzal jellemezve, hogy emberi faggyúmirigyből származnak.
- 3. A 2. igénypont szerinti faggyútermelő sejtek, azzal jellemezve, hogy a faggyúmirigysejtek arcfaggyúmirigysejtek.
- 4. Az előző igénypontok bármelyike szerinti faggyútermelő sejtek, azzal jellemezve, hogy sejtvonal formájában vannak.
- 5. Az előző igénypontok bármelyike szerinti faggyútermelő sejtek, azzal jellemezve, hogy a proliferációjuk androgénekkel és/vagy retinoidokkal megváltoztatható.
- 6. Az előző igénypontok bármelyike szerinti faggyútermelő sejtek, azzal jellemezve, hogy kiónozottak.
- 7. DSM ACC2383 letéti számú, emberi faggyútermelő sejtvonal.
- 8. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti faggyútermelő sejtek vagy a 7. igénypont szerinti emberi faggyútermelő sejtvonal alkalmazása gyógyszer vagy diagnosztikai, terápiás vagy kozmetikai készítmény előállítására.
- 9. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti faggyútermelő sejtek vagy a 7. igénypont szerinti emberi faggyútermelő sejtvonal alkalmazása emberi vagy állati faggyúmirigy fiziológiájának vagy patofiziológiájának in vitro vizsgálatára.
- 10. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti faggyútermelő sejtek vagy a 7. igénypont szerinti emberi faggyútermelő sejtvonal alkalmazása az akne és/vagy seborrhoea és/vagy más megbetegedések keletkezésének in vitro vizsgálatához.
- 11. A 10. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a vizsgálandó más megbetegedések olyan bőrbetegségek, amelyeknél a faggyúmirigy működése játszik vagy játszhat szerepet.
- 12. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti faggyútermelő sejtek vagy a 7. igénypont szerinti emberi faggyútermelő sejtvonal alkalmazása akne és/vagy seborrhoea elleni vegyületek vagy szerek in vitro tesztelésére.
- 13. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti faggyútermelő sejtek vagy a 7. igénypont szerinti emberi faggyútermelő sejtvonal alkalmazása megbetegedések elleni vegyületek vagy szerek in vitro tesztelésére.
- 14. A 13. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a megbetegedések olyan bőrbetegségek, amelyeknél a faggyúmirigy-működés játszik vagy játszhat szerepet.
- 15. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti faggyútermelő sejtek vagy a 7. igénypont szerinti emberi faggyútermelő sejtvonal alkalmazása egyszerű vagy komplex sejttenyészetek kifejlesztéséhez.
- 16. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti faggyútermelő sejtek vagy a 7. igénypont szerinti emberi faggyútermelő sejtvonal alkalmazása háromdimenziós sejthalmazok vagy szervhez hasonló struktúrák képzéséhez vagy ezekben való felhasználáshoz.HU 226 915 Β1
- 17. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti faggyútermelő sejtek vagy a 7. igénypont szerinti emberi faggyútermelő sejtvonal alkalmazása olyan sejttermékek előállítására, amelyek ezekből a sejtekből származnak.
- 18. A 17. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a sejt termékek lipidek, plazmidok, vektorok és olyan protei nek, amelyeket a sejtek fejeznek ki és/vagy ezen pro teinek DNS- vagy RNS-szekvenciái.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19903920A DE19903920B4 (de) | 1999-02-01 | 1999-02-01 | Sebozyten, Sebozyten-Zellinie und deren Verwendungen |
| PCT/EP1999/009988 WO2000046353A1 (de) | 1999-02-01 | 1999-12-15 | Sebozyten, sebozyten-zellinie und deren verwendungen |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP0200048A2 HUP0200048A2 (hu) | 2002-05-29 |
| HUP0200048A3 HUP0200048A3 (en) | 2006-02-28 |
| HU226915B1 true HU226915B1 (en) | 2010-03-01 |
Family
ID=7896032
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU0200048A HU226915B1 (en) | 1999-02-01 | 1999-12-15 | Sebocytes, sebocyte cell lines and applications thereof |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (5) | US20020034820A1 (hu) |
| EP (1) | EP1151082B1 (hu) |
