KR20020013495A - 세보사이트, 세보사이트 세포주 및 이들의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 피지성 물질을 분지하는 지방 세포(세보사이트)에 관한 것이다. 본 발명은 특히 피지선 세포 및 많은 계대배양을 거쳐 연속적으로 배양되는 성질을 가진 피지선 세포주에 관한 것이다. 세보사이트는 유용한 용도에 매우 적합하다.

Description

세보사이트, 세보사이트 세포주 및 이들의 용도 {SEBOCYTES, SEBOCYTE CELL LINES AND APPLICATIONS THEREOF}
증가된 징후는 세보사이트가 병리생리학적 과정과 피지선/모 복합체(sebaceous gland/hair complex), 특히 여드름에서 중요한 역할을 하는 것을 제안한다[Gollnick et al. J.Dermatol. 1991; 18:489-499; Brown and Shalita, Lancet 1998;351;1871-1876; Cunliffe, Dermatology 1998; 196:9-15; Strauss, Dermatology 1998;196:182-184]. 대부분의 피지선의 생리학 및 병리생리학은 실험 동물 모델로부터 이해된다[Pochi in "Models in Dermatology", Vol. 2, N. Loweand H. Maibach, editors, Basel, 1985;70-75]. 그러나, 동물 모델은 인간에 대한 항 여드름 약물의 효능 평가를 위한 합리적인 예측을 가능하게 하지 못한다고 알려져 dlT다[Geiger, Dermatology 1995; 1991:305-310]. 여드름이 인간에서만 발생한다는 사실과 피지선의 분비 활동이 매우 화학종 특이적이라는 사실[Nikkari, J. Invest. Dermatol. 1974; 257-267]로 인해 인간 모델을 찾아야 했다. 이러한 단점을 피하기 위한 예비 연구가 인간 피부 샘플을 이용하여 실행되었고, 이것은 생체외에서 인큐베이션되거나[Hsia et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1970; 135:285-291; Cooper et al., Br.J.Dermatol. 1976;94:156-172; Sharp et al., J. Endrocrinol. 1976; 70:491-499], 누드 마이스로 이식되었다[Petersen et al., J. Clin.Invest. 1984; 74:1358-1365]. 이러한 인간 세보사이트의 활성과 이들의 조절에 대한 기본적인 연구는 살아있는 인간 피지선이 분리됨에 따라, 단지 최근 수십년 동안에 가능하게 되었고[Kealex et al. Br. J. Dermatol. 1986; 114:181-188], 인간 세보사이트에 대한 배양 모델을 생체외에서 설정할 수 있었다[Xia et al., J. Invest. Dermatol. 1989; 93:315-321].
지아(Xia)등의 배양 기술(1989)의 변법에 의해, 최근 수년 동안 생체외에서 인간 세보사이트 배양의 재생산성이 향상되었다. 따라서, 초우볼리스(Zouboulis) 등은 인간 혈청을 첨가하여 배양 배지에서 하이드로코르티솔(hydrocortisol)을 제거하였다[Skin. Pharmacol. 1991; 4:74-83]. 리(Lee)는 피지선을 콜라겐분해효소로 처리하고, 이들을 첨가제가 풍부한 혈청 부재 배지에서 배양시켰다[in Epithelia: Advances in Cell Physiology and Cell Culture; C.J. Jones, editors:Kluwer, Dordrecht, 1990; 333-350)]. 또한, 1차 세보사이트 배양물은 접착 베이스층으로 기능하는 3T3 섬유아세포층을 제거하여 수득하였다[Akamatsu et al., J. Invest. Dermatol. 1992; 99: 509:511]. 2차 배양물을 지질 부재 혈청이 보강된 배지[Zouboulis et al., J. Invest. Dermatol. 1993; 101:629-633] 및 첨가제가 없는 혈청 부재 각질세포 함유 배지에서 유지시켰다[Akamazu et al., J. Invest. Dermatol. 1992; 99:509-511]. 또한, 인간 세보사이트의 증식과 수율은 각질세포 성장 인자(KGF)에 의해 현저하게 증가하는 것으로 나타났다.
이러한 기술의 상승에도 불구하고, 분리된 인간 피지선으로부터 다량의 세보사이트를 배양시키는 것이 어려운 상황으로 인해 더이상의 발전이 강하게 저지되고 있다. 특히, 장기간 동안 배양물에서 세포 물질을 유지하는 것이 어렵다. 이에 대한 이유로서, 세보사이트가 분화되고, 자연적인 세포막 파열에 의해 죽고, 후속하여 이들의 내용물이 방출되는 경향이 있는 것으로 추정된다. 현재로서 수득된 최상의 결과는 후지에(Fujie) 등의 결과이며[Arch. Dermatol. Res. 1996; 288:703-708], 후지에는 지아 등의 기술을 기초하여 피지선을 분리하고 세포 접착층 없이 혈청 부재 각질세포 배양 배지에서 6회 계대배양을 통한 분산된 세포 배양 방법에 의해 세보사이트를 배양시켰다.
본 발명은 세보사이트(sebocyte)라 불리우는, 피부 및 점막의 그리스 또는 지질 함유 및 피지(sebum) 생성 세포에 관한 것이다. 본 발명은 특히 다량의 계대배양(subculture)을 통해 연속적으로 배양될 수 있는 특성을 갖는 피지선의 세포 및 피지선의 세포주에 관한 것이다. 세보사이트는 특히 유용한 용도, 예를 들어 인간 또는 동물 피지선의 병리생리학 및 생리학의 연구, 여드름, 지루증 또는 다른 질환의 발생 연구, 다양한 물질 및 약물의 효과 시험, 2차원 또는 3차원 세포 어셈블리 및 장기 유형 구조물의 제작에 기초된 세포 배양 시스템의 개발, 및 이러한 세포로부터 유래하는 생성물의 제조에 적합하다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 보다 높은 수의 계대배양을 통해 배양액중에 유지될 수 있는 세보사이트(피지 세포)를 제공하는 것이다. 본원에서, 제공된 세보사이트는 형태학, 표현형 및 기능적 특징면에서, 생리학적, 병리생리학적 및 약학 평가 및 연구를 위해 이들이 지질 함유, 피지 생성 세포, 및 특히 세보사이트에 대한 세포 물질 또는 세포 배양 모델로서 적절한 범위로 살아있는 정상 인간 세보사이트의 특징에 접근할 것이다.
이러한 목적은 무한증식 세보사이트의 제공에 의해 해결된다. 적합하게, 본 발명의 세포는 유용한 응용을 위해 가장 중요하므로, 인간으로부터 유도된다. 이러한 종류의 세보사이트는 인간 피하선 세포계 SZ95에 존재하며, 이것은 기탁 번호 제 DSM ACC2383하에 유기물 및 세포 배양의 독일 기탁기관에 기탁되었다.
