JPWO2017138078A1 - 成熟皮脂腺細胞の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(特許文献2)特開平5−268948号公報
(非特許文献2)Dermatology, 1998, 196:21-31
(非特許文献3)Stem cell, 2008, 26:1241-1252
(非特許文献4)J Invest Dermatol, 2008, 128:1266-1272
(非特許文献5)J Invest Dermatol, 2003, 120:905-914
また本発明は、未成熟ヒト皮脂腺細胞を低酸素条件下で培養することを含む、未成熟ヒト皮脂腺細胞の成熟ヒト皮脂腺細胞への分化誘導方法を提供する。
また本発明は、未成熟ヒト皮脂腺細胞を低酸素条件下で培養することと、培養された細胞の油滴形成に対する被験物質又は試験条件の影響を調べることを含む、皮脂分泌制御剤の評価及び/又は選択方法を提供する。
さらに本発明は、細胞培養のためのチャンバーと、培養雰囲気を低酸素条件に調整又は維持するための酸素濃度制御器とを備える、成熟ヒト皮脂腺細胞の培養のための装置を提供する。
さらに本発明は、細胞培養のためのチャンバーと、培養雰囲気を低酸素条件に調整又は維持するための酸素濃度制御器とを備える、未成熟ヒト皮脂腺細胞の成熟ヒト皮脂腺細胞への分化誘導のための装置を提供する。
被験物質若しくは試験条件を適用しないで未成熟ヒト皮脂腺細胞を低酸素条件下で培養すること、ならびに、
以下のいずれか:
上記被験物質又は条件を適用した細胞の油滴形成量が、該被験物質若しくは試験条件を適用しなかった細胞と比べて統計学的に有意に増加していた場合に、該被験物質又は試験条件を皮脂分泌促進剤として選択すること;
上記試験物質又は条件を適用した細胞の油滴形成量が、該被験物質若しくは試験条件を適用しなかった細胞と比べて統計学的に有意に減少していた場合に、該被験物質又は試験条件を皮脂分泌抑制剤として選択すること;
上記被験物質又は条件を適用した細胞の油滴形成量が、該被験物質若しくは試験条件を適用しなかった細胞と比べて、好ましくは120%以上、より好ましくは150%以上に増加していた場合に、該被験物質又は試験条件を皮脂分泌促進剤として選択すること;
又は、
上記被験物質又は条件を適用した細胞の油滴形成量が、該被験物質若しくは試験条件を適用しなかった細胞と比べて、好ましくは80%以下、より好ましくは60%以下に減少していた場合に、該被験物質又は試験条件を皮脂分泌抑制剤として選択すること;
をさらに含む、<15>記載の方法。
上記低酸素条件下で培養した細胞を、被験物質若しくは試験条件を適用しないでさらに培養すること
ならびに、
以下のいずれか:
上記被験物質又は条件を適用した細胞の油滴形成量が、該被験物質若しくは試験条件を適用しなかった細胞と比べて統計学的に有意に増加していた場合に、該被験物質又は試験条件を皮脂分泌促進剤として選択すること;
上記試験物質又は条件を適用した細胞の油滴形成量が、該被験物質若しくは試験条件を適用しなかった細胞と比べて統計学的に有意に減少していた場合に、該被験物質又は試験条件を皮脂分泌抑制剤として選択すること;
上記試験物質又は条件を適用した細胞の油滴形成量が、該被験物質若しくは試験条件を適用しなかった細胞と比べて、好ましくは120%以上、より好ましくは150%以上に増加していた場合に、該被験物質又は試験条件を皮脂分泌促進剤として選択すること;
又は、
上記被験物質又は条件を適用した細胞の油滴形成量が、該被験物質若しくは試験条件を適用しなかった細胞と比べて、好ましくは80%以下、より好ましくは60%以下に減少していた場合に、該被験物質又は試験条件を皮脂分泌抑制剤として選択すること;
をさらに含む、<16>記載の方法。
1)細胞
ヒト皮脂腺細胞株(SZ95)は、10%FBS、5ng/mL EGFを含むSebomedTM basal medium中で培養した。通常酸素濃度下での培養は、大気中の酸素濃度(20.9%)下で行った。低酸素下での培養は、BIONIX低酸素培養キット(株式会社スギヤマゲン)を用いて、酸素濃度10%、5%、1%又は0.1%の条件下で行った。いずれの場合も、5%CO2、37℃下で、最大72時間培養した。
SZ95を4%パラホルムアルデヒド溶液を用いて5分間固定し、その後1μg/mLのNile red溶液(Sigma Aldorich)、及びDAPI溶液(Life Technologies)で15分間、室温で染色し、蛍光顕微鏡を用いて油滴の観察を実施した。
