PL190847B1 - Sposób identyfikacji szczepu DSM 6601 Escherichia coli - Google Patents

Abstract

1. Sposób identyfikacji szczepu DSM 6601 Escherichia coli, znamienny tym, ze do reakcji PCR stosuje sie pare starterów Muta 1 do Muta 10 o sekwencjach DNA przedstawionych na fig. 1 do 4. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze przeprowadza sie reakcje PCR w nastepujacych warunkach: a) 3 min w 95°C b) 45 sek. w 95°C c) 45 sek. w 58°C d) 45 sek. w 72°C 3. Sposób wedlug zastrz. 1 i 2, znamienny tym, ze etapy b) do d) powtarza sie srednio 20 razy. 4. Sekwencje DNA o nastepujacej sekwencji nukleotydowej: ATA CTA CGA CGG TAA ATG GT i/lub ATG CTA CCG ATA CTG ATG TA 5. Sekwencje DNA o nastepujacej sekwencji nukleotydowej: CCA CGG TTA GGT GTG GTA CAG i/lub TGG TAT TGC CAA CGC CGA CG 6. Sekwencje DNA o nastepujacej sekwencji nukleotydowej: AAC TGT CGA GCG ATG AAC CC i/lub GAT AGC TCT CTG AAC AGT CC 7. Sekwencje DNA o nastepujacej sekwencji nukleotydowej GCG AGG TAA CCT CGA ACA TG i/lub CGT GAA TTA TCG ATA CGC CG i/lub GTG AGA TGA TGG CCA CGA TT i/lub CAT CCG GTT ATC GCT TGG PL PL PL

Description

Wynalazek dotyczy sposobu identyfikacji szczepu DSM 6601 Escherichia coli (E. coli).

Escherichia coli jest Gram-ujemną bakterią występującą we florze jelita ludzi i zwierząt, jak również występującą pozajelitowe. E. coli jest obecnie najważniejszym mikroorganizmem gospodarza w systemach klonowania inżynierii genetycznej, stosowanym do ekspresji białek heterologicznych, jak również do klonowania i amplifikacji DNA.

E. coli występuje w licznych odmianach, różniących się antygenem otoczkowym (antygen K), antygenem powierzchniowym (antygen O) i antygenem wici (antygen H) i na tej podstawie podzielonych na liczne rodzaje serologiczne. Przyporządkowanie według serotypów nic nie mówi o zróżnicowanej zjadliwości drobnoustrojów. Przedstawiciele jednego i tego samego serotypu mogą więc wykazywać w organizmie ludzkim jak również zwierzęcym zróżnicowany potencjał patogenny, który w skrajnych przypadkach może się wahać od niezjadliwego do silnie zjadliwego patogenu. Wiadomo, że E. coli szczepu DSM 6601 uważany jest za niepatogenny dla ludzi i zwierząt.

Stąd wynika zapotrzebowanie na sposób weryfikacji niepatogennych szczepów E. coli. Serotypowanie jako jedyna metoda oceny czy szczep E. coli jest patogenny czy nie, nie wystarcza. Dowiedziono, że w tym samym serotypie występują zarówno odmiany patogenne, jak i nie patogenne. Dla celów diagnostycznych i terapeutycznych w medycynie, ale również w celu zastosowania w inżynierii genetycznej, byłoby pożądana możliwość bezbłędnej identyfikacji pojedynczych szczepów.

Według wynalazku, zaproponowano sposób identyfikacji szczepu E. coli DSM 6601, charakteryzujący się tym, że w reakcji PCR stosuje się określoną parę starterów z plazmidu ewentualnie z sekwencji bakteryjnego DNA fimA i focA.

PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy) jest metodą umożliwiającą zwiększenie niewielkiej liczby cząsteczek pożądanej sekwencji genomowego DNA w krótkim czasie in vitro o współczynnik od 10⁶ do 10⁸. Sposób według wynalazku opiera się na sposobie opisanym przez R.K. Saiki i in., Science 239:487-491 (1988).

Do przeprowadzenia PCR wykorzystuje się startery, które są oligonukleotydami mającymi długość od 15 do 30 nukleotydów, których sekwencja jest komplementarna do początku, względnie końca nici siostrzanej amplifikowanego DNA.