| JP (1) | JP4514963B2 (hu) |
| KR (1) | KR100689120B1 (hu) |
| CN (1) | CN100366735C (hu) |
| AT (1) | ATE319813T1 (hu) |
| AU (1) | AU770518B2 (hu) |
| CA (1) | CA2360762C (hu) |
| DE (2) | DE19903920B4 (hu) |
| DK (1) | DK1151082T3 (hu) |
| HU (1) | HU226915B1 (hu) |
| IL (2) | IL144683A0 (hu) |
| PL (1) | PL194865B1 (hu) |
| WO (1) | WO2000046353A1 (hu) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10141443B4 (de) * | 2001-08-23 | 2007-02-01 | Christos C. Prof. Dr. Zouboulis | Verwendung von molekularbiologisch hergestellten, nicht-viralen Wirkstoffen zur Behandlung der Akne |
| FR2960549B1 (fr) * | 2010-05-25 | 2015-06-19 | Univ Paris Curie | Procede de culture d'adipocytes |
| CN102668885B (zh) * | 2012-05-30 | 2013-06-05 | 北京市农林科学院 | 一种黄伞新菌株及其子实体栽培方法 |
| DE102013015560A1 (de) | 2013-09-20 | 2015-03-26 | Cutech Srl. | Ex vivo Kulturen auf Basis humaner Talgdrüsen und deren Verwendung als Screening Werkzeug |
| WO2017138078A1 (ja) | 2016-02-08 | 2017-08-17 | 花王株式会社 | 成熟皮脂腺細胞の製造方法 |
| EP3444356B1 (en) | 2016-03-25 | 2021-02-17 | Kao Corporation | Method for assessing or selecting sebaceous-gland- or hair-follicle-selective androgen receptor activity controlling agent |
| EP3284817A1 (en) * | 2016-08-18 | 2018-02-21 | Phenocell | Human sebocyte precursor cells, human sebocytes and in vitro methods for obtaining the same from human induced pluripotent stem cells (hipsc) |
| FR3061205A1 (fr) * | 2016-12-22 | 2018-06-29 | L'oreal | Modele d'epithelium reconstruit sebocytaire differencie a partir de sebocytes humains primaires |
| CN109852576A (zh) * | 2019-01-07 | 2019-06-07 | 施歌 | 一种永生化皮脂腺细胞株的构建方法 |
| CN111088217B (zh) * | 2019-12-20 | 2023-03-03 | 广东博溪生物科技有限公司 | 细胞培养基、细胞培养试剂盒及细胞培养方法 |
| CN112608947B (zh) * | 2020-12-28 | 2023-06-16 | 上海市皮肤病医院 | 一种永生化人皮脂腺细胞系的构建方法及其应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0578769A4 (en) * | 1991-04-04 | 1995-08-16 | Us Health | Immortalization of human endothelial cells |
| WO1998008089A1 (en) * | 1996-08-23 | 1998-02-26 | Arch Development Corporation | Identification of activators and inhibitors of sebum formation |
| IT1293484B1 (it) * | 1997-06-11 | 1999-03-01 | Fidia Advanced Biopolymers Srl | Materiale biologico comprendente una efficiente coltura di cellule e una matrice tridimensionale biocompatibile e biodegradabile |
-
1999
- 1999-02-01 DE DE19903920A patent/DE19903920B4/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-12-15 JP JP2000597413A patent/JP4514963B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1999-12-15 PL PL350191A patent/PL194865B1/pl unknown
- 1999-12-15 CA CA002360762A patent/CA2360762C/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-12-15 AT AT99963551T patent/ATE319813T1/de active
- 1999-12-15 CN CNB998165387A patent/CN100366735C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1999-12-15 HU HU0200048A patent/HU226915B1/hu unknown
- 1999-12-15 IL IL14468399A patent/IL144683A0/xx active IP Right Grant
- 1999-12-15 WO PCT/EP1999/009988 patent/WO2000046353A1/de active IP Right Grant
- 1999-12-15 KR KR1020017009722A patent/KR100689120B1/ko active IP Right Grant
- 1999-12-15 DK DK99963551T patent/DK1151082T3/da active
- 1999-12-15 DE DE59913210T patent/DE59913210D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1999-12-15 AU AU19804/00A patent/AU770518B2/en not_active Ceased
- 1999-12-15 EP EP99963551A patent/EP1151082B1/de not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-08-01 IL IL144683A patent/IL144683A/en not_active IP Right Cessation
- 2001-08-01 US US09/920,392 patent/US20020034820A1/en not_active Abandoned
-
2008
- 2008-10-01 US US12/243,869 patent/US20110065142A1/en not_active Abandoned
-
2011
- 2011-09-29 US US13/248,370 patent/US20120225445A1/en not_active Abandoned
-
2013
- 2013-10-23 US US14/060,937 patent/US20140120569A1/en not_active Abandoned
-
2015
- 2015-09-14 US US14/853,013 patent/US20160237406A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU1980400A (en) | 2000-08-25 |
| US20020034820A1 (en) | 2002-03-21 |
| JP2002535984A (ja) | 2002-10-29 |
| KR20020013495A (ko) | 2002-02-20 |
| DE59913210D1 (de) | 2006-05-04 |
| US20110065142A1 (en) | 2011-03-17 |
| HUP0200048A3 (en) | 2006-02-28 |
| ATE319813T1 (de) | 2006-03-15 |
| IL144683A0 (en) | 2002-06-30 |
| PL350191A1 (en) | 2002-11-18 |
| KR100689120B1 (ko) | 2007-03-09 |
| US20160237406A1 (en) | 2016-08-18 |
| EP1151082A1 (de) | 2001-11-07 |
| JP4514963B2 (ja) | 2010-07-28 |
| CA2360762C (en) | 2009-01-27 |
| HUP0200048A2 (hu) | 2002-05-29 |
| DE19903920A1 (de) | 2000-08-10 |
| AU770518B2 (en) | 2004-02-26 |
| CN1344314A (zh) | 2002-04-10 |
| CA2360762A1 (en) | 2000-08-10 |
| WO2000046353A1 (de) | 2000-08-10 |
| US20140120569A1 (en) | 2014-05-01 |
| IL144683A (en) | 2008-04-13 |
| US20120225445A1 (en) | 2012-09-06 |
| PL194865B1 (pl) | 2007-07-31 |
| DE19903920B4 (de) | 2005-08-25 |
| DK1151082T3 (da) | 2006-04-10 |
| EP1151082B1 (de) | 2006-03-08 |
| CN100366735C (zh) | 2008-02-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20160237406A1 (en) | Sebocytes, sebocyte cell lines and applications thereof | |
| Zouboulis et al. | Establishment and characterization of an immortalized human sebaceous gland cell line (SZ95) 1 | |
| Boelsma et al. | Reconstruction of a human skin equivalent using a spontaneously transformed keratinocyte cell line (HaCaT) | |
| Broad et al. | Growth and adipose differentiation of sheep preadipocyte fibroblasts in serum‐free medium | |
| Ponec et al. | Lipid composition of cultured human keratinocytes in relation to their differentiation | |
| Xia et al. | Isolation of human sebaceous glands and cultivation of sebaceous gland-derived cells as an in vitro model | |
| Moll | Proliferative potential of different keratinocytes of plucked human hair follicles | |
| JP2002520594A (ja) | 不死化ヒトケラチノサイト細胞系統 | |
| Zouboulis et al. | Culture of human sebocytes and markers of sebocytic differentiation in vitro | |
| Surya et al. | Assessing the differentiation state of cultured bovine urothelial cells: elevated synthesis of stratification-related K5 and K6 keratins and persistent expression of uroplakin I | |
| Muresan et al. | Involvement of cutaneous SR-B1 in skin lipid homeostasis | |
| JP6688051B2 (ja) | メラニン産生抑制剤 | |
| US11530384B2 (en) | Use of matrix cells for preparing a micro hair follicle | |
| Phillips et al. | Convergent differentiation in cultured rat cells from nonkeratinized epithelia: keratinocyte character and intrinsic differences. | |
| Bergstresser et al. | [60] Detection by immunochemical techniques of cell surface markers on epidermal Langerhans cells | |
| WO2005071065A1 (en) | Method for studying functional interactions between sensory neurons and keratinocytes or melanocytes | |
| Pauli et al. | Development of an in vitro and in vivo epithelial tumor model for the study of invasion | |
| Pasco et al. | Effect of hormones and EGF on proliferation of rat mammary epithelium enriched for alveoli: an in vitro study | |
| Abdel‐Naser | Selective cultivation of normal human sebocytes in vitro; a simple modified technique for a better cell yield | |
| Niderla-Bielinska et al. | Keratinization of outer root sheath cells is prevented by contact with inner root sheath of rat hair follicles | |
| US12098386B2 (en) | Use of germ cells for preparing a micro hair follicle | |
| US20200181571A1 (en) | Use of germ cells for preparing a micro hair follicle | |
| Busch et al. | Vesicular pH is sensitive to changes in cell volume | |
| Niderla-Bielińska et al. | Involucrin, but not filaggrin and Kdap mRNA, expression is downregulated in 3-D cultures of intact rat hair bulbs after calcium stimulation | |
| Sobiepanek et al. | Soszy nska |