PL182898B1 - Związek z grupy androstanów i pregnanów oraz środek farmaceutyczny do modulowania pobudliwości mózgu - Google Patents

Abstract

3a-hydroksy-ß -(3'-metylobut-3' -en-1 ' -ynylo)-5ß -pregnan-20-on; 3a -hydroksy-3ß-(3' -metylobut-3' -en-1' -yny- lo)-5a-pregnan-20-on; 3a-hydroksy-3ß -trifluorom etylo-5a-pregnan-20-on; 3a-hydroksy-3ß -trifluoromety- lo-5ß -pregn-11-en-20-on; 3ß -(cyklopropylo)etynylo-3a-hydroksy-3ß -pregnan-20-on; 3a, 20a-dihydroksy-3ß -ety- nylo-5a-pregnan; 3a , 2 1-dihydroksy-3ß -etenylo-5a-pregnan-20-onu; 3a, 21-dihydroksy-3ß -fluorometylo-5a -pre gnan-20-on; lub ich fizjologicznie dopuszczalne 3ß- estry, 20-estry, 21-estry, 3,20-diestry lub 3,21-diestry. 8. Srodek farmaceutyczny do modulowania pobudliwosci mózgu zwierzecego, zwlaszcza do lagodzenia stresu, niepokoju, aktywnosci ataków, redukowania lub lagodzenia bezsennosci, zaklócen nastroju, w szczególnosci de- presji, objawów przed menstruacyjnych i depresji poporodowych oraz wywolywania znieczulen znamienny tym, ze jako substancje czynna zawiera zwiazek z grupy obejmujacej: 3a -hydroksy-3ß -(3' -metylobut-3'-en- 1'-ynylo)-5ß -pregnan-20-on; 3a-hydroksy-3ß -(3 '-metylobut-3ß' -en-1'-yny- lo) 5a-pregnan-20-on; 3a-hydroksy-3-trifluorometylo-5a-pregnan-20-on; 3a-hydroksy-3ß -trifluorometylo-5ß -pregn-1 1- -en-20-on; 3ß -(cyklopropylo)etynylo-3ß-ah ydroksy-3a -pregnan-20-on; 3a,20a-dihydroksy-3ß -etynylo-5a-pregnan; 3a,21-dihydroksy-3ß -etenylo-5a-pregnan-20-onu; 3,21-dihydroksy-3ß -fluoro-metylo-5a-pregnan-20-on; lub ich fi- zjologicznie dopuszczalne 3-estiy, 20-estry, 21-estry, 3,20-diestry lub 3,21-diestry oraz sól sodowa 2 1-hemibursztynianu 3a 21-dihydroksy-3ß -trifluorometylo-19-nor-5ß -pregnan-20-onu; bis hemibursztynian 3a.20a-dihydroksy-21 -mety- lo-5a-pregnanu; 21-hemibursztynian 3a, 21-dihydroksy-3ß -etenylo-5ß-pregnan-20-onu; 21-octan 3a,21-dihydro- ksy-3ß -metylo-5a-pregnan-20-onu; sól sodowa 21-hemifumaranu 3a,21-dihydroksy-3ß -trifluorometylo-5ß -preg- nan-20-onu; metylo-21-bursztynian 3a ,21-dihydroksy-3ß -trifluorometylo-5ß -pregnan-20-onu; 21-propionian 3a,21-di- hydroksy-3 ß -trifluorometylo-5ß -pregnan-20-onu; 21-hemibursztynian bis(3a.2 l-dihydroksy-3ß -trifluorometylo-5ß -preg- nan-20-onu; 21-hemibursztynian bis (3a,21-dihydroksy-3ß -etynylo-5ß -pregnan-20-onu; i N(3ß-hydroksy-3-metylo- -5a-pregnan-20-ylideno)etanoloamine. PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest związek z grupy androstanów i pregnanów dla allosterycznej modulacji receptorów GABA oraz środek farmaceutyczny do modulowania pobudliwości mózgu ludzkiego lub zwierzęcego.

