CZ20001873A3 - Způsob identifikace E. coli DSM 6601 - Google Patents
Způsob identifikace E. coli DSM 6601 Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20001873A3 CZ20001873A3 CZ20001873A CZ20001873A CZ20001873A3 CZ 20001873 A3 CZ20001873 A3 CZ 20001873A3 CZ 20001873 A CZ20001873 A CZ 20001873A CZ 20001873 A CZ20001873 A CZ 20001873A CZ 20001873 A3 CZ20001873 A3 CZ 20001873A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- nucleotide sequences
- dna sequence
- cga
- sec
- following nucleotide
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Způsob identifikace E. coii DSM 6601
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká způsobu identifikace Escherichia coli (E. coli) kmen DSM 6601.
Dosavadní stav techniky
Escherichia coli je gramnegativní bakterie, která se vyskytuje v lidské a zvířecí střevní flóře, ale vyskytuje se také extraintestinálně. E. coli je dnes mezi mikrobiálními klonovacími systémy genové techniky nejdůležitější produkční organismus pro expresi heterologních proteinů a pro klonování a amplifikaci DNA.
E. coli se vyskytuje v četných variantách, které se liší v antigenech pouzdra (K-antigeny), povrchových antigenech (0antigeny) a antigenech bičíků (H-antigeny), a proto mohou být rozděleny do četných serologických typů. Uspořádání podle serotypů však nic nevypovídá o rozdílné virulentnosti mikroorganismu. Zástupci stejných serotypů mohou mít jak v lidském těle, tak i v tělech zvířat různý potenciál patogenity, který se v extrémním případě může pohybovat v oblasti od avirulentního až do vysoce patogenního. Je známo, že kmen E. coli DSM 6601 nepatří k patogenům lidí nebo zvířat.
Proto existuje potřeba vytvořit metody verifikace pro nepatogenní kmeny E. coli. Zařazení do serotypových skupin jako jediná metoda pro posouzení patogenity nebo nepatogenity kmene E. coli nedostačuje. Již bylo řečeno, že pod stejným serotypem se mohou vyskytovat jak patogenní tak i nepatogenní varianty. Pro diagnostické a terapeutické účely v medicíně, ale i pro použití pro účely genetických technologií je proto žádoucí mít možnost spolehlivé identifikace jednotlivých kmenů.
Podstata vynálezu
Podle vynálezu se tedy navrhuje způsob identifikace E. coli kmene DSM 6601, který se vyznačuje tím, že se používají při reakci PCR určité páry primerů z plazmidů, popřípadě sekvencí fimA a focA bakteriální DNA.
PCR (polymerázová řetězová reakce) je způsob, při kterém je možné rozmnožit několik málo molekul libovolné genomové sekvence DNA v nejkratším čase in vitro s faktory 106 až 108. Způsob průkazu podle vynálezu se opírá o způsob popsaný v R. K. Saiki a další, Science 239: 487 -491 (1988).
Pro provádění reakce PCR jsou nutné primery, tedy oligonukleotidy, které mají zpravidla délku přibližně 15 až 30 nukleotidů a jejichž sekvence jsou komplementární s počátečními, popřípadě koncovými sekvencemi sesterských řetězců DNA určené k amplifikaci.
Nejprve se zahřátím denaturuje dvouřetězcová DNA amplifikované sekvence, takže vzniknou jednotlivé řetězce. Na jednořetězcovém úseku nukleové kyseliny označovaném jako templát nebo matrice se později tvoří komplementární řetězec. Po denaturaci ohřátím se směs ochladí s primery, přičemž nukleotidy primerů hybridizují na koncích jednořetězcové DNA a tím zabrání opětnému spojení jednotlivých řetězců původní DNA. Potom se po zvýšení teploty přidá směs čtyř nukleotid-5’-trifosfátů typických pro DNA a teplotně stabilní DNA-polymeráza. Jako zvláště vhodná se ukázala Tag-polymeráza z extrémně termofilního organismu Thermus aquaticus, která vydrží krátkodobé zahřátí na teplotu více než 95 °C.
• ·
Při 72 °C se pomocí polymerázy doplní jednotlivý řetězec DNA mezi oběma konci obsazenými primery na dvojitý řetězec.
Tyto tři kroky, totiž denaturace teplem, teplotní hybridizace (annealing) primerů a polymerace, se mohou opakovat tak dlouho, dokud se nevyčerpají přidané reagencie. Při každém jednotlivém kroku dojde ke zdvojení množství DNA, takže se po přibližně dvaceti cyklech teoreticky dosahuje faktoru zesílení přibližně 106.
V rámci předkládaného vynálezu se používají jako páry primerů řetězce sekvence fimA označené Muta 1 a 2 (obr. 1) a řetězce sekvence focA označené Muta 2 a 4 (obr. 2) kmene DSM 6601. Tyto sekvence DNA se částečně shodují s geny jiných enterobakterií, ale na druhé straně mají v určitých polohách báze, které dosud u jiných enterobakterií nebyly pozorovány. Další páry primerů Muta 5 a 6 (obr. 3), Muta 7 a 8 a Muta 9 a 10 (obr. 4) byly vybrány ze sekvencí DNA plazmidů pMUT 1 (obr. 5) a pMUT 2 (obr. 6) kmene DSM 6601. Tyto páry primerů mají rovněž nukleotidovou sekvenci, která dosud nebyla u enterobakterií nalezena. Sekvence primerů Muta 1 až Muta 10 jsou podrobně zobrazeny v přiložených obrázcích 1 až 4.
