CZ289739B6 - Způsob identifikace E. coli DSM 6601 a sekvence pro pouľití při identifikaci - Google Patents
Způsob identifikace E. coli DSM 6601 a sekvence pro pouľití při identifikaci Download PDFInfo
- Publication number
- CZ289739B6 CZ289739B6 CZ20001873A CZ20001873A CZ289739B6 CZ 289739 B6 CZ289739 B6 CZ 289739B6 CZ 20001873 A CZ20001873 A CZ 20001873A CZ 20001873 A CZ20001873 A CZ 20001873A CZ 289739 B6 CZ289739 B6 CZ 289739B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- dna sequence
- nucleotide sequences
- following nucleotide
- escherichia coli
- dna
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Sekvence DNA s po°ad m nukleotid uveden²m v obr zc ch 1 a 4 pro pou it p°i identifikaci a zp sob identifikace Escherichia coli kmen DSM 6601, p°i kter m se pou ij jako p ry primer pro polymer zovou °et zovou reakci, PCR, sekvence DNA z obr. 1 a 4.\
Description
Způsob identifikace E. coli DSM 6601 a sekvence pro použití při identifikaci
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká způsobu identifikace Escherichia coli (E. coli) kmen DSM 6601 a sekvencí pro použití při identifikaci.
Dosavadní stav techniky
Escherichia coli je gramnegativní bakterie, která se vyskytuje v lidské a zvířecí střevní flóře, ale vyskytuje se také extraintestinálně. E. coli je dnes mezi mikrobiálními klonovacími systémy genové techniky nej důležitější produkční organismus pro expresi heterologních proteinů a pro klonování a amplifikaci DNA.
E. coli se vyskytuje v četných variantách, které se liší v antigenech pouzdra (K-antigeny), povrchových antigenech (O-antigeny) a antigenech bičíků (H-antigeny), a proto mohou být rozděleny do četných serologických typů. Uspořádání podle serotypů však nic nevypovídá a rozdílné virulentnosti mikroorganismu. Zástupci stejných serotypů mohou mít jak v lidském těle, tak i v tělech zvířat různých potenciál patogenity, který se v extrémním případě může pohybovat v oblasti od avirulentního až do vysoce patogenního. Je známo, že kmen E. coli DSM 6601 nepatří k patogenům lidí nebo zvířat.
Proto existuje potřeba vytvořit metody verifikace pro nepatogenní kmeny E. coli. zařazení do serotypových skupin jako jediná metoda pro posouzení patogenity nebo nepatogenity kmene E. coli nedostačuje. Již bylo řečeno, že pod stejným serotypem se mohou vyskytovat jak patogenní tak i nepatogenní varianty. Pro diagnostické a terapeutické účely v medicíně, ale i pro použití pro účely genetických technologií je proto žádoucí mít možnost spolehlivé identifikace jednotlivých kmenů.
Podstata vynálezu
Podle vynálezu se tedy navrhuje způsob identifikace E. coli kmene DSM 6601, který se vyznačuje tím, že se používají při reakci PCR určité páry primerů z plazmidů, popřípadě sekvencí fimA a focA bakteriální DNA.
PCR (polymerázová řetězová reakce) je způsob, při kterém je možné rozmnožit několik málo molekul libovolné genomové sekvence DNA vnejkratším čase in vitro s faktory 106 až 108. Způsob průkazu podle vynálezu se opírá o způsob popsaný vR. K. Saiki a další, Science 239: 487-491 (1988).
Pro provádění reakce PCR jsou nutné primery, tedy oligonukleotidy, které mají zpravidla délku 15 až 30 nukleotidů a jejichž sekvence jsou komplementární s počátečními, popřípadě koncovými sekvencemi sesterských řetězců DNA určené k amplifikaci.
