CZ289739B6 - Způsob identifikace E. coli DSM 6601 a sekvence pro pouľití při identifikaci - Google Patents

Abstract

Sekvence DNA s po°ad m nukleotid uveden²m v obr zc ch 1 a 4 pro pou it p°i identifikaci a zp sob identifikace Escherichia coli kmen DSM 6601, p°i kter m se pou ij jako p ry primer pro polymer zovou °et zovou reakci, PCR, sekvence DNA z obr. 1 a 4.\

Description

Způsob identifikace E. coli DSM 6601 a sekvence pro použití při identifikaci

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká způsobu identifikace Escherichia coli (E. coli) kmen DSM 6601 a sekvencí pro použití při identifikaci.

Dosavadní stav techniky

Escherichia coli je gramnegativní bakterie, která se vyskytuje v lidské a zvířecí střevní flóře, ale vyskytuje se také extraintestinálně. E. coli je dnes mezi mikrobiálními klonovacími systémy genové techniky nej důležitější produkční organismus pro expresi heterologních proteinů a pro klonování a amplifikaci DNA.

E. coli se vyskytuje v četných variantách, které se liší v antigenech pouzdra (K-antigeny), povrchových antigenech (O-antigeny) a antigenech bičíků (H-antigeny), a proto mohou být rozděleny do četných serologických typů. Uspořádání podle serotypů však nic nevypovídá a rozdílné virulentnosti mikroorganismu. Zástupci stejných serotypů mohou mít jak v lidském těle, tak i v tělech zvířat různých potenciál patogenity, který se v extrémním případě může pohybovat v oblasti od avirulentního až do vysoce patogenního. Je známo, že kmen E. coli DSM 6601 nepatří k patogenům lidí nebo zvířat.

Proto existuje potřeba vytvořit metody verifikace pro nepatogenní kmeny E. coli. zařazení do serotypových skupin jako jediná metoda pro posouzení patogenity nebo nepatogenity kmene E. coli nedostačuje. Již bylo řečeno, že pod stejným serotypem se mohou vyskytovat jak patogenní tak i nepatogenní varianty. Pro diagnostické a terapeutické účely v medicíně, ale i pro použití pro účely genetických technologií je proto žádoucí mít možnost spolehlivé identifikace jednotlivých kmenů.

Podstata vynálezu

Podle vynálezu se tedy navrhuje způsob identifikace E. coli kmene DSM 6601, který se vyznačuje tím, že se používají při reakci PCR určité páry primerů z plazmidů, popřípadě sekvencí fimA a focA bakteriální DNA.

PCR (polymerázová řetězová reakce) je způsob, při kterém je možné rozmnožit několik málo molekul libovolné genomové sekvence DNA vnejkratším čase in vitro s faktory 10⁶ až 10⁸. Způsob průkazu podle vynálezu se opírá o způsob popsaný vR. K. Saiki a další, Science 239: 487-491 (1988).

Pro provádění reakce PCR jsou nutné primery, tedy oligonukleotidy, které mají zpravidla délku 15 až 30 nukleotidů a jejichž sekvence jsou komplementární s počátečními, popřípadě koncovými sekvencemi sesterských řetězců DNA určené k amplifikaci.

Nejprve se zahřátím denaturuje dvouřetězcová DNA amplifikované sekvence, takže vzniknou jednotlivé řetězce. Na jednořetězcovém úseku nukleové kyseliny označovaném jako templát nebo matrice se později tvoří komplementární řetězec. Po denaturaci ohřátím se směs ochladí s primery, přičemž nukleotidy primerů hybridizují na koncích jednořetězcové DNA a tím zabrání opětnému spojení jednotlivých řetězců původní DNA. Potom se po zvýšení teploty přidá směs čtyř nukleotid-5'-trifosfátů typických pro DNA a teplotně stabilní DNA-polymeráza. Jako zvláště vhodná se ukázala Τα^-polymeráza z extrémně termofilního organismu Thermus aquaticus, která vydrží krátkodobé zahřátí na teplotu více než 95 °C. Při 72 °C se pomocí

-1 CZ 289739 B6 polymerázy doplní jednotlivý řetězec DNA mezi oběma konci obsazenými primery na dvojitý řetězec.