바람직한 구체예의 설명
하기에서 본 발명은 도면 도 1을 참고로 보다 상세하게 설명될 것이며, 도 2는 본 발명에 의해 제공된 무한증식 세보사이트 SZ95가 이들이 유래하는(본 발명의 경우: 인간으로부터 유래함) 1차, 정상 세보사이트의 상피 다형 외관을 유지한다는 것을 보여준다. 또한, 제공된 무한증식 세보사이트와 이들의 클론(클론은 단일 세포로부터 확실하게 유래하는 세포를 의미한다)이 특징적인 94-kD-거대 SV-40 거대 T-항원을 발현하며, 코딩 DNA 서열 트랜스펙션이 이후의 계대배양에서 수행되었다. 도 1은 (a) 제 2 계대배양의 정상 인간 세보사이트, b) 1차 계대배양으로부터 무한증식 세보사이트에 의해 공급된 바와 같은 부착성 세보사이트 배양물 및 c) 공급된 무한증식 세보사이트(클론의 50회 계대배양)를 보여준다. 모든 세포는 유사한 상피 다형 구조를 나타낸다. 도 2는 (a) 공급된 영구 세보사이트 및 (b) 양성 대조군으로서 작용하는 상피 세포 배양 세포 HMEC-1의 세포원심분리된 샘플을 보여주며, 이 둘은 모두 인간 SV-40 거대 T-항원에 대해 모노클로날 항체로 표지되었다. 양쪽 샘플은 양성으로 표지되고 인간 SV-40 거대 T-항원이 주로로 세포핵, 부분적으로는 세포의 세포질에 존재함을 보여준다. c) 에서는, 공급된 무한증식 세보사이트에서 인간 SV-40 거대 T-항원의 발현이 웨스턴 블롯 분석에 의해 증명된다. 인간 SV-40 거대 T-항원이 트랜스펙션되지 않은 정상 인간 세보사이트(레인 1)와 정상 인간 상피 각질세포(레인 2)에서 검출되지 않는 반면, 특징적인 94kD 거대 단백질은 34회 계대배양(레인 3) 뿐만 아니라 세개의 분리된 클론(레인 4, 5 및 6)의 공급된 무한증식 세보사이트의 단백질 추출물에서 측정되었다.
본 발명의 무한증식 세보사이트는 바람직하게는 인간으로부터 유래한다. 용어 "세보사이트(sebocytes)"는 광의로서, 즉, 다소의 그리스(grease) 또는 지질을 함유하고 피지를 생성시키는 모든 세포와 관련이 있는 것으로 이해되어야 한다. 피지는 단지 다양한 지방 또는 지질 물질만으로 구성된다. 이와 관련하여, 세포의 지방 또는 지질 함량은 지질 물질의 분율에 따라 변할 수 있다. 반드시 그러한 것은 아니지만 대개는, 세포의 지방 또는 지질 물질의 함량은 유리 지방산, 트리글리세라이드, 왁스, 스쿠알렌, 유리된 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스테르, 디히드록시 콜레스테롤 및 그 밖의 스테로이드, 및 탄화수소를 포함한다. 특히, 이들 무한증식 세보사이트는 인간의 피지선 세포로부터 유래한 것이 바람직하다. 세보사이트가 인간 안면의 피지선 세포로부터 유래하는 경우, 의료 목적에 특히 양호한 적합성이 달성된다.
본 발명의 세보사이트의 본질적 특성은 이들의 무한증식에 있다. 본원에서사용되는 용어 무한증식은 기본적으로 다수의 계대배양을 통해 세포의 생육 상태를 유지시킴을 의미한다. 정상적인 인간의 세보사이트는 사멸하기 전에 3 내지 6회의 계대배양까지만 성장할 수 있지만, 본 발명의 무한증식 세보사이트 SZ95는 과거 약 4½년 동안 관찰한 결과 50회 이상 계대배양될 수 있었다.
본 발명에 따른 무한증식 세보사이트는 증식 억제 유전자와 안정한 불활성의 복합체를 형성시키는데 작용하는 DNA로-바람직하게는 인간 유래의 세보사이트, 특히 인간의 피지선으로부터 유리하는 세보사이트를 사용하여-정상적인 세보사이트를 트랜스펙션시킴으로써 수득될 수 있다. 특히 성공적인 무한증식은 SV-40 거대 T-단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 DNA로 정상적인 인간의 세보사이트, 특히 안면의 피지선으로부터 유래하는 세보사이트를 트랜스펙션시킴으로써 본 발명에서 달성되었다. SV-40 거대 T-항원(단백질)의 무한증식 효과, 및 인간 세포를 트랜스펙션시키기 위한 코딩되는 DNA 서열의 상응하는 용도는 공지되어 있다. 이와 같이, 무한증식 세포주는 SV-40 T를 코딩시키는 DNA에 의한 트랜스펙션을 통해 수득되었으며, 예를 들어 상피 기원[참고문헌: Tohyama et al., Tohoku. J. Exp. Med. 1997; 182:75-82; Bae et al., Prostate 1998; 34:275-282] 및 내피 기원[참고문헌: Ades et al., J. Invest. Dermatol. 1992; 99:683-690 및 WO-A-92/17569]의 기타 세포들이 사용되어 수득되었다.
외래 DNA가 양이온성 지질/DNA 복합체를 통해 세포내로 세포내이입에 의해 취해지는[참고문헌 : Wang et al., In. Vitro. Cell. Dev. Biol. 1991; 27A:63-74; Staedel et al., J. Invest. Dermatol. 1994; 102:768-772], 양이온성 지질(멤브레인 여과된 물[1mg/ml] 중에 양이온성 지질 DOTMA [1,2-디올릴옥시프로필-3-트리메틸 암모늄 클로라이드] 및 DOPE [디올릴포스파티딜에탄올아민]을 함유하는 1:1 (w/w) 리포솜 제형인 리포펙틴(LIPOFECTIN) 시약)의 적용에 의한 유전자 전달 방법으로 세보사이트를 트랜스펙션시킴으로써, 무한증식에 대한 양호한 결과가 달성되었지만, 트랜스펙션 혼합물이 적합한 트랜스펙션 완충액중에 0.25 내지 2.0부피%, 특히 2.0부피%의 리포펙틴 시약 및 0.05 내지 0.5중량%, 특히 0.5중량%의 DNA를 함유하는 것이 바람직한 것으로 밝혀졌다. SV-40 거대 T-단백질을 코딩하는 DNA와 유사한 외래 DNA는 전형적으로 적합한 벡터내에 삽입되며, 이러한 삽입에 의해 SV-40 거대 T-단백질의 발현이 바람직하게는 프로모터 및 엔핸서 서열에 의해 증대된다. 정상적인 인간의 세보사이트가, SV-40 거대 T-항원을 코딩하는 DNA에 의해 트랜스펙션된다면, 제공된 세보사이트가 성공적인 트랜스펙션 및 무한증식 후에 SV-40의 대용량 T-항원을 발현시킬 것으로 예상된다. 이것은 SV-40 거대 T-항원에 대한 모노클로날 항체를 사용하여, 면역학적 세포화학 방법 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 본 발명에 따라 제공된 무한증식 세보사이트인 것으로 확인되었다.