Nejprve se zahřátím denaturuje dvouřetězcová DNA amplifikované sekvence, takže vzniknou jednotlivé řetězce. Na jednořetězcovém úseku nukleové kyseliny označovaném jako templát nebo matrice se později tvoří komplementární řetězec. Po denaturaci ohřátím se směs ochladí s primery, přičemž nukleotidy primerů hybridizují na koncích jednořetězcové DNA a tím zabrání opětnému spojení jednotlivých řetězců původní DNA. Potom se po zvýšení teploty přidá směs čtyř nukleotid-5'-trifosfátů typických pro DNA a teplotně stabilní DNA-polymeráza. Jako zvláště vhodná se ukázala Τα^-polymeráza z extrémně termofilního organismu Thermus aquaticus, která vydrží krátkodobé zahřátí na teplotu více než 95 °C. Při 72 °C se pomocí
-1 CZ 289739 B6 polymerázy doplní jednotlivý řetězec DNA mezi oběma konci obsazenými primery na dvojitý řetězec.
Tyto tři kroky, totiž denaturace teplem, teplotní hybridizace (annealing) primerů a polymerace, se mohou opakovat tak dlouho, dokud se nevyčerpají přidané reagencie. Při každém jednotlivém kroku dojde ke zdvojení množství DNA, takže se po přibližně dvaceti cyklech teoreticky dosahuje faktoru zesílení přibližně 106.
V rámci předkládaného vynálezu se používají jako páry primerů řetězce sekvence fimA označené Muta 1 a 2 (obr. 1) a řetězce sekvence focA označené Muta 2 a 4 (obr. 2) kmene DSM 6601. tyto sekvence DNA se částečně shodují s geny jiných enterobakterií, ale na druhé straně mají v určitých polohách báze, které dosud u jiných enterobakterií nebyly pozorovány. Další páry primerů Muta 5 a 6 (obr. 3), Muta 7 a 8 a Muta 9 a 10 (obr. 4) byly vybrány ze sekvencí DNA plazmidů pMUT 1 (obr. 5) a pMUT 2 (obr. 6) kmene DSM 6601. Tyto páry primerů mají rovněž nukleotidovou sekvenci, která dosud nebyla u neterobakterií nalezena. Sekvence primerů Muta 1 až Muta 10 jsou podrobně zobrazeny v přiložených obrázcích 1 až 4.
Vynález bude nyní osvětlen na následujících příkladech.
Příklady provedení vynálezu
Jedna kolonie E. coli kmen DSM 6601 se odpíchne zagarové plotny a suspenduje ve 100 μΐ bidestilované vody, tato suspenze se zahřívá 10 min na 95 °C a potom se ochladí v ledu. Jeden mikrolitr bakteriální suspenze se použije jako templátová DNA pro PCR.
Potom se do reakční nádobky pro PCR napipetuje následující směs reagencií pro PCR:
μΐ bidestilovaná H2O μΐ 5 x PCR pufr μΐ 1,25 mM směs dNTP po 1 μΐ primeru (0,5 pg/)d) μΐ templátu μΐ Ta^-polymerázy (1 U/μΙ)
Pro reakci PCR byly zvoleny následující podmínky:
a. 3 min 95 °C (denaturace)
b. 45 s při 95 °C (denaturace)
c. 45spři58°C
d. 45 s při 72 °C (reakční teplota Ta^-polymerázy)
Kroky b. až d. byly opakovány alespoň dvacetkrát.
Konečné produkty mohou být potom použity například pro identifikaci Escherichia coli kmen DSM 6601 nebo mohou být také známým způsobem sekvenovány a použity pro přezkoušení odpovídajícím způsobem získaných sekvencí DNA z testovaných kmenů E. coli.
Claims (7)
1. Způsob identifikace Escherichia coli DSM 6601, vyznačující se tím, že se při polymerázové řetězové reakci, PCR, použijí páry primerů Muta 1 až Muta 10 se sekvencemi DNA na obr. 1 až 4.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se reakce PCR provádí při následujících teplotách:
a) 3 min při 95 °C
b) 45 s při 95 °C
c) 45 s při 58 °C
d) 45spři72°C
3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se kroky b) až d) opakují alespoň dvacetkrát.
