JPH05268948A

JPH05268948A - 皮脂腺細胞培養法

Info

Publication number: JPH05268948A
Application number: JP4103455A
Authority: JP
Inventors: Masami Koshiyama; 雅巳腰山; Yoichi Tachibana; 陽一橘; Kenichi Ito; 健一伊藤; Rinshi Shiyou; 臨之庄; Jiyuuchiyuu Se; 従柱施; Eikou Ri; 英皓李
Original assignee: Nippon Zeon Co Ltd
Current assignee: Zeon Corp
Priority date: 1992-03-30
Filing date: 1992-03-30
Publication date: 1993-10-19

Abstract

(57)【要約】【目的】皮脂の生合成が可能な皮脂腺細胞を提供す
る。【構成】未分化の皮脂腺細胞を旋回培養することで該
細胞に分化を誘導させることができる。また、分化した
皮脂腺細胞を静置培養することにより、皮脂腺細胞内に
皮脂を蓄積させることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、未分化の皮脂腺細胞を
分化させるための皮脂腺細胞の培養方法、および細胞内
に皮脂を蓄積させるための皮脂腺細胞の培養方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】皮脂腺とは、皮膚腺の一種で、表皮性毛
嚢の細胞に由来する多細胞性の胞状腺体である。皮脂腺
の排出管は毛嚢部に開口し、皮脂腺細胞内に脂肪粒がた
まると細胞全体が壊れて脂肪様物質となり、排出管から
毛嚢部に分泌され、毛や皮膚を潤し、乾燥を防ぐ。従っ
て、皮脂腺細胞の培養技術は、脂漏、にきび等の疾患の
基礎研究、育毛剤や化粧品の開発研究のためにきわめて
重要である。

【０００３】培養された皮脂腺培養細胞に、皮脂を蓄積
させる例は、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、
９３、３１５（１９８９）で報告されている。しかし、
この方法は、皮脂を生合成し、蓄積することのできる分
化した皮脂腺由来細胞（以下、皮脂腺細胞という）と共
に、増殖能は有するが皮脂の生合成能を持たない未分化
の皮脂腺由来細胞（以下、未分化皮脂腺細胞という）を
含む細胞を用いており、これらの２種類の細胞が混在す
る状態で継代培養すると未分化皮脂腺細胞ばかりが増殖
し、皮脂を生合成できる皮脂腺細胞が減るために、得ら
れる皮脂の量は少ないと考えられる。従って、効率よく
細胞に皮脂を産生させるためには、未分化皮脂腺細胞を
含まない皮脂腺細胞を単離することが望まれている。

【０００４】未分化の細胞に分化を誘導させる例とし
て、マウスの肝細胞を旋回培養により分化させた例が報
告されている（ＣｅｌｌＤｉｆｆｅｒ．Ｄｅｖ．、３
０（２）、１１７−１２７（１９９０））。しかし、こ
の細胞は、皮脂腺細胞とは明らかに機能、性質が個とな
る細胞であり、この方法で未分化皮脂腺細胞を分化させ
ることができるということは、いままで知られていなか
った。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、皮脂
の生合成が可能な皮脂腺細胞を提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明のかかる目的は、
未分化皮脂腺細胞を旋回培養し、該細胞に分化を誘導さ
せることによって達成される。

【０００７】本発明でいう皮脂とは、皮脂腺により分泌
される脂質のことをいう。一般に、細胞は器官や組織の
特異性が高く、それに比べ種の特異性が低いため、本発
明に用いる皮脂腺由来細胞の起源となる動物は、特に限
定されず、哺乳類や鳥類から適宜選択される。その具体
例としては、スンクス、マウス、ラット、モルモット、
麝香鹿、アヒル、ヒト等が挙げられる。用いる皮膚は、
皮脂腺が多く存在するものが好ましく、その例として、
スンクスの放臭腺付近の皮膚や麝香し鹿の麝香腺付近の
皮膚等がある。