Vynález bude nyní osvětlen na následujících příkladech.
Příklady provedení vynálezu
Jedna kolonie E. coli kmen DSM 6601 se odpíchne z agarové plotny a suspenduje ve 100 pl bidestilované vody. Tato suspenze se zahřívá 10 min na 95 °C a potom se ochladí v ledu. Jeden mikrolitr bakteriální suspenze se použije jako templátová DNA pro PCR.
Potom se do reakční nádobky pro PCR napipetuje následující směs reagencií pro PCR:
μΙ bidestilovaná H2O μΙ 5 x PCR pufr • · · ·
- 4 8 μΙ 1,25 mM směs dNTP po 1 μΙ primeru (0,5 pg/pl) 1 μΙ templátu μΙ Taq-polymerázy (1 U/μΙ)
Pro reakci PCR byly zvoleny následující podmínky:
a. 3 min 95 °C (denaturace)
b. 45 s při 95 °C (denaturace)
c. 45 s při 58 °C (teplotní hybridizace primeru)
d. 45 s při 72 °C (reakční teplota TaQ-polymerázy) io Kroky b. až d. byly opakovány alespoň dvacetkrát.
Konečné produkty mohou být potom použity například pro identifikaci Escherichia coli kmen DSM 6601 nebo mohou být také známým způsobem sekvenovány a použity pro přezkoušení odpovídajícím způsobem získaných sekvencí DNA z testovaných kmenů E. coli.
Claims (7)
1. Způsob identifikace Escherichia coli DSM 6601,
5 vyznačující se tím, že se při reakci PCR použijí páry primerů Muta 1 až Muta 10 se sekvencemi DNA na obr. 1 až 4.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, io ž e se reakce PCR provádí při následujících teplotách:
a) 3 min při 95 °C
b) 45 s při 95 °C
c) 45 s při 58 °C
d) 45 s při 72 °C.
3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se kroky b) až d) opakují alespoň dvacetkrát.
4. Sekvence DNA s následujícími sledy nukleotidů:
20 ATA CTA CGA CGG TAA ATG GT a/nebo
ATG CTA CCG ATA CTG ATG TA.
5. Sekvence DNA s následujícími sledy nukleotidů:
25 CCA CGG TTA GGT GTG GTA CAG a/nebo • · · · · ····· ·· ·
- 6 TGG TAT TGC CAA CGC CGA CG.
6. Sekvence DNA s následujícími sledy nukleotidů:
AAC TGT GAA GCG ATG AAC CC
5 a/nebo
GAT AGC TCT CTG AAC AGT CC.
7. Sekvence DNA s následujícími sledy nukleotidů:
GCG AGG TAA CCT CGA ACA TG io a/nebo
CGT GAA TTA TCG ATA CGC CG a/nebo
GTG AGA TGA TGG CCA CGA TT a/nebo
15 CAT CCG GTT ATC GCT TGG.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19751243 | 1997-11-19 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20001873A3 true CZ20001873A3 (cs) | 2000-10-11 |
| CZ289739B6 CZ289739B6 (cs) | 2002-03-13 |
Family
ID=7849197
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20001873A CZ289739B6 (cs) | 1997-11-19 | 1998-11-18 | Způsob identifikace E. coli DSM 6601 a sekvence pro pouľití při identifikaci |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6489107B1 (cs) |
| EP (1) | EP1038035A1 (cs) |
| JP (1) | JP2004516801A (cs) |
| CZ (1) | CZ289739B6 (cs) |
| EE (1) | EE200000231A (cs) |
| HU (1) | HUP0004409A3 (cs) |
| NO (1) | NO20002550L (cs) |
| PL (1) | PL190847B1 (cs) |
| WO (1) | WO1999025870A1 (cs) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19915772C2 (de) * | 1998-11-18 | 2001-08-30 | Pharma Zentrale Gmbh | Verfahren zur Identifizierung von Escherichia coli Stamm DSM 6601 |
| US20050064447A1 (en) * | 2001-04-18 | 2005-03-24 | Sheng-He Huang | Probiotic therapy of neonatal meningitis and method of using E. coli virulence determinatns |
| DE10155928A1 (de) * | 2001-11-15 | 2003-06-12 | Degussa | recA-negativer und rhaB-negativer Mikroorganismus |
| EP3506917A4 (en) | 2016-08-31 | 2020-05-06 | President and Fellows of Harvard College | GENETICALLY MODIFIED BACTERIA SECRETING THERAPEUTIC PROTEINS AND METHODS OF USE THEREOF |
| CN109576198B (zh) * | 2018-11-09 | 2022-06-07 | 南京工业大学 | 一株敲除fimA基因的重组大肠杆菌及其构建方法与应用 |
| WO2022060848A1 (en) * | 2020-09-15 | 2022-03-24 | Northeastern University | Plasmid vectors for in vivo selection-free use with the probiotic e. coli nissle |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19713543B4 (de) * | 1997-04-02 | 2007-01-11 | Pharma-Zentrale Gmbh | Bakterielle Plasmide |
| DE19751242C2 (de) | 1997-11-19 | 2001-02-08 | Pharma Zentrale Gmbh | DNA-Sequenzen aus Fimbriengenen von Escherichia coli Stamm DSM 6601 |
-
1998
- 1998-11-18 EP EP98966241A patent/EP1038035A1/de not_active Withdrawn
- 1998-11-18 WO PCT/EP1998/007398 patent/WO1999025870A1/de not_active Application Discontinuation
- 1998-11-18 CZ CZ20001873A patent/CZ289739B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-11-18 PL PL340330A patent/PL190847B1/pl unknown
- 1998-11-18 EE EEP200000231A patent/EE200000231A/xx unknown
- 1998-11-18 US US09/554,724 patent/US6489107B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-11-18 HU HU0004409A patent/HUP0004409A3/hu not_active Application Discontinuation
- 1998-11-18 JP JP2000521233A patent/JP2004516801A/ja active Pending
-
2000
- 2000-05-18 NO NO20002550A patent/NO20002550L/no unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2004516801A (ja) | 2004-06-10 |
| HUP0004409A2 (hu) | 2001-04-28 |
| PL190847B1 (pl) | 2006-02-28 |
| US6489107B1 (en) | 2002-12-03 |
| EE200000231A (et) | 2001-06-15 |
| NO20002550D0 (no) | 2000-05-18 |
| NO20002550L (no) | 2000-07-18 |
| PL340330A1 (en) | 2001-01-29 |
| CZ289739B6 (cs) | 2002-03-13 |
| EP1038035A1 (de) | 2000-09-27 |
| HUP0004409A3 (en) | 2001-09-28 |
| WO1999025870A1 (de) | 1999-05-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bassam et al. | DNA amplification fingerprinting of bacteria | |
| US5849497A (en) | Specific inhibition of the polymerase chain reaction using a non-extendable oligonucleotide blocker | |
| Scheinert et al. | Molecular differentiation of bacteria by PCR amplification of the 16S–23S rRNA spacer | |
| RU2673733C2 (ru) | Способ амплификации днк на основе внедрения в цепь | |
| JP3016399B2 (ja) | ポリメラーゼ鎖反応によるサルモネラ菌の同定 | |
| Choi et al. | Prevalence of the enteroaggregative Escherichia coli heat-stable enterotoxin 1 gene and its relationship with fimbrial and enterotoxin genes in E. coli isolated from diarrheic piglets | |
| EP2570489A1 (en) | Food-poisoning bacteria detection carrier, and method for detecting food-poisoning bacteria | |
| JP4212648B2 (ja) | 遺伝標識および大腸菌血清型―０１５７：ｈ７の検出方法 | |
| Blais et al. | Comparative analysis of yadA and ail polymerase chain reaction methods for virulent Yersinia enterocolitica | |
| EP1651773A1 (en) | Diagnostics of diarrheagenic escherichia coli (dec) and shigella spp. | |
| CZ20001873A3 (cs) | Způsob identifikace E. coli DSM 6601 | |
| EP2633082B1 (en) | Rapid salmonella serotyping assay | |
| US20030235837A1 (en) | High resolution typing system for pathogenic E. coli | |
| US20030113757A1 (en) | Rapid and specific detection of campylobacter | |
| Olsen et al. | Isolation of a Salmonella‐specific DNA hybridization probe | |
| Iqbal et al. | Detection of Yersinia pestis by pesticin fluorogenic probe-coupled PCR | |
| US7521183B2 (en) | Method for detecting Chlamydia trachomatis and kit therefor | |
| EP1223225A1 (en) | Detection of mycobacterium avium ssp paratuberculosis | |
| KR101821547B1 (ko) | 호흡기 질환 원인체 검출용 조성물 | |
| Saxena et al. | Ribotyping of Indian isolates of Pasteurella multocida based on 16S and 23S rRNA genes | |
| Narongwanichgarn et al. | Differentiation of Fusobacterium necrophorum subspecies from bovine pathological lesions by RAPD-PCR | |
| US20230265527A1 (en) | Polynucleotide, polynucleotide set, method for detecting porphyromonas gingivalis, method for assessing periodontal disease susceptibility, porphyromonas gingivalis detection kit, and periodontal disease susceptibility assessment kit | |
| DE19915772C2 (de) | Verfahren zur Identifizierung von Escherichia coli Stamm DSM 6601 | |
| Bashyal et al. | Development of Specific Marker for Identification and Characterization of Fungal Plant Pathogens | |
| Fliss et al. | Multiplex riboprobes for the detection of virulent Yersinia enterocolitica and simple methods for their preparation |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20061118 |