Następnie, podwójną nić DNA denaturuje się przez ogrzanie, przez co rozdziela się ona na dwie pojedyncze nici. Wzdłuż jednoniciowego obszaru określanego jako matryca, w późniejszym etapie zostanie dobudowana nić komplementarna. Po denaturacji przez ogrzanie, mieszaninę ze starterami schładza się, przez co nukleotydy startera hybrydyzują z końcami jednoniciowego DNA i zapobiegają ponownemu połączeniu się pierwotnych pojedynczych nici DNA. Następnie podwyższa się temperaturę mieszaniny czterech typowych dla DNA 5'-fosforanów nukleotydów i termostabilnej polimerazy DNA. Jako szczególnie przydatna okazała się polimeraza Taq ze skrajnie termofilnego organizmu Thermus aquaticus, która wytrzymuje krótkotrwałe podgrzewanie do temperatury 95°C. W temperaturze 72°C pojedyncze nici DNA wydłużane są przez polimerazę DNA między oboma końcami z przyłączonymi starterami, z wytworzeniem podwójnej nici DNA.

Trzy etapy sposobu, mianowicie denaturacji przez podgrzanie, przyłączenia starterów i polimeryzacji można powtarzać, aż do wyczerpania mieszaniny. Ponieważ w każdym pojedynczym etapie uzyskuje się podwojenie ilości DNA, po około 20 cyklach otrzymuje się teoretycznie współczynnik wzmocnienia rzędu 106.

W przypadku niniejszego wynalazku stosuje się parę starterów pochodzących z sekwencji fimA, oznaczonych Muta 1 i 2 (fig. 1) jak również z sekwencji focA, oznaczonych Muta 3 i 4 (fig. 2), ze szczepu DSM 6601. Te sekwencje DNA wykazują częściową homologię z genami innych enterobakterii, ale w przeciwieństwie, wykazują zasady w niektórych położeniach inne niż obserwowane u innych enterobakterii.

Dalsze pary starterów Muta 5 i 6 (fig. 3), Muta 7 i 8, jak również Muta 9 i 10 (fig. 4) wybrano z sekwencji DNA plazmidu pMUT1 (fig. 5) i pMUT2 (fig. 6) szczepu DSM 6601. Te pary starterów wykazują sekwencję nukleotydową, nie opisywaną do tej pory u enterobakterii.

Sekwencje starterów Muta 1 do Muta 10 przedstawiono szczegółowo na fig.1 do 4.

Wynalazek zostanie dalej przedstawiony przy pomocy następującego przykładu:

Kolonię E. coli szczepu DSM 6601 pobrano z płytki agarowej i zawieszono w 100 ml wody bidestylowanej. Zawiesinę podgrzewano przez 10 minut w 95°C, po czym ochłodzono na lodzie, 1 ml zawiesiny bakterii zastosowano jako matrycę DNA do PCR.

PL 190 847 B1

Następnie, wytworzono następującą mieszaninę reakcyjną PCR w naczyniu reakcyjnym do PCR:

μ! H2O bi-destylowanej μ| 5X bufora PCR μ| 1,25 mM dNTP po 1 μ! każdego ze starterów (0,5 mg/μΙ) μΙ matrycy ml polimerazy Taq (1 U/ul)

Do reakcji PCR wybrano następujące warunki:

a. 3 min w 95°C (denaturacja)

b. 45 sek. w 95°C (denaturacja)

c. 45 sek. w 58°C (przyłączanie starterów)

d. 45 sek. w 72°C (temperatura reakcji polimerazy Taq).

Etapy b. do d. powtarza się średnio 20 razy.

Produkty końcowe można, przykładowo, zastosować do identyfikacji szczepu DSM 6601 Escherichia coli, albo sekwencjonować w znany sposób i zastosować do sprawdzania odpowiednio wytworzonych sekwencji DNA również do badania szczepów E. coli.

Claims (7)

1. SspsóóiddntyfikaajiszzzzeuDDS 6661 Esccheicdaccli, zznmieenntym, żż e dreekcji PCC stosuje się parę starterów Muta 1 do Muta 10 o sekwencjach DNA przedstawionych na fig. 1 do 4.

2. Sspsóóweeługzzktrz. 1,z znmieenntym,. żż pιzzerowaadzsięreekajęPCC w naktęęujących warunkach:

a) 3 min w 95°C

b) 45 sek. w 95°C

c) 45 sek. w 58°C

d) 45 sek. w 72°C

3. Sposób według zastrz. 1 i 2, znamienny tym, że etapy b) do d) powtarza się średnio 20 razy.

4. Sekwencje DNA o następującej sekwencji nukleotydowej:

ATA CTA CGA CGG TAA ATG GT i/lub

ATG CTA CCG ATA CTG ATG TA

5. Sekwencje DNA o następującej sekwencji nukleotydowej:

CCA CGG TTA GGT GTG GTA CAG i/lub

TGG TAT TGC CAA CGC CGA CG

6. Sekwencje DNA o następującej sekwencji nukleotydowej:

AAC TGT CGA GCG ATG AAC CC i/lub

GAT AGC TCT CTG AAC AGT CC

7. Sekwencje DNA o następującej sekwencji nukleotydowej GCG AGG TAA CCT CGA ACA TG