Bardziej szczegółowo wynalazek dotyczy związków służących modulowaniu pobudliwości mózgu za pośrednictwem kompleksu receptora kwasu γ-aminomasłowego A (GABAą) i jenoforu chlorkowego (GRC), a w szczególności, modulowaniu pobudliwości mózgu poprzez związanie receptora neurosteroidowego GRC.

Pobudliwość mózgu definiuje się jako poziom pobudzenia w kontinuum rozciągającym się od śpiączki aż do drgawek, sterowanego poprzez różne przekaźniki nerwowe. Ogólnie, przekaźniki nerwowe odpowiadają za regulację przewodnictwa jonów przez błony neuronowe. Błona neuronowa w spoczynku posiada potencjał (albo napięcie błony) w przybliżeniu -80 mV, wnętrze komórki naładowane jest ujemnie w porównaniu z jej otoczeniem. Potencjał (napięcie) ten jest wynikiem równowagi jonowej (K⁺, Na⁺, Cl, aniony organiczne) po obu stronach neuronowej błony półprzepuszczalnej. Przekaźniki nerwowe umieszczone są w pęcherzykach presynaptycznych i uwalniane są pod wpływem potencjałów działania neuronowego. Po uwolnieniu do szczeliny synaptycznej, pobudzający przekaźnik chemiczny, taki jak acetylocholina, powoduje depolaryzację błony (zmiana potencjału od -80mV do -50 mV). W efekcie tym pośredniczą postsynaptyczne receptory nikotynowe, które w wyniku stymulowania przez acetylocholinę zwiększają przepuszczalność błony w stosunku do jonów Na⁺. Obniżenie potencjału błony stymuluje pobudliwość neuronową w formie potencjału działania postsynaptycznego.

W przypadku GRC, wpływ na pobudliwość mózgu odbywa się za pośrednictwem przekaźnika nerwowego GABA. GABA ma znaczący wpływ na globalną pobudliwość mózgu, ponieważ do 40% neuronów w mózgu wykorzystuje GABA jako przekaźnik nerwowy. GABA reguluje pobudliwość poszczególnych neuronów poprzez zmiany przewodnictwa jonów chlorkowych przez błonę neuronową. GABA wzajemnie oddziałowuje z miejscem rozpoznania w GRC ułatwiając przepływ jonów chlorkowych w dół gradientu elektrochemicznego GRC, do wnętrza komórki.

Wzrost stężenia tych anionów wewnątrz komórki powoduje hiperpolaryzację potencjału przezbłonowego czyniąc neuron mniej wrażliwym na czynniki pobudzające (tzw. zmniejszona pobudliwość neuronu). Innymi słowy, im większe stężenie jonów chlorkowych w neuronie, tym mniejsza pobudliwość mózgu (poziom pobudzenia).

Fakt, że GRC jest odpowiedzialny za pośrednictwo w powstawaniu leku, częstotliwości napadów oraz uspokojeniu polękowym jest dobrze udokumentowany. Tak więc GABA oraz leki działające podobnie do GABA lub ułatwiające działanie GABA (np. stosowane w terapiach barbiturany lub benzodiazepiny (Bzs), takie jak Valium) wywołują skutki terapeutyczne poprzez oddziaływanie na specyficzne miejsca regulacyjne na GRC.

Zaobserwowano również, że seria metabolitów steroidowych oddziałuje z GRC zmieniając pobudliwość mózgu (Majewska, M. D. i wsp., Science 232:1004-1007 (1986); Harrison, N. L. i wsp., J. Pharmacol. Exp. Ther. 241:346-353 (1987). Przed niniejszym wynalazkiem, stosowalność terapeutyczna tych metabolitów steroidowych nie była badana z uwagi na niekompletne rozumienie siły i miejsca ich działania. Niniejsze zgłoszenie patentowe w części odnosi się do farmaceutycznego zastosowania wiedzy powstałej w oparciu o lepsze zrozumienie siły i miejsca działania pewnych związków steroidowych.