4. Sekvence DNA pro použití při způsobu podle některého z nároků 1 až 3, s následujícími sledy nukleotidů:
ATA CTA CGA CGG TAA ATG GT a/nebo
ATG CTA CCG ATA CTG ATG TA.
5. Sekvence DNA pro použití při způsobu podle některého z nároků 1 až 3, s následujícími sledy nukleotidů:
CCA CGG TTA GGT GTG GTA CAG a/nebo
TGG TAT TGC CAA CGC CGA CG.
6. Sekvence DNA pro použití při způsobu podle některého z nároků 1 až 3, s následujícími sledy nukleotidů:
AAC TGT GAA GCG ATG AAC CC a/nebo
GAT AGC TCT CTG AAC AGT CC.
7. Sekvence DNA pro použití při způsobu podle některého z nároků 1 až 3, s následujícími sledy nukleotidů:
GCG AGG TAA CCT CGA ACA TG a/nebo
CGT GAA TTA TCG ATA CGC CG
-3CZ 289739 B6 a/nebo
GTG AGA TGA TGG CCA CGA TT
5 a/nebo
CAT CCG GTT ATC GCT TGG.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19751243 | 1997-11-19 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ20001873A3 CZ20001873A3 (cs) | 2000-10-11 |
CZ289739B6 true CZ289739B6 (cs) | 2002-03-13 |
Family
ID=7849197
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ20001873A CZ289739B6 (cs) | 1997-11-19 | 1998-11-18 | Způsob identifikace E. coli DSM 6601 a sekvence pro pouľití při identifikaci |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6489107B1 (cs) |
EP (1) | EP1038035A1 (cs) |
JP (1) | JP2004516801A (cs) |
CZ (1) | CZ289739B6 (cs) |
EE (1) | EE200000231A (cs) |
HU (1) | HUP0004409A3 (cs) |
NO (1) | NO20002550L (cs) |
PL (1) | PL190847B1 (cs) |
WO (1) | WO1999025870A1 (cs) |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE19915772C2 (de) * | 1998-11-18 | 2001-08-30 | Pharma Zentrale Gmbh | Verfahren zur Identifizierung von Escherichia coli Stamm DSM 6601 |
US20050064447A1 (en) * | 2001-04-18 | 2005-03-24 | Sheng-He Huang | Probiotic therapy of neonatal meningitis and method of using E. coli virulence determinatns |
DE10155928A1 (de) * | 2001-11-15 | 2003-06-12 | Degussa | recA-negativer und rhaB-negativer Mikroorganismus |
CN109843310A (zh) | 2016-08-31 | 2019-06-04 | 哈佛学院院长等 | 分泌治疗性蛋白的工程化细菌及其使用方法 |
CN109576198B (zh) * | 2018-11-09 | 2022-06-07 | 南京工业大学 | 一株敲除fimA基因的重组大肠杆菌及其构建方法与应用 |
WO2022060848A1 (en) * | 2020-09-15 | 2022-03-24 | Northeastern University | Plasmid vectors for in vivo selection-free use with the probiotic e. coli nissle |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE19713543B4 (de) * | 1997-04-02 | 2007-01-11 | Pharma-Zentrale Gmbh | Bakterielle Plasmide |
DE19751242C2 (de) | 1997-11-19 | 2001-02-08 | Pharma Zentrale Gmbh | DNA-Sequenzen aus Fimbriengenen von Escherichia coli Stamm DSM 6601 |
-
1998
- 1998-11-18 EE EEP200000231A patent/EE200000231A/xx unknown
- 1998-11-18 HU HU0004409A patent/HUP0004409A3/hu not_active Application Discontinuation
- 1998-11-18 US US09/554,724 patent/US6489107B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-11-18 CZ CZ20001873A patent/CZ289739B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-11-18 JP JP2000521233A patent/JP2004516801A/ja active Pending
- 1998-11-18 WO PCT/EP1998/007398 patent/WO1999025870A1/de not_active Application Discontinuation
- 1998-11-18 EP EP98966241A patent/EP1038035A1/de not_active Withdrawn
- 1998-11-18 PL PL340330A patent/PL190847B1/pl unknown
-
2000
- 2000-05-18 NO NO20002550A patent/NO20002550L/no unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
PL190847B1 (pl) | 2006-02-28 |
JP2004516801A (ja) | 2004-06-10 |
US6489107B1 (en) | 2002-12-03 |
HUP0004409A2 (hu) | 2001-04-28 |
HUP0004409A3 (en) | 2001-09-28 |
NO20002550D0 (no) | 2000-05-18 |
CZ20001873A3 (cs) | 2000-10-11 |
EP1038035A1 (de) | 2000-09-27 |
WO1999025870A1 (de) | 1999-05-27 |
EE200000231A (et) | 2001-06-15 |
PL340330A1 (en) | 2001-01-29 |
NO20002550L (no) | 2000-07-18 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Bassam et al. | DNA amplification fingerprinting of bacteria | |
US5849497A (en) | Specific inhibition of the polymerase chain reaction using a non-extendable oligonucleotide blocker | |
Hilton et al. | Random amplification of polymorphic DNA (RAPD) of Salmonella: strain differentiation and characterization of amplified sequences | |
JP3016399B2 (ja) | ポリメラーゼ鎖反応によるサルモネラ菌の同定 | |
JP4212648B2 (ja) | 遺伝標識および大腸菌血清型―0157:h7の検出方法 | |
Osek | Virulence factors and genetic relatedness of Escherichia coli strains isolated from pigs with post-weaning diarrhea | |
EP2633082B1 (en) | Rapid salmonella serotyping assay | |
LeJeune et al. | Polymerase chain reaction for definitive identification of Yersinia ruckeri | |
CZ289739B6 (cs) | Způsob identifikace E. coli DSM 6601 a sekvence pro pouľití při identifikaci | |
US20030235837A1 (en) | High resolution typing system for pathogenic E. coli | |
Olsen et al. | Isolation of a Salmonella‐specific DNA hybridization probe | |
Iqbal et al. | Detection of Yersinia pestis by pesticin fluorogenic probe-coupled PCR | |
US9932642B2 (en) | Rapid Salmonella serotyping assay | |
CA2252013C (en) | Procedure for the detection of high virus concentrations in blood plasma and/or blood serum by means of the polymerase chain reaction | |
KR102388060B1 (ko) | 결핵균 및 베이징 계통 결핵균의 감별을 위한 조성물 및 이를 이용한 결핵균 검출 방법 | |
US5733724A (en) | Oligonucleotides for the detection of enterobacteriaceae selected from salmolysin | |
KR101821547B1 (ko) | 호흡기 질환 원인체 검출용 조성물 | |
Saxena et al. | Ribotyping of Indian isolates of Pasteurella multocida based on 16S and 23S rRNA genes | |
CA2721899A1 (en) | Salmonella detection assay | |
Narongwanichgarn et al. | Differentiation of Fusobacterium necrophorum subspecies from bovine pathological lesions by RAPD-PCR | |
US20230265527A1 (en) | Polynucleotide, polynucleotide set, method for detecting porphyromonas gingivalis, method for assessing periodontal disease susceptibility, porphyromonas gingivalis detection kit, and periodontal disease susceptibility assessment kit | |
KR102369388B1 (ko) | 시료에서 M. tuberculosis, M. bovis 및 M. bovis BCG의 존재 또는 부존재를 결정하는 방법 | |
JPH06253847A (ja) | 炭疽菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出方法 | |
DE19915772C2 (de) | Verfahren zur Identifizierung von Escherichia coli Stamm DSM 6601 | |
Fliss et al. | Multiplex riboprobes for the detection of virulent Yersinia enterocolitica and simple methods for their preparation |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20061118 |