PL193236B1

PL193236B1 - Zastosowania amyliny lub agonisty amyliny

Info

Publication number: PL193236B1
Application number: PL338082A
Authority: PL
Inventors: Bradford J. Duft; Orville Kolterman
Original assignee: Amylin Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1997-06-06
Filing date: 1998-06-05
Publication date: 2007-01-31
Also published as: PL338082A1; AU7823098A; BR9809951A; RU2314121C9; US7910548B2; RU2314121C2; WO1998055144A1; NO324818B1; RU2207871C2; CZ9904360A3; NZ501451A; US20030026812A1; CZ294983B6; HUP0004271A3; HUP0004271A2; NO995996L; NO995996D0

Abstract

1. Zastosowanie amyliny lub agonisty amyliny w ilo sci od 2,5 µg na dawk e do 5000 µg na dawk e do wytwarzania leku do leczenia lub zapobiegania oty lo sci u podmiotu ludzkiego, z wy la- czeniem stosowania cholecystokininy (CCK), agonisty CCK. 13. Zastosowanie amyliny lub agonisty amyliny w ilo sci od 2,5 µg do 5000 µg na dawk e do wy- twarzania leku do redukowania indukowanego insulin a wzrostu masy cia la u cz lowieka bior acego insulin e. PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie amyliny lub agonisty amyliny do wytwarzania leku do leczenia lub zapobiegania otyłości u podmiotu ludzkiego, z wyłączeniem stosowania cholecystokininy (CCK), agonisty CCK oraz zastosowanie amyliny lub agonisty amyliny do wytwarzania leku do redukowania indukowanego insuliną wzrostu masy ciała u człowieka biorącego insulinę.

Amylina

Strukturę i biologię amyliny omówiono wcześniej. Zobacz np. Rink i in., Trends in Pharmaceutical Sciences, 14: 113-118 (1993); Gaeta i Rink, Med. Chem. Res. 3: 483-490 (1994); oraz Pittner i in., J. Cel. Biochem., 55S: 19-28 (1994). Amylina jest hormonem białkowym o 37 aminokwasach. Wyizolowano ją, oczyszczono i scharakteryzowano chemicznie jako główny składnik osadu amyloidowego wysepek trzustkowych zmarłych ludzi z cukrzycą typu 2 (Cooper i in., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 84: 8628-8632 (1987)). Cząsteczka amyliny posiada dwie istotne modyfikacje potranslacyjne: koniec C jest amidowany (to znaczy 37 resztę aminokwasową stanowi tyrozynoamid) a cysteiny w pozycjach 2 i 7 są usieciowane, tworząc pętlę N-terminalną (poprzez resztę cystynową). Sekwencja otwartej ramki odczytu dla genu ludzkiej amyliny ukazuje obecność sygnału cięcia proteolitycznego aminokwasów dizasadowych Lys-Arg, przed kodonem N-terminalnym dla Lys, oraz Gly przed sygnałem proteolitycznym Lys-Arg w pozycji C-terminalnej, typowa sekwencja dla amidacji przez enzym amidacji białka, PAM (Cooper i in., Biochem. Biophys. Acta, 1014: 247-258 (1989)). Amylinę opisano i zastrzeżono w opisie patentowym U.S. nr 5,367,052, opublikowanym 22 listopada 1994.

Okazało się, że w cukrzycy typu 1 brakuje amyliny i zaproponowano skojarzone leczenie zastępcze z insuliną, jako zalecane leczenie w stosunku do samej insuliny, we wszystkich postaciach cukrzycy. Stosowanie amyliny i innych agonistów amyliny w leczeniu cukrzycy jest przedmiotem opisu patentowego U.S. nr 5,175,145, opublikowanego 29 grudnia 1992. Kompozycje farmaceutyczne, zawierające amylinę i amylinę plus insulinę, opisano i zastrzeżono w opisie patentowym U.S. nr 5,124,314 opublikowanym 23 czerwca 1992.

Nadmierne działanie amyliny uznano za kluczowe cechy naśladowcze cukrzycy typu 2 i zaproponowano blokadę amyliny jako nową strategię terapeutyczną. W opisie patentowym U.S. nr 5,266,561 opublikowanym 30 listopada 1993, ujawniono, że amylina powoduje redukcję zarówno podstawowego jak i stymulowanego insuliną wprowadzania znakowanej glukozy do glikogenu w mięśniu szkieletowym. Opisywano także, że na to ostatnie ma wpływ również peptyd związany z genem kalcytoniny (CGRP) (zobacz także Leighton i Cooper, Nature, 335: 632-635 (1988)). Donoszono także, że amylina redukuje stymulowany insuliną wychwyt glukozy do mięśnia szkieletowego i zmniejsza zawartość glikogenu (Young i in., Amer. J. Physiol., 259: 457476-1 (1990)). Ujawniono leczenie cukrzycy typu 2 oraz oporności insulinowej z użyciem antagonistów amyliny.

Sekwencja amyliny jest w około 50% homologiczna z białkami CGRP, białkami także o 37 aminokwasach, które są szeroko rozpowszechnionymi neuroprzekaźnikami o wielu silnych działaniach biologicznych, łącznie z rozszerzaniem naczyń. Amylina i CGRP mają wspólny disiarczkowy mostek ²Cys-⁷Cys oraz C-terminalną resztę amidową aminokwasu, z których obie są zasadnicze dla pełnej aktywności biologicznej (Cooper i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 857763-7766 (1988)). Amylina, zgodnie z doniesieniami, może być jednym z członków rodziny pokrewnych peptydów, która obejmuje CGRP, insulinę, insulinopodobne czynniki wzrostu oraz relaksyny, które mają wspólne pochodzenie genetyczne (Cooper i in., Prog. Growth Factor Research, 1: 99-105 (1989)).

Amylina syntetyzowana jest przede wszystkim w komórkach beta trzustki i wydzielana w odpowiedzi na bodziec pokarmowy, taki jak glukoza i arginina. Badanie nad klonowanymi liniami nowotworowymi komórek beta (Moore i in., Biochem. Biophys. Res. Commun., 179(1) (1991)), wykazały, że substancje pobudzające wydzielanie, takie jak glukoza i arginina stymulują wydzielanie amyliny, a także insuliny. Stosunek molowy wydzielanych białek amylina: insulina jest zróż nicowana wśród preparatów od około 0,01 do 0,4, lecz okazuje się, że nie zmienia się znacznie przy ostrym bodźcu w każ dym z preparatów. Jednakże podczas przedłuż onej stymulacji przez podniesiony poziom glukozy, stosunek amylina: insulina może się progresywnie zwiększać (Gedulin i in., Biochem. Biophys. Res. Commun., 180(1): 782-789 (1991)). Tak więc, amylina i insulina nie zawsze wydzielane są w stałym stosunku.

Stwierdzono i opisano, że pewne działania amyliny są podobne do niektórych nie metabolicznych działań CGRP i kalcytoniny; jednakże działania metaboliczne amyliny odkryte podczas badań tego nowo zidentyfikowanego białka, okazały się odzwierciedlać jego pierwotną rolę naśladowczą.

PL 193 236 B1

CGRP naśladuje co najmniej kilka z tych działań metabolicznych, aczkolwiek przy dawkach, które są wybitnie rozszerzające naczynia (zobacz np. Leighton i in., Nature, 335: 632-635 (1988)); Molina i in., Diabetes, 39: 260-265 (1990)).

Pierwszym odkrytym działaniem amyliny było zmniejszanie stymulowanego insuliną wprowadzania glukozy do glikogenu w mięśniu szkieletowym szczura (Leighton i in., Nature, 335: 632-635 (1986)); mięsień uczyniono „opornym na insulinę”. Kolejna praca z mięśniem płaszczkowatym szczura ex vivo oraz in vitro wskazywała, że amylina zmniejsza aktywność syntazy glikogenowej, pobudza przemianę fosforylazy glikogenowej z nieaktywnej formy b w aktywną formę a, pobudza utratę glikogenu netto (w obecności lub przy braku insuliny), zwiększa poziom glukozo-6-fosforanu i może zwiększyć usuwanie mleczanu (zobacz np. Deems i in., Biochem. Biophys. Res. Commun., 181(1): 116-120 (1991)); Young i in., Febs Letts, 281(1,2): 149-151 (1991)). Jak się okazało amylina nie wpływa na transport glukozy jako taki (np. Pittner i in., FEBS Letts., 365(1): 98-100 (1995)). Badania relacji odpowiedzi na dawkę amyliny i insuliny pokazują, że amylina działa jako niekompetycyjny lub funkcjonalny antagonista insuliny w mięśniu szkieletowym (Young i in., Am. J. Physiol. 263(2): E274-E281 (1992)). Nie istnieje dowód na to, że amylina zakłóca wiązanie isuliny z jej receptorami, lub dalszą aktywację kinazy tyrozynowej receptora insulinowego (Follett i in., Clinical Research, 39(1): 39A (1991)); Koopmans i in., Diabetologia, 34: 218-224 (1991)).

Uważa się, że amylina działa poprzez receptory obecne w błonach plazmatycznych. Badania amyliny i CGRP oraz wpływu selektywnych antagonistów, sugerują, że amylina działa poprzez swój własny receptor (Beaumont i in., Br. J. Pharmacol., 115(5): 713-715 (1995); Wang i in., FEBS Letts., 219: 195-198 (1991b)), przeciwnie do wniosku innych badaczy, że amylina może działać przede wszystkim przy receptorach CGRP (np. Chantry i in., Biochem. J., 277: 139-143 (1991); Galeazza i in., Peptides 12: 585-591 (1991)); Zhu i in., Biochem. Biophys. Res. Commun. 177(2): 771-776 (1991)). Receptory amyliny i ich stosowanie w metodach skriningu i testowania pod względem agonistów amyliny oraz związków antagonistycznych opisano w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych nr 5,264,372, opublikowanym 23 listopada 1993.

Podczas gdy amylina ma znaczący wpływ na metabolizm płynu wątrobowego in vivo, nie ma generalnej zgody co do działania amyliny widocznego na izolowanych komórkach wątroby lub wątrobie poddanej perfuzji. Dostępne dane nie popierają idei, że amylina pobudza glikogenezę w wątrobie, to jest nie działa jak glukagon (np. Stephens i in., Diabetes, 40: 395-400 (1991); Gomez-Foix i in., Biochem J., 276: 607-610 (1991)). Sugerowano, że amylina może działać na wątrobę pobudzając przemianę mleczanu w glikogen oraz wzmacniając ilość glukozy możliwej do uwolnienia przez glukagon (zobacz Roden i in., Diabetologia, 35: 116-120 (1992)). W ten sposób amylina mogłaby działać jako partner anaboliczny wobec insuliny w wątrobie, w przeciwieństwie do jej działania katabolicznego w mięśniu.

W komórkach tł uszczowych, przeciwnie do działania w mięśniu, amylina nie wykazuje wykrywalnego działania na stymulowany insuliną wychwyt glukozy, wprowadzanie glukozy do triglicerydu, wytwarzanie CO2 (Cooper i in., Proc. Natl. Acad. Sci., 85: 7763-7766 (1988)), lipolizę stymulowaną epinefryną, lub hamowania lipolizy przez insulinę (Lupien i Young, „Diabetes Nutrition and Metabolism - Clinical and Experimental” tom 6(1) strony 1318 (luty 1993)). W ten sposób amylina wywo łuje efekty specyficzne dla tkanek, z bezpośrednim działaniem na mięsień szkieletowy, znacznym bezpośrednim (poprzez zaopatrzenie w substrat) i prawdopodobnie pośrednim wpływem na wątrobę, podczas gdy komórki tłuszczowe okazują się „ślepe” wobec obecności lub nieobecności amyliny.

Donoszono także, że amylina może mieć znaczny wpływ na wydzielanie insuliny. Doświadczenia na nieuszkodzonych szczurach (Young i in., Mol. Cell. Endocrinol., 84: R1-R5 (1992)) wskazują, że amylina hamuje wydzielanie insuliny. Jednakże inni badacze nie mogli wykryć wpływu amyliny na izolowane komórki β, na izolowane wysepki lub na całe zwierzę (zobacz Broderick i in., Biochem. Biophys. Res. Commun., 177: 932-938 (1991)).

Amylina i agoniści amyliny silnie hamują opróżnianie żołądka u szczurów (Young i in., Diabetologia 38(6): 642-648 (1995)), psów (Brown i in., Diabetes 43(suppl 1): 172A (1994)) i ludzi (Macdonald i in., Diabetologia 38(suppl 1): A32 (skrót 118)(1995)). Według doniesień opróżnianie żołądka jest przyspieszone u szczurów BB z cukrzycą typu 1 z niedoborem amyliny (Young i in., Diabetologia jak wyżej; Nowak i in., J. Lab. Clin. Med., 123(1): 110-6 (1994)) i u szczurów traktowanych selektywnym antagonistą amyliny, AC187 (Gedulin i in., Diabetologia 38(suppl. 1): A244 (1995). Okazuje się, że wpływ amyliny na opróżnianie żołądka jest fizjologiczny (wywierany jest przy normalnie występujących w krążeniu stężeniach).

PL 193 236 B1

Niemetaboliczne działania amyliny obejmują wpływ rozszerzający naczynia, w którym może pośredniczyć interakcja z receptorami naczyniowymi CGRP. Opisywane testy in vivo sugerują, że amylina jest co najmniej 100 do 1000 razy słabsza jako środek rozszerzający naczynia, niż CGRP (Brain i in., Eur. J. Pharmacol., 183: 2221 (1990); Wang i in., FEBS Letts., 291: 195-198 (1991)). Opisywano także wpływ amyliny na regionalne działanie hemodynamiczne, włączając przepływ krwi przez nerki, u przytomnych szczurów (Gardiner i in., Diabetes, 40: 948-951 (1991)). Autorzy zauważyli, ż e wlew amyliny szczurzej wiązał się z większym rozszerzeniem naczyń nerkowych i mniejszym zwężeniem naczyń krezkowych niż obserwowany przy wlewie ludzkiego α-CGRP. Doszli oni do wniosku, że pobudzając niedokrwienie nerkowe w większym stopniu niż α-CGRP, amylina szczurza mogła spowodować mniej znaczną stymulację układu renina-angiotensyna, a więc, mniejsze wtórne zwężenie naczyń za pośrednictwem angiotensyny II. Jednak zauważono także, że podczas łącznego wlewu ludzkiego a-^8-37CGRP i amyliny szczurzej, zwężenie naczyń nerkowych i krezkowych nie było maskowane, przypuszczalnie z powodu braku wpływu przeciwstawnego do angiotensyny II, oraz że to stwierdzenie jest podobne do obserwowanego podczas łącznego wlewu ludzkiego A-CGRP i ludzkiego a-^8-37CGRP (również na 951).

Donoszono także, że amylina ma wpływ zarówno na izolowane osteoklasty, gdzie powoduje stan spoczynku komórek, jak i in vivo, gdzie opisywano, że obniża wapń w osoczu o 20% u szczurów, u królików i ludzi z chorobą Pageta (zobacz np. Zaidi i in., Trends in Endocrinal. and Metab., 4: 255-259 (1993)). Na podstawie dostępnych danych wydaje się, że amylina jest 10 do 30 razy słabsza pod względem tych działań niż ludzka kalcytonina. Co interesujące, opisano, że jak się okazało amylina zwiększa wytwarzanie cAMP przez osteoklasty lecz nie zwiększa Ca²⁺ w cytozolu, podczas gdy kalcytonina zwiększa oba (Alam i in., Biochem. Biophys. Res. Commun., 179(1): 134-139 (1991)). Sugerowano, choć nie zostało to ustalone, że kalcytonina może działać poprzez dwa typy receptorów, i że amylina może wchodzić w interakcję z jednym z nich.