Tyto tři kroky, totiž denaturace teplem, teplotní hybridizace (annealing) primerů a polymerace, se mohou opakovat tak dlouho, dokud se nevyčerpají přidané reagencie. Při každém jednotlivém kroku dojde ke zdvojení množství DNA, takže se po přibližně dvaceti cyklech teoreticky dosahuje faktoru zesílení přibližně 10⁶.

V rámci předkládaného vynálezu se používají jako páry primerů řetězce sekvence fimA označené Muta 1 a 2 (obr. 1) a řetězce sekvence focA označené Muta 2 a 4 (obr. 2) kmene DSM 6601. tyto sekvence DNA se částečně shodují s geny jiných enterobakterií, ale na druhé straně mají v určitých polohách báze, které dosud u jiných enterobakterií nebyly pozorovány. Další páry primerů Muta 5 a 6 (obr. 3), Muta 7 a 8 a Muta 9 a 10 (obr. 4) byly vybrány ze sekvencí DNA plazmidů pMUT 1 (obr. 5) a pMUT 2 (obr. 6) kmene DSM 6601. Tyto páry primerů mají rovněž nukleotidovou sekvenci, která dosud nebyla u neterobakterií nalezena. Sekvence primerů Muta 1 až Muta 10 jsou podrobně zobrazeny v přiložených obrázcích 1 až 4.

Vynález bude nyní osvětlen na následujících příkladech.

Příklady provedení vynálezu

Jedna kolonie E. coli kmen DSM 6601 se odpíchne zagarové plotny a suspenduje ve 100 μΐ bidestilované vody, tato suspenze se zahřívá 10 min na 95 °C a potom se ochladí v ledu. Jeden mikrolitr bakteriální suspenze se použije jako templátová DNA pro PCR.

Potom se do reakční nádobky pro PCR napipetuje následující směs reagencií pro PCR:

μΐ bidestilovaná H₂O μΐ 5 x PCR pufr μΐ 1,25 mM směs dNTP po 1 μΐ primeru (0,5 pg/)d) μΐ templátu μΐ Ta^-polymerázy (1 U/μΙ)

Pro reakci PCR byly zvoleny následující podmínky:

a. 3 min 95 °C (denaturace)

b. 45 s při 95 °C (denaturace)

c. 45spři58°C

d. 45 s při 72 °C (reakční teplota Ta^-polymerázy)

Kroky b. až d. byly opakovány alespoň dvacetkrát.

Konečné produkty mohou být potom použity například pro identifikaci Escherichia coli kmen DSM 6601 nebo mohou být také známým způsobem sekvenovány a použity pro přezkoušení odpovídajícím způsobem získaných sekvencí DNA z testovaných kmenů E. coli.

Claims (7)

1. Způsob identifikace Escherichia coli DSM 6601, vyznačující se tím, že se při polymerázové řetězové reakci, PCR, použijí páry primerů Muta 1 až Muta 10 se sekvencemi DNA na obr. 1 až 4.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se reakce PCR provádí při následujících teplotách:

a) 3 min při 95 °C

b) 45 s při 95 °C

c) 45 s při 58 °C

d) 45spři72°C

3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se kroky b) až d) opakují alespoň dvacetkrát.

4. Sekvence DNA pro použití při způsobu podle některého z nároků 1 až 3, s následujícími sledy nukleotidů:

ATA CTA CGA CGG TAA ATG GT a/nebo

ATG CTA CCG ATA CTG ATG TA.

5. Sekvence DNA pro použití při způsobu podle některého z nároků 1 až 3, s následujícími sledy nukleotidů:

CCA CGG TTA GGT GTG GTA CAG a/nebo

TGG TAT TGC CAA CGC CGA CG.

6. Sekvence DNA pro použití při způsobu podle některého z nároků 1 až 3, s následujícími sledy nukleotidů:

AAC TGT GAA GCG ATG AAC CC a/nebo

GAT AGC TCT CTG AAC AGT CC.

7. Sekvence DNA pro použití při způsobu podle některého z nároků 1 až 3, s následujícími sledy nukleotidů:

GCG AGG TAA CCT CGA ACA TG a/nebo

CGT GAA TTA TCG ATA CGC CG

-3CZ 289739 B6 a/nebo

GTG AGA TGA TGG CCA CGA TT

5 a/nebo

CAT CCG GTT ATC GCT TGG.