Wykazano, że hormon jajnikowy - progesteron oraz jego metabolity mają znaczący wpływ na pobudliwość mózgu (Backstrom, T. i wsp. , Acta Obstet. Gynecol. Scand. Suppl. 130:19-24 (1985); Pfaff, D. W. i McEwen, B. S., Science 219:808-814 (1983); Gyermek i wsp., J. Med. Chem. 11:117 (1968); oraz Lambert, J. i wsp., Trends Pharmacol. 8:224-227 (1987)). Poziomy progesteronu i jego metabolitów zmieniają się wraz z fazami cyklu menstruacyjnego. Dobrze udokumentowano fakt obniżenia poziomu progesteronu i jego metabolitów przed początkiem miesiączki. Dobrze udokumentowano również comiesięczne nawroty pewnych fizycznych objawów przed rozpoczęciem menstruacji.

182 898

Objawy związane z syndromem przed menstruacyjnym (PMS) obejmują napięcie, lęk i migrenowe bóle głowy (Dalton, K., Premenstrual Syndrome and Progesterone Therapy, 2nd edition, Chicago: Chicago yearbook, 1984). Pacjentki z PMS mają co miesiąc nawrót objawów w okresie przed menstruacyjnym oraz ich zanik po menstruacji. Podobnie, okresowe obniżenie poziomu progesteronu korelowano ze zwiększeniem się częstotliwości ataków u kobiet epileptyczek (np. epilepsja menstruacyjna; Laidlaw, J., „Catamenial epilepsy”, Lancet, 1235-1237 (1956)). Bardziej bezpośrednią korelację zaobserwowano badając obniżenie poziomu metabolitów progesteronu (Rościszewska i wsp., J. Neurol. Neurosurg. Psych. 49ΆΊ-5\ (1986)). W dodatku u pacjentek ze stwierdzoną epilepsją mało-napadową skorelowano okresowe występowanie ataków z występowaniem objawów syndromu przed menstruacyjnego (Backstrom, T. i wsp., J. Psychosom. Obstet. Gynaecol. 2:8-20 (1983)). Steroid dezoksykortykosteron okazał się skuteczny w leczeniu pacjentek, u których ataki epilepsji skorelowano z ich cyklami menstruacyjnymi (Aird, R. B. i Gordan, G., J. Amer. Med. Soc. 745:715-719(1951)).

Zespołem związanym z niskim poziomem progesteronu jest depresja poporodowa (PND). Bezpośrednio po porodzie poziom progesteronu dramatycznie spada prowadząc do początku PND. Objawy PND mogą być różne, począwszy od łagodnej depresji a kończąc na psychozach wymagających hospitalizacji; PND wiąże się z poważnym lękiem oraz pobudliwością. Depresja związana z PND nie nadaje się do leczenia klasycznymi lekami antydepresyjnymi, a kobiety dotknięte PND narażone są na częstsze występowanie PMS (Dalton, K. 1984).