Stwierdzono także, niespodziewanie ze względu na wcześniej opisywane właściwości rozszerzające naczynia nerkowe i inne, że amylina znacznie zwiększa aktywność reniny w osoczu u nieuszkodzonych szczurów po podaniu podskórnym w taki sposób, że unika się jakichkolwiek zakłóceń ciśnienia krwi. Ten ostatni punkt jest istotny, ponieważ obniżone ciśnienie krwi jest silnym bodźcem dla uwalniania reniny. Antagonistów amyliny, takich jak antagonistów receptora amyliny, włączając selektywne pod względem receptorów amyliny w porównaniu z receptorami CGRP i/lub kalcytoniny, można używać do blokowania wywołanego amyliną wzrostu aktywności reniny w osoczu. Stosowanie antagonistów amyliny do leczenia schorzeń związanych z reniną, opisano i zastrzeżono w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych nr 5,376,638, opublikowanym 27 grudnia 1994.

Opisano, że u zdrowych ludzi poziom amyliny na czczo wynosi od 1 do 10 pM a poposiłkowy lub poglukozowy poziom wynosi od 5 do 20 pM (np. Koda i in., The Lancet, 339: 1179-1180 (1992)). U otyłych, insulino-opornych osobników, poziom poposiłkowy amyliny może wzrosnąć, osiągając do około 50 pM. Dla porównania, wartości dla poziomu na czczo i poziomu poposiłkowego insuliny wynoszą 20 do 50 pM i 100 do 300 pM odpowiednio u zdrowych ludzi, z możliwym 3- do 4-krotnie wyższym poziomem u ludzi opornych na insulinę. W cukrzycy typu 1, gdzie zniszczone są komórki beta, poziom amyliny znajduje się na poziomie lub poniżej poziomu wykrywania i nie rośnie w odpowiedzi na glukozę (Koda i in., The Lancet, 339: 1179-1180 (1992)). Opisano, że u zdrowych myszy i szczurów podstawowy poziom amyliny wynosi od 30 do 100 pM, podczas gdy u pewnych cukrzycowych szczepów gryzoni opornych na insulinę zmierzono wartości do 600 pM (np. Huang i in., Hypertension, 19: I-101I-109 (1991)).

Opisywano, że amylina po wstrzyknięciu do mózgu lub podaniu obwodowym hamuje pobieranie pokarmu, np. Chance i in., Brain Res., 539: 352-354 (1991) i Chance i in., Brain Res., 607: 185-188 (1993), działając wspólnie z CGRP i kalcytoniną. Nie są nieznane skuteczne pośredniczące w tym działaniu stężenia w komórkach. Stosowanie amyliny i agonistów amyliny do leczenia anoreksji opisano i zastrzeżono w opisie patentowym U.S. nr 5,656,590, opublikowanym 12 sierpnia 1997. Kompozycje obejmujące agonistów cholecystokininy i agonistów amyliny albo cząsteczkę hybrydową do stosowania w zmniejszaniu pobierania pokarmu lub kontrolowania apetytu albo masy ciała, opisano i zastrzeżono w opisie patentowym U.S. nr 5,739,106, opublikowanym 14 kwietnia 1998.

W opisach patentowych nr U.S. 5,800,014 i U.S. 5,354,841 ujawniono podawanie antagonistów i blokerów amyliny lub CGRP, albo obydwu, w celu leczenia otyłości, nadciśnienia i związanych z nimi zaburzeń.

PL 193 236 B1

Otyłość

Otyłość jest chorobą przewlekłą, bardzo powszechną we współczesnym społeczeństwie i wiąże się nie tylko ze znamieniem społecznym, lecz także ze skróceniem długości życia i licznymi problemami medycznymi, łącznie z niekorzystnym rozwojem psychologicznym, zaburzeniami związanymi z rozmnażaniem, takimi jak wielotorbielowatość jajników, schorzeniami dermatologicznymi, takimi jak zakażenia, żylaki, rogowacenie ciemne oraz egzema, nietolerancją wysiłkową, cukrzycą, opornością na insulinę, nadciśnieniem, hipercholesterolemią, kamicą żółciową, zapaleniem kostno-stawowym, uszkodzeniami ortopedycznymi, chorobą zakrzepowo-zatorową, rakiem i chorobami naczyń wieńcowych. Rissanen i in., British Medical Journal, 301: 835-837 (1990).

Otyłość, a zwłaszcza otyłość górnej części ciała, jest powszechnym i bardzo poważnym problemem zdrowia publicznego w Stanach Zjednoczonych i na całym świecie. Zgodnie z ostatnimi statystykami, ponad 25% populacji Stanów Zjednoczonych i 27% Kanady ma nadwagę. Kuczmarski, Amer. J. of Clin. Nut. 55: 495S-502S (1992); Reeder i in., Can. Med. Ass. J., 23: 226-233 (1992). Otyłość górnej części ciała jest najsilniejszym czynnikiem ryzyka znanym dla cukrzycy typu II i silnym czynnikiem ryzyka dla choroby sercowo-naczyniowej, a także raka. Ostatnie dane szacunkowe dla kosztów medycznych związanych z otyłością wynoszą 150 000 000 000 dolarów amerykańskich na całym świecie. Problem stał się na tyle poważny, że chirurg główny podjął inicjatywę zwalczania wciąż wzrastającego narastającego otłuszczenia w społeczeństwie amerykańskim.

Większość patologii indukowanych otyłością można przypisać silnemu związkowi z dyslipidemią, nadciśnieniem i opornością na insulinę. Wiele badań wykazało, że zmniejszenie otyłości dietą i wysił kiem redukuje dramatycznie te czynniki ryzyka. Niestety te sposoby leczenia koń czą się w wię kszości przypadków niepowodzeniem, przy czym współczynnik niepowodzenia wynosi 95%. Niepowodzenie to może być spowodowane faktem, że stan ten jest silnie związany z genetycznie dziedziczonymi czynnikami, które przyczyniają się do zwiększonego apetytu, preferencji wobec wysoko kalorycznych posiłków, mniejszej aktywności fizycznej i zwiększonego metabolizmu lipogennego. Wskazuje to, że ludzie dziedziczący takie cechy genetyczne są predysponowani do otyłości, bez względu na ich wysiłki do zwalczania tego stanu. Zatem, istnieje zapotrzebowanie na nowy środek farmakologiczny, który może usunąć tę przeszkodę prowadzącą do otłuszczenia i pozwolić lekarzowi na pomyślne leczenie otyłych pacjentów, pomimo ich dziedzictwa genetycznego.

Istniejące terapie otyłości obejmują standardowo diety i ćwiczenia, diety bardzo niskokaloryczne, terapię behawioralną, farmakoterapię, obejmującą środki hamujące apetyt, leki termogenne, inhibitory wchłaniania pokarmu, urządzenia mechaniczne, takie jak drutowanie szczęki, sznury w pasie i balony, oraz operację. Jung i Chong, Clinical Endocrinology, 35: 11-20 (1991); Bray, Am. J. Glin. Nutr., 55: 538S-544S (1992). Opisywano modyfikowane głodzenie się z oszczędzaniem białek, jako skutecznie obniżające masę ciała u dojrzewających. Lee i in., Clin. Pediatr., 31: 234-236 (kwiecień 1992). Ograniczanie kalorii jako leczenie otyłości powoduje katabolizm zasobów białek organizmu i wytwarza ujemny bilans azotu. Z tego powodu zyskały na popularności diety z suplementacją białka, jako środki do zmniejszenia utraty azotu przy ograniczaniu kalorii. Ze względu na to, że takie diety powodują tylko umiarkowane oszczędzanie azotu, potrzebna jest skuteczniejsza droga do zachowania szczupłej masy ciała i zasobów białka. Poza tym, leczenie otyłości byłoby lepsze jeśli taki reżim powodowałby także przyspieszenie utraty tłuszczu z organizmu. Różne podejścia do takiego leczenia obejmują omawiane przez Weintraub i Bray, Med. Clinics N. Amer., 73: 237 (1989); Bray, Nutrition Reviews, 49: 33 (1991).

Biorąc pod uwagę dużą powszechność występowania otyłości w naszym społeczeństwie i wiążące się z nią poważne konsekwencje, jakie wymieniono powyżej, każdy lek terapeutyczny potencjalnie użyteczny w zmniejszaniu masy ciała otyłych osób mógłby mieć istotny korzystny wpływ na ich zdrowie. Istnieje zapotrzebowanie na lek, który będzie zmniejszał całkowitą masę ciała otyłych podmiotów w stronę idealnej masy ciała i pomoże utrzymać masę na niższym poziomie.

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie amyliny lub agonisty amyliny w ilości od 2,5 μg na dawkę do 5000 μg na dawkę do wytwarzania leku do leczenia lub zapobiegania otyłości u podmiotu ludzkiego, z wyłączeniem stosowania cholecystokininy (CCK), agonisty CCK.

Korzystnie agonistę amyliny stanowi analog agonisty amyliny.

Korzystniej agonista amyliny posiada następującą sekwencję aminokwasową: ¹A1-X-Asn-Thr-⁵Ala-Thr-Y-Ala-Thr-¹⁰Gln-Arg-Leu-B1-Asn-¹⁵Phe-Leu-C1-D1-E1-²⁰F1-G1-Asn-H1-Gly-²⁵Pro-I1-Leu-Pro-J1-³⁰Thr-K1-Val-Gly-Ser-³⁵Asn-Thr-Tyr-Z gdzie:

A1 oznacza Lys, Ala, Ser lub wodór;

PL 193 236 B1

B1 oznacza Ala, Ser lub Thr;

C1 oznacza Val, Leu lub Ile;

D1 oznacza His lub Arg;

E1 oznacza Ser lub Thr;

F1 oznacza Ser, Thr, Gln lub Asn;

G1 oznacza Asn, Gln lub His;

H1 oznacza Phe, Leu lub Tyr;

I1 oznacza Ile, Val, Ala lub Leu;

J1 oznacza Ser, Pro lub Thr;

K1 oznacza Asn, Asp lub Gln;

X i Y są niezależ nie wybranymi resztami, mają cymi ł a ń cuchy boczne, które są chemicznie powiązane między sobą, tworząc formę wiązania wewnątrzcząsteczkowego, gdzie wymienione wiązanie wewnątrzcząsteczkowe obejmuje wiązanie disiarczkowe, laktam lub wiązanie tioeterowe; oraz Z oznacza grupę aminową, alkiloaminową, dialkiloaminową, cykloalkiloaminową, aryloaminową, aryloalkiloaminową, alkiloksy, aryloksy, lub aryloalkiloksy; przy czym gdy A1 oznacza Lys, B1 oznacza Ala, C1 oznacza Val, D1 oznacza Arg, E1 oznacza Ser, F1 oznacza Ser, G1 oznacza Asn, H1 oznacza Leu, I1 oznacza Val, J1 oznacza Pro i K1 oznacza Asn wtedy jedno lub więcej z A1 do K1 oznacza D-aminokwas i Z wybiera się z grupy składającej się z grupy alkiloaminowej, dialkiloaminowej, cykloalkiloaminowej, aryloaminowej, aryloalkiloaminowej, alkiloksy, aryloksy lub aryloalkiloksy.

Korzystniej agonista amyliny posiada następującą sekwencję aminokwasową:

¹A1-X-Asn-Thr-⁵Ala-Thr-Y-Ala-Thr-¹⁰Gln-Arg-Leu-B1-Asn-¹⁵Phe-Leu-C1-D1-E1-²⁰F1-G1-Asn-H1-Gly-²⁵Pro-I1-Leu-J1-Pro-³⁰Thr-K1-Val-Gly-Ser-³⁵Asn-Thr-Tyr-Z gdzie:

A1 oznacza Lys, Ala, Ser lub wodór;

B1 oznacza Ala, Ser lub Thr;

C1 oznacza Val, Leu lub Ile;

D1 oznacza His lub Arg;

E1 oznacza Ser lub Thr;

F1 oznacza Ser, Thr, Gln lub Asn;

G1 oznacza Asn, Gln lub His;

H1 oznacza Phe, Leu lub Tyr;

I1 oznacza Ile, Val, Ala lub Leu;

J1 oznacza Ser, Pro, Leu, Ile lub Thr;

K1 oznacza Asn, Asp lub Gln;

X i Y są niezależ nie wybranymi resztami, mają cymi ł a ń cuchy boczne, które są chemicznie powiązane między sobą, tworząc formę wiązania wewnątrzcząsteczkowego, gdzie wymienione wiązanie wewnątrzcząsteczkowe obejmuje wiązanie disiarczkowe, laktam lub wiązanie tioeterowe; oraz Z oznacza grupę aminową, alkiloaminową, dialkiloaminową, cykloalkiloaminową, aryloaminową, aryloalkiloaminową, alkiloksy, aryloksy, lub aryloalkiloksy; przy czym gdy (a) A1 oznacza Lys, B1 oznacza Ala, C1 oznacza Val, D1 oznacza Arg, E1 oznacza Ser, F1 oznacza Ser, G1 oznacza Asn, H1 oznacza Leu, I1 oznacza Val, J1 oznacza Pro i K1 oznacza Asn; lub (b) A1 oznacza Lys, B1 oznacza Ala, C1 oznacza Val, D1 oznacza His, E1 oznacza Ser, F1 oznacza Asn, G1 oznacza Asn, H1 oznacza Leu, I1 oznacza Val, J1 oznacza Ser i K1 oznacza Asn;

wtedy jedno lub więcej z A1 do K1 oznacza D-aminokwas i Z wybiera się z grupy składającej się z grupy alkiloaminowej, dialkiloaminowej, cykloalkiloaminowej, aryloaminowej, aryloalkiloaminowej, alkiloksy, aryloksy lub aryloalkiloksy.

Korzystniej agonista amyliny posiada następującą sekwencję aminokwasową:

¹A1-X-Asn-Thr-⁵Ala-Thr-Y-Ala-Thr-¹⁰Gln-Arg-Leu-B1-Asn-¹⁵Phe-Leu-C1-D1-E1-²⁰F1-G1-Asn-H1-Gly-²⁵I1-J1-Leu-Pro-Pro-³⁰Thr-K1-Val-Gly-Ser-³⁵Asn-Thr-Tyr-Z gdzie:

A1 oznacza Lys, Ala, Ser lub wodór;

B1 oznacza Ala, Ser lub Thr;

C1 oznacza Val, Leu lub Ile;

D1 oznacza His lub Arg;

E1 oznacza Ser lub Thr;

F1 oznacza Ser, Thr, Gln lub Asn;

PL 193 236 B1

G1 oznacza Asn, Gln lub His;

H1 oznacza Phe, Leu lub Tyr;

I1 oznacza Ala lub Pro;

J1 oznacza Ile, Val, Ala lub Leu;

K1 oznacza Asn, Asp lub Gln;

X i Y są niezależ nie wybranymi resztami, mają cymi ł a ń cuchy boczne, które są chemicznie powiązane między sobą, tworząc formę wiązania wewnątrzcząsteczkowego, gdzie wymienione wiązanie wewnątrzcząsteczkowe obejmuje wiązanie disiarczkowe, laktam lub wiązanie tioeterowe; oraz Z oznacza grupę aminową, alkiloaminową, dialkiloaminową, cykloalkiloaminową, aryloaminową, aryloalkiloaminową, alkiloksy, aryloksy, lub aryloalkiloksy;

przy czym gdy A1 oznacza Lys, B1 oznacza Ala, C1 oznacza Val, D1 oznacza Arg, E1 oznacza Ser, F1 oznacza Ser, G1 oznacza Asn, H1 oznacza Leu, I1 oznacza Pro, J1 oznacza Val i K1 oznacza Asn;

wtedy jedno lub więcej z A1 do K1 oznacza D-aminokwas i Z wybiera się z grupy, składającej się z grupy alkiloaminowej, dialkiloaminowej, cykloalkiloaminowej, aryloaminowej, aryloalkiloaminowej, alkiloksy, aryloksy lub aryloalkiloksy.

Korzystniej agonista amyliny posiada następującą sekwencję aminokwasową:

¹A1-X-Asn-Thr-⁵Ala-Thr-Y-Ala-Thr-¹⁰Gln-Arg-Leu-B1-Asn-¹⁵Phe-Leu-C1-D1-E1-^{20 * * * *}F1-G1-Asn-H1-Gly-^{25 * * * *}Pro-I1-Leu-Pro-Pro-^{30 * * *}Thr-J1-Val-Gly-Ser-³⁵Asn-Thr-Tyr-Z gdzie:

A1 oznacza Lys, Ala, Ser lub wodór;

B1 oznacza Ala, Ser lub Thr;

C1 oznacza Val, Leu lub Ile;

D1 oznacza His lub Arg;

E1 oznacza Ser lub Thr;

F1 oznacza Ser, Thr, Gln lub Asn;

G1 oznacza Asn, Gln lub His;

H1 oznacza Phe, Leu lub Tyr;

I1 oznacza Ile, Val, Ala lub Leu;

J1 oznacza Asn, Asp lub Gln;

przy czym gdy A1 oznacza Lys, B1 oznacza Ala, C1 oznacza Val, D1 oznacza Arg, E1 oznacza Ser, F1 oznacza Ser, G1 oznacza Asn, H1 oznacza Leu, I1 oznacza Val i J1 oznacza Asn;

Korzystniej analog agonisty amyliny stanowi ^25,28,29Pro-h-amylina.

25,28,29

Korzystniej analog agonisty amyliny stanowi ^{18 *}Arg^25,28,29Pro-h-amylina.

25,28

Korzystniej analog agonisty amyliny stanowi ¹⁸Arg^25,28Pro-h-amylina.

Korzystnie lek zawiera amylinę lub agonistę amyliny w ilości od 30 μg na dawkę do 300 μg na dawkę.

Korzystniej lek zawiera amylinę lub agonistę amyliny w ilości około 30 μg na dawkę.

Korzystniej lek zawiera amylinę lub agonistę amyliny w ilości około 60 μg na dawkę.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto zastosowanie amyliny lub agonisty amyliny w ilości od 2,5 μg do 5000 μg na dawkę do wytwarzania leku do redukowania indukowanego insuliną wzrostu masy ciała u człowieka biorącego insulinę.

Korzystnie agonistę amyliny stanowi analog agonisty amyliny.

Korzystniej agonista amyliny posiada następującą sekwencję aminokwasową:

¹A1-X-Asn-Thr-⁵Ala-Thr-Y-Ala-Thr-¹⁰Gln-Arg-Leu-B1-Asn-¹⁵Phe-Leu-C1-D1-E1-²⁰F1-G1-Asn-H1-Gly-²⁵Pro-I1-Leu-Pro-J1-³⁰Thr-K1-Val-Gly-Ser-³⁵Asn-Thr-Tyr-Z gdzie:

A1 oznacza Lys, Ala, Ser lub wodór;

B1 oznacza Ala, Ser lub Thr;

PL 193 236 B1

C1 oznacza Val, Leu lub Ile;

D1 oznacza His lub Arg;

E1 oznacza Ser lub Thr;

F1 oznacza Ser, Thr, Gln lub Asn;

G1 oznacza Asn, Gln lub His;

H1 oznacza Phe, Leu lub Tyr;

I1 oznacza Ile, Val, Ala lub Leu;

J1 oznacza Ser, Pro lub Thr;

K1 oznacza Asn, Asp lub Gln;

X i Y są niezależnie wybranymi resztami, mającymi łańcuchy boczne, które są chemicznie powiązane między sobą, tworząc formę wiązania wewnątrzcząsteczkowego, gdzie wymienione wiązanie wewnątrzcząsteczkowe obejmuje wiązanie disiarczkowe, laktam lub wiązanie tioeterowe; oraz Z oznacza grupę aminową, alkiloaminową, dialkiloaminową, cykloalkiloaminową, aryloaminową, aryloalkiloaminową, alkiloksy, aryloksy, lub aryloalkiloksy;

przy czym gdy A1 oznacza Lys, B1 oznacza Ala, C1 oznacza Val, D1 oznacza Arg, E1 oznacza Ser, F1 oznacza Ser, G1 oznacza Asn, H1 oznacza Leu, I1 oznacza Val, J1 oznacza Pro i K1 oznacza Asn, wtedy jedno lub więcej z A1 do K1 oznacza D-aminokwas i Z wybiera się z grupy składającej się z grupy alkiloaminowej, dialkiloaminowej, cykloalkiloaminowej, aryloaminowej, aryloalkiloaminowej, alkiloksy, aryloksy lub aryloalkiloksy.

Korzystniej agonista amyliny posiada następującą sekwencję aminokwasową:

A1 oznacza Lys, Ala, Ser lub wodór;

B1 oznacza Ala, Ser lub Thr;

C1 oznacza Val, Leu lub Ile;

D1 oznacza His lub Arg;

E1 oznacza Ser lub Thr;

F1 oznacza Ser, Thr, Gln lub Asn;

G1 oznacza Asn, Gln lub His;

H1 oznacza Phe, Leu lub Tyr;

I1 oznacza Ile, Val, Ala lub Leu;

J1 oznacza Ser, Pro, Leu, Ile lub Thr;

K1 oznacza Asn, Asp lub Gln;

X i Y są niezależnie wybranymi resztami, mającymi łańcuchy boczne, które są chemicznie powiązane między sobą, tworząc formę wiązania wewnątrzcząsteczkowego, gdzie wymienione wiązanie wewnątrzcząsteczkowe obejmuje wiązanie disiarczkowe, laktam lub wiązanie tioeterowe; oraz Z oznacza grupę aminową, alkiloaminową, dialkiloaminową, cykloalkiloaminową, aryloaminową, aryloalkiloaminową, alkiloksy, aryloksy, lub aryloalkiloksy; przy czym gdy (a) A1 oznacza Lys, B1 oznacza Ala, C1 oznacza Val, D1 oznacza Arg, E1 oznacza Ser, F1 oznacza Ser, G1 oznacza Asn, H1 oznacza Leu, I1 oznacza Val, J1 oznacza Pro i K1 oznacza Asn; lub (b) A1 oznacza Lys, B1 oznacza Ala, C1 oznacza Val, D1 oznacza His, E1 oznacza Ser, F1 oznacza Asn, G1 oznacza Asn, H1 oznacza Leu, I1 oznacza Val, J1 oznacza Ser i K1 oznacza Asn;

Korzystniej agonista amyliny posiada następującą sekwencję aminokwasową:

¹A1-X-Asn-Thr-⁵Ala-Thr-Y-Ala-Thr-¹⁰Gln-Arg-Leu-B1-Asn-¹⁵Phe-Leu-C1-D1-E1-²⁰F1-G1-Asn-H1-Gly-²⁵l1-J1-Leu-Pro-Pro-³⁰Thr-K1-Val-Gly-Ser-³⁵Asn-Thr-Tyr-Z gdzie:

A1 oznacza Lys, Ala, Ser lub wodór;

B1 oznacza Ala, Ser lub Thr;

C1 oznacza Val, Leu lub Ile;

D1 oznacza His lub Arg;

E1 oznacza Ser lub Thr;

F1 oznacza Ser, Thr, Gln lub Asn;

PL 193 236 B1

G1 oznacza Asn, Gln lub His;

H1 oznacza Phe, Leu lub Tyr;

I1 oznacza Ala lub Pro;

J1 oznacza Ile, Val, Ala lub Leu;

K1 oznacza Asn, Asp lub Gln;

Korzystniej agonista amyliny posiada następującą sekwencję aminokwasową:

¹A1-X-Asn-Thr-⁵Ala-Thr-Y-Ala-Thr-¹⁰Gln-Arg-Leu-B1-Asn-¹⁵Phe-Leu-C1-D1-E1-^{20 * * * *}F1-G1-Asn-H1-Gly-^{25 * * * *}Pro-l1-Leu-Pro-Pro-^{30 * * *}Thr-J1-Val-Gly-Ser-³⁵Asn-Thr-Tyr-Z gdzie:

A1 oznacza Lys, Ala, Ser lub wodór;

B1 oznacza Ala, Ser lub Thr;

C1 oznacza Val, Leu lub Ile;

D1 oznacza His lub Arg;

E1 oznacza Ser lub Thr;

F1 oznacza Ser, Thr, Gln lub Asn;

G1 oznacza Asn, Gln lub His;

H1 oznacza Phe, Leu lub Tyr;

I1 oznacza Ile, Val, Ala lub Leu;

J1 oznacza Asn, Asp lub Gln;

Korzystniej analog agonisty amyliny stanowi ^25,28,29Pro-h-amylina.

25,28,29

Korzystniej analog agonisty amyliny stanowi ^{18 *}Arg^25,28,29Pro-h-amylina.

25,28

Korzystniej analog agonisty amyliny stanowi ¹⁸Arg^25,28Pro-h-amylina.

Niespodziewanie stwierdzono, że amylina i agoniści amyliny, np. analog agonisty amyliny ^25,28,29Pro-h-amylina (przytaczana także jako „pramlintyd” i przytaczana wcześniej jako „AC-0137”), mogą być stosowani do leczenia otyłości u ludzi.

Amylinę lub agonistę amyliny można podawać pojedynczo lub w połączeniu z innym czynnikiem do znoszenia otyłości. Zastosowanie według wynalazku stosuje się do leczenia otyłości u podmiotu ludzkiego, obejmującego podawanie temu podmiotowi skutecznej ilości amyliny lub takiego agonisty amyliny. Przez „leczenie” rozumie się kierowanie pacjentem i opiekę nad nim w celu zwalczenia choroby, stanu lub zaburzenia, i obejmuje podawanie amyliny lub agonisty amyliny w celu zapobiegania występowaniu objawów lub powikłań, zmniejszania objawów lub powikłań, albo eliminacji stanu chorobowego lub zaburzenia. Leczenie otyłości obejmuje zatem hamowanie przyrostu masy i indukcję utraty

PL 193 236 B1 masy u pacjentów, którzy tego potrzebują. Poza tym, przez leczenie otyłości rozumie się objęcie kontrolą masy w celach kosmetycznych u ludzi, to jest kontrolowanie masy ciała w celu poprawienia wyglądu.

Określenie „amylina” rozumie się jako obejmujące związki, takie jak te, które określono w opisie patentowym U.S. nr 5,234,906, opublikowanym 10 sierpnia 1993 pod tytułem „Hyperglycemic Compositions”, którego zawartość załącza się do niniejszego opisu jako odniesienie. Przykładowo, obejmuje on ludzki hormon peptydowy przytaczany jako amylina i wydzielany z komórek beta trzustki, oraz jego odmiany gatunkowe. „Agonista amyliny” stanowi także określenie znane w dziedzinie i odnosi się do związku, który naśladuje wpływy amyliny. Agonista amyliny może być peptydem lub związkiem niepeptydowym i obejmuje analogi agonistów amyliny.

Określenie „analog agonisty amyliny” rozumie się jako odnoszące do pochodnych amyliny, które działają jako agoniści amyliny, normalnie uważa się obecnie, przez właściwość wiązania się lub innej bezpośredniej lub pośredniej interakcji z receptorem amyliny lub innym receptorem albo receptorami, z którymi sama amylina może wchodzić w interakcję w celu wywołania odpowiedzi biologicznej. Użyteczne analogi agonistów amyliny obejmują te, które zidentyfikowano w międzynarodowym zgłoszeniu WPI Acc. nr 93-182488/22, zatytułowanym „Nowe peptydy agonistów amyliny stosowane w leczeniu i zapobieganiu hipoglikemii i cukrzycy”, którego zawartość także załącza się do niniejszego opisu jako odniesienie.

W zalecanej postaci realizacji, agonista amyliny może oznaczać analog agonisty amyliny, korzystnie ^25,28,29Pro-h-amylinę. ^25,28,29Pro-h-amylina i inne analogi agonisty amyliny opisano i zastrzeżono w opisie patentowym U.S. nr 5,686,411, opublikowanym 11 listopada 1997, którego zawartość także załącza się do niniejszego opisu jako odniesienie.

Zastosowanie według wynalazku może być stosowane do redukcji przyrostu masy indukowanego insuliną u podmiotów ludzkich, pobierających insulinę, przez podawanie terapeutycznie skutecznej ilości amyliny lub agonisty amyliny, przy czym podmiot może chorować na cukrzycę, np. cukrzycę typu 1 lub typu 2. W zalecanej postaci realizacji zastosowania według wynalazku agonistę amyliny stanowi ^25,28,29Pro-h-amylina.

Badanie opisane w przykładzie 1 wykazało, że podawanie agonisty amyliny ^25,28,29Pro-h-amyliny (pramlintyd) cukrzykom (typ 2), stosującym insulinę, powodowało zmniejszenie masy ciała po 4 tygodniach, uzyskując istotność statystyczną w dwóch grupach dawkowania, 60 μg TID i 60 μg QID. Badanie opisane w przykładzie 2 wykazało, że podawanie pramlintydu (30 μg lub 60 μg QID) cukrzykom typu 1 spowodowało statystycznie istotne zmniejszenie masy ciała w porównaniu z placebo, po 13, 26 i 52 tygodniach. Badanie opisane w przykładzie 3 wykazało, że podawanie pramlintydu (30, 75 lub 150 μg TID) pacjentom z cukrzycą typu 2, którzy wymagają podawania insuliny, spowodowało statystycznie istotne zmniejszenie masy ciała w porównaniu z placebo, po 13, 26 i 52 tygodniach. Wyniki te pozostają w ostrym kontraście z leczeniem pacjentów z cukrzycą typu 1 lub typu 2 przy użyciu samej insuliny, któremu zwykle towarzyszy zwiększenie masy ciała.

Analogi agonisty amyliny użyteczne w tym wynalazku obejmują analogi agonistów amyliny opisane i zastrzeżone w opisie patentowym U.S. nr 5,686,411.

Innych agonistów amyliny opisano powyżej.

25,28,29 18 25,28,29

Zalecane analogi agonistów amyliny obejmują ^25,28,29Pro-h-amylinę, ¹⁸Arg^25,28,29Pro-h-amylinę i ¹⁸Arg^25,28Pro-h-amylinę.

Aktywność agonistów amyliny można potwierdzić i ocenić ilościowo, przeprowadzając różne testy przesiewowe, łącznie z testem wiązania receptora jądra półleżącego (nucleus accumbens) opisanym poniżej w przykładzie 8, testem opróżniania żołądka opisanym poniżej w przykładzie 9 lub 10, lub przez zdolność do indukcji hipokalcemii lub zmniejszania poposiłkowej hiperglicemii u ssaków, jak tu opisano.

Test wiązania receptora, test kompetycyjny, który mierzy zdolność związków do specyficznego wiązania z receptorami amyliny związanymi z błoną, opisano i zastrzeżono w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych nr 5,264,372 opublikowanym 23 listopada 1993, który załącza się do niniejszego opisu jako odniesienie. Test wiązania receptora opisano także w przykładzie 7 poniżej. Zalecanym źródłem preparatów błonowych stosowanych w teście jest podstawowe przodomózgowie, które obejmuje błony z jądra półleżącego i regionów otaczających. Testowane związki współzawodniczą o wiązanie z tymi preparatami receptorowymi z amyliną szczurzą ¹²⁵I Bolton Hunter. Krzywe współzawodnictwa, w których ilość związaną (B) nanosi się jako funkcję logarytmu stężenia liganda, analizuje komputerowo, przy użyciu analiz przez nieliniową regresję 4-parametrowego równania logistycznego (program

PL 193 236 B1

Inplot; GraphPAD Sortware, San Diego, Kalifornia) lub program ALLFLT DeLeana i in., (ALLFIT, wersja 2,7 (NIH, Bethesda, MD 20892)). Munson i Rodbard, Anal, Biochem. 107: 220-239 (1980).

Testy aktywności biologicznej agonistów amyliny w mięśniu płaszczkowatym można przeprowadzić przy użyciu wcześniej opisanych metod (Leighton, B. i Cooper, Nature, 335: 632-635 (1988); Cooper i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7763-7766 (1988)), w których aktywność agonisty amyliny można oceniać przez pomiar hamowania syntezy glikogenu stymulowanej insuliną. Test mięśnia płaszczkowego opisano także w przykładzie 8 poniżej.