細胞から、RNeasy(登録商標)Mini kitを用いて、添付のプロトコールに従ってtotal RNAを抽出した。抽出したtotal RNAからのcDNA合成には、QuantiTect(登録商標)reverse transcription kit(QIAGEN)を用いた。リアルタイムPCRでは、TaqMan(登録商標)Universal master Mix(Life technologies)、ならびにTaqManプローブ(Life technologies)を用いて、Perilipin 1(PLIN1)、及びRibosomal protein LP0(RPLP0)のmRNA発現量を定量した。PLIN1のmRNA発現量は、RPLP0の発現量で補正した。
SZ95細胞を、20.9%、10%、5%、1%及び0.1%の酸素濃度下で2日間培養し、Nile red染色した後、蛍光顕微鏡観察した。顕微鏡画像を図1〜2に示す。図1〜2中、輝度の低い白色で見える円形の領域(図1の拡大図中の点線で囲った領域内)は細胞の核であり、核の周辺に多数点在している輝度の高い白いドット(図1の拡大図中の矢印)が油滴である。顕微鏡観察の結果、0.1%、1%及び5%の酸素濃度下で培養した細胞は、強くNile redに染色されており、細胞内に油滴を蓄積したことが明らかとなった。その中でも、酸素濃度が最も低い0.1%の酸素濃度下で培養した細胞が、油滴の形成率が最も高いことが確認された。
SZ95細胞を、酸素濃度0.1%で3、6、9、24、48時間培養した。その結果、24時間以上培養した細胞が、強くNile redに染色されており、細胞内に豊富に油滴を蓄積したことが明らかとなった(図3〜4)。
Perilipin 1(PLIN1)がノックアウトされたマウスでは、通常脂肪細胞に蓄積される油滴が著しく減少することが報告されている(PNAS,2001,98:6494−6499)。本試験では、SZ95細胞を酸素濃度20.9%(通常)及び0.1%(低酸素)の条件下で24時間又は48時間培養した後、細胞のPLIN1の発現量を測定した。その結果、PLIN1の発現は、通常酸素濃度条件下(20.9%)と比較して、低酸素条件下(0.1%)で培養した細胞において有意に上昇していることが明らかとなった(図5)。このことから、皮脂腺細胞の低酸素環境下における油滴形成の分子機構にはPLIN1が関与していること、及びPLIN1を指標に、皮脂腺細胞の油滴形成量を定量することができることが示唆された。
Claims (13)
- 未成熟ヒト皮脂腺細胞を低酸素条件下で培養することを含む、成熟ヒト皮脂腺細胞の製造方法。
- 未成熟ヒト皮脂腺細胞を低酸素条件下で培養することを含む、未成熟ヒト皮脂腺細胞の成熟ヒト皮脂腺細胞への分化誘導方法。
- 未成熟ヒト皮脂腺細胞を低酸素条件下で培養することと、培養された細胞の油滴蓄積に対する被験物質又は試験条件の影響を調べることを含む、皮脂分泌制御剤の評価及び/又は選択方法。
- 前記未成熟ヒト皮脂腺細胞が、ヒト皮脂腺細胞株である、請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。
- 前記ヒト皮脂腺細胞株が、DSM ACC2383で登録された細胞、SZ95細胞、又はSEB−1細胞である、請求項4記載の方法。
- 前記低酸素条件が、培養雰囲気中の酸素濃度が5%以下の条件である、請求項1〜5のいずれか1項記載の方法。
- 前記低酸素条件が、培養雰囲気中の酸素濃度が2%以下の条件である、請求項1〜5のいずれか1項記載の方法。
- 前記低酸素条件が、培養雰囲気中の酸素濃度が1%以下の条件である、請求項1〜5のいずれか1項記載の方法。
- 前記低酸素条件が、培養雰囲気中の酸素濃度が0.1%〜5%の条件である、請求項1〜5のいずれか1項記載の方法。
- 前記培養が静置状態で実施される、請求項1〜9のいずれか1項記載の方法。
- 前記培養が24時間以上実施される、請求項1〜10のいずれか1項記載の方法。
- 細胞培養のためのチャンバーと、培養雰囲気を低酸素条件に調整又は維持するための酸素濃度制御器とを備える、成熟ヒト皮脂腺細胞の培養のための装置。
- 細胞培養のためのチャンバーと、培養雰囲気を低酸素条件に調整又は維持するための酸素濃度制御器とを備える、未成熟ヒト皮脂腺細胞の成熟ヒト皮脂腺細胞への分化誘導のための装置。
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