Podsumowując, obserwacje te wskazują na to, że progesteron i dezoksykortykosteron oraz ich metabolity odgrywają kluczową rolę w hemostatycznej regulacji pobudliwości mózgu, co objawia się zwiększeniem częstotliwości ataków padaczkowych lub występowaniem objawów związanych z epilepsją menstruacyjną PMS oraz PMD. Występowanie korelacji między poziomem progesteronu oraz objawami związanymi z PMS, PND oraz epilepsją menstruacyjną (Backstrom i wsp., 1983; Dalton, K., 1984) spowodowało zastosowanie progesteronu w ich leczeniu (Mattson i wsp., w Advances in epileptology: XVth Epilepsy International Symposium, Raven Press, New York, 279-282, 1984, oraz Dalton, K., 1984). Jednakże progesteron nie okazał się istotnie efektywny w leczeniu wyżej wspomnianych zespołów chorobowych. Na przykład nie istnieje relacja dawka-odpowiedź podczas leczenia progesteronem PMS-u (Maddocks, et al,. Obstet. Gynecol. 154: 573-581 (1986); Dennerstein, i wsp., British Medical Journal, 290:16-17 (1986)). Przedmiotem wynalazku są związki służące modulowaniu pobudliwości mózgu. W szczególności wynalazek dotyczy wykorzystania 3a-hydroksypochodnych steroidów działających na nowoodkryte miejsce kompleksu GR w celu modulowania pobudliwości mózgu w sposób łagodzący napięcie, lęk, bezsenność, zaburzenia nastroju (takie jak depresja) dające się leczyć czynnikami GR-aktywnymi oraz ataki padaczki. W zakres wynalazku wchodzą również środki farmaceutyczne zawierające związki skuteczne w takim leczeniu.

Wynalazek obejmuje następujące związki z grupy androstanów i pregnanów:

3a-hydroksy-3p-(3'-metylobut-3'-en-r-ynylo)-53-pregnan-20-on; 3a-hydroksy-3p-(3'-metylobut-3'-en-l'-ynylo)-5a-pregnan-20-on; 3a-hydroksy-3p-trifluorometylo-5a-pregnan-20-on; 3a-hydroksy-3 P-trifluorometylo-5 β-pregn-11 -en-20-on; 3 3-(cyklopropy lo)etynylo-3a-hydroksy-3P-pregnan-20-on; 3a,20a-dihydroksy-33-etynylo-5a-pregnan; 3a,21 -dihydroksy-3 β-etenylo-5a-pregnan-20-onu; 3a,21-dihydroksy-3p-fluorometylo-5a-pregnan-20-on; lub ich fizjologicznie dopuszczalne 3-estry, 20-estry, 21-estry, 3,20-diestry lub 3,21-diestry.

Wynalazek obejmuje również: sól sodową 21-hemibursztynianu 3cc,21-dihydroksy-3p-trifluorometylo-19-nor-5P-pregnan-20-onu; bis hemibursztynian 3a,20a-dihydroksy-2 l-metylo-5a-pregnanu; 21-hemibursztynian 3a,21-dihydroksy-3P-etenylo-5a-pregnan-20-onu; 21-octan 3a,21-dihydroksy-3P-metylo-5a-pregnan-20-onu; sól sodową 21-hemifumaranu 3α,21 -dihydroksy-3 P-trifluorometylo-5 P-pregnan-20-onu; metylo-21 -bursztynian 3α,21 -dihydroksy-3 β-trifluoromety lo-5 β-pregnan-20-onu; 21 -propionian 3α,21 -dihydroksy-3 β-trifluo182 898 rometylo-5p-pregnan-20-onu; 21 -hemibursztynian bis (3a,21-dihydroksy-3 β-trifluoromety lo-5P-pregnan-20-onu; 21-hemibursztynian bis (3cc,21-dihydroksy-3p-etynylo-5P-pregnan-20-onu; i N-(3a-hydroksy-3 P-metylo-5a-pregnan-20-ylideno)etanoloaminę.

Korzystnymi związkami są: 3a-hydroksy-3p-(3'-metylobut-3'-en-r-ynylo)-53-pregnan20-oh; 3a-hydroksy-3 p-trifluoro-metylo-5a-pregnan-20-on; 3a-hydroksy-3 β-trifluorometylo-53-pregn-l l-en-20-on; sól sodowa 21-hemibursztynianu 3a,21-dihydroksy-3 β-trifluorometylo-19-nor-5P-pregnan-20-onu i 3p-(cyklopropylo)etynylo-3a-hydroksy-53-pregnan-20-on.