Metody pomiaru tempa opróżniania żołądka opisano np. u Young i in., Diabetologia, 38(6): 642-648 (1995). W metodzie z użyciem czerwieni fenolowej, którą opisano w przykładzie 9 poniżej, przytomne szczury otrzymują przez zgłębnik bezbarwny żel, zawierający metylocelulozę i wskaźnik czerwieni fenolowej. Dwadzieścia minut po podaniu przez zgłębnik, zwierzęta usypia się przy użyciu halotanu, żołądek obnaża i zaciska przy odźwierniku i niższych zwieraczach przełyku, usuwa i otwiera do roztworu alkalicznego. Zawartość żołądka można uzyskać z intensywności czerwieni fenolowej w roztworze alkalicznym, zmierzonej przez absorbancję przy długości fali 560 nm. W metodzie z użyciem trytowanej glukozy, którą opisano w przykładzie 10 poniżej, przytomne szczury odżywia się przez zgłębnik trytowaną glukozą w wodzie. Szczury delikatnie ogranicza się przez ogon, którego czubek znieczula się lidokainą. Zbiera się tryt z osocza oddzielonego z krwi ogonowej przy różnych punktach czasowych i wykrywa w liczniku beta. Związki testowe podaje się zazwyczaj około jednej minuty przed żywieniem przez zgłębnik.

Wpływ amylin lub agonistów amyliny na masę ciała, można identyfikować, oceniać lub przesiewać stosując sposoby opisane w przykładach 1-3 poniżej, albo inne znane w dziedzinie lub równoważne sposoby określania wpływu na masę ciała. Zalecane związki agonistów amyliny wykazują aktywność w teście wiązania receptora rzędu mniej niż około 1 do 5 nM, dogodnie mniej niż około 1 nM, dogodniej mniej niż około 50 pM. W teście mięśnia płaszczkowatego, zalecane związki agonistyczne amyliny wykazują wartości ED50 rzędu mniej niż około 1 do 10 mikromolarne. W testach opróżniania żołądka, zalecane związki agonistyczne wykazują wartości ED₅₀ rzędu mniej niż 100 μg/szczura.

Amylinę i peptydowych agonistów amyliny można wytwarzać przy użyciu standardowych technik syntezy peptydów w fazie stałej i korzystnie w automatycznym lub półautomatycznym syntetyzerze peptydów. Zazwyczaj, stosując takie techniki, aminokwas zabezpieczony grupą α-N-karbamoilową oraz aminokwas przyłączone do rosnącego łańcucha peptydowego na żywicy, sprzęga się w temperaturze pokojowej w obojętnym rozpuszczalniku, takim jak dimetyloformamid, N-metylopirolidynon lub chlorek metylenu w obecności czynników sprzęgających, takich jak dicykloheksylokarbodiimid i 1-hydroksybenzotriazol w obecności zasady, takiej jak diizopropyloetyloamina. Grupę zabezpieczającą a-2N-karbamoilową usuwa się z uzyskanej żywicy peptydowej przy użyciu odczynnika, takiego jak kwas trifluorooctowy lub piperydyna, a reakcję sprzęgania powtarza z następnym, żądanym N-zabezpieczonym aminokwasem dodawanym do łańcucha peptydowego. Odpowiednie grupy N-zabezpieczające są dobrze znane w dziedzinie, przy czym zaleca się tu grupę tert-butyloksykarbonylową (tBoc) i fluorofenylometoksykarbonylową (Fmoc).

Rozpuszczalniki, pochodne aminokwasowe i żywicę 4-metylobenzhydryloaminową stosowaną w syntetyzatorze peptydów można nabyć od Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA). Następujące aminokwasy z zabezpieczonymi łańcuchami bocznymi można nabyć od Applied Biosystems, Inc.: Boc-Arg(Mts), Fmoc-Arg(Pmc), Boc-Thr(Bzl), Fmoc-Thr(t-Bu), Boc-Ser(Bzl), Fmoc-Ser(t-Bu), Boc-Tyr(BrZ), Fmoc-Tyr(t-Bu), Boc-Lys(Cl-Z), Fmoc-Lys(Boc), Boc-Glu(Bzl), Fmoc-Glu(t-Bu), Fmoc-His-(Trt), Fmoc-Asn(Trt) i Fmoc-Gln(Trt). Boc-His(BOM) można nabyć od Applied Biosystems, Inc. lub Bachem Inc. (Torrance, CA). Anizol, metylosiarczek, fenol, etanoditiol i tioanizol można uzyskać od Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI). Air Products and Chemicals (Allentown, PA) dostarcza HF. Eter etylowy, kwas octowy i metanol można nabyć od Fisher Scientific (Pittsburgh, PA).

Syntezę peptydów w fazie stałej można przeprowadzić z użyciem automatycznego syntetyzera peptydów (Model 430A, Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) stosując system NMP/HOBt (Option 1) i chemie tBoc lub Fmoc (zobacz instrukcja obsługi Applied Biosystems dla ABI 430A Peptyde Syntesizer, wersja 1,3B 1 lipiec 1988, sekcja 6, strony 49-70, Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) z nakryciem. Żywicę peptydową Boc można rozszczepiać przy użyciu HF (temperatura -5°C do 0°C, 1 godzina). Peptyd można ekstrahować z żywicy kolejno wodą i kwasem octowym i filtraty liofilizować. Żywice peptydowe Fmoc można rozszczepiać zgodnie ze standardowymi metodami (Introduction to Cleavage Techniques, Applied Biosystems Inc., 1990 strony 6-12). Peptydy można także składać stosując Advanced Chem Tech Syntesizer (Model MPS 350, Louisville, Kentucky).

PL 193 236 B1

Peptydy można oczyszczać przy użyciu RP-HPLC (preparatywnej i analitycznej) stosując system Waters Delta Prep 3000. Do izolacji peptydów można stosować kolumnę preparatywną C4, C8 lub C18 (10 μ, 2,2 x 25 cm; Vydac, Hesperia, CA), a czystość można określać przy użyciu kolumny analitycznej C4, C8 lub C18 (5 μ, 0,46 x 25 cm; Vydac). Rozpuszczalniki (A=0,1% TFA/woda i B-0,1% TFA/CH3CN) można dostarczyć do kolumny analitycznej przy tempie przepływu, wynoszącym 1,0 ml/minutę i do kolumny preparatywnej przy 15 ml/minutę. Analizy aminokwasów można przeprowadzić na systemie Waters Pico Tag i obrabiać przy użyciu programu Maxima. Peptydy można hydrolizować przez hydrolizę kwasową w fazie pary (temperatura 115°C, 20-24 godziny). Hydrolizaty można derywatyzować i analizować standardowymi metodami (Cohen i in., The Pico Tag Method: A Manual of Advanced Techniques for Amino Acid Analysis, strony 11-52, Millipore Corporation, Milford, MA (1989)). Analizę bombardowania szybkimi atomami można przeprowadzić przy użyciu M-Scan, Incorporated (West Chester, PA). Kalibrację masy można przeprowadzić stosując jodek cezu lub mieszaninę jodek cezu/glicerol. Analizę jonizacji desorpcji plazmy przy użyciu detekcji czasu lotu, można prowadzić na spektrometrze masowym Applied Biosystems Bio-lon 20.

Związki peptydowe użyteczne w wynalazku można także wytwarzać stosując techniki rekombinacji DNA, przy użyciu metod obecnie znanych w dziedzinie. Zobacz np. Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, drugie wydanie, Cold Spring Harbor (1989). Związki nie peptydowe użyteczne w niniejszym wynalazku można wytwarzać metodami znanymi w dziedzinie.

Związki przytoczone powyżej mogą tworzyć sole z różnymi nieorganicznymi i organicznymi kwasami i zasadami. Takie sole obejmują sole wytworzone z kwasami organicznymi i nieorganicznymi, np. HCl, HBr, H2SO4, H3PO4, kwasem trifluorooctowym, kwasem octowym, kwasem mrówkowym, kwasem metanosulfonowym, kwasem toluenosulfonowym, kwasem jabłkowym, kwasem fumarowym i kwasem kamfosulfonowym. Sole tworzone z zasadami obejmują sole amonowe, sole metali alkalicznych, np. sole sodowe i potasowe, oraz sole metali ziem alkalicznych, np. sole wapnia i magnezu. Zaleca się sole octanowe, chlorowodorki oraz trifluorooctanowe. Najbardziej zaleca się sole octanowe. Sole można tworzyć konwencjonalnymi środkami, jak przez reakcję postaci wolnego kwasu lub zasady z jednym lub więcej równoważników odpowiedniej zasady lub kwasu w rozpuszczalniku lub środowisku, w którym sól jest nierozpuszczalna, albo w rozpuszczalniku, takim jak woda, który następnie usuwa się pod zmniejszonym ciśnieniem lub przez liofilizację albo przez wymianę jonów istniejącej soli na inny jon, na odpowiedniej żywicy jonowymiennej.

Kompozycje użyteczne w wynalazku można dogodnie dostarczać w postaci preparatów odpowiednich do podawania pozajelitowego (łącznie z dożylnym, domięśniowym i podskórnym) albo nosowego lub doustnego. Odpowiedni sposób podawania określić może najlepiej lekarz, dla każdego pacjenta indywidualnie. Odpowiednie nośniki dopuszczalne farmaceutycznie i ich preparaty opisano w pracach o standardowych preparatach, np. Remigton's Pharmaceutical Sciences E.W. Martin, zobacz także Wang, Y.J. i Hanson, M.A. „Parenteral Formulations of Proteins and Peptides: Stability and Stabilizers”, Journal of Parenteral Science and Technology, Technical Report nr 10, suplement 42:2S (1988). Związki dostarczone w postaci kompozycji pozajelitowych do wstrzykiwania lub wlewu, można np. zawieszać w obojętnym oleju, odpowiednio oleju roślinnym, takim jak olej sezamowy, z orzeszków ziemnych, z oliwek, albo innym dopuszczalnym nośniku. Dogodnie, zawiesza się je w nośniku wodnym, np. w izotonicznym roztworze buforującym przy pH, wynoszącym około 5,6 do 7,4. Te kompozycje można wyjaławiać konwencjonalnymi technikami wyjaławiania lub można je wyjaławiać przez filtrację. Kompozycje mogą zawierać farmaceutycznie dopuszczalne substancje pomocnicze, jakie wymagane są do przybliżenia warunków fizjologicznych, takie jak czynniki buforujące pH. Użytecznymi buforami są np. bufory octan sodu/kwas octowy. Można stosować postać czopka lub preparatu do powolnego uwalniania typu „depot” tak, że terapeutycznie skuteczne ilości są doprowadzane do krwi przez wiele godzin lub dni po przezskórnym wstrzyknięciu lub doprowadzeniu.

Dogodnie, te postacie dawkowania pozajelitowego wytwarza się zgodnie z należącym również do niniejszego zgłaszającego zgłoszeniem patentowym zatytułowanym „Parenteral, Liquid Formulations for Amylin Agonist Peptides”, nr 60/035,140, złożonym 8 stycznia 1997 oraz zgłoszeniem Stanów Zjednoczonych nr 09/005,262, złożonym 8 stycznia 1998, które załącza się do niniejszego opisu jako odniesienie, i obejmują odpowiednio około 0,01 do 0,5% (wag./obj.) amyliny lub agonisty amyliny w układzie wodnym razem z około 0,02 do 0,5% (wag./obj.) buforu octanowego, fosforanowego, cytrynianowego lub glutaminianowego, w celu otrzymania pH kompozycji końcowej, wynoszącego około 3,0 do 6,0 (dogodniej 3,0 do 5,5), jak również około 1,0 do 10% (wag./obj.) środka tonizującego węglowodanowego lub wielowodorotlenowego alkoholu w ciągłej fazie wodnej. W zalecanym preparacie produktu

PL 193 236 B1 opracowanego tak aby pozwolić pacjentowi na pobieranie wielokrotnych dawek występuje także około 0,005 do 1,0% (wag./obj.) przeciwdrobnoustrojowego środka konserwującego, wybranego z grupy, składającej się z meta-krezolu, alkoholu benzylowego, parabenów metylu, etylu, propylu i butylu oraz fenolu. Środek stabilizujący nie jest konieczny. W celu uzyskania żądanego stężenia roztworu stosuje się wystarczającą ilość wody do wstrzyknięć. Jeśli trzeba, może być także obecny chlorek sodu, oraz inne zaróbki. Jednak takie zaróbki muszą utrzymywać ogólną stabilność amyliny lub peptydowego agonisty amyliny. Preparaty płynne powinny być zasadniczo izotoniczne, to jest ich izotoniczność powinna wynosić ±20%, a dogodnie 10%. Najdogodniej, w preparacie amyliny lub agonisty amyliny do podawania pozajelitowego, alkoholem wielowodorotlenowym jest mannitol, buforem jest bufor octanowy, środkiem konserwującym jest około 0,1 do 0,3% (wag./obj.) meta-krezol i pH wynosi około 3,7 do 4,3. Żądaną izotoniczność można uzyskać przy użyciu chlorku sodu lub innych farmaceutycznie dopuszczalnych soli.

Jeśli trzeba, roztwory powyższych kompozycji można zagęszczać środkiem zagęszczającym, takim jak metyloceluloza. Można je wytwarzać w postaci zemulgowanej, albo woda w oleju albo olej w wodzie. Można wykorzystać każdy z wielu różnych farmaceutycznie dopuszczalnych środków emulgujących, włączając np. proszek z akacji, nie jonowy środek powierzchniowo czynny (taki jak Tween), albo jonowy środek powierzchniowo czynny (taki jak siarczany lub sulfoniany alkalicznych polieteroalkoholi, np. Triton).

Kompozycje użyteczne w wynalazku można wytwarzać przez mieszanie składników, postępując zgodnie z ogólnie przyjętymi procedurami. Przykładowo, wybrane składniki można po prostu wymieszać w blenderze lub innym standardowym urządzeniu do wytwarzania stężonych mieszanin, które można potem wyregulować do ostatecznego stężenia i lepkości przez dodanie wody lub czynnika zagęszczającego oraz prawdopodobnie buforu do kontrolowania pH lub dodatkowej substancji rozpuszczonej, do kontrolowania toniczności.

Do użytku przez lekarza, kompozycje mogą być dostarczane w postaci jednostki dawkowania, zawierającej ilość amyliny lub agonisty amyliny, np. związku analoga agonisty amyliny, która będzie skuteczna w jednej lub wielu dawkach do kontrolowania otyłości na wybranym poziomie.

Terapeutycznie skuteczne ilości amyliny lub agonisty amyliny, takiego jak analog agonisty amyliny, do stosowania w kontrolowaniu otyłości, są tymi, które zmniejszają masę ciała. Zrozumiałym będzie dla specjalisty w dziedzinie, że skuteczna ilość środka terapeutycznego będzie się zmieniać w zależności od wielu czynników, włączając wiek i masę pacjenta, stan fizyczny pacjenta, działanie jakie chce się uzyskać i innych czynników.

Skuteczne pojedyncze, dzielone lub ciągłe, znoszące ból dawki związków, np. obejmujące ^25,28,29Pro-h-amylinę, ¹⁸Arg^25,28,29Pro-h-amylinę, ¹⁸Arg^25,28Pro-h-amylinę, będą zwykle wynosić około 0,01 do około 5 mg/dzień, dogodnie około 0,05 do około 2 mg/dzień i dogodniej około 0,1 do 1 mg/dzień, dla pacjenta ważącego 70 kg, podawane w dawce pojedynczej, podzielonej lub ciągłej. Dokładną dawkę do podawania, określa lekarz prowadzący i zależy ona od licznych czynników, łącznie z tymi, które wyliczono powyżej. Podawanie powinno się rozpocząć przy pierwszej oznace otyłości. Podawanie można prowadzić przez iniekcję lub wlew, dogodnie dożylne, podskórne lub domięśniowe. Związki aktywne po podaniu doustnym można pobierać doustnie, jednakże dawkowanie powinno być zwiększone 5-10-krotnie.