이와 같이 수득된 무한증식 세보사이트는 이러한 형태로 적용 목적에 우수하게 사용될 수 있는 세포주의 상태에 있는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 무한증식 세보사이트는 혈청 부재 배양 배지에 순응 후에, 트랜스펙션되지 않은 정상적인 인간 세보사이트 보다 우수하게 성장하였고, 혈청 부재 배지내에 유지된 트랜스펙션되지 않은 정상적인 인간 세보사이트와는 대조적으로 피지선 특이적 지질을 합성시키는 능력을 보유하고 있었다. 본 발명에 따른무한증식 세보사이트는 연속적으로 재생이 가능하고 증식되는 세포주로서 기능을 수행할 수 있으며 규정된 배양 배지에서 성장할 수 있다.
본 발명에 따른 무한증식 세보사이트의 특정 값은 이들이 형태학적 표현형 및 기능형 측면에서 트랜스펙션되지 않은 정상의 및 분화된 세보사이트의 특징을 가지고 있음을 나타낸다. 그러므로, 본 발명에 따른 무한증식 세보사이트는 생리학적, 이상생리학적 및 약물학적 연구를 위한 모델로서 우수하게 제공될 수 있다. 동시에, 인간 기원의 통상적으로 배양된 정상적인 세보사이트의 제한된 생명력의 단점이 회피된다. 따라서, 본 발명에 따른 무한증식 세보사이트가 정상적인 세보사이트의 표현형을 실질적으로 유지할 수 있으며 기능적인 측면에서 안면의 트랜스펙션되지 않은 정상적인 인간 세보사이트와 유사하게 거동할 수 있다고 확신되었다.
본 발명에 따른 무한증식 세보사이트 또는 세보사이트 세포주가, 트랜스펙션되지 않은 정상적인 인간 세보사이트의 외양과 유사한 다형의 상피 외양을 나타낸다는 것이 밝혀졌다. 세포 배양시에, 세포는 다양한 크기 및 세포내 구조로 성장하였는데, 이는 다양한 세포 성숙 단계를 나타낸다. 이와 같이, 다양한 크기, 평균적으로는 컨플루언트(confluent) 성장과 비교하여 5배 또는 6배 이하 크기의 세포가 관찰되었는데, 이는 시험관내에서 분화가 진행되는 트랜스펙션되지 않은 정상적인 인간 세보사이트의 세포 성장 증가분에 본질적으로 상응한다(평균적으로 4배 내지5.5배의 크기 차이). 더욱이, 본 발명에 따른 무한증식 세보사이트는 트랜스펙션되지 않은 정상적인 인간 세보사이트에서와 같이, 세포질에서 지방 물질 또는지질 입자가 많은 것으로 밝혀졌다. 정상적인 인간 세보사이트에 대하여 보편적인, 특성적인 피지선 지질 스쿠알렌 및 왁스 에스테르의 합성은 본 발명을 수행하는 동안에 실험적으로 확인되었다. 더욱이, 본 발명에 따른 무한증식 세보사이트는 유리 지방산을 합성하였는데, 이는 트랜스펙션되지 않은 정상적인 인간 세보사이트의 시험관내 연구와 관련이 있으며 다수의 계대배양 이후에도 그러하다.
또한, 세보사이트 기원을 확신시키고 생육가능한 분화를 나타내는 발현 마이커는 본 발명의 무한증식 세보사이트 또는 세보사이트 세포주의 세보사이트에 대한 전형적인 지시로서 확인되었다. 이와 같이, 무한증식 세보사이트 또는 세보사이트 세포주는 피지선 항원, 인간의 유지방 글로불린 1 및 2, 인간의 상피 시알로뮤신, 톰센-프리덴리치(Thomsen-Friedenreich) 항원, 뮤신 유사 발암물질 관련된 항원 및 상피막 항원과 같이, 인간의 다형 상피의 점액질 단백질 그룹에 대하여 전형적인 항원을 발현시켰다. 이것은 면역 세포 화학적 방법 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 본 발명의 수행중에 확인되었다. 또한, 본 발명의 무한증식 세보사이트 또는 세보사이트 세포주는 서브-클래스 7, 13 및 19의 항원과 같은, 트랜스펙션되지 않은 정상적인 인간 세보사이트에 대하여 전형적인 케라틴성 항원을 발현시켰다. 항원의 표현형은 이와 같이 세보사이트의 분화 뿐만 아니라 세보사이트의 기원을 나타냈다.
또한 기능적인 점에서, 본 발명의 무한증식 세보사이트(sebocyte) 또는 세보사이트 세포주는 트랜스펙션되지 않은 정상 인간 세보사이트와 유사하다. 따라서, 본 발명의 무한증식 세보사이트는 예를 들어, 5α-디히드로테스토스테론에 의해 그생체외 증식을 강화함으로써 안드로겐의 작용에 반응한다. 또한, 본 발명의 무한증식 세보사이트 또는 세보사이트 세포주는 레티노이드 특히, 비방향족형(예를 들어, 13-cis-레티노산, 전-트랜스(all-trans-retinoic acid)의 작용에 의해 그 증식을 변화시킬 수 있는 능력을 갖는다.
본 발명의 바람직한 구체예는 무한증식 및 바람직한 인간 세보사이트가 클로닝되는 것이다. 이것은 무한증식 세보사이트 또는 이렇게 생성된 세보사이트 세포주가 잘 정의되고 그 독특한 게놈 기초에 의해 특이적으로 특성화되므로 유리하다. 클로닝되는 무한증식 인간 세보사이트 세포주는, 배양 용기 당 단지 하나의 세포로부터 다시 세포 분열이 시작될 때까지 충분히 긴 시간 동안 배양 용기내의 무한증식 세보사이트를 점진적으로 희석함으로써 적절히 수득될 수 있다. 이것은 현미경에 의해 관찰되고 제어될 수 있다.
따라서, 수득된 무한증식 인간 세보사이트 또는 이렇게 수득된 세보사이트 세포주가 트랜스펙션되지 않은 정상 인간 세보사이트와 비교하여 세보사이트 동일성을 유지하는 것이 본 발명의 과정중에서 밝혀졌다. 이것은 특성 결정 및 기능성 시험에 의해 확인되었다.
상기 본 발명의 이점을 수반하는 명세 SZ95를 가진 세보사이트 세포주로는 수탁번호 ACC2383 하에 DSMZ에 기탁된 피지선 세포주가 대표적이다.