Ponadto wynalazek obejmuje środek farmaceutyczny do modulowania pobudliwości mózgu zwierzęcego, zwłaszcza do łagodzenia stresu, niepokoju, aktywności ataków, redukowania lub łagodzenia bezsenności, zakłóceń nastroju, w szczególności depresji, objawów przed menstruacyjnych i depresji poporodowych oraz wywoływania znieczuleń, który jako substancję czynną zawiera związek z grupy obejmującej:

3a-hydroksy-3p-(3'-metylobut-3'-en-l'-ynylo)-5p-pregnan-20-on; 3a-hydroksy-3p-(3'-metylobut-3'-en- l'-ynylo)-5a-pregnan-20-on; 3a-hydroksy-3 3-trifluorometylo-5a-pregnan-20-on; 3a-hydroksy-3 β-trifluoromety lo-5 β-pregn-11 -en-20-on; 3 p-(cyklopropylo)ety nylo-3a-hydroksy-3 P-pregnen-20-on; 3a,20cc-dihydroksy-3 P-etynylo-5a-pregnan; 3α,21 -dihydroksy-3 β-etenylo-5a-pregnan-20-onu; 3a,21 -dihydroksy-3 β-fluoro-metylo-5α-pregnan-20-on; lub ich fizjologicznie dopuszczalne 3-estry, 20-estry, 21-estry, 3,20-diestry lub 3,21-diestry oraz sól sodową 21-hemibursztynianu 3oc,21 -dihydroksy-3 β-trifluorometylo-19-nor-5β-pregnan-20-onu; bis hemibursztynian 3a,20a-dihydroksy-21-metylo-5a-pregnanu; 21-hemibursztynian 3a,21 -dihydroksy-3 β-etenylo-5a-pregnan-20-onu; 21 -octan 3α,21 -dihydroksy-3 β-metylo-5α-pregnan-20-onu; sól sodową 21-hemifumaranu 3a,21-dihydroksy-3 β-trifluorometylo-5β-pregnan-20-onu; metylo-21-bursztynian 3a,21-dihydroksy-3 β-trifluorometylo-5β-pregnan-20-onu; 21 -propionian 3α,21 -dihydroksy-3 β-trifluorometylo-5 β-pregnan-20-onu; 21 -hemibursztynian bis(3a,21 -dihydroksy-3 β-trifluorometylo-5β-trifluorometylo-5 β-pregnan-20-onu; 21 -hemibursztynian bis (3oc,21-dihydroksy-3β-etynylo-5β-pregnan-20-onu; i N-(3α-hydroksy-3β-metylo-5a-pregnan-20-ylideno)etanoloaminę.

Środek według wynalazku może mieć postać tradycyjnej kompozycji farmaceutycznej.

Związki według wynalazku, są modulatorami pobudliwości centralnego układu nerwowego, które pośredniczą w regulowaniu kanałów chlorkowych związanych z układem receptora GABA. Przeprowadzone eksperymenty wykazały, że związki według wynalazku posiadają działanie przeciw drgawkowe i uspokajające podobne do znanych leków uspokajających takich jak Bzs, lecz działające na różne miejsca kompleksu GR.

Powiązanie endogennych metabolitów progesteronu z procesami związanymi z reprodukcją (cykl rujowy i ciąża) jest dobrze znane (Marker, R. E., Kamm, O., oraz McGrew, R. V., „Isolation of epi-pregnanol-3-one-20 from human pregnancy urine”, J Am. Chem. Soc. 59:616-618 (1937)). Dotychczas jednakże nie zbadano, wjaki sposób leczyć choroby poprzez modulowanie pobudliwości mózgu w wyniku stosowania metabolitów progesteronu. Tak więc niniejszy wynalazek dotyczy związków dla leczenia zaburzeń poprzez modulowanie pobudliwości mózgu. Reprezentatywne choroby leczone środkiem farmaceutycznym według wynalazku to epilepsja, lęk, syndrom przed menstruacyjny (PMS), depresja poprodowa (PND), zaburzenia nastroju (takie, jak depresja) poddające się leczeniu środkami GR-aktywnymi oraz bezsenność. Związki objęte wynalazkiem mogą być również stosowane w anestezjologii.