Generalnie, w leczeniu lub zapobieganiu otyłości, związki do zastosowania według tego wynalazku można podawać pacjentom potrzebującym takiego leczenia w zakresie dawkowania podobnym do podanego powyżej, jednakże związki można podawać częściej, np. jeden, dwa lub trzy razy dziennie lub w sposób ciągły. Dogodnie, dawki agonistów peptydowych, np. pramlintyd, podaje się podskórnie w dawkach 30-300 μg podawanych od jednego do czterech razy dziennie, a dogodniej w dawkach od 30-120 μg podawanych dwa do czterech razy dziennie.

Dla ułatwienia zrozumienia niniejszego wynalazku, załączono następujące przykłady, które opisują wyniki zbioru doświadczeń. Badania odnoszące się do tego wynalazku nie powinny być oczywiście rozpatrywane jako specyficznie ograniczające wynalazek, a takie odmiany wynalazku, obecnie znane lub później opracowane, które wchodziłyby w zakres wiedzy fachowca, uważa się za wchodzące w zakres wynalazku, jak opisano w niniejszym opisie i dalej zastrzeżono.

PL 193 236 B1

P r z y k ł a d 1

Pomiar masy ciała: badanie 4-tygodniowe u chorych z cukrzycą typu 2, którzy wymagają pobierania insuliny

Uczestnikami badania były osoby płci męskiej i żeńskiej w wieku 25 do 78 lat z cukrzycą typu 2 w wywiadzie, wymagający leczenia insuliną przez co najmniej 6 miesięcy przed wizytą wstępnego przesiewu. Masa ciała pacjentów nie różniła się więcej niż 45% od żądanej masy ciała przed przyjęciem do badania (na podstawie Metropolitan Life Tables). W badaniu wykorzystywano metody opisane u Thompson i in., Diabetes 46: 632-636 (1997). Po okresie wprowadzenia placebo, pacjentów podzielono losowo na otrzymujących placebo i jeden z trzech trybów dawkowania ^25,28,29Pro-h-amyliny (pramlintyd) przez 4 tygodnie: 30 μg QID (przed śniadaniem, lunchem, obiadem i przekąską wieczorną), 60 μg TID (przed śniadaniem, lunchem i obiadem) lub 60 μg QID (przed śniadaniem, lunchem, obiadem i przekąską wieczorną). W okresie badania leku, pacjenci sami podawali sobie cztery iniekcje badanego leku dziennie, w czasie 15 minut każdego posiłku oraz przekąski wieczornej. Podczas podwójnie ślepego okresu, pacjentów podzielono losowo na tych, którym podawano pramlintyd 60 μg TID i placebo przed przekąską wieczorną. Zarówno pramlintyd jak i placebo podawano jako oddzielne iniekcje do tkanki podskórnej przedniej ściany brzucha; specyficzne miejsce zmieniano po każdej iniekcji. Pacjentów poinstruowano żeby zachowali swój typowy zwykły reżim diety, insuliny i ćwiczeń w czasie badania, chyba, że badający poinstruował inaczej, oraz żeby powstrzymali się od spożycia napojów alkoholowych przed wszystkimi wizytami w klinice.

Jak pokazano w tabeli I, wystąpiło statystycznie istotne zmniejszenie masy ciała od linii podstawowej do tygodnia 4 w grupie pramlintydu 60 μg TID (średnia = -0,89 kg, p = 0,0056) i pramlintydu 60 μg QID (średnia = -0,72, p = 0,0014). Stosując dopasowanie Hochberga dla wielu porównań, nie istniała statystycznie istotna zmiana masy ciała od linii podstawowej do tygodnia 4 w żadnej z trzech grup pramlintydu w porównaniu z grupą placebo. Tak więc, podawanie pramlintydu z ciągłym stosowaniem insuliny poprawiło kontrolę poziomu glukozy przy zmniejszeniu masy ciała, z osiągnięciem istotności statystycznej w grupach 60 μg TID i QID. To zmniejszenie pozostaje w ostrym kontraście z przyrostem masy, zwykle towarzyszącym poprawionej kontroli poziomu glukozy uzyskanej przy zastosowaniu samej insuliny u pacjentów z cukrzycą typu 2.

T a b e l a I

Masa ciała: zmiana od linii podstawowej do tygodnia 4

	Linia podstawowa	Zmiana w tygodniu 4	Wartość p*
Leczona grupa	N	Średnia (kg)	Średnia (kg)	Mediana (kg)	W grupie badanego leku	Porównanie placebo
Placebo	47	87,0	-0,04	0,00	NS	NAP
Pramlintyd 30 μg QID	47	88,5	-0,36	-0,45	NS	NS
Pramlintyd 60 μg TID	48	86,2	-0,89	-1,05	0,0056	NS
Pramlintyd 60 μg QID	51	91,5	-0,72	-0,45	0,0014	NS

* Test t-Studenta (porównania w grupie badanego leku). Dwustronna ANOVA (porównanie placebo) z dopasowaniem Hochberga NS = statystycznie nieistotny NAP = nie ma zastosowania

P r z y k ł a d 2

Pomiar masy ciała: badanie 52-tygodniowe chorych z cukrzycą typu 1

Badanie to było wieloośrodkowe, podwójnie ślepe, kontrolowane placebo, było badaniem równoległych grup ze zwiększaniem potencjalnej dawki. Uczestnikami badania byli osobnicy płci męskiej i żeńskiej w wieku między 16 a 70 lat, z cukrzycą typu 1. Podawali oni sobie sami cztery iniekcje podskórne dziennie, jedną przed każdym posiłkiem i przekąską przed snem. Niektórych pacjentów (tych w grupie pramlintydu, którzy wykazywali redukcję HbA1c od linii podstawowej, wynoszącą mniej niż 1,0% po 13 tygodniach leczenia) poddano po 20 tygodniach, ponownemu losowemu podziałowi na grupy 30 μg lub 60 μg QID do pozostałej części badania. Pacjentów w tym badaniu leczono badanym lekiem wytworzonym tak, że jego pH wynosiło 4,0 przy stężeniu pozwalającym na iniekcję 0,1 ml na dawkę. 477

PL 193 236 B1 pacjentów otrzymało co najmniej jedną dawkę badanego leku (pramlintyd lub placebo). Z 477 pacjentów, których wybrano losowo i ustalono dawki, 341 zakończyło 52-tygodniowe badanie.

Pacjenci traktowani pramlintydem doświadczyli klinicznie znaczącego i statystycznie istotnego zmniejszenia masy ciała, w porównaniu z placebo, w 13, 26 i 52 tygodniu (tabela II). Największą różnicę w stosunku do placebo zaobserwowano w 26 tygodniu i 52 tygodniu (zmniejszenie o co najmniej o 1,2 kg w porównaniu z placebo w każdym punkcie czasowym). Utrata masy zachodziła szczególnie u tych pacjentów, u których posiadana linia podstawowa indeksu masy ciała (BMI), wynosiła co najmniej 27,0 kg/m², wskazując na największą korzyść u otyłych pacjentów (tabela III).

Pacjenci biorący pramlintyd w podgrupie pacjentów z poziomem linii podstawowej HbA1c 1, wynoszącym co najmniej 8,0% i stabilną insuliną, doświadczyli średniego zmniejszenia masy ciała w porównaniu z placebo we wszystkich trzech punktach czasowych (tabela IV). Obserwacja ta jest zgodna z dobrze znanym wpływem insuliny na ułatwienie przyrostu masy ciała. Tak więc, pramlintyd jak się okazało, redukuje indukowany insuliną przyrost masy.

Dane o rozkładzie normalnym analizowano przy użyciu dwustronnej analizy wariancji. W przypadkach gdzie dane nie pasowały do rozkładu normalnego, wykorzystano metody nieparametryczne oparte ma rangach (test Kruskal-Wallis). W tych przypadkach, zamiast średniej przedstawiono estymator Hodgesa-Lehmana dla różnicy w stosunku dla placebo.

T a b e l a II

Masa ciała: zmiany mas w stosunku do linii podstawowej w tygodniach 13, 26 i 52

Punkt czasowy/masa ciała (kg)	Placebo (N=154)	Pramlintyd 30 lub 60 μg QID (N=163)
1	2	3
Linia podstawowa
Średnia (SE)	76,3(1,1)	76,4(1,1)
Mediana	75,0	75,9
Zakres	47; 121,8	46,4; 113,6
Tydzień 13 (3 miesiące)
Średnia (SE)	76,5(1,1)	75,4(1,1)
Mediana	75,1	75,6
Zakres	45; 125,7	47,3; 110,5
Zmiana wobec linii podstawowej
Średnia (SE)	0,2(0,2)	-1,0(0,2)
Mediana	0	-1,0
Zakres	-6,0; 8,2	-7,6; 8,2
Estymator Hodgesa-Lehmana dla różnicy z placebo	-	-1,2
Wartość p \|	-	0,0001*
Tydzień 26 (6 miesięcy)
Średnia (SE)	76,9(1,1)	75,5(1,1)
Mediana	75,9	76,4
Zakres	45,8; 126,8	46,4; 111,2
Zmiana wobec linii podstawowej
Średnia (SE)	0,6(0,2)	-0,9(0,3)
Mediana	0,55	-0,5

PL 193 236 B1 ciąg dalszy tabeli II

1	2	3
Zakres	-7,3; 9,3	-23,5; 9,1
Estymator Hodgesa-Lehmana dla różnicy z placebo	-	-1,3
Wartość p t	-	0,0001*
Tydzień 52 (12 miesięcy)
Średnia (SE)	77,1(1,1)	76,0(1,1)
Mediana	75,7	76,4
Zakres	44,8; 126,8	48,2; 109,9
Zmiana wobec linii podstawowej
Średnia (SE)	0,8(0,3)	-0,5(0,3)
Mediana	0,8	-0,5
Zakres	-11,5; 11,2	-12,0; 13,7
Średnia różnica wobec placebo	-	-1,3
Wartość f	-	0,0137*

t Test Kruskal-Wallis f Dwustronna ANOVA * Statystycznie istotna różnica w porównaniu z placebo

T a b e l a III

Masa ciała: zmiany w stosunku do linii podstawowej dla pacjentów z linią podstawową BMI >27,0 kg/m² lub <27,0 kg/m²; masy w tygodniu 13, 26 i 52

Podgrupa BMI/masa ciała (kg)	Placebo (N=154)	Pramlintyd 30 lub 60 μg QID (N=163)
Linia podstawowa BMI>27,0 kg/m²
Zmiana w tygodniu 52
N	51	53
Średnia (SE)	0,4(0,53)	-1,8(0,65)
Zakres	-6,4; 11,2	-12,0; 9,1
Linia podstawowa BMI<27,0 kg/m²
Zmiana w tygodniu 52
N	103	110
Średnia (SE)	1,0(0,36)	0,1(0,28)
Zakres	-11,5; 11,2	-5,0; 13,7

PL 193 236 B1

T a b e l a IV

Masa ciała: zmiany w stosunku do linii podstawowej; pacjenci z HbAic >8,0%, insulina w zakresie ±10% od linii podstawowej; masy w tygodniach 13, 26 i 52

Punkt czasowy/masa ciała (kg)	Placebo (N=31)	Pramlintyd 30 lub 60 μg QID (N=39)
Linia podstawowa
Średnia (SE)	75,9(2,2)	81,3(2,2)
Mediana	74,6	79,4
Zakres	56,5; 113,6	55,5; 113,6
Tydzień 13 (3 miesiące)
Średnia (SE)	75,8(2,1)	80,3(2,1)
Mediana	74,1	78,6
Zakres	56,5; 108,2	56,4; 110,5
Zmiana wobec linii podstawowej
Średnia (SE)	-0,1(0,4)	-1,0(0,4)
Mediana	0	-1,4
Zakres	-6,4; 4,1	-7,6; 8,2
Średnia różnica wobec placebo	-	-0,9
Wartość p t	-	0,0745
Tydzień 26 (6 miesięcy)
Średnia (SE)	76,2(2,0)	80,8(2,1)
Mediana	75,9	80,5
Zakres	54,9; 108,2	55,5; 111,2
Zmiana wobec linii podstawowej
Średnia (SE)	0,3(0,5)	-0,5(0,6)
Mediana	0,4	0
Zakres	-5,4; 5,9	-10,5; 9,1
Średnia różnica wobec placebo	-	0,8
Wartość p t	-	0,1197
Tydzień 52 (12 miesięcy)
Średnia (SE)	76,5(2,1)	81,7(2,1)
Mediana	75,9	79,6
Zakres	54,5; 109,1	56,4; 109,9
Zmiana wobec linii podstawowej
Średnia (SE)	0,6(0,7)	0,4(0,6)
Mediana	0,7	0,2
Zakres	-7,0; 11,2	-10,0; 13,7
Średnia różnica wobec placebo	-	-0,2
Wartość p φ	-	0,2441

t ANOVA dla dwóch prób * Statystycznie istotna różnica w porównaniu z placebo

PL 193 236 B1

P r z y k ł a d 3

Pomiar masy ciała: badanie 52-tygodniowe u chorych z cukrzycą typu 2, którzy wymagają pobierania insuliny

Badanie to było wieloośrodkowe, podwójnie ślepe, kontrolowane placebo, było badaniem równoległych grup z różnymi zakresami dawek. Uczestnicy byli osobnikami płci męskiej i żeńskiej w wieku między 18 a 75 lat, z cukrzycą typu 2, którzy wymagają insuliny. Podawali oni sobie sami trzy podskórne iniekcje dziennie pramlintydu (30, 75 lub 150 μg TID) lub placebo (TID), jedną przed każdym posiłkiem, przez 52 tygodnie. Pacjentów w tym badaniu traktowano badanym lekiem w takim preparacie, że jego pH wynosiło 4,7 przy stężeniu wymagającym iniekcji 0,3 ml na dawkę. Okres podwójnie ślepego traktowania był poprzedzony 3- lub 10-dniowym pojedynczo ślepym okresem wprowadzenia placebo. Z 539 pacjentów randomizowanych i którym ustalono dawki, 381 zakończyło 52-tygodniowe badanie.

Pacjenci traktowani każdą z tych trzech dawek pramlintydu, doświadczyli klinicznie znaczącego i statystycznie istotnego zmniejszenia masy ciała, w porównaniu z placebo, w 13, 26 i 52 tygodniu (tabela V). Największą różnicę w stosunku do placebo zaobserwowano w 26 tygodniu i 52 tygodniu (zmniejszenie o co najmniej 2,3 i 2,7 kg w porównaniu z placebo w każdym punkcie czasowym). Masa pacjentów traktowanych placebo zwiększyła się w stosunku do linii podstawowej we wszystkich trzech punktach czasowych, w przeciwieństwie do zmniejszenia masy w trzech grupach pramlintydu, we wszystkich trzech punktach czasowych. Utrata masy zachodziła szczególnie u tych pacjentów, którzy posiadali linię podstawową indeksu masy ciała (BMI), wynoszącą co najmniej 27,0 kg/m², oraz mających linię podstawową BMI mniejszą niż 27,0 kg/m² (tabela VI).

Pacjenci, pobierający pramlintyd we wszystkich trzech grupach z poziomem linii podstawowej HbA1c, wynoszącym co najmniej 8,0% i stabilną insuliną, doświadczyli zmniejszenia masy ciała w porównaniu z placebo we wszystkich trzech punktach czasowych (tabela VII). Wielkość odpowiedzi była generalnie porównywalna z obserwowaną dla wszystkich pacjentów sugerując, że skutek jest niezależny od dawki insuliny.

Dane o rozkładzie normalnym analizowano przy użyciu dwustronnej analizy wariancji (z dopasowaniem Hochberga w stosunku do procedury Bonferroniego dla wielu porównań). W przypadkach gdzie dane nie pasowały do rozkładu normalnego, wykorzystano metody nieparametryczne oparte na rangach (test Kruskal-Wallis). W tych przypadkach, zamiast średniej przedstawiono estymator Hodgesa-Lehmana dla różnicy w stosunku dla placebo.

T a b e l a V

Masa ciała: zmiany w stosunku do linii podstawowej; masy w tygodniach 13, 26 i 52

Punkt czasowy/masa ciała (kg)	Placebo (N=89)	Pramlintyd 30 μ9 TID (N=86)	Pramlintyd 75 μ9 TID (N=93)	Pramlintyd 150 μ9 TID (N=77)
1	2	3	4	5
Linia podstawowa
Średnia (SE)	90,6(1,6)	90,3(1,8)	93,2(1,8)	94,3(2,1)
Mediana	90,3	89,15	92,3	95,7
Zakres	59,5; 130,9	60,0; 140,0	51,8; 165,0	57,3; 158,1
Tydzień 13 (3 miesiące)
Średnia (SE)	91,3(1,6)	89,8(1,8)	92,5(1,9)	92,7(2,1)
Mediana	90,0	89,3	92,3	92,3
Zakres	60,5; 132,9	57,7; 142,7	49,1; 166,8	56,4; 156,8
Zmiana od linii podstawowej
Średnia (SE)	0,6(0,2)	-0,5(0,3)	-0,6(0,4)	-1,6(0,3)
Mediana	0,5	-0,7	-0,4	-1,4
Zakres	-6,9; 8,7	-7,7; 10,5	-23,4; 9,5	-9,5; 2,7

PL 193 236 B1 ciąg dalszy tabeli V

1	2	3	4	5
Estymator Hodgesa-Lehmana dla różnicy od placebo		-1,1	-0,9	-2,0
Wartość p t	-	0,0006*	0,0066*	0,0001*
Tydzień 26 (6 miesięcy)
Średnia (SE)	91,5(1,7)	89,7(1,8)	92,3(1,8)	92,6(2,1)
Mediana	90,5	89,1	92,3	92,3
Zakres	58,6; 133,0	55,9; 140,9	46,4; 162,5	58,2; 156,4
Zmiana od linii podstawowej
Średnia (SE)	0,8(0,3)	-0,6(0,3)	-0,9(0,5)	-1,7(0,3)
Mediana	0,9	-0,45	0,0	-1,5
Zakres	-5,3; 8,3	-10,7; 11,4	-24,7; 9,0	-10,0; 3,2
Estymator Hodgesa-Lehmana dla różnicy od placebo		-1,3	-1,3	-2,3
Wartość p t	-	0,0005*	0,0029*	0,0001*
Tydzień 52 (12 miesięcy)
Średnia (SE)	91,9(1,7)	89,6(1,9)	92,3(1,9)	92,4(2,1)
Mediana	90,0	89,05	92,7	92,7
Zakres	60,5; 136,6	55,9; 147,3	46,6; 170,8	56,4; 158,2
Zmiana od linii podstawowej
Średnia (SE)	1,2(0,4)	-0,6(0,4)	-0,9(0,5)	-1,9
Mediana	0,9	-0,4	-0,3	-1,8
Ranga	-8,0; 20,5	-13,6; 11,9	-31,1; 10,0	-43,2; 7,3
Estymator Hodgesa-Lehmana dla różnicy od placebo		-1,6	-1,4	-2,7
Wartość p t	-	0,0009*	0,0106*	0,0001*

t Test Kruskal-Wallis z ustawieniem Hochberga dla wielu porównań, przeciw placebo * Statystycznie istotna różnica w porównaniu z placebo

PL 193 236 B1

T a b e l a VI

Masa ciała: zmiany w stosunku do linii podstawowej dla pacjentów z linią podstawową

BMI >27,0 kg/m² lub <27,0 kg/m², masy w tygodniach 13, 26 i 52

Podgrupa BMI/masa ciała (kg)	Placebo (N=91)	Pramlintyd 30 μg TID (N=88)	Pramlintyd 75 μg TID (N=97)	Pramlintyd 150 μg TID (N=80)
Linia podstawowa BMI >27,0 kg/m² zmiana w tytoniu 52
N	67	67	80	62
Średnia (SE)	0,7(0,43)	-0,3(0,52)	-0,7(0,47)	-1,8(0,80)
Zakres	-8,0; 10,0	-13,6; 11,9	-13,7; 10,0	-43,2; 7,3
Linia podstawowa BMI <27,0 kg/m² zmiana w tygodniu 52
N	24	21	17	18
Średnia (SE)	2,4(1,08)	-0,7(0,56)	-1,7(2,07)	-1,9(0,71)
Zakres	-3,4; 20,5	-4,7; 6,4	-31,1; 9,0	-7,2; 6,5

T a b e l a VII

Masa ciała: zmiany w stosunku do linii podstawowej; pacjenci z HbA1c >8,0%, insuliną w zakresie 10% od linii podstawowej; masy w tygodniach 13, 26 i 52

Punkt czasowy/masa ciała (kg)	Placebo (N=26)	Pramlintyd 30 μg TID (N=20)	Pramlintyd 75 μg TID (N=22)	Pramlintyd 150 μg TID (N=18)
1	2	3	4	5
Linia podstawowa
Średnia (SE)	84,3(2,9)	92,7(3,5)	93,3(3,2)	99,8(5,6)
Mediana	82,15	89,75	90,9	98,9
Zakres	61,4; 115,7	65,0; 119,5	65,0; 121,8	59,5; 158,1
Tydzień 13 (3 miesiące)
Średnia (SE)	84,3(2,8)	92,5(3,6)	93,3(3,3)	98,3(5,7)
Mediana	81,5	88,85	91,6	97,4
Zakres	60,5; 112,3	65,9; 123,4	67,3; 121,8	57,7; 156,8
Zmiana od linii podstawowej
Średnia (SE)	0,0(0,2)	-0,2(0,5)	-0,0(0,7)	-1,5(0,4)
Mediana	0,45	-0,55	0	-1,55
Zakres	-3,4; 1,9	-4,6; 6,4	-5,9; 6,4	-3,9; 2,7
Estymator Hodges-Lehman dla różnicy od placebo		-0,5	-0,4	-1,9
Wartość p \|	-	0,2812	0,5827	0,0005*
Tydzień 26 (6 miesięcy)
Średnia (SE)	84,8(2,9)	92,4(3,6)	93,1(3,3)	98,1(5,6)
Mediana	83,15	89,75	91,8	97,5

PL 193 236 B1 ciąg dalszy tabeli VII

1	2	3	4	5
Zakres	60,9; 117,5	64,1; 123,6	71,8; 121,1	58,9; 156,4
Zmiana od linii podstawowej
Średnia (SE)	0,5(0,3)	-0,3(0,5)	-0,1(0,8)	-1,8(0,5)
Mediana	0,7	-0,45	0	-1,4
Zakres	-2,7; 4,7	-3,7; 4,1	-6,8; 7,3	-5,4; 2,0
Estymator Hodges-Lehman dla różnicy od placebo		-0,8	-0,6	-2,2
Wartość p t	-	0,8903	0,3616	0,0552
Tydzień 52 (12 miesięcy)
Średnia (SE)	85,2(2,9)	91,9(3,5)	93,4(3,1)	95,3(5,5)
Mediana	83,3	89,05	92,05	94,0
Zakres	60,9; 115,0	66,7; 122,7	70,0; 116,2	57,3; 158,2
Zmiana od linii podstawowej
Średnia (SE)	0,9(0,7)	-0,8(0,4)	0,1(1,0)	-4,6(2,3)
Mediana	0,45	-0,65	0,7	-2,55
Zakres	-4,6; 14,3	-4,1; 3,2	-8,6; 10,0	-43,2; 2,3
Średnia różnica w stosunku do placebo	-	-1,8	-0,8	-5,5
Wartość p t	-	0,1837	0,2377	0,0069*

t Test Kruskal-Wallis z dopasowaniem Hochberga dla wielu porównań, przeciw placebo φ Dwustronna ANOVA z dopasowaniem Hochberga dla wielu porównań, względem placebo * Statystycznie istotna różnica w porównaniu z placebo.

P r z y k ł a d 4

Wytwarzanie ^25,28,29Pro-h-amyliny

25,28,29

Przeprowadzono syntezę w fazie stałej ^25,28,29Pro-h-amyliny stosując żywicę związaną z zakotwiczeniem metylobenzhydryloaminowym i zabezpieczeniem łańcucha bocznego N^a-Boc/benzylowym, standardowymi metodami syntezy peptydów. Żywicę ^2,7-[disiarczek]amylina-MBHA otrzymano przez traktowanie cystein zabezpieczonych Acm trifluorooctanem talu (III) w kwasie trifluorooctowym. Po cyklizacji, żywicę i grupy zabezpieczające łańcuchy boczne rozszczepiono płynnym HF w obecności

25,28,29 dimetylosiarczku i anizolu. ^25,28,29Pro-h-amylinę oczyszczono z użyciem preparatywnej HPLC z odwróconą fazą. Za pomocą analitycznej HPLC i elektroforezy kapilarnej stwierdzono, że peptyd jest homogenny, a strukturę potwierdzono przez analizę aminokwasów i analizę sekwencji. Produkt dał żądaną masę jonową. Widmo masowe FAB: (M+H)⁺ = 3,949.

P r z y k ł a d 5

Wytwarzanie ¹⁸Arg^25,28,29Pro-h-amyliny

25,28,29

Przeprowadzono syntezę w fazie stałej ¹⁸Arg^25,28,29Pro-h-amyliny stosując żywicę związaną z zakotwiczeniem metylobenzhydryloaminowym i zabezpieczeniem łańcucha bocznego N^a-Boc/benzylowym, standardowymi metodami syntezy peptydów. Żywicę ^2,7-[disiarczek]amylina-MBHA otrzymano przez traktowanie cystein zabezpieczonych Acm trifluorooctanem talu (III) w kwasie trifluorooctowym. Po cyklizacji, żywicę i grupy zabezpieczające łańcuchy boczne rozszczepiono płynnym HF w obecności dimetylosiarczku i anizolu. ¹⁸Arg^25,28,29Pro-h-amylinę oczyszczono z użyciem preparatywnej HPLC z odwróconą fazą. Za pomocą analitycznej HPLC i elektroforezy kapilarnej stwierdzono, że peptyd jest

PL 193 236 B1 homogenny, a strukturę potwierdzono przez analizę aminokwasów i analizę sekwencji. Produkt dał żądaną masę jonową. Widmo masowe FAB: (M+H)⁺ = 3,971.

P r z y k ł a d 6

Wytwarzanie ¹⁸Arg^25,28Pro-h-amyliny

25,28

Przeprowadzono syntezę w fazie stałej ¹⁸Arg^25,28Pro-h-amyliny stosując żywicę związaną z zakotwiczeniem metylobenzhydryloaminowym i zabezpieczeniem łańcucha bocznego N^a-Boc/benzylowym, standardowymi metodami syntezy peptydów. Żywicę ^2,7-[disiarczek]amylina-MBHA otrzymano przez traktowanie cystein zabezpieczonych Acm trifluorooctanem talu (III) w kwasie trifluorooctowym. Po cyklizacji, żywicę i grupy zabezpieczające łańcuchy boczne rozszczepiono płynnym HF w obecności dimetylosiarczku i anizolu. ¹⁸Arg^25,28,29Pro-h-amylinę oczyszczono z użyciem preparatywnej HPLC z odwróconą fazą. Za pomocą analitycznej HPLC i elektroforezy kapilarnej stwierdzono, że peptyd jest homogenny, a strukturę potwierdzono przez analizę aminokwasów i analizę sekwencji. Produkt dał żądaną masę jonową. Widmo masowe FAB: (M+H)⁺ = 3,959.

P r z y k ł a d 7

Test wiązania receptora

W następujący sposób przeprowadzono ocenę wiązania związków z receptorami amyliny. ¹²⁵I amylinę szczurzą (znakowana Bolton-Hunter na lizynie N-terminalnej) nabyto od Amersham Corporation (Arlington Heights, IL). Specyficzna aktywność w czasie stosowania wynosiła od 1950 do 2000 Ci/mmol. Nieznakowane peptydy otrzymano od BACHEM Inc. (Torrance, CA) i Peninsula Laboratories (Belmont, CA).

Samce szczurów Sprague-Dawley (o 200-250 gramach) uśmiercono przez dekapitację. Mózgi usunięto do zimnego roztworu soli fizjologicznej buforowanego fosforanem (PBS). Z powierzchni brzusznej wykonano cięcia dogłowowe do podwzgórza, połączone bocznie przez pasma węchowe i biegnące po kątem 45° przyśrodkowo od tych pasm. Tę tkankę podstawowego przodomózgowia, zawierającą jądro półleżące i regiony otaczające, zważono i homogenizowano w lodowatym 20 mM buforze HEPES (20 mM kwas HEPES, pH dostosowano do 7,4 przy użyciu NaOH w temperaturze 23°C). Błony przemyto trzykrotnie w świeżym buforze przez wirowanie przez 15 minut przy 48,000 x g. Ostateczny osad błon zawieszono w 20 mM buforze HEPES, zawierającym 0,2 mM fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF).

Aby zmierzyć wiązanie ¹²⁵I-amyliny, błony z 4 mg początkowej mokrej masy tkanki, inkubowano z ¹²⁵I-amyliną przy 12-16 pM w 20 mM buforze HEPES, zawierającym 0,5 mg/ml bacytracyny, 0,5 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej oraz 0,2 mM PMSF. Roztwory inkubowano przez 60 minut w temperaturze 23°C. Inkubacje zakończono przez filtrację przez filtry z włókna szklanego GF/B (Whatman Inc., Clifton, NJ), które wstępnie namaczano przez 4 godziny w 0,3% polietylenoiminie w celu zredukowania niespecyficznego wiązania radioznakowanych peptydów. Filtry przemyto tuż przed filtracją 5 ml zimnego PBS, i zaraz po filtracji 15 ml zimnego PBS. Filtry usunięto i oszacowano radioaktywność w liczniku gamma, przy skuteczności zliczania, wynoszącej 77%. Utworzono krzywe kompetycji przez pomiar wiązania w obecności 10^-12 do 10^-6 M nieznakowanego związku testowego i analizowano przez nieliniową regresję, przy użyciu 4-parametrowego równania logistycznego (program Inplot, GraphPAD Sotware, San Diego).

W tym teście, oczyszczona ludzka amylina wiąże się ze swym receptorem przy zmierzonym IC50, wynoszącym około 50 pM. Wyniki dla związków testowych podano w tabeli VIII, pokazującej, że każdy ze związków wykazuje istotną aktywność wiązania receptora.

P r z y k ł a d 8

Test mięśnia płaszczkowatego

W następujący sposób przeprowadzono określenie aktywności agonistycznej amyliny związków przy użyciu testu mięśnia płaszczkowatego. Samce szczurów Harlan Sprague-Dawley o masie około 200 g użyto w celu utrzymania masy podzielonego mięśnia płaszczkowatego poniżej 40 mg. Zwierzęta głodzono przez 4 godziny przed uśmierceniem przez dekapitację. Z tylnej kończyny zdjęto skórę, którą następnie rozpięto na korkowej tablicy. Ścięgno Achillesa ucięto tuż powyżej kości piętowej i mięsień brzuchaty łydki odgięto od tylnej strony piszczeli. Mięsień płaszczkowaty, mały, 15-20 mm długości, 0,5 mm grubości, płaski mięsień na powierzchni kostnej mięśnia brzuchatego łydki, wypreparowano następnie i oczyszczono z omięsnej przy użyciu drobnych nożyczek i szczypczyków. Mięsień płaszczkowaty podzielono potem na równe części przy użyciu ostrza prowadzonego w sposób przednio-tylny poprzez beleczki mięśniowe, aby otrzymać całość 4 pasków mięśniowych od każdego zwierzęcia. Po wycięciu mięśnia ze zwierzęcia, utrzymywano go przez krótki okres w soli fizjologicznej. Nie było konieczne aby

PL 193 236 B1 mięsień trzymać w warunkach napięcia, jako że nie miało to widocznego wpływu na włączanie radioglukozy do glikogenu.

Mięśnie wprowadzono do 50 ml kolb Erlenmeyera, zawierających 10 ml buforu wodorowęglanowego Krebsa-Ringera, przez który wstępnie przepuszczono gaz, zawierającego (w każdym litrze) NaCl 118,5 mmola (6,93 g), KCl 5,94 mmola (443 mg), CaCl2 2,54 mmola (282 mg), MgSO4 1,19 mmola (143 mg), KH2PO4 1,19 mmola (162 mg), NaHCO3 25 mmoli (2,1 g), 5,5 mmola glukozy (1 g) i rekombinowaną ludzką insulinę (Humulin-R Eli Lilly, IN) i związek testowy, jaki wyszczególniono poniżej. pH w temperaturze 37°C weryfikowano jako wynoszące między 7,1 a 7,4. Mięśnie przypisano do różnych kolb tak, że 4 kawałki mięśnia z każdego zwierzęcia były losowo rozmieszczone w różnych warunkach testowych. Środowiska inkubacji poddano gazowaniu przez delikatne przedmuchiwanie carbogenem (95% O2, 5% CO2) na powierzchnię, przy ciągłym mieszaniu w temperaturze 37°C w obracającej się łaźni wodnej. Po półgodzinnym okresie „wstępnej inkubacji” do każdej kolby dodano 0,5 μθ U-¹⁴C-glukozy, którą inkubowano przez dalsze 60 minut. Następnie każdy kawałek mięśnia szybko usunięto, odciśnięto i zamrożono w ciekłym N2, zważono i przechowywano do kolejnego określenia ¹⁴C-glikogenu.

Określenie ¹⁴C-glikogenu przeprowadzono w 7 ml fiolce scyntylacyjnej. Każdą zamrożoną próbkę mięśnia umieszczono w fiolce i trawiono w 1 ml 60% wodorotlenku potasu w temperaturze 70°C przez 45 minut przy ciągłym mieszaniu. Rozpuszczony glikogen wytrącono na fiolkę przez dodanie 3 ml etanolu absolutnego i całonocne chłodzenie w temperaturze -20°C. Supernatant delikatnie aspirowano, glikogen ponownie przemyto etanolem, aspirowano i osad wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem. Cały etanol odparowuje się w celu uniknięcia zobojętniania w trakcie liczenia scyntylacyjnego. Pozostały glikogen ponownie rozpuszczono w 1 ml wody i 4 ml płynu scyntylacyjnego i zliczano pod kątem ¹⁴C.

Tempo włączania glukozy do glikogenu (wyrażone w μmolach/godzinę) otrzymano ze specyficznej aktywności ¹⁴C-glukozy w 5,5 mM glukozie ze środowiska inkubacyjnego, a całość zliczeń ¹⁴C pozostających w glikogenie ekstrahowano z każdego mięśnia. Krzywe dawki/odpowiedzi dopasowano do 4-paramterycznego modelu logistycznego przy użyciu programu iteratywnego najmniejszych kwadratów (ALLFIT, wersja 2,7, NIH, MD) aby uzyskać EC50. Ze względu na fakt, że EC50 wykazuje rozkład logarytmiczny normalny, wyraża się go ± błąd standardowy logarytmu. Przeprowadzono porównanie par przy użyciu testu t w oparciu na schematach SYSTAT (Wilkinson, „SYSTAT: the system for statistics,” SYSTAT Inc., Evanston IL (1989)).

Utworzono krzywe odpowiedzi na dawkę dla mięśni dodanych do pożywek, zawierających 7,1 nM (1000 μυ/ml) insuliny i każdy związek testowy dodany do ostatecznego (nominalnego) stężenia, wynoszącego 0, 1, 3, 10, 30, 100, 300 i 1000 nM. Każdy test także zawierał wewnętrzne kontrole dodatnie, składające się z pojedynczej partii amyliny szczurzej z archiwum, liofilizowanej i przechowywanej w temperaturze -70°C.

Wiadomo, że ludzka amylina jest peptydem hiperglikemicznym a pomiary EC50 preparatów amyliny w teście mięśnia płaszczkowatego zwykle wynoszą od około 1-10 nM, mimo, że niektóre komercyjnie dostępne preparaty, o czystości mniejszej niż 90%, posiadają wyższe EC50 z powodu obecności zanieczyszczeń, które skutkują niższą mierzoną aktywnością. Wyniki związków testowych podano w tabeli VIII.

PL 193 236 B1

T a b e l a VIII

Mięsień EC50 (nM)	Test wiązania receptora IC50 (pM)	Test płaszczkowaty
1) ²⁵Pro²⁶Val^28,29Pro-h-amylina	18,0	4,68
2) ^2,7Cyklo-[²Asp,⁷Lys]-h-amylina	310,0	6,62
3) ^2-37h-amylina	236,0	1,63
4) ¹Ala-h-amylina	148,0	12,78
5) ¹Ser-h-amylina	33,0	8,70
6 ) ^25,28Pro-h-amylina	26,0	13,20
7) des-¹Lys-^25,28Pro-h-amylina	85,0	7,70
8) ¹⁸Arg^25,28Pro-h-amylina	32,0	2,83
9) des-¹Lys^25,28Pro-h-amylina	82,0	3,77
10) ¹⁸Arg^25,28,29Pro-h-amylina	21,0	1,25
11) des-¹Lys¹⁸Arg^25,28,29Pro-h-amylina	21,0	1,86
12 ) ^25,28,29Pro-h-amylina	10,0	3,71
13) des-¹Lys^25,28,29Pro-h-amylina	14,0	4,15

P r z y k ł a d 9

Test opróżniania żołądka z użyciem czerwieni fenolowej

Opróżnianie żołądka zmierzono stosując modyfikację (Plourde i in., Life Sci. 53: 857-862 (1993)) oryginalnej metody Scarpignato i in., (Arch. Int. Phamacodyn. Ther. 246: 286-295 (1980)). W skrócie, przytomne szczury otrzymały przez zgłębnik 1,5 ml bezbarwnego żelu, zawierającego 1,5% metylocelulozy (M-0262, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) i 0,05% wskaźnika czerwieni fenolowej. Dwadzieścia minut po podaniu, szczury znieczulono przy użyciu 5% halotanu, uwidoczniono żołądek i zaciśnięto przy odźwierniku i niższych zwieraczach przełyku stosując zaciski tętnicze, usunięto i otwarto do alkalicznego roztworu, który wykonano do trwałej objętości. Zawartość żołądka uzyskano z intensywności czerwieni fenolowej w roztworze alkalicznym, zmierzonej przez absorbancję przy długości fali wynoszącej 560 nm. W większości doświadczeń, żołądek był czysty. W innych doświadczeniach, poszczególne zawartości żołądka wirowano w celu wyklarowania roztworu do pomiarów absorbancji. Jeśli rozcieńczone zawartości żołądkowe pozostawały mętne, absorbancję spektroskopową z użyciem czerwieni fenolowej uzyskiwano jako różnicę między tą obecną w rozcieńczalniku alkalicznym, względem rozcieńczalnika zakwaszonego. W oddzielnych doświadczeniach na 7 szczurach, zarówno żołądek jak i jelito cienkie wycięto i otwarto do roztworu alkalicznego. Ilość czerwieni fenolowej, którą można było odzyskać z górnego odcinka przewodu pokarmowego w ciągu 29 minut podawania przez zgłębnik, wynosiła 89 ± 4%; barwnik, który jak się okazało związał się w sposób niemożliwy do odzyskania z powierzchnią światła jelita, mógł się przyczyniać do równowagi. Aby skompensować tę małą stratę, procent zawartości żołądkowych pozostających po 20 minutach, wyrażono jako frakcję zawartości żołądkowych odzyskanych od szczurów kontrolnych, zaraz po podaniu przez zgłębnik, w tym samym doświadczeniu. Procent pozostałych zawartości opróżnianych żołądków = (absorbancja w 20 minucie)/(absorbancja w 0 minucie). Krzywe odpowiedzi na dawkę dla opróżniania żołądka dopasowano do 4-paramterycznego modelu logistycznego stosując schemat iteratywny najmniejszych kwadratów (ALLFIT, wersja 2,7, NIH, MD) aby uzyskać EC50. Ze względu na fakt, że EC50 wykazuje rozkład logarytmiczny normalny, wyraża się go ± błąd standardowy logarytmu. Przeprowadzono porównanie par przy użyciu jednostronnej analizy wariancji i testu wielu porównań Student-Newman-Keuls (Instat wersja 2,0, GraphPad Software, San Diego, CA), przy użyciu P < 0,05 jako poziomu istotności.

W badaniach odpowiedzi na dawkę, szczurzą amylinę (Bachem, Torrance, CA) rozpuszczoną w 0,15 M soli fizjologicznej, podano jako 0,1 ml podskórny bolus w dawkach, wynoszących 0; 0,01; 0,1; 1; 10 lub 100 μg 5 minut przed podaniem przez zgłębnik szczurom Harlan Sprague Dawley (bez cukrzycy), głodzonych 20 godzin i szczurów BB z cukrzycą głodzonych 6 godzin. Po podaniu podskórnych iniekcji amyliny 5 minut przed podaniem przez zgłębnik wskaźnika czerwieni fenolowej, istniała supresja

PL 193 236 B1 zależna od dawki opróżniania żołądka (dane nie pokazane). Supresja opróżniania żołądka była całkowita u normalnych szczurów HSD, którym podawano 1 μg amyliny, oraz u szczurów z cukrzycą, którym podawano 10 μg (P = 0,22, 0,14). ED₅₀ dla hamowania opróżniania żołądka u szczurów normalnych wynosiło 0,43 μg (0,60 nmoli/kg) ±0,19 jednostek logarytmicznych, a 2,2 μg (2,3 nmoli/kg) ±0,18 jednostek logarytmicznych u szczurów z cukrzycą.

P r z y k ł a d 10

Test opróżniania żołądka z użyciem glukozy trytowanej

Przytomne, nie głodzone szczury Harlan Sprague Dawley ograniczono przez ogon, którego czubek znieczulono stosując 2% lidokainę. Tryt w osoczu oddzielonym od krwi ogonowej zebranym 0, 15, 30, 60, 90 i 120 minut po podaniu przez zgłębnik, wykrywano w liczniku beta. Szczurom wstrzyknięto podskórnie 0,1 ml soli fizjologicznej, zawierającej 0; 0,1; 0,3; 1; 10 lub 100 μg amyliny szczurzej, 1 minutę przed podaniem przez zgłębnik (odpowiednio n=8, 7, 5, 5, 5). Po podaniu przez zgłębnik trytowanej glukozy szczurom, którym wstępnie wstrzyknięto sól fizjologiczną, tryt w osoczu zwiększył się gwałtownie (t 1/2 około 8 minut) do asymptoty, która powoli opadała. Podskórna iniekcja amyliny spowalniała w sposób zależny od dawki i/lub opóźniała absorpcję znacznika. Aktywność trytu z osocza zbierano przez 30 minut w celu otrzymania obszarów pod wykreśloną krzywą jako funkcją dawki amyliny. ED₅₀ uzyskane z dopasowania logistycznego wynosiło 0,35 μg amyliny.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Zastosowanie amyliny lub agonisty amyliny w ilości od 2,5 μg na dawkę do 5000 μg na dawkę do wytwarzania leku do leczenia lub zapobiegania otyłości u podmiotu ludzkiego, z wyłączeniem stosowania cholecystokininy (CCK), agonisty CCK.
2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że agonistę amyliny stanowi analog agonisty amyliny.
3. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że agonista amyliny posiada następującą sekwencję aminokwasową:

¹A1-X-Asn-Thr-⁵Ala-Thr-Y-Ala-Thr-¹⁰Gln-Arg-Leu-B1-Asn-¹⁵Phe-Leu-C1-D1-E1-²⁰F1-G1-Asn-H1-Gly-²⁵Pro-I1-Leu-Pro-J1-³⁰Thr-K1-Val-Gly-Ser-³⁵Asn-Thr-Tyr-Z gdzie:

A1 oznacza Lys, Ala, Ser lub wodór;

B1 oznacza Ala, Ser lub Thr;

C1 oznacza Val, Leu lub Ile;

D1 oznacza His lub Arg;

E1 oznacza Ser lub Thr;

F1 oznacza Ser, Thr, Gln lub Asn;

G1 oznacza Asn, Gln lub His;

H1 oznacza Phe, Leu lub Tyr;

I1 oznacza Ile, Val, Ala lub Leu;

J1 oznacza Ser, Pro lub Thr;

K1 oznacza Asn, Asp lub Gln;

X i Y są niezależnie wybranymi resztami, mającymi łańcuchy boczne, które są chemicznie powiązane między sobą, tworząc formę wiązania wewnątrzcząsteczkowego, gdzie wymienione wiązanie wewnątrzcząsteczkowe obejmuje wiązanie disiarczkowe, laktam lub wiązanie tioeterowe; oraz Z oznacza grupę aminową, alkiloaminową, dialkiloaminową, cykloalkiloaminową, aryloaminową, aryloalkiloaminową, alkiloksy, aryloksy, lub aryloalkiloksy; przy czym gdy A1 oznacza Lys, B1 oznacza Ala, C1 oznacza Val, D1 oznacza Arg, E1 oznacza Ser, F1 oznacza Ser, G1 oznacza Asn, H1 oznacza Leu, I1 oznacza Val, J1 oznacza Pro i K1 oznacza Asn wtedy jedno lub więcej z A1 do K1 oznacza D-aminokwas i Z wybiera się z grupy składającej się z grupy alkiloaminowej, dialkiloaminowej, cykloalkiloaminowej, aryloaminowej, aryloalkiloaminowej, alkiloksy, aryloksy lub aryloalkiloksy.
4. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że agonista amyliny posiada następującą sekwencję aminokwasową:

¹A1-X-Asn-Thr-⁵Ala-Thr-Y-Ala-Thr-¹⁰Gln-Arg-Leu-B1-Asn-¹⁵Phe-Leu-C1-D1-E1-²⁰F1-G1-Asn-H1-Gly-²⁵Pro-I1-Leu-J1-Pro-³⁰Thr-K1-Val-Gly-Ser-³⁵Asn-Thr-Tyr-Z gdzie:

PL 193 236 B1

A1 oznacza Lys, Ala, Ser lub wodór;

B1 oznacza Ala, Ser lub Thr;

C1 oznacza Val, Leu lub Ile;

D1 oznacza His lub Arg;

E1 oznacza Ser lub Thr;

F1 oznacza Ser, Thr, Gln lub Asn;

G1 oznacza Asn, Gln lub His;

H1 oznacza Phe, Leu lub Tyr;

I1 oznacza Ile, Val, Ala lub Leu;

J1 oznacza Ser, Pro, Leu, Ile lub Thr;

K1 oznacza Asn, Asp lub Gln;

X i Y są niezależnie wybranymi resztami, mającymi łańcuchy boczne, które są chemicznie powiązane między sobą, tworząc formę wiązania wewnątrzcząsteczkowego, gdzie wymienione wiązanie wewnątrzcząsteczkowe obejmuje wiązanie disiarczkowe, laktam lub wiązanie tioeterowe; oraz Z oznacza grupę aminową, alkiloaminową, dialkiloaminową, cykloalkiloaminową, aryloaminową, aryloalkiloaminową, alkiloksy, aryloksy, lub aryloalkiloksy; przy czym gdy (a) A1 oznacza Lys, B1 oznacza Ala, C1 oznacza Val, D1 oznacza Arg, E1 oznacza Ser, F1 oznacza Ser, G1 oznacza Asn, H1 oznacza Leu, I1 oznacza Val, J1 oznacza Pro i K1 oznacza Asn; lub (b) A1 oznacza Lys, B1 oznacza Ala, C1 oznacza Val, D1 oznacza His, E1 oznacza Ser, F1 oznacza Asn, G1 oznacza Asn, H1 oznacza Leu, I1 oznacza Val, J1 oznacza Ser i K1 oznacza Asn;

wtedy jedno lub więcej z A1 do K1 oznacza D-aminokwas i Z wybiera się z grupy składającej się z grupy alkiloaminowej, dialkiloaminowej, cykloalkiloaminowej, aryloaminowej, aryloalkiloaminowej, alkiloksy, aryloksy lub aryloalkiloksy.
5. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że agonista amyliny posiada następującą sekwencję aminokwasową:

¹A1-X-Asn-Thr-⁵Ala-Thr-Y-Ala-Thr-¹⁰Gln-Arg-Leu-B1-Asn-¹⁵Phe-Leu-C1-D1-E1-²⁰F1-G1-Asn-H1-Gly-²⁵I1-J1-Leu-Pro-Pro-³⁰Thr-K1-Val-Gly-Ser-³⁵Asn-Thr-Tyr-Z gdzie:

A1 oznacza Lys, Ala, Ser lub wodór;

B1 oznacza Ala, Ser lub Thr;

C1 oznacza Val, Leu lub Ile;

D1 oznacza His lub Arg;

E1 oznacza Ser lub Thr;

F1 oznacza Ser, Thr, Gln lub Asn;

G1 oznacza Asn, Gln lub His;

H1 oznacza Phe, Leu lub Tyr;

I1 oznacza Ala lub Pro;

J1 oznacza Ile, Val, Ala lub Leu;

K1 oznacza Asn, Asp lub Gln;

X i Y są niezależnie wybranymi resztami, mającymi łańcuchy boczne, które są chemicznie powiązane między sobą, tworząc formę wiązania wewnątrzcząsteczkowego, gdzie wymienione wiązanie wewnątrzcząsteczkowe obejmuje wiązanie disiarczkowe, laktam lub wiązanie tioeterowe; oraz Z oznacza grupę aminową, alkiloaminową, dialkiloaminową, cykloalkiloaminową, aryloaminową, aryloalkiloaminową, alkiloksy, aryloksy, lub aryloalkiloksy;

przy czym gdy A1 oznacza Lys, B1 oznacza Ala, C1 oznacza Val, D1 oznacza Arg, E1 oznacza Ser, F1 oznacza Ser, G1 oznacza Asn, H1 oznacza Leu, I1 oznacza Pro, J1 oznacza Val i K1 oznacza Asn;

wtedy jedno lub więcej z A1 do K1 oznacza D-aminokwas i Z wybiera się z grupy, składającej się z grupy alkiloaminowej, dialkiloaminowej, cykloalkiloaminowej, aryloaminowej, aryloalkiloaminowej, alkiloksy, aryloksy lub aryloalkiloksy.
6. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że agonista amyliny posiada następującą sekwencję aminokwasową:

¹A1-X-Asn-Thr-⁵Ala-Thr-Y-Ala-Thr-¹⁰Gln-Arg-Leu-B1-Asn-¹⁵Phe-Leu-C1-D1-E1-²⁰F1-G1-Asn-H1-Gly-²⁵Pro-I1-Leu-Pro-Pro-³⁰Thr-J1-Val-Gly-Ser-³⁵Asn-Thr-Tyr-Z gdzie:

A1 oznacza Lys, Ala, Ser lub wodór;

B1 oznacza Ala, Ser lub Thr;

PL 193 236 B1

C1 oznacza Val, Leu lub Ile;

D1 oznacza His lub Arg;

E1 oznacza Ser lub Thr;

F1 oznacza Ser, Thr, Gln lub Asn;

G1 oznacza Asn, Gln lub His;

H1 oznacza Phe, Leu lub Tyr;

I1 oznacza Ile, Val, Ala lub Leu;

J1 oznacza Asn, Asp lub Gln;

X i Y są niezależnie wybranymi resztami, mającymi łańcuchy boczne, które są chemicznie powiązane między sobą, tworząc formę wiązania wewnątrzcząsteczkowego, gdzie wymienione wiązanie wewnątrzcząsteczkowe obejmuje wiązanie disiarczkowe, laktam lub wiązanie tioeterowe; oraz Z oznacza grupę aminową, alkiloaminową, dialkiloaminową, cykloalkiloaminową, aryloaminową, aryloalkiloaminową, alkiloksy, aryloksy, lub aryloalkiloksy;

przy czym gdy A1 oznacza Lys, B1 oznacza Ala, C1 oznacza Val, D1 oznacza Arg, E1 oznacza Ser, F1 oznacza Ser, G1 oznacza Asn, H1 oznacza Leu, I1 oznacza Val i J1 oznacza Asn;

wtedy jedno lub więcej z A1 do K1 oznacza D-aminokwas i Z wybiera się z grupy, składającej się z grupy alkiloaminowej, dialkiloaminowej, cykloalkiloaminowej, aryloaminowej, aryloalkiloaminowej, alkiloksy, aryloksy lub aryloalkiloksy.
7. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że analog agonisty amyliny stanowi ^25,28,29Pro-h-amylina.
8. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że analog agonisty amyliny stanowi ¹⁸Arg^25,28,29Pro-h-amylina.
9. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że analog agonisty amyliny stanowi ¹⁸Arg^25,28Pro-h-amylina.
10. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, albo 6, albo 7, albo 8, albo 9, znamienne tym, że lek zawiera amylinę lub agonistę amyliny w ilości od 30 μg na dawkę do 300 μg na dawkę.
11. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że lek zawiera amylinę lub agonistę amyliny w ilości około 30 μg na dawkę.
12. Zastosowanie według zastrz. 10, znamienne tym, że lek zawiera amylinę lub agonistę amyliny w ilości około 60 μg na dawkę.
13. Zastosowanie amyliny lub agonisty amyliny w ilości od 2,5 μg do 5000 μg na dawkę do wytwarzania leku do redukowania indukowanego insuliną wzrostu masy ciała u człowieka biorącego insulinę.
14. Zastosowanie według zastrz. 13, znamienne tym, że agonistą amyliny jest analog agonisty amyliny.
15. Zastosowanie według zastrz. 14, znamienne tym, że agonistą amyliny posiada następującą sekwencję aminokwasową:

¹A1-X-Asn-Thr-⁵Ala-Thr-Y-Ala-Thr-¹⁰Gln-Arg-Leu-B1-Asn-¹⁵Phe-Leu-C1-D1-E1-²⁰F1-G1-Asn-H1-Gly-²⁵Pro-I1-Leu-Pro-J1-³⁰Thr-K1-Val-Gly-Ser-³⁵Asn-Thr-Tyr-Z gdzie:

A1 oznacza Lys, Ala, Ser lub wodór;

B1 oznacza Ala, Ser lub Thr;

C1 oznacza Val, Leu lub Ile;

D1 oznacza His lub Arg;

E1 oznacza Ser lub Thr;

F1 oznacza Ser, Thr, Gln lub Asn;

G1 oznacza Asn, Gln lub His;

H1 oznacza Phe, Leu lub Tyr;

I1 oznacza Ile, Val, Ala lub Leu;

J1 oznacza Ser, Pro lub Thr;

K1 oznacza Asn, Asp lub Gln;

X i Y są niezależnie wybranymi resztami, mającymi łańcuchy boczne, które są chemicznie powiązane między sobą, tworząc formę wiązania wewnątrzcząsteczkowego, gdzie wymienione wiązanie wewnątrzcząsteczkowe obejmuje wiązanie disiarczkowe, laktam lub wiązanie tioeterowe; oraz Z oznacza grupę aminową, alkiloaminową, dialkiloaminową, cykloalkiloaminową, aryloaminową, aryloalkiloaminową, alkiloksy, aryloksy, lub aryloalkiloksy;

PL 193 236 B1 przy czym gdy A1 oznacza Lys, B1 oznacza Ala, C1 oznacza Val, D1 oznacza Arg, E1 oznacza Ser, F1 oznacza Ser, G1 oznacza Asn, H1 oznacza Leu, I1 oznacza Val, J1 oznacza Pro i K1 oznacza Asn wtedy jedno lub więcej z A1 do K1 oznacza D-aminokwas i Z wybiera się z grupy składającej się z grupy alkiloaminowej, dialkiloaminowej, cykloalkiloaminowej, aryloaminowej, aryloalkiloaminowej, alkiloksy, aryloksy lub aryloalkiloksy.
16. Zastosowanie według zastrz. 14, znamienne tym, że agonista amyliny posiada następującą sekwencję aminokwasową:

¹A1-X-Asn-Thr-⁵Ala-Thr-Y-Ala-Thr-¹⁰Gln-Arg-Leu-B1-Asn-¹⁵Phe-Leu-C1-D1-E1-²⁰F1-G1-Asn-H1-Gly-²⁵Pro-I1-Leu-J1-Pro-³⁰Thr-K1-Val-Gly-Ser-³⁵Asn-Thr-Tyr-Z gdzie:

A1 oznacza Lys, Ala, Ser lub wodór;

B1 oznacza Ala, Ser lub Thr;

C1 oznacza Val, Leu lub Ile;

D1 oznacza His lub Arg;

E1 oznacza Ser lub Thr;

F1 oznacza Ser, Thr, Gln lub Asn;

G1 oznacza Asn, Gln lub His;

H1 oznacza Phe, Leu lub Tyr;

I1 oznacza Ile, Val, Ala lub Leu;

J1 oznacza Ser, Pro, Leu, Ile lub Thr;

K1 oznacza Asn, Asp lub Gln;

X i Y są niezależnie wybranymi resztami, mającymi łańcuchy boczne, które są chemicznie powiązane między sobą, tworząc formę wiązania wewnątrzcząsteczkowego, gdzie wymienione wiązanie wewnątrzcząsteczkowe obejmuje wiązanie disiarczkowe, laktam lub wiązanie tioeterowe; oraz Z oznacza grupę aminową, alkiloaminową, dialkiloaminową, cykloalkiloaminową, aryloaminową, aryloalkiloaminową, alkiloksy, aryloksy, lub aryloalkiloksy; przy czym gdy (a) A1 oznacza Lys, B1 oznacza Ala, C1 oznacza Val, D1 oznacza Arg, E1 oznacza Ser, F1 oznacza Ser, G1 oznacza Asn, H1 oznacza Leu, I1 oznacza Val, J1 oznacza Pro i K1 oznacza Asn; lub (b) A1 oznacza Lys, B1 oznacza Ala, C1 oznacza Val, D1 oznacza His, E1 oznacza Ser, F1 oznacza Asn, G1 oznacza Asn, H1 oznacza Leu, I1 oznacza Val, J1 oznacza Ser i K1 oznacza Asn;

wtedy jedno lub więcej z A1 do K1 oznacza D-aminokwas i Z wybiera się z grupy składającej się z grupy alkiloaminowej, dialkiloaminowej, cykloalkiloaminowej, aryloaminowej, aryloalkiloaminowej, alkiloksy, aryloksy lub aryloalkiloksy.
17. Zastosowanie według zastrz. 14, znamienne tym, że agonista amyliny posiada następującą sekwencję aminokwasową:

¹A1-X-Asn-Thr-⁵Ala-Thr-Y-Ala-Thr-¹⁰Gln-Arg-Leu-B1-Asn-¹⁵Phe-Leu-C1-D1-E1-²⁰F1-G1-Asn-H1-Gly-²⁵I1-J1-Leu-Pro-Pro-³⁰Thr-K1-Val-Gly-Ser-³⁵Asn-Thr-Tyr-Z gdzie:

A1 oznacza Lys, Ala, Ser lub wodór;

B1 oznacza Ala, Ser lub Thr;

C1 oznacza Val, Leu lub Ile;

D1 oznacza His lub Arg;

E1 oznacza Ser lub Thr;

F1 oznacza Ser, Thr, Gln lub Asn;

G1 oznacza Asn, Gln lub His;

H1 oznacza Phe, Leu lub Tyr;

I1 oznacza Ala lub Pro;

J1 oznacza Ile, Val, Ala lub Leu;

K1 oznacza Asn, Asp lub Gln;

X i Y są niezależnie wybranymi resztami, mającymi łańcuchy boczne, które są chemicznie powiązane między sobą, tworząc formę wiązania wewnątrzcząsteczkowego, gdzie wymienione wiązanie wewnątrzcząsteczkowe obejmuje wiązanie disiarczkowe, laktam lub wiązanie tioeterowe; oraz Z oznacza grupę aminową, alkiloaminową, dialkiloaminową, cykloalkiloaminową, aryloaminową, aryloalkiloaminową, alkiloksy, aryloksy, lub aryloalkiloksy;

przy czym gdy A1 oznacza Lys, B1 oznacza Ala, C1 oznacza Val, D1 oznacza Arg, E1 oznacza Ser, F1 oznacza Ser, G1 oznacza Asn, H1 oznacza Leu, I1 oznacza Pro, J1 oznacza Val i K1 oznacza Asn;

PL 193 236 B1 wtedy jedno lub więcej z A1 do K1 oznacza D-aminokwas i Z wybiera się z grupy, składającej się z grupy alkiloaminowej, dialkiloaminowej, cykloalkiloaminowej, aryloaminowej, aryloalkiloaminowej, alkiloksy, aryloksy lub aryloalkiloksy.
18. Zastosowanie według zastrz. 14, znamienne tym, że agonista amyliny posiada następującą sekwencję aminokwasową:

¹A1-X-Asn-Thr-⁵Ala-Thr-Y-Ala-Thr-¹⁰Gln-Arg-Leu-B1-Asn-¹⁵Phe-Leu-C1-D1-E1-²⁰F1-G1-Asn-H1-Gly-²⁵Pro-I1-Leu-Pro-Pro-³⁰Thr-J1-Val-Gly-Ser-³⁵Asn-Thr-Tyr-Z gdzie:

A1 oznacza Lys, Ala, Ser lub wodór;

B1 oznacza Ala, Ser lub Thr;

C1 oznacza Val, Leu lub Ile;

D1 oznacza His lub Arg;

E1 oznacza Ser lub Thr;

F1 oznacza Ser, Thr, Gln lub Asn;

G1 oznacza Asn, Gln lub His;

H1 oznacza Phe, Leu lub Tyr;

I1 oznacza Ile, Val, Ala lub Leu;

J1 oznacza Asn, Asp lub Gln;

X i Y są niezależnie wybranymi resztami, mającymi łańcuchy boczne, które są chemicznie powiązane między sobą, tworząc formę wiązania wewnątrzcząsteczkowego, gdzie wymienione wiązanie wewnątrzcząsteczkowe obejmuje wiązanie disiarczkowe, laktam lub wiązanie tioeterowe; oraz Z oznacza grupę aminową, alkiloaminową, dialkiloaminową, cykloalkiloaminową, aryloaminową, aryloalkiloaminową, alkiloksy, aryloksy, lub aryloalkiloksy;

przy czym gdy A1 oznacza Lys, B1 oznacza Ala, C1 oznacza Val, D1 oznacza Arg, E1 oznacza Ser, F1 oznacza Ser, G1 oznacza Asn, H1 oznacza Leu, I1 oznacza Val i J1 oznacza Asn;

wtedy jedno lub więcej z A1 do K1 oznacza D-aminokwas i Z wybiera się z grupy, składającej się z grupy alkiloaminowej, dialkiloaminowej, cykloalkiloaminowej, aryloaminowej, aryloalkiloaminowej, alkiloksy, aryloksy lub aryloalkiloksy.
19. Zastosowanie według zastrz. 14, znamienne tym, że analog agonisty amyliny stanowi ^25,28,29Pro-h-amylina.
20. Zastosowanie według zastrz. 14, znamienne tym, że analog agonisty amyliny stanowi ¹⁸Arg^25,28,29Pro-h-amylina.
21. Zastosowanie według zastrz. 14, znamienne tym, że analog agonisty amyliny stanowi ¹⁸Arg^25,28Pro-h-amylina.
22. Zastosowanie według zastrz. 13 albo 14, albo 15, albo 16, albo 17, albo 18, albo 19, albo 20, albo 21, znamienne tym, że lek zawiera amylinę lub agonistę amyliny w ilości od 30 μg na dawkę do 300 μg na dawkę.
23. Zastosowanie według zastrz. 22, znamienne tym, że lek zawiera amylinę lub agonistę amyliny w ilości około 30 μg na dawkę.
24. Zastosowanie według zastrz. 22, znamienne tym, że lek zawiera amylinę lub agonistę amyliny w ilości około 60 μg na dawkę.