【０００８】これらの細胞は、皮脂腺細胞や未分化皮脂
腺細胞であればどの様な方法で得られたものであっても
よく、例えば、皮脂腺が比較的多く存在している皮膚を
細切および酵素処理することによって得られたもの、ま
たは、皮脂腺が比較的多く存在している皮膚を細切およ
び酵素処理した後、牛脳下垂体抽出液を含む基本培地で
継代培養したもの等がある。

【０００９】皮脂を得るためには、まず、未分化皮脂腺
細胞を皮脂腺細胞に分化させる必要がある。未分化皮脂
腺細胞は、旋回培養により分化する。旋回培養条件は特
に規定されない。例えば、培地に０．５×１０⁶〜２×
１０⁶細胞／ｍｌとなるように調製した細胞の懸濁液を
加え、直径６ｃｍの培養皿を用い、振幅半径２５ｍｍで
５０〜８０ｒ．ｐ．ｍ．の回転数で水平方向に旋回さ
せ、培養すると細胞塊が形成する。未分化皮脂腺細胞が
分化したことにより細胞塊が形成するのか、細胞塊が形
成したために未分化皮脂腺細胞が分化するのかは明らか
ではないが、得られた細胞塊は、皮脂腺細胞が集まった
ものである。

【００１０】培養時間は、細胞塊の直径が２０μｍ以
上、好ましくは５０〜５００μｍの大きさになるまでと
する。また、培地には、５０μｇ／ｍｌ程度のＤＮａｓ
ｅを添加することができる。

【００１１】得られた細胞塊を静置培養することにより
皮脂腺細胞内に皮脂が蓄積する。培地等培養条件は、細
胞内に皮脂が蓄積される限り特に限定されないが、例え
ば、旋回培養を行った培地と同じ培地を用いて、３７
℃、５％ＣＯ₂−９５％空気のインキュベーター内で培
養すると、細胞内に皮脂が蓄積される。このときの培養
皿は、細胞が接着しないように処理したものを用いると
よい。

【００１２】皮脂腺細胞内の皮脂の確認は、通常、細胞
塊をＯ．Ｔ．Ｃ．コンパウンド等で包埋し、凍結切片と
した後、オイルレッドＯ染色（「染色法のすべて」第２
版、昭和５９年、月刊ＭｅｄｉｃａｌＴｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ編、医歯薬出版、３８〜３９頁）。

【００１３】細胞内に蓄積された皮脂は、細胞破壊後、
一般に脂質の抽出に用いられる溶媒で抽出される。例え
ば、クロロホルム−メタノール（２：１）混合溶媒、エ
ーテル−エタノール（１：３）混合溶媒、クロロホルム
−メタノール−水（１：２：０．８）混合溶媒、ブタノ
ール−水（６５：３５）混合溶媒等により抽出される。

【００１４】

【発明の効果】かくして本発明によれば、未分化皮脂腺
細胞を分化させることにより、効率よく皮脂を製造する
ことができる。。

【００１５】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明する。なお、実施例、比較例、および参考例中の
部、および％はとくに断りのないかぎり重量基準であ
る。

【００１６】（参考例１）未分化皮脂腺細胞の単離培
養スンクス（オス、５週齢）を脱頸し、放臭腺を含む皮膚
を切り出し、７０％エタノールで消毒した。皮膚から放
臭腺を採取し、ハンクス液（日水製薬製）で洗浄後、放
臭腺から表皮、皮下組織をメスで取り除いた。得られた
放臭腺組織をメスで、充分に細切し、０．０５％コラゲ
ナーゼ（タイプＩＩＩ、ワシントン・バイオケミカル社
製）含むハンクス液中で、３７℃、３０分間振盪した。
この状態で細胞を顕微鏡観察したところ、放臭腺由来皮
脂腺由来細胞は１０個〜数１００個程度のクラスターと
なってコラゲナーゼに含むハンクス液中に浮遊してい
た。

【００１７】皮脂腺細胞のクラスターが浮遊しているハ
ンクス液をステンレスメッシュ（メッシュサイズは１５
０μｍ程度）に通し、７００ｒ．ｐ．ｍ．（回転半径１
５．５ｃｍ）で３分間遠心して、皮脂腺由来細胞のペレ
ットを得た。５％牛血清アルブミン（フラクションＶ、
シグマ社製）を含むハンクス液でペレットをほぐし、７
００ｒ．ｐ．ｍ．（回転半径１５．５ｃｍ）で１分間遠
心分離し、上清を除去し、ペレットを得た。

【００１８】つぎに、細胞群のペレットを１％牛脳下垂
体抽出液を含むダルベッコ改変イーグル培地（日水製薬
製）とハム氏Ｆ−１２培地（日水製薬製）との等比混合
培地にペニシリン・ストレプトマイシン液（５０００
Ｉ．Ｕ．／ｍｌ＆５０００μｇ／ｍｌ、フローボラトリ
ー社製）１０ｍｌ／ｌ、カナマイシン（５０００μｇ／
ｍｌ、フローラボラトリー社製）２０ｍｌ／ｌ、牛膵臓
由来インスリン（シグマ社製）５μｇ／ｍｌ、およびマ
ウス由来上皮成長因子（東洋紡社製）１０μｇ／ｍｌを
加えた培地（以下、Ａ培地という）を用いて、組織培養
用培養皿に植え込み、３７℃下、５％ＣＯ₂−９５％空
気のインキュベーター内で培養したところ、多くの未分
化皮脂腺細胞が遊走し、増殖した。

【００１９】得られた未分化皮脂腺細胞を、０．０２％
のＥＤＴＡと０．２５％のトリプシン（ディフコ社製）
をＭｇ²⁺とＣａ²⁺を含まないリン酸緩衝液（フローラボ
ラトリー社製、以下、ＰＢＳ（−）という）に溶解した
もので１回洗浄後、ＰＢＳ（−）で３７℃下、５分間処
理して、細胞の浮遊液を得る。細胞浮遊液を８００ｒ．
ｐ．ｍ．（回転半径１５．５ｃｍ）で３分間遠心分離し
て、細胞を集める。培地で細胞を洗浄し、再度遠心分離
して細胞を集め、前述のＡ培地に約１／３の密度で移し
かえることにより継代した。この未分化皮脂腺細胞の倍
加時間は約４０時間であった。

【００２０】（実施例１）旋回培養法による分化の誘
導培養細胞の培養皿への付着を防ぐために１％濃度の組織
培養用寒天のＰＢＳ（−）溶液３ｍｌを入れて固化させ
ることで、底面を被覆した直径６ｃｍの培養皿に、Ａ培
地にＤＮａｓｅ（ベーリンガーマンハイム社製、グレー
ド２）５０μｇ／ｍｌを加えた培地（以下、Ｂ培地とい
う）２ｍｌを入れた。この培地に実施例１で得た未分化
皮脂腺細胞２×１０⁶個を懸濁させ、参考例１で得たス
ンクス放臭腺由来の未分化皮脂腺細胞を、植物用旋回振
盪培養液を用いて３７℃下、５％ＣＯ₂−９５％空気の
インキュベーター内で振幅半径２５ｍｍ、６５ｒ．ｐ．
ｍ．の回転数で水平方向に２４時間旋回培養した（Ｅｘ
ｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＣｅｌｌＲｅｓｅａｃｈ、２
２、４５５−４７５（１９６１））。

【００２１】旋回培養後、４００ｒ．ｐ．ｍ．（回転半
径１５．５ｃｍ）、１分間遠心分離して細胞塊を集め
た。得られた細胞塊は、顕微鏡で観察、測定したとこ
ろ、約１００μｍの大きさであった。

【００２２】（実施例２）皮脂の製造、確認、抽出実施例１で得た細胞塊を実施例３で使用したＢ培地５ｍ
ｌに懸濁して、３７℃、５％ＣＯ₂−９５％空気のイン
キュベーター内で３日間静置培養した。培養後、皮脂腺
細胞の一部をＯ．Ｔ．Ｃ．コンパウンド（マイルス社
製）中に包埋し、クリオスタットで８μｍ厚の凍結切片
とした。

【００２３】一方、ネオプレン（日新ＥＭ株式会社製）
の０．１％トルエン溶液を調製し、スライドグラスを、
この溶液に数秒間浸した後、風乾して、ネオプレンをコ
ートしたスライドグラスを用意した。このスライドグラ
ス上に前述の凍結切片をのせ、ドライヤーで乾燥させ、
オイルレッドＯ染色（「染色法のすべて」第２版、昭和
５９年、月刊ＭｅｄｉｃａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
編、医歯薬出版、３８〜３９頁）を行った。

【００２４】細胞内に蓄積された皮脂は、赤く染色され
た脂肪滴として観察された。細胞内には非常に多くの脂
肪滴が存在し、この細胞を顕微鏡で観察・測定したとこ
ろ、脂肪滴の直径が約１．５μｍの大きなものもあっ
た。

【００２５】残りの皮脂腺細胞塊を超音波破砕装置で処
理した後、２０００ｒ．ｐ．ｍ．（回転半径１５．５ｃ
ｍ）で遠心分離して細胞および細胞片を集め、凍結融解
を３回繰り返し、細胞を破砕した。

【００２６】これに適量のクロロホルム−メタノール
（２：１）混合溶媒を加えて激しく攪拌し、細胞片を濾
過して除き、溶媒を窒素気流下、減圧留去して、抽出物
を得た。この抽出物をシリカゲル薄層クロマトグラフィ
ーに供し、ヘキサンで展開した。展開後、４０％硫酸を
噴霧し、加熱して発色させたところ、標準品のスクワレ
ン（東京化成社製）と同じ位置に同様のスポット（Ｒｆ
値０．４９）が確認された。

【００２７】（実施例３）単離培養前の皮脂腺由来細
胞の分化誘導と、皮脂腺細胞の静置培養による皮脂の製
造・確認単離培養された未分化皮脂腺細胞の代わりに、参考例１
で得た細胞群（細胞数約２×１０⁶個）を用いる以外は
実施例１と同様の方法により旋回培養した。旋回培養
後、実施例と同じ方法で培養細胞を静置培養した。静置
培養後、実施例２と同様の方法により細胞内の皮脂を確
認したところ、やはり、多くの脂肪滴が存在し、脂肪滴
の直径が１．５μｍほどの大きなものもあった。

【００２８】（比較例１）単層培養参考例１で得た細胞群（細胞数約２×１０⁶個）をＢ培
地５ｍｌに懸濁して静置培養し、２４時間後培養上清を
捨て、同Ｂ培地５ｍｌを加え３日間培養した。培養上清
を捨て、ＰＢＳ（−）で２回洗浄後、ホルマリンを１０
％含むＰＢＳ（−）２ｍｌを加え、室温で１０分間放置
して、細胞を固定した。蒸留水で洗浄後、実施例３の方
法でオイルレッドＯ染色を行ったところ、脂肪滴を蓄積
している細胞は殆ど観察されず、希に核の周辺に小さな
脂肪滴を有する細胞が確認されるのみであった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者李英皓中華人民共和国北京市中関村路19

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】未分化の皮脂腺細胞を旋回培養し、該細
胞に分化を誘導させることを特徴とする皮脂腺細胞の培
養方法。
【請求項２】請求項１の方法で得られた皮脂腺細胞を
静置培養することを特徴とする皮脂腺細胞の培養方法。