Związki według wynalazku i stosowane w środkach według wynalazku są pochodnymi różnych 3a-21-pregnandiol-20-onów; 3a-20-pregnandioli; oraz 3a-hydroksylowanych-androstanów oraz ich pochodnych estrowych, eterowych, sulfonianowych, siarczanowych, fosfonianowych, fosforanowych, oksymowych (iminowych) oraz tiazolidynowych, które to pochodne określa się jako proleki. Wyrażenie „prolek” oznacza pochodną leku o bezpośrednim działaniu, która charakteryzuje się wartością terapeutyczną porównywalną z lekiem oraz ulega transformacji do leku aktywnego w wyniku procesu enzymatycznego lub chemicznego; patrz Notari, R. E., „Theory and Practise of Prodrug Kinetics”, Methods in Enzymology,

182 898 /72:309-323 (1985); Bodor, N., „Novel Approaches in Prodrug Design”, Drugs of the Futurę, 5(3):165-182 (1981); oraz Bundgaard, H., „Design of Prodrugs: Bioreversible Derivatives for Various Functional Groups and Chemical Entities”, w Design of Prodrugs (H. Bundgaard, ed.), Elsevier, New York (1985). Należy stwierdzić, że niektóre syntetyczne pochodne nie mogą być naprawdę prolekami, ponieważ oprócz powyższej charakterystyki posiadają również aktywność wewnętrzną. Jednak dla potrzeb wynalazku zostały zaliczone do proleków.

Badania przeprowadzone w laboratoriach zgłaszającego (Gee, K. W. i wsp., European Journal of Pharmacology, 136A\9-623 (1987) wykazały, że 3a-hydroksylowane steroidy według wynalazku mają o rzędy wielkości silniejsze działanie od innych opisanych związków (Majewska, M. D. i wsp. (1986) oraz Harrison, N. L. i wsp. (1987)) jako modulatorów kompleksu GR. Majewska i wsp. oraz Harrison i wsp. podają że 3a-hydroksylowane-5-zredukowane steroidy posiadają skuteczność o wiele mniejszą. Nasze badania in vitro oraz in vivo wykazały, że silne działanie wymienionych steroidów pozwala na ich wykorzystanie terapeutyczne w celu modulacji pobudliwości mózgu poprzez kompleks GR. Najaktywniejsze steroidy stosowane w niniejszym wynalazku obejmują pochodne głównych metabolitów progesteronu i dezoksykortykosteronu. Steroidy te w bardzo korzystny sposób można stosować do modulowania pobudliwości mózgu podczas stresu, lęku, bezsenności, zaburzeń nastroju (takich jak depresja) poddających się terapii czynnikami GR-aktywnymi oraz padaczki. Ponadto wspomniane steroidy wzajemnie oddziałowują z jedynym w swoim rodzaju miejscem kompleksu GR, odmiennym niż inne znane miejsca oddziaływania (np. barbiturany, BZ i GABA), gdzie ujawniono wcześniej korzystny terapeutyczny wpływ na stres, lęk, sen, zaburzenia nastroju, ataki padaczki (Gee, K. W. oraz Yamamura, Η. I., w In Central Nervous System Disorders, str. 123-147, D. C. Horvell, ed., 1985; Lloyd, K. G. i Morselli, P. L., w Psychopharmacology: The Third Generation of Progress, str. 183-195, Η. Y. Meltzer, ed., Raven Press, N. Y, 1987). Związki te są atrakcyjne ze względu na czasookres trwania, siłę działania i doustna drogę podawania (obok innych sