CN107241908B - 成熟皮脂腺细胞的制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种可以蓄积脂滴的培养皮脂腺细胞。一种成熟人皮脂腺细胞的制造方法，其中，包括将未成熟人皮脂腺细胞在低氧条件下进行培养。
Description
技术领域
本发明涉及一种可以形成脂滴的分化后的皮脂腺细胞的制造方法。
背景技术
皮脂腺为多细胞性的胞状腺体，从在毛孔的内表面开口的皮脂腺开口部分泌皮脂。在皮脂腺中存在皮脂腺细胞，起到放出皮脂的作用。所分泌的皮脂对皮肤及毛发进行保护及保湿。皮脂的分泌异常成为油性皮肤、干燥皮肤、粉刺、皮脂溢出症、脂溢性皮炎、干皮病等皮肤病的原因。特别是粉刺是以青年人为中心、在世界中许多人体验到的问题。
为了研究开发控制皮脂分泌的医药品或化妆品，能够再现动物生物体的皮脂腺的行为的培养细胞模型的构建是重要的。目前，作为可以利用于实验的皮脂腺细胞株，已知有仓鼠皮脂腺细胞株。该细胞与生物体的皮脂腺细胞同样地具有在细胞内形成脂滴的优点，另一方面，基因组信息未弄清，因此，不适于利用遗传学方法的研究。
专利文献1及非专利文献1中公开有一种对皮脂腺的生理学检查有用的、通过SV-40的巨大T抗原DNA的转染而永生化的源自人的皮脂腺细胞细胞株SZ95。由于该细胞源自人，因此，基因组信息清楚，并且在增殖性高方面作为研究工具是有利的，另一方面，具有在细胞内几乎不形成脂滴的缺点。
除了专利文献1及非专利文献1所公开的SZ95细胞以外，在以往的人皮脂腺细胞中存在如果在体外进行培养则失去形成脂滴的能力的共同的问题。迄今为止，报道有将从人的皮肤中分离的皮脂腺细胞进行培养时，虽然在细胞质中可以看到脂质的蓄积，但是，其量只不过是角化细胞的4～8倍左右，与在活体内的皮脂腺细胞相比非常低，作为其原因，暗示在体外培养中皮脂腺细胞的分化变得不完全(非专利文献2)。与该报道一致，报道有如果在上述SZ95细胞中导入促进上述SZ95细胞向皮脂腺细胞的分化的Myc基因，则在细胞质内蓄积脂滴(非专利文献3)。
在专利文献2中提示有如下想法：在培养皮脂腺细胞中包含生物合成皮脂的分化后的细胞和具有增殖能力、但不具有皮脂的生物合成能力的未分化细胞；及培养皮脂腺细胞不产生皮脂是因为通过继代培养仅增殖未分化细胞，生物合成皮脂的分化后的细胞减少。专利文献2中还公开了通过将未分化的皮脂腺细胞进行回转培养，从而诱导该细胞的分化的方法。
非专利文献4中报道有：在将非专利文献1记载的源自人的皮脂腺细胞细胞株SZ95用亚油酸进行处理时，观察到细胞内的脂滴的蓄积。非专利文献5中公开有由源自人耳前部的正常皮肤的皮脂腺细胞细胞株SEB-1确认了脂滴蓄积。
(专利文献1)日本特表2002-535984号公报
(专利文献2)日本特开平5-268948号公报
(非专利文献1)J Invest Dermatol,1999,113:1011-1120
(非专利文献2)Dermatology,1998,196:21-31
(非专利文献3)Stem cell,2008,26:1241-1252
(非专利文献4)J Invest Dermatol,2008,128:1266-1272
(非专利文献5)J Invest Dermatol,2003,120:905-914
发明内容
本发明提供一种成熟人皮脂腺细胞的制造方法，其中，包括将未成熟人皮脂腺细胞在低氧条件下进行培养。
另外，本发明提供一种未成熟人皮脂腺细胞向成熟人皮脂腺细胞的分化诱导方法，其中，包括将未成熟人皮脂腺细胞在低氧条件下进行培养。
另外，本发明提供一种皮脂分泌控制剂的评价和/或选择方法，其中，包括：将未成熟人皮脂腺细胞在低氧条件下进行培养；和调查被检测物质或试验条件对培养后的细胞的脂滴形成的影响。
进一步，本发明提供一种用于培养成熟人皮脂腺细胞的装置，其具备：用于细胞培养的腔室、和用于将培养气氛调整或维持在低氧条件的氧浓度控制器。
进一步，本发明提供一种用于将未成熟人皮脂腺细胞向成熟人皮脂腺细胞分化诱导的装置，其具备：用于细胞培养的腔室、和用于将培养气氛调整或维持在低氧条件的氧浓度控制器。
附图说明
图1表示氧浓度对皮脂腺细胞的脂滴形成产生的影响。左：核染色图像，中：脂滴染色图像，右：融合图像。图像左侧的数值表示氧浓度。放大(Enlarged)表示以在1％氧浓度下培养的融合图像中的白框包围的区域的放大图。
图2表示氧浓度对皮脂腺细胞的脂滴形成产生的影响。左：核染色图像，中：脂滴染色图像，右：融合图像。图像左侧的数值表示氧浓度。
图3表示低氧下培养时间(3～9小时)产生的皮脂腺细胞的脂滴形成量的变化。左：核染色图像，中：脂滴染色图像，右：融合图像。
图4表示低氧下培养时间(24～48小时)产生的皮脂腺细胞的脂滴形成量的变化。左：核染色图像，中：脂滴染色图像，右：融合图像。放大(Enlarged)表示以培养48小时的融合图像中的白框包围的区域的放大图。
图5表示在低氧下进行培养的皮脂腺细胞中的PLIN1表达量的提高。误差条＝SD、n＝3。
具体实施方式
本发明涉及一种可以形成脂滴的分化后的培养皮脂腺细胞的制造方法。
本发明者们深入研究了用于在以往的培养人皮脂腺细胞中如生物体内的皮脂腺细胞那样获得形成脂滴的能力的方法。其结果，发现：通过将人皮脂腺细胞在低氧条件下进行培养，该细胞分化为形成脂滴的细胞。
根据本发明，可以提供如生物体内的皮脂腺细胞那样获得了形成脂滴的性质的培养成熟人皮脂腺细胞。由本发明所提供的培养成熟人皮脂腺细胞可以成为用于皮脂分泌的机理的研究、或用于控制皮脂分泌的医药品或化妆品的开发的有用的工具。
在皮脂腺的最外层中存在作为未分化的皮脂腺细胞的基底细胞，积极地进行细胞分裂。如果基底细胞转移至皮脂腺的中心部，则细胞分裂逐渐地停止。停止了分裂的细胞开始在细胞内蓄积脂滴，最终使脂滴占细胞质的大部分。该蓄积脂滴的皮脂腺细胞为分化后的皮脂腺细胞的(J.Invest.Dermatol,1974,62:147-152)。蓄积了脂滴的分化后的皮脂腺细胞最后进行崩解而放出皮脂。
在本说明书中，“成熟皮脂腺细胞”是指为分化后的皮脂腺细胞、且在细胞内具有脂滴(Lipid droplet)的细胞。另外，在本说明书中，“未成熟(的)皮脂腺细胞”是为了与上述的“成熟皮脂腺细胞”区别而使用的用语，是指不是上述“成熟皮脂腺细胞”的未分化的皮脂腺细胞、或在细胞内不具有脂滴的皮脂腺细胞。
细胞内的脂滴的存在可以通过公知的方法来确认。例如，如后述的实施例中记载的，可以通过利用油红O、尼罗红等油脂染色试剂进行了染色的细胞的显微镜观察、或荧光或吸光度测定来确认。例如，在细胞内存在脂滴的情况下，在用油脂染色试剂进行了处理的细胞的细胞质内观察到清晰的点状或圆形的染色区域(例如图1)。或者，细胞内的脂滴的存在也可以通过细胞中的脂滴包被蛋白1(perilipin 1，PLIN1)等脂肪滴结合蛋白质(PNAS,2001,98:6494-6499)的表达量的测定等来确认。
在本发明中，诱导没有形成或蓄积脂滴的未成熟人皮脂腺细胞的分化，制备形成或蓄积了脂滴、或者脂滴蓄积量增加的成熟人皮脂腺细胞。即，本发明的一个实施方式为成熟人皮脂腺细胞的制造方法。本发明的另一实施方式为未成熟人皮脂腺细胞向成熟人皮脂腺细胞的分化诱导方法。这些本发明的方法包括将未成熟的人皮脂腺细胞在低氧条件下进行培养。
在上述本发明的方法中，作为提供给低氧条件下的培养的未成熟人皮脂腺细胞的例子，可以列举由包含皮脂腺的生物体的皮肤使用公知的方法而制备的培养人皮脂腺细胞、被确立的人皮脂腺细胞株等，优选为被确立的人皮脂腺细胞株。作为人皮脂腺细胞株的例子，可以列举专利文献1、或非专利文献1、5中所记载的永生化源自人的皮脂腺细胞细胞株(例如DSM ACC2383或SZ95、及SEB-1)，但并不限定于这些。
在上述的培养人皮脂腺细胞及细胞株中，不仅存在未成熟的皮脂腺细胞，而且可能在一部分中存在成熟皮脂腺细胞。但是，如果按照本发明的方法培养这样的未成熟细胞和成熟细胞的混合物，则可以制备蓄积有脂滴的成熟人皮脂腺细胞的含有率显著地增加的培养皮脂腺细胞。因此，用本发明的方法培养的未成熟的皮脂腺细胞可以是仅由未成熟的皮脂腺细胞构成的皮脂腺细胞群，也可以是含有未成熟的皮脂腺细胞的皮脂腺细胞群。换句话说，本发明的成熟人皮脂腺细胞的制造方法的一实施方式可以为由未成熟的人皮脂腺细胞制造成熟人皮脂腺细胞的方法，另一实施方式可以为由含有未成熟的人皮脂腺细胞的人皮脂腺细胞培养物制造成熟人皮脂腺细胞的含有率更高的人皮脂腺细胞培养物的方法。
在上述本发明的方法中，将上述未成熟的人皮脂腺细胞在低氧条件下进行培养。由此，将该未成熟细胞分化诱导为成熟人皮脂腺细胞。本发明中的低氧条件优选为培养气氛中的氧浓度为约5％以下、更优选约2％以下、进一步优选约1％以下的条件，或培养气氛中的氧浓度为约0.1％～约5％的条件。低氧条件可以由具备氧浓度控制器的培养器来实现。这种培养器为公知的，市售有各种类型(例如BIONlX低氧培养试剂盒，SUGIYAMA-GENCO.,LTD.)。
将上述本发明的方法中的人皮脂腺细胞进行培养时的其它条件按照通常的人皮脂腺细胞的体外的培养条件即可。以下列举培养条件的例子：对于培养基，使用相对于William’s E Medium、D-MEM、RPM11640、Ham’s F-12、Modified D-MEM/Ham’s F-12(1:1)培养基(例如、SebomedTM basal medium)等基础培养基、优选为Modified D-MEM/Ham’s F-12(1:1)培养基，添加有血清0.1％～20％、优选为10％；表皮生长因子(Epidermal GrowthFactor，EGF)1～10ng/mL、优选为3～6ng/mL；氢化可的松0.1～20μg/mL、优选为5～15μg/mL；胰岛素5～50μg/mL、优选为8～20μg/mL而成的培养基。培养容器使用塑料、玻璃等，优选使用塑料。细胞在培养基中的播种浓度为1×103～1×106细胞/cm2、优选为0.5×103细胞/cm2～0.5×105细胞/cm2。在培养温度为30～40℃、优选为33～38℃下静置、振荡、或旋转条件下、优选在静置状态下实施培养。培养时间根据细胞内的脂滴的形成状态适当确定即可，优选为24小时以上，更优选为24～72小时左右。
因此，本发明的另一实施方式涉及一种用于培养成熟人皮脂腺细胞、或用于将未成熟人皮脂腺细胞向成熟人皮脂腺细胞分化诱导而使用具备可以在上述低氧条件下将细胞进行培养的装置的细胞培养装置。在一个实施方式中，该细胞培养装置具备用于细胞培养的腔室、和用于将培养气氛调整或维持在低氧条件的氧浓度控制器。
作为上述用于细胞培养的腔室，只要可以对培养培养细胞的气氛阻挡来自周边的通常的大气即可，可以列举例如密闭型的培养皿、罐子、孵化器等。上述氧浓度控制器是可以将上述腔室内的氧浓度调整或维持为比通常的大气低的浓度、优选为上述的低氧条件的装置。作为该氧浓度控制器，例如可以列举氧吸收剂；和可以将氧、氮及二氧化碳以任意的浓度进行混合的氧控制器等。上述中例示的腔室及氧浓度控制器各自有市售，或也市售有将它们组合而成的低氧培养用试剂盒(例如BIONIX低氧培养试剂盒，SUGIYAMA-GEN CO.,LTD.)。例如，可以将现有癌细胞的培养用所提供的用于低氧培养的设备或试剂盒用作本发明的用于培养成熟人皮脂腺细胞的装置。
由上述的步骤得到的成熟人皮脂腺细胞如生物体内的皮脂腺细胞那样具有形成或蓄积脂滴的性质，因此，在皮脂分泌的机理的研究、或用于控制皮脂分泌的医药品或化妆品的开发研究中，可以作为人皮脂腺模型使用。
因此，本发明的另一实施方式为利用了在上述低氧下进行了培养的人皮脂腺细胞形成或蓄积脂滴的性质的皮脂分泌控制剂的评价和/或选择方法。该方法包括：将未成熟人皮脂腺细胞在低氧条件下进行培养；及调查被检测物质或试验条件对所培养的细胞的脂滴形成的影响。将该未成熟人皮脂腺细胞在低氧条件下进行培养的步骤如上所述。
在本发明的皮脂分泌控制剂的评价和/或选择方法的一个实施方式中，上述未成熟人皮脂腺细胞在低氧条件下的培养在被检测物质的存在下进行。规定期限的培养之后，观察经过培养的细胞的脂滴，调查被检测物质对该细胞的脂滴形成的影响。
在另一实施方式中，上述未成熟人皮脂腺细胞在低氧条件下的培养在试验条件的适用下进行。规定期限的培养之后，观察经过培养的细胞的脂滴，调查试验条件对该细胞的脂滴形成的影响。
在另一实施方式中，上述未成熟人皮脂腺细胞在低氧条件下的培养在无被检测物质或试验条件下进行，该培养后的细胞适用被检测物质或试验条件而进一步进行培养。该被检测物质或试验条件适用后的培养不需要在低氧条件下。规定期限的培养之后，观察细胞的脂滴，调查被检测物质或试验条件对该细胞的脂滴形成的影响。
作为被检测物质或试验条件，只要是期望用于皮脂分泌控制的物质或条件，就没有特别地限制。被检测物质可以为天然存在的物质，也可以为用化学或生物学的方法等人工地合成的物质，或可以为化合物，也可以为组合物或混合物。作为试验条件，可以列举光(例如光照射或遮光)、温度(例如加热或冷却)等物理化学的条件等，但并不限定于这些。
作为在培养细胞中适用被检测物质或试验条件的方法，可以列举在培养基中添加被检测物质的方法、在细胞中直接添加被检测物质的方法、在被检测物质存在的气氛下培养细胞的方法、将培养中的细胞暴露于规定的物理化学的条件的方法等，但并不限定于这些。
在细胞的脂滴的观察中，可以用显微镜观察等定性地评价脂滴，但也可以将细胞的脂滴形成量进行定量。作为细胞的脂滴形成量的定量方法，可以列举：基于使用荧光或吸光度测定装置测定的、用油红O、尼罗红等油脂染色试剂进行了染色的细胞的染色强度来定量油脂量的方法；通过实时RT-PCR等定量细胞中的脂滴包被蛋白1(PLIN1)等脂滴相关蛋白质(lipid droplet-associated protein)的表达量的方法等。
接着，调查被检测物质或试验条件对细胞的脂滴形成的影响。在培养后的细胞的脂滴形成量由于被检测物质或试验条件的适用而增加或减少的情况下，将该被检测物质或试验条件选择作为皮脂分泌控制剂。更详细而言，在由于被检测物质或试验条件的适用而造成培养后的细胞的脂滴形成量增加的情况下，将该被检测物质或试验条件选择作为皮脂分泌促进剂。另一方面，在由于被检测物质或试验条件的适用而造成培养后的细胞的脂滴形成量减少的情况下，将该被检测物质或试验条件选择作为皮脂分泌抑制剂。
优选细胞的脂滴形成量与对照进行比较。在适用了被检测物质或试验条件的细胞的脂滴形成量与对照相比统计学上显著性增加的情况下，将该被检测物质或试验条件选择作为皮脂分泌促进剂。另一方面，在适用了被检测物质或试验条件的细胞的脂滴形成量与对照相比统计学上显著性减少的情况下，将该被检测物质或试验条件选择作为皮脂分泌抑制剂。或者，在适用了被检测物质或试验条件的细胞的脂滴形成量优选增加至对照的120％以上、更优选为150％以上的情况下，将该被检测物质或试验条件选择作为皮脂分泌促进剂。另一方面，在适用了被检测物质或试验条件的细胞的脂滴形成量优选减少至对照的80％以下、更优选为60％以下的情况下，将该被检测物质或试验条件选择作为皮脂分泌抑制剂。
作为对照，例如可以列举在不适用被检测物质或试验条件、或对照物质存在下将未成熟人皮脂腺细胞在低氧条件下进行了培养的细胞、或在低氧条件下的培养中及培养后不适用被检测物质或试验条件的细胞等。
选择后的皮脂分泌控制剂具有皮脂分泌的促进或抑制的效果，可以治疗或改善伴有过剩的皮脂分泌或皮脂分泌的降低的各种状态或疾病。例如，皮脂分泌抑制剂可以作为粉刺、油性皮肤、皮脂溢出症等的治疗或改善剂、或以皮脂为原因的臭味(体臭等)的抑制的有效成分使用，皮脂分泌促进剂可以作为干燥皮肤、干皮病、干眼症、唇的皴裂或干燥等的治疗或改善剂的有效成分使用。
本发明还作为例示的实施方式包含以下的物质、制造方法、用途或方法。但是，本发明并不限定于这些实施方式。
＜1＞一种成熟人皮脂腺细胞的制造方法，其中，包括将未成熟人皮脂腺细胞在低氧条件下进行培养。
＜2＞一种未成熟人皮脂腺细胞向成熟人皮脂腺细胞的分化诱导方法，其中，包括将未成熟人皮脂腺细胞在低氧条件下进行培养。
＜3＞一种人皮脂腺细胞的脂滴形成量的增加方法，其中，包括将未成熟人皮脂腺细胞在低氧条件下进行培养。
＜4＞根据＜1＞～＜3＞中任一项所述的方法，其中，优选上述未成熟人皮脂腺细胞为仅由未成熟皮脂腺细胞构成的皮脂腺细胞群，或为含有未成熟皮脂腺细胞的皮脂腺细胞群。
＜5＞根据＜1＞～＜3＞中任一项所述的方法，其中，上述未成熟人皮脂腺细胞优选为人皮脂腺细胞株，更优选为以DSM ACC2383注册的细胞、SZ95细胞、或SEB-1细胞。
＜6＞根据＜1＞～＜5＞中任一项所述的方法，其中，上述低氧条件为培养气氛中的氧浓度为优选约5％以下、更优选约2％以下、进一步优选约1％以下的条件，或者培养气氛中的氧浓度为约0.1％～约5％的条件。
＜7＞根据＜1＞～＜6＞中任一项所述的方法，其中，优选在静置状态下实施上述培养。
＜8＞根据＜1＞～＜7＞中任一项所述的方法，其中，优选上述培养实施24小时以上。
＜9＞一种皮脂分泌控制剂的评价和/或选择方法，其中，包括：将未成熟人皮脂腺细胞在低氧条件下进行培养；和调查被检测物质或试验条件对培养后的细胞的脂滴形成的影响。
＜10＞根据＜9＞所述的方法，其中，优选上述未成熟人皮脂腺细胞为仅由未成熟皮脂腺细胞构成的皮脂腺细胞群，或为含有未成熟皮脂腺细胞的皮脂腺细胞群。
＜11＞根据＜9＞所述的方法，其中，上述未成熟人皮脂腺细胞优选为人皮脂腺细胞株，更优选为以DSM ACC2383注册的细胞、SZ95细胞、或SEB-1细胞。
＜12＞根据＜9＞～＜11＞中任一项所述的方法，其中，上述低氧条件为培养气氛中的氧浓度为优选约5％以下、更优选约2％以下、进一步优选约1％以下的条件，或者培养气氛中的氧浓度为约0.1％～约5％的条件。
＜13＞根据＜9＞～＜12＞中任一项所述的方法，其中，优选在静置状态下实施上述培养。
＜14＞根据＜9＞～＜13＞中任一项所述的方法，其中，优选上述培养实施24小时以上。
＜15＞根据＜9＞～＜14＞中任一项所述的方法，其中，优选在被检测物质的存在下或试验条件的适用下进行上述未成熟人皮脂腺细胞的低氧条件下的培养。
＜16＞根据＜9＞～＜14＞中任一项所述的方法，其中，优选在无被检测物质或试验条件下进行上述未成熟人皮脂腺细胞的低氧条件下的培养，并且上述方法还包括将在该低氧条件下进行了培养的细胞在被检测物质或试验条件的适用下进一步进行培养。
＜17＞根据＜9＞～＜16＞中任一项所述的方法，其中，优选还包括：在培养后的细胞的脂滴形成量由于被检测物质或试验条件的适用而增加或减少的情况下，将该被检测物质或试验条件选择作为皮脂分泌控制剂。
＜18＞根据＜15＞所述的方法，其中，优选还包括：不适用被检测物质或试验条件而将未成熟人皮脂腺细胞在低氧条件下进行培养；以及以下的任一种：
在适用了上述被检测物质或条件的细胞的脂滴形成量与不适用该被检测物质或试验条件的细胞相比统计学上显著性增加的情况下，将该被检测物质或试验条件选择作为皮脂分泌促进剂；
在适用了上述被检测物质或条件的细胞的脂滴形成量与不适用该被检测物质或试验条件的细胞相比统计学上显著性减少的情况下，将该被检测物质或试验条件选择作为皮脂分泌抑制剂；
在适用了上述被检测物质或条件的细胞的脂滴形成量与不适用该被检测物质或试验条件的细胞相比增加至优选120％以上、更优选为150％以上的情况下，将该被检测物质或试验条件选择作为皮脂分泌促进剂；或者
在适用了上述被检测物质或条件的细胞的脂滴形成量与不适用该被检测物质或试验条件的细胞相比减少至优选80％以下、更优选为60％以下的情况下，将该被检测物质或试验条件选择作为皮脂分泌抑制剂。
＜19＞根据＜16＞所述的方法，其中，优选还包括：将在上述低氧条件下进行了培养的细胞不适用被检测物质或试验条件而进一步进行培养；以及以下的任一种：
在适用了上述被检测物质或条件的细胞的脂滴形成量与不适用该被检测物质或试验条件的细胞相比统计学上显著性增加的情况下，将该被检测物质或试验条件选择作为皮脂分泌促进剂；
在适用了上述被检测物质或条件的细胞的脂滴形成量与不适用该被检测物质或试验条件的细胞相比统计学上显著性减少的情况下，将该被检测物质或试验条件选择作为皮脂分泌抑制剂；
在适用了上述被检测物质或条件的细胞的脂滴形成量与不适用该被检测物质或试验条件的细胞相比增加至优选120％以上、更优选为150％以上的情况下，将该被检测物质或试验条件选择作为皮脂分泌促进剂；或者
在适用了上述被检测物质或条件的细胞的脂滴形成量与不适用该被检测物质或试验条件的细胞相比减少至优选80％以下、更优选为60％以下的情况下，将该被检测物质或试验条件选择作为皮脂分泌抑制剂。
＜20＞根据＜9＞～＜19＞中任一项所述的方法，其中，优选上述皮脂分泌控制剂为伴有过剩的皮脂分泌或皮脂分泌的降低的各种状态或疾病的治疗或改善剂。
＜21＞一种用于培养成熟人皮脂腺细胞的装置，其中，具备：用于细胞培养的腔室、和用于将培养气氛调整或维持在低氧条件的氧浓度控制器。
＜22＞一种用于将未成熟人皮脂腺细胞向成熟人皮脂腺细胞分化诱导的装置，其中，具备：用于细胞培养的腔室、和用于将培养气氛调整或维持在低氧条件的氧浓度控制器。
＜23＞根据＜21＞或＜22＞所述的装置，其中，上述低氧条件为培养气氛中的氧浓度为优选约5％以下、更优选约2％以下、进一步优选约1％以下的条件、或培养气氛中的氧浓度为约0.1％～约5％的条件。
实施例
以下，基于实施例来进一步详细地说明本发明，但本发明并不限定于此。
＜方法＞
1)细胞
人皮脂腺细胞株(SZ95)在含有10％FBS、5ng/mL EGF的SebomedTM basal medium中进行培养。通常氧浓度下的培养在大气中的氧浓度(20.9％)下进行。在低氧下的培养使用BIONIX低氧培养试剂盒(SUGIYAMA-GEN CO.,LTD.)，在氧浓度10％、5％、1％或0.1％的条件下进行。任一种情况均在5％CO2、37℃下培养最多72小时。
2)脂滴的荧光显微镜观察
使用4％多聚甲醛溶液将SZ95固定5分钟，其后用1μg/mL的尼罗红溶液(SigmaAldorich)、及DAPI溶液(Life Technologies)在室温下染色15分钟，使用荧光显微镜实施脂滴的观察。
3)实时RT-PCR
使用RNeasy(注册商标)Mini kit，按照所附的实验流程从细胞中提取总RNA。由提取的总RNA合成cDNA中使用QuantiTect(注册商标)逆转录试剂盒(QIAGEN)。在实时PCR中，使用TaqMan(注册商标)Universal master Mix(Life technologies)、以及TaqMan探针(Life technologies)，将脂滴包被蛋白1(PLIN1)、及核糖体蛋白LP0(RPLP0)的mRNA表达量进行定量。PLIN1的mRNA表达量根据RPLP0的表达量进行校正。
(试验1)低氧下培养导致的皮脂腺细胞的脂滴形成量的促进
将SZ95细胞在20.9％、10％、5％、1％及0.1％的氧浓度下培养2天，进行了尼罗红染色之后，进行荧光显微镜观察。将显微镜图像示于图1～2中。图1～2中，以亮度低的白色所看到的圆形的区域(图1的放大图中的虚线包围的区域内)为细胞的核，在核的周边大量散布的亮度高的白点(图1的放大图中的箭头)为脂滴。显微镜观察的结果可知：在0.1％、1％及5％的氧浓度下进行了培养的细胞较强地被尼罗红染色，在细胞内蓄积脂滴。其中确认：在氧浓度最低的0.1％的氧浓度下进行了培养的细胞其脂滴的形成率最高。
(试验2)培养时间导致的皮脂腺细胞的脂滴形成量的变化
将SZ95细胞以氧浓度0.1％培养3、6、9、24、48小时。其结果可知：培养了24小时以上的细胞较强地被尼罗红染色。在细胞内丰富地蓄积了脂滴(图3～4)。
(试验3)低氧导致的脂滴形成的分子机制
报道有在脂滴包被蛋白1(PLIN1)敲除的小鼠中，通常蓄积于脂肪细胞的脂滴显著地减少(PNAS,2001,98:6494-6499)。本试验中，将SZ95细胞在氧浓度20.9％(通常)及0.1％(低氧)的条件下培养了24小时或48小时之后，测定细胞的PLIN1的表达量。其结果可知：PLIN1的表达与通常氧浓度条件下(20.9％)相比，在低氧条件下(0.1％)进行了培养的细胞中显著地上升(图5)。由此启示了：在皮脂腺细胞的低氧环境下的脂滴形成的分子机制中PLIN1参与，并且以PLIN1为指标可以将皮脂腺细胞的脂滴形成量定量。
Claims (13)
1.一种成熟人皮脂腺细胞的制造方法，其中，
包括将未成熟人皮脂腺细胞在低氧条件下进行培养，
所述未成熟人皮脂腺细胞为仅由未成熟皮脂腺细胞构成的皮脂腺细胞群。
2.一种未成熟人皮脂腺细胞向成熟人皮脂腺细胞的分化诱导方法，其中，
包括将未成熟人皮脂腺细胞在低氧条件下进行培养，
所述未成熟人皮脂腺细胞为仅由未成熟皮脂腺细胞构成的皮脂腺细胞群。
3.一种皮脂分泌控制剂的评价和/或选择方法，其中，
包括：将未成熟人皮脂腺细胞在低氧条件下进行培养；和调查被检测物质或试验条件对培养后的细胞的脂滴蓄积的影响，
所述未成熟人皮脂腺细胞为仅由未成熟皮脂腺细胞构成的皮脂腺细胞群。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，
所述未成熟人皮脂腺细胞为人皮脂腺细胞株。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，
所述人皮脂腺细胞株为以DSMACC2383注册的细胞、SZ95细胞、或SEB-1细胞。
6.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，
所述低氧条件为培养气氛中的氧浓度为5％以下的条件。
7.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，
所述低氧条件为培养气氛中的氧浓度为0.1％～5％的条件。
8.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，
在静置状态下实施所述培养。
9.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，
所述培养实施24小时以上。
10.根据权利要求3所述的方法，其中，
在所述被检测物质或试验条件的适用下进行所述未成熟人皮脂腺细胞的低氧条件下的培养。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，
进一步包括：在所述被检测物质或试验条件的适用下进行了培养的细胞的脂滴形成量增加或减少的情况下，将该被检测物质或试验条件选择作为皮脂分泌控制剂。
12.根据权利要求3所述的方法，其中，
在无所述被检测物质或所述试验条件下进行所述未成熟人皮脂腺细胞的低氧条件下的培养，并且该方法进一步包括：在该被检测物质的存在下或该试验条件的适用下将该低氧条件下培养后的细胞进一步进行培养。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，
进一步包括：在所述被检测物质或试验条件的适用下培养后的细胞的脂滴形成量增加或减少的情况下，将该被检测物质或试验条件选择作为皮脂分泌控制剂。
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2016
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Patent Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
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| CN1344314A (zh) * | 1999-02-01 | 2002-04-10 | 赫里斯托斯·祖布利斯 | 脂肪细胞,脂肪细胞系及其应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Upregulation of Hypoxia-Inducible Factors in Normal and Psoriatic Skin;Christian Rosenberger等;《Journal of Investigative Dermatology》;20071031;第127卷(第10期);2445-2452 * |
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