따라서, 본 발명에 따른 무한증식 세보사이트 또는 세보사이트 세포주는 유용한 응용 가능성을 크게 제공한다. 일반적으로, 본 발명에 따른 세보사이트 또는 세보사이트 세포주는 진단, 치료 또는 화장품 용도로 이용될 수 있다. 특히, 상기세보사이트 또는 세보사이트 세포주는 특히 인간 또는 동물의 피지선 세포인 지질함유 피지 생성 세포의 생리학 또는 병리생리학뿐만 아니라 피부의 병리생리학적 과정 및 여드름과 같은 피부 질환에서의 그 역할을 연구하고 개발하는 데 기여한다. 본 발명의 도움으로, 여드름 및/또는 지루증 및/또는 기타 질병의 발생 특히, 피지선 세포가 작용을 하거나 작용을 할 수 있는 피부 질환의 발생이 연구될 수 있다. 본 발명의 생성물은 항여드름 화합물 및/또는 항지루증 화합물 또는 치료제의 시험 및 평가를 위한 우수한 모델로서 추가로 기여하지만, 또한 피지선 세포가 작용하거나 작용할 수 있는 질환 특히, 피부 질환에 대한 치료제로서 기여한다. 특히 임상 연구의 수행에 대하여, 약물의 약리학적 특성에 대한 이러한 생체외 연구가 유용하다.
상기와 같은 본 발명의 세보사이트 또는 세보사이트 세포주는 추가의 세포 배양 시스템이 도입될 수 있는 이점을 갖는다. 이것은 단일 또는 복합 세포 배양 시스템의 개발을 포함한다. 단일 세포 배양 시스템은 일반적으로 2차원 단일층 또는 복수층 부착성 배양 또는 비부착성 배양을 의미하고, 예를 들어 상기 세보사이트를 이종 세포형에 부가하거나 또는 그것을 중간- 또는 비-투과성 막을 통해 배양함으로써 형성될 수 있다[참고문헌: Schwartz et al., J. Surg. Res. 1998; 76: 79-85; Nackman et al., Surgery. 1998; 124: 353-361]. 복합 세포 배양 시스템은 일반적으로 단일층 또는 복수층 배양액의 3차원 배양을 의미하고, 예를 들어 세포를 타원체로서, 타원체 상에서, 콜라겐 내에서 또는 기타 젤리형 재료 내에서 또는 인위적 피부형 구조물 내에서 배양함으로써 형성된다[참고문헌: Korff andAugustin, J. Cell. Biol. 1998; 143: 1341-1352; Hamamoto et al. Anticancer. Res. 1998; 18.4147-4157; Hamilton, Cancer. Lett. 1998; 131:29-34; Niemann et al., J. Cell. Biol. 1998; 143:533-545; Awata et al., J. Gastroenterol. Hepatol. 1998; 13Suppl:S55-61; Voura et al., Microsc. Res. Tech. 1998; 43:265-275; Pipili-Synetos et al., Br. J. Pharmacol. 1998; 125:1252-1257; Vasile et al., J. Histochem. Cytochem. 1999; 47:159-168; Michalopoulos et al. Hepatology. 1999; 29:90-100; Trent and Kirsner., Int. J. Clin. Pract. 1998; 52:408-413; Fransson et al., Br. J. Dermatol. 1998; 139:598-604; Konstantinova et al., Arch. Dermatol. Res. 1998; 290:610-614; Black et al. FASEB J. 1998; 12.1331-1340; Zhao et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999; 254:49-53].
특히 유용한 응용분야는 3차원 세포 어셈블리의 발생, 또는 본 발명의 세보사이트 또는 세보사이트 세포주를 기재로 하는 기관형 구조물의 제작 또는 복원에 관계된다. 이러한 목적을 위하여, 세보사이트는 단독으로 사용되지만, 추가로 피부 생성 세포 특히 각질형성세포, 섬유아세포, 멜라닌세포, 내피세포, 랑게르한스 세포 및/또는 모낭세포에 부가하여 사용하는 것이 바람직하다. 3차원 세포 어셈블리를 발생 또는 기관형 구조물의 제작 또는 복원을 위하여, 먼저 콜라겐 또는 기타 젤리형 재료 및/또는 비활성 조직의 일부를 구비한 지지체 스캐폴드(scaffold)가 제공되고 나서, 상기 세포가 이 지지체 스캐폴드내 또는 위로 도포된다. 이 방법은 기본적으로 당업자에게 공지되어 있고, 샘플은 시판된다[참고문헌: Trent andKirsner, Int. J. Clin. Pract. 1998; 52;408-413; Fransson et al., Br. J. Dermatol. 1998; 139:589-604; Konstantinova et al., Arch. Dermatol. Res. 1998; 290:610-614; Black et al., FASEB. J. 1998; 12:1331-1340; Zhao et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999; 254:49-53]. 이렇게 제조된 "인공 피부" 또는 대체 피부는 이식 또는 동종이계 이식 의술, 손상된 피부 부위 예를 들어 화상 입은 피부의 복원, 또는 피부 병변의 치료에 대한 우수한 가능성을 제공한다. 본 발명의 도움으로, 그러한 "인공 피부"는 본 발명의 세보사이트가 제작에 혼입되는 경우 지질/피지를 충분한 양으로 합성할 수 있다.
추가적으로 유용한 응용 분야는 본 발명의 세보사이트 또는 세보사이트 세포주로부터 유도된 생성물을 제조하는 것에 관련된다. 이것은 세포 물질 예를 들어, 지질, 단백질, DNA 및/또는 RNA의 분리 및 정제를 포함한다. 세포에 무한증식성이 부여되었으므로, 그들은 이러한 세포 물질에 대한 연속적 공급원으로서 계속 제공된다. 이러한 세포로부터 수득될 수 있는 매우 적당한 물질에 대한 특정 예는 다음과 같다: 국소용 약제 및 의약에서 사용하기 위한 피부 지질, 세보사이트의 표현형 특성과 관련하여 하기 실시예 3에서 언급된 항원 단백질, 및 추가로 플라스미드 DNA 또는 벡터 DNA의 제조. 플라스미드 DNA 또는 벡터 DNA의 제조는 당업자에게 공지된 유전공학에 의해 수행될 수 있다. 따라서, 지질 생산을 유도하는 유전자가 복원될 수 있다. 특히 바이러스 벡터의 제조를 포함하는 이러한 적당한 플라스미드 및 벡터 제작에 의해, 기타 세포 및 기관이 또한 변형되거나 트랜스펙션될 수 있다.
본 발명은 하기 비제한적 실시예를 참조하여 더욱 상세하게 설명될 것이다.
실시예
하기 설명되는 실시예에 대하여, 물질 및 방법에 대한 것으로서의 하기 구체예가 사용될 것이다. 실시예는 제한적인 것으로 해석되어서는 안된다.
세포 배양물
별다른 언급이 없는 한, 모든 세포를 10% 열불활성화된 우태아 혈청 (FCS; Biochrom) 뿐만 아니라 50 ㎛/㎖ 겐타마이신 (입수처: Gibco-BRL, Karlsruhe, Germany)이 보강된 2 mM N-아세틸-L-알라닐-L-글루타민을 지닌 변형된 DMEM/HAM의 F12-배지 (1:1) (입수처: Biochrom, Berlin, Germany)로 구성된 유착 배양물로서 배지내에 유지시켰다. 배양물을 37℃에서 5% CO2를 함유하는 습한 환경에서 유지시키고, 배양 배지를 2 내지 3일 마다 갈아주었다.
정상 인간 세보사이트의 분리 및 배양
정상 세보사이트를 시아(Xia) 등의 문헌 (J. Invest. Dermatol. 1989; 93:315-321)에 보고된 바와 같이 수술 중인 87세된 여성 환자의 안면 피부로부터 분리하였다. 분리된 피지선을 9 ng/㎖ 상피 성장 인자 (EGF), 9 ng/㎖ 각질세포 성장 인자 (KGF) (두 인자의 입수처: Boehringer Mannheim, Germany), 0.4 ㎍/㎖ 히드로코르티손 (입수처: Sigma, Deisenhofen, Germany) 뿐만 아니라 10-9M 콜레라 독소 (입수처: Calbiochem, Bad Soden, Germany)가 보강된 표준 배지에서 공급층없이 배양하였다. 1차 정상 세보사이트 배양물은 피지선 소엽의 주변부로부터의 증식으로서 나타났다.
면역세포화학적 시험
서브-컨플루언트(sub-confluent) 정상 세보사이트 배양물의 분산된 세포를 세포원심분리에 의해 유리 슬라이드에 부착시켰다. 샘플을 공기 건조시키고, 10분간 차가운 아세톤으로 고정시켰다. 그 후, 표본을 실온에서 30분간 각각의 모노클로날 항체 또는 대조 항체와 인큐베이션시켰다. 결합된 항체를 실온에서 30분간 토끼/항-마우스 IgG (H+L)로부터의 모노클로날 항체 컨쥬게이트의 1:100 희석액과 알칼리 포스파타제/항-알칼리 포스파타제 복합체 (입수처: Dianova, Hamburg, Germany)와 커플링시킴으로써 검출하였다. 1차 및 2차 모노클로날 항체를 pH 7.4에서 10% RPMI-1640과 10% FCS를 함유하는 용액에 희석시켰다. 세척 단계를 Ca2+와 Mg2+가 없는 PBS 완충액 (입수처: Biochrom)으로 3회 수행하였다. 표본을 유착제로서의 뉴푸크신(Neufuchsin)과 커플링제로서의 나프톨염 (두 제제의 입수처: Sigma)을 사용하여 완충 용액에서 30분간 염색시키고, 메이어의 해말룸 (Mayer's Haemalum) (Merck, Darmstadt, Germany)를 사용하여 역염색시키고, 덮고, 광학 현미경으로 평가하였다.
단백질의 분리 및 정량
세포 배양물을 PBS로 2회 세척하고, 50 mM HEPES, 1% 노니뎃(Nonidet) P-40 (입수처: ICN, Aurora, OH, USA), 150 mM NaCl 뿐만 아니라 프로테아제 억제제(CompleteTMMini; 입수처: Boehringer Mannheim)로 구성된 차가운 용액에 의해 배양 접시에서 직접 용해시킨 후, 스크러빙하고, 작은 원심분리 접시에 수거하여 세포 단백질을 단리하였다. 수득된 물질을 초음파 파괴에 의해 균질화시키고, 원심분리하고, 상층액을 얼음에 정치시켰다. 비신코닌산 (BCA-단백질 검정; 입수처: Pierce, Rochford, IL, USA)을 첨가하여 전체 단백질을 가시화시키고, 단백질 농도를 550 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다.
웨스턴 블롯 분석
단리된 단백질의 분취량 (20㎍)을 15분간 95℃로 가열하였다. 1차원 SDS/PAGE 전기영동을 7.5% 겔상에서 각각의 샘플에 대해 수행하였다. 그 후, 단백질을 표준 블롯 시스템 (입수처: Bio-Rad, Muechen, Germany)을 이용하여 이동막(transfer membrane) (PVDF의 임모빌론-P; 입수처: Millipore, Eschborn, Germany)으로 이동시켰다. 블롯을 실온에서 60분간 1차 모노클로날 항체와 인큐베이션시킨 후, 각각 양고추냉이 과산화효소-컨쥬게이션된 염소/항-마우스 모노클로날 항체 및 염소/항-토끼 모노클로날 항체 (입수처: Oncogene Science)와 실온에서 60분간 0.2 ㎍/㎖의 희석액중에서 인큐베이션시켰다. 철저히 세척한 후, 신호를 표준 검정을 이용하는 화학발광법 (ECL, 입수처: Amersham, Braunschweig)에 의해 X선 민감성 필름 (XAR 5; 입수처: Kodak, Rochester, NY, USA)상에서 가시화시켜, 다양한 조명 간격을 조정하였다.
오일 레드 및 나일(Nile) 레드 염색
챔버 슬라이드에서 성장시킨 세포를, 시아 등의 문헌 (1989) (상기 참조)에 보고된 바와 같이, 60% 이소프로파놀에서 15 내지 120분간 0.6% 오일 레드 (Sigma)와 인큐베이션시키거나 실온에서 15분간 1 ㎍/㎖의 나일 레드 염료 (입수처: Kodak)와 인큐베이션시켰다. 그 후, 배양물을 광학 현미경으로 관찰하거나 (오일 레드 염색 후), 580 nm 보다 큰 광 방출에 의해 450 내지 500 nm 띠통과 여기 필터를 사용하는 형광 현미경으로 관찰하였다 (나일 레드 염색 후).
유동 세포계측법
분산된 표지되지 않은 세포를 통상적인 분류기를 사용하여 세포 크기를 결정하면서, 나일 레드 염료 (입수처: Kodak)로 표지된 세포를 형광도를 기초로 하여 유동 세포계측법에 의해 지질 함량을 평가하였다. 샘플 당 10,000개의 세포를 시험하였다.
표지화 및 지질의 추출
세포 배양물을 배양 배지에 2일간 유지시킨 후, 2 mM L-글루타민, 10% 열불활성화된 FCS 및 100 IU/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신이 보강된 RPMI-1640 배지 중의 0.5 μCi/㎖의 농도로 [2-14C] 아세트산의 나트륨염 (45 - 60 mCi/mmol; 입수처: Dupont-NEN, Boston, MA, USA)에 의해 방사활성적으로 펄싱시켰다. 인큐베이션을 24시간 더 계속하였다. 지질을 배양된 세포 및 상층 배양 배지로부터 단리하고, 중성 지질, 지방산 및 인지질로 분리하였다 (참조: Seifert et al. J. Invest. Dermatol. 1997; 108: 375).
분획으로의 크기 분리 및 중성 지질과 유리 지방산의 가시화를 20 x 10 ㎠ 실리카겔 코팅된 유리 플레이트 (입수처: Merck, Darmstadt, Germany)상에서 고성능 박막 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 달성하였다. 플레이트를 n-헥산으로 전처리하고, 24시간 동안 건조시켰다. 샘플을 자동 지질 도포기 (Linomat IV; Camag, Berlin, Germany)로 도포시켰다. 중성 지질의 크로마토그램을 9 cm로 n-헥산-디에틸에테르 용액 (9:1)에서 전개시키고, 건조시키고, 4.5 cm로 클로로포름/디에틸에테르, 에틸아세테이트의 용액 (80:4:16)에서 후-전개(post-developing)시켰다. 조명을 위해, 영상 분석기 ("BAS 1000 Bio-Imaging Analyser", Fuji)를 사용하여 스캐닝되는 조명 시트 (TR 2040S, 입수처: Fuji, Tokyo, Japan)를 사용하였다. 지질 표준물질을 비교 샘플로서 사용하였다.
성장 거동 시험
세포를 웰 당 0.5 내지 4 x 103개의 세포 밀도로 96 웰 배양 플레이트에 시딩하였다. 세포 증식을 4-메틸움벨리페릴헵타노에이트형광 검정에 의해 평가하고, 자동 측정하였다 (Zouboulis et al. Melanoma. Res. 1991; 1:91-95).
이와 관련하여, 평가하는 날에, 배양 배지를 분리하고, 세포를 PBS로 2회 세척하고, PBS 중의 4-메틸움벨리페릴 헵타노에이트 (Sigma, Deisenhofen, Germany)의 100 ㎍/㎖ 용액 100㎕를 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 30분간 인큐베이션시키고, 방출되는 형광을 적당한 형광 측정 장치 (Titertec-Fluoroscan II; Flow, Meckenheim, Germany)에 의해 측정하였다. 형광 단위는 355 nm 여기 및460 nm 방출 필터에서 수득되었다.
5α-디히드로테스토스테론 및 레티노이드로 처리
5α-디히드로테스토스테론(5α-DHT; 시그마(Sigma))을 DMSO에 용해시키고 후속하여 5ng/ml EGF, 50㎍/ml 소 뇌하수체 추출물, 1mg/ml 지방산 부재 소 혈청 알부민(베링거 만하임(Boehringer Mannheim)) 및 50㎍/ml 겐타마이신으로 보강된 2mM n-아세틸-L-알라닐-L-글루타민을 함유한, 혈청 부재, 페놀 부재의 개질된 DMEM/Ham's F12-배지(1:1)(집코(Gibco)-BRL)에 용해시켜 10-6M 5α-DHT 및 0.1% DMSO의 최종 농도를 수득하였다. 0.1% DMSO 단독을 대조군으로 취급하였다. 세포(0.5 내지 2X103/웰)를 5α-DHT로 18일간 처리하였다.
레티노이드로 처리한 경우, 전-트랜스-레티노산(all-trans-retinoic acid),13-시스-레티노산 및 아시트레틴(acitretin)을 DMSO에 용해시키고 후속하여 5ng/ml EGF, 50㎍/ml 소 뇌하수체 추출물, 1mg/ml 지방산 부재 소 혈청 알부민 및 50㎍/ml 겐타마이신으로 보충된 2nM n-아세틸-L-알라닐-L-글루타민을 함유한, 혈청 부재의 개질된 DME-배지/Ham's F12-배지(1:1)에 용해시켜 10-7M 레티노이드 및 0.1% DMSO의 최종 농도를 수득하였다. 0.1% DMSO 단독을 대조군으로 취급하였다. 레티노이드를 어두운 황색광하에서 취급하였다. 세포(0.5 내지 2X103/웰)를 레티노이드로 9일간 처리하였다.
통계적 분석
배양 시험을 96웰 플레이트의 6개 제형으로 평가하였다. 모든 다른 실험은 3개 제형으로 수행하였다.
실시예 1
정상 인간 세보사이트(sebocyte)의 트랜스펙션
pSVT로 지칭되는, 정상 인간 세보사이트의 트랜스펙션에 사용되는 벡터는 SV-40 거대 T 단백질에 대한 서열을 포함하는 PBR322을 기재로 하는 플라스미드 구조물이었고, 그 단백질 발현은 라우스 육종 바이러스(Rous Sarcoma Virus) 긴 말단 반복서열(long terminal repeat)에 의해 작동되었다[참조: Dutt et al. Oncogene 1990; 5: 195-200; Wang et al. In. Vitro. Cell. Dev. Biol. 1991; 27A: 63-74]. 2차 계대배양중 인간 세보사이트 배양물은 35mm 배양 접시(벡톤 디킨슨, 플리머스, 영국(Becton Dickinson, Plymouth, UK))에서 50% 컨플루언시(confluency)로 배양하여 트랜스펙션에 사용하였다. 트랜스펙션은 양이온성 지질을 사용한 유전자 전달 방법을 기준으로 하여 수행하였다. 이러한 목적으로, 멤브레인 여과시킨 물중(1mg/ml)의 양이온성 지질 DOTMA(1ㅡ2-디오릴옥시프로필-3-트리메틸암모늄 클로라이드) 및 DOPE(디올릴포스파티딜에탄올아민)의 1:1(w/w) 리포좀 제형을 함유한 리포펙틴(LIPOFECTIN) 시약을 사용하였다. 이를 위하여, 배양 배지를 제거하고, 배양 세포를 혈청 부재 배지(집코 BRL사의 Opti-MEM)로 2회 세척하고 이 배지에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 배지를 0.5ml PBS를 가진 용액중에 적당량의 pSVT DNA(1 내지 10㎍)(최종 DNA 농도 0.5중량%가 가장 바람직함) 및 적당량의 리포펙틴 시약(집코-BRL사; 5 내지 30㎕, 가장 바람직하게는 1.5부피%)를 함유한항생제 부재의 일정량의 Opti-MEM(1.5ml)으로 구성된 트랜스펙션 혼합물로 대체하였다. 배양액을 37℃에서 5% CO2를 함유한 습한 환경에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 배양액을 최종적으로 배양 배지로 2회 세척하고 상기 설명한 바와 같이 세보사이트 배양 배지에서 더 유지시켰다.
트랜스펙션 처리 후에, pSVT 처리한 세보사이트의 생존 능력이 4주 동안 현저하게 감소된 것으로 관찰되었다. 특히 최적량의 리포펙틴 시약 및 pSVT DNA를 사용한 경우에, 증식성 세보사이트 콜로니가 출현하였다. 이들 세포(SZ95)는 지금까지 50회 넘게 계대될 수 있었다. 이들은 4.5년의 관찰기간을 통해 여전히 생존가능하다.
실시예 2
무한증식 인간 세보사이트의 클로닝
이렇게 얻은 무한증식 인간 세보사이트 SZ95를, 제 1 계열에서 1X102개 세포의 세포수를 최종 계열에서 이론적으로 0개 세포로 기하적으로 감소시키는 희석 계열을 사용하는 96웰 플레이트에 접종하였다[참조: Zouboulis et al. in "The malignous melanome of the skin", C. E. Orfanos and C. Garbe(eds) Zuckschwerdt, Muenchen, Germany: 1990; 158-168]. 세포를 5mg/ml EGF 및 3ng/ml KGF로 보강된 표준 배양 배지에서 유지시켰다. 배양 세포가 광학 현미경적 실험에 의해 관찰가능한 웰당 단일 세포로부터 얻어지는 경우에 이를 클론으로 간주하였 다. 이렇게 하여, 클로닝된 SZ95 세포를 수득하였다.
실시예 3
무한증식 인간 세보사이트의 특성화
SV 거대 T 항원의 검출
무한증식 세보사이트에서 SV-40 거대 T 항원의 발현을, 마우스 혈청으로부터 얻은 항-인간 SV-40 거대 T 항원 모노클로날 항체(온코젠 사이언스(Oncogene Science, Cambridge, MA, USA))를 면역세포화학적 분석에 대해서는 1:1000 및 웨스턴 블롯 분석에 대해서는 1:100으로 희석하여 사용하여 면역세포화학적 및 웨스턴 블롯 분석에 의해 검출하였다. 인간의 정상 상피 각질세포, 피부 섬유아세포와, 양성 대조군으로서 SV-40 거대 T 항원에 의해 무한증식되는 내피 세포 HMEC-1을 대조군으로서 사용하였다.
실시예 1에 따른 무한증식 세보사이트를 SV-40 거대 T 항원에 대한 모노클로날 항체를 사용한 면역세포화학적 실험에 의하면 강한, 주로 핵, 부분적으로 세포질이 염색되었다(도 2a 참조). 정상 각질세포 및 섬유아세포는 균등하게 SV-40 거대 T 단백질의 음성 대조군이었고, 양성 대조군으로서 HMEC-1 세포는 SV-40 거대 T 단백질에 대해 주로 핵, 부분적으로 세포질 염색을 나타내었다(도 2b 참조).
도 2c는 트랜스펙션되지 않은 정상 인간 세포사이트(레인 1), 정상 인간 상피 각질세포(레인 2), 본 발명에 따른 무한증식 세보사이트(34회 계대배양; 레인 3) 및 본 발명의 따른 다양한 클로닝된 세보사이트(레인 4, 5, 및 6)에서 SV-40 거대 T 항원 발명의 웨스턴 블롯 분석의 결과를 나타낸다. 94kD에서의 밴드는 무한증식 세보사이트 주(sebocyte line) 및 그의 클론으로 확인되었고, 이로써 SV-40거대 T 단백질의 발현이 확인되었다[참조: Harlow et ak. J. Virol. 1981; 39: 861-869].
본 발명에 따른 무한증식 세보사이트의 표현형 특성
실시예 1에 따른 무한증식 세보사이트 SZ95의 형태는 상피성이었고, 다형적 외관을 나타내어 세포의 크기가 상이한 한편, 세포질에서 많은 소적이 관찰가능하였다(도 1b 및 도 1c 참조).
본 발명에 따른 무한증식 세보사이트를 각 항체를 사용하여 면역조직화학적으로 실험한 결과 피지선 항원에 대한 모노클로날 항체에 의해 염색되지 않은 정상 상피 각질 세포와 대조적으로 피지선 항원에 대하여 양성인 것으로 관찰되었다(도 3 참조). 도 3은 (a) 본 발명에 따른 무한증식 세보사이트 및 (b) 정상 인간 상피 각질세포의 세포원심 표본(preparation)에 대한 면역세포화학적 결과를 도시한다. 표본들을 피지선 항원에 대한 모노클로날 항체로 염색하였다. 본 발명의 무한증식 세보사이트가 양성 세포질 염색을 나타낸 반면, 정상 인간 상피 각질세포는 염색되지 않았다.
또한, 무한증식 세보사이트(sebocytes)에서 인간 다형성 상피 뮤신(mucine) 그룹의 다양한 단백질 및 케라틴 7, 13 및 19의 발현이 웨스턴 블롯 분석에 의해 검출된 반면, 반면에, 인간 각질세포는 단지 케라틴 13 (도 4 참조)만을 발현했다. 도 4에 따른 웨스턴 블롯 분석에서, 본 발명에 따른 무한증식 세보사이트의 총 추출 단백질(34회 계대배양; 레인 1), 본 발명에 따른 다양한 클로닝된 무한증식 세보사이트(레인 2, 3 및 4) 및 정상의 인간 표피 각질세포(레인 5)를 인간 상피 시알로뮤신(ESM)(> 400 kD), 인간 유지방(milk fat) 글로불린-1 (80-400 kD), 뮤신계 암종 관련 항원(MCA)(350 kD), 상피성 막 항원(EMA)(250-400 kD), 톰센-프리덴라이히 항원(TF 항원)(155 kD), 케라틴 7(54 kD), 케라틴 13(54 kD), 케라틴 19(40 kD) 및 타입 1의 5α-환원효소(5α-레드. 1)(21-27 kD)의 발현 확인에 사용했다. 본 발명에 따른 상기 무한증식 세포주 및 이것의 클론이 모든 시험 단백질을 발현한 반면에, 각질세포는 단지 케라틴 13 및 타입 1의 5α-환원효소만을 발현했다.
지질 합성
나일 레드(Nile Red)를 사용한 염색 및 형광분석기에 의한 평가는, 세포 세포질중의 지질의 존재를 제시했다(도 5). 본 발명의 무한증식 세보사이트 SZ95에서, 중성 지질에 대한 나일 레드 형광성 염료에 의한 염색한 결과 세보사이트 세포질에서 임의적으로 분할되는 개별적인 또는 집합된 지질 소적이 나타났다. 본 발명에 따른 무한증식 세보사이트는, 그 함량이 나일 레드로 염색한 세포의 형광세포계수에 의해 검출시, 혈청 함유 배지에서 세포당 510 형광체 단위(중간값)으로부터 혈청 부재 배지에서 세포당 429 형광체 단위(중간값; 즉 -16%)으로 감소하였다.
실시예 1의 본 발명에 따른 무한증식 세보사이트는, 전형적인 피지선 지질 스쿠알렌 및 왁스 에스테르 및 트리글리세라이드, 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스테르, 디글리세라이드, 라노스테롤 및 유리 지방산을 포함하는 중성 지질의 다양한 분획을 합성했다. 이것은 25 내지 40회의 계대배양을 통해 관찰되었다. 결과를 도 6에 제시했으며, 여기서는 HPTLC-분획처리된 지질을, 두개의 선택된 무한증식 및 클로닝된 세보사이트 배양물을 사용하여 방사측정 영상화로 방사활성 표지된 나트륨의 펄스 기록 후에 측정했다(각각, 레인 3 및 4 및 5 및 6). 레인 3, 4 및 5에 제시된 바와 같이, 세포는 스쿠알렌(Sq), 왁스 에스테르(WE) 및 트리글리세라이드(Tg), 콜레스테롤(Cho), 콜레스테롤 에스테르(ChE), 디글리세라이드(Dg), 라노스테롤(Lan) 및 유리 지방산(FFA)를 포함하는 중성 지질의 다중 분획을 합성했다. 모든 중성 지질이 세포외 상청액중에 보다 더 적은 양으로 발견되었다(레인 6). 비교를 위하여, 레인 1에 표준 지질, 레인 2에 인간 피지, 및 레인 4에 세포로부터 추출된 유리 지방산을 적용하였다. 추가 비교로서, 레인 7 및 레인 8은 각질세포의 결과를 나타내었고, 레인 7은 세포내에 콜레스테롤 및 트리글리세라이드이 주로 존재하는 반면에, 상청액(레인 8)으로부터는 주로 콜레스테린이 발견되었다.
증식 연구
본 발명에 따른 무한증식 세보사이트의 대수적 증식 패턴을, 최초 배양 세포 밀도와 무관한 52.4 ±1.6의 세포수 배가 시간(population doubling time)을 가진 정상 배양 조건에서 측정했다. 도 7은 무한증식 세보사이트 세포주(SZ95)가 세보사이트 배지에서 18일을 초과하여 증식함을 보여준다.
무한증식 세보사이트의 증식은 혈청 부재 배지의 첨가에 의해 감소했으나, 5α-DHT의 첨가 후에 회복되었다. 이것은 예시적 세보사이트 클론에 대한 도 8에 제시되며, 여기서 2,000/웰로 접종된 세포의 증식이 혈청 부재 배지(대조군) 및 10-6M 5α-DHT가 보충된 혈청 부재 배지에서 18일을 초과하여 관찰되었다. 8일 후, 5α-DHT이 세포의 증식을 현저히 증가시켰고, 이는 136시간(대조군) 및 53.7시간(5α-DHT-처리 세포(*, p<0.05; **, p<0.01))의 측정된 세포수 배가 시간에 의해 증명된다.
무한증식 세포에 대한 레티노이드의 영향은 증식 거동의 차별화된 반응으로 나타났다. 몇몇의 클론은 레티노이드에 의한 증식 저해를 나타내었으나(전형적으로 뚜렷이 구분되기로는 13-시스-레티노산>전-트랜스-레티노산>>아시트레틴), 다른 클론은 정상의 인간 상피 각질세포의 증식 반응에 상응하게 증식이 자극되었다(예를 들어, 전-트랜스-레티노산 및 13-시스-레티노산). 이것을 도 9에 나타냈다(*, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001).

Claims (23)

  1. 무한증식 세보사이트.
  2. 제 1항에 있어서, 인간으로부터 유래함을 특징으로 하는 세보사이트.
  3. 제 2항에 있어서, 인간 피지선으로부터 유래함을 특징으로 하는 세포사이트.
  4. 제 3항에 있어서, 피지선 세포가 안면 피지선 세포임을 특징으로 하는 세보사이트.
  5. 제 1항 내지 제 4항중 어느 한 항에 있어서, 세포주의 형태로 존재함을 특징으로 하는 세보사이트.
  6. 제 1항 내지 제 5항중 어느 한 항에 있어서, DNA의 트랜스펙션에 의해 무한증식함을 특징으로 하는 세보사이트.
  7. 제 1항 내지 제 6항중 어느 한 항에 있어서, SV-40 거대 T 항원을 발현함을 특징으로 하는 세보사이트.
  8. 제 1항 내지 제 7항중 어느 한 항에 있어서, 정상 세보사이트, 트랜스펙션되지 않은 세보사이트 및 분화중인 세보사이트의 특징을 나타냄을 특징으로 하는 세보사이트.
  9. 제 1항 내지 제 8항중 어느 한 항에 있어서, 세보사이트의 증식이 안드로겐 및/또는 레티노이드에 의해 변형가능함을 특징으로 하는 세보사이트.
  10. 제 1항 내지 제 9항중 어느 한 항에 있어서, 클로닝됨을 특징으로 하는 세보사이트.
  11. 인간 세보사이트 세포주 DSM ACC2383.
  12. 진단, 치료 또는 향장 제제를 위한, 제 1항 내지 제 10항중 어느 한 항에 따른 세보사이트 또는 제 11항에 따른 인간 세보사이트 세포주의 용도.
  13. 인간 또는 동물의 피지선의 생리학적 또는 병리학적 검사를 위한, 제 1항 내지 제 10항중 어느 한 항에 따른 세보사이트 또는 제 11항에 따른 인간 세보사이트 세포주의 용도.
  14. 여드름 및/또는 지루증 및/또는 기타 질환의 원인을 검사하기 위한, 제 1항내지 제 10항중 어느 한 항에 따른 세보사이트 또는 제 11항에 따른 인간 세보사이트 세포주의 용도.
  15. 제 14항에 있어서, 검사하고자 하는 기타 질환이 피지선 기능이 관련되거나 관련될 수 있는 피부 질환임을 특징으로 하는 세보사이트의 용도.
  16. 항-여드름 및/또는 항-지루증 화합물 또는 약제를 시험하기 위한, 제 1항 내지 제 10항중 어느 한 항에 따른 세보사이트 또는 제 11항에 따른 인간 세보사이트 세포주의 용도.
  17. 질환에 대한 화합물 또는 약제를 시험하기 위한, 제 1항 내지 제 10항중 어느 한 항에 따른 세보사이트 또는 제 11항에 따른 인간 세보사이트 세포주의 용도.
  18. 제 17항에 있어서, 질환이 피지선 기능이 관련되거나 관련될 수 있는 피부 질환임을 특징으로 하는 세보사이트의 용도.
  19. 단순 또는 복합 세포 배양 시스템의 개발을 위한, 제 1항 내지 제 10항중 어느 한 항에 따른 세보사이트 또는 제 11항에 따른 인간 세보사이트 세포주의 용도.
  20. 3차원 세포 응집물의 형성 또는 3차원 세포 응집물에 사용하거나 기관형 구조물의 제적을 위한, 제 1항 내지 제 10항중 어느 한 항에 따른 세보사이트 또는 제 11항에 따른 인간 세보사이트 세포주의 용도.
  21. 하기 세포로부터 유래하는 생성물의 제조를 위한, 제 1항 내지 제 10항중 어느 한 항에 따른 세보사이트 또는 제 11항에 따른 인간 세보사이트 세포주의 용도.
  22. 제 21항에 있어서, 세포 생성물이 세포의 서열 및/또는 단백질의 DNA 또는 RNA 서열에 의해 발현되는 지질, 플라스미드, 벡터, 단백질임을 특징으로 하는 용도.
  23. 기타 세포의 변형 또는 생물체의 변형을 위한, 제 21항 또는 제 22항에 따라 수득한 생성물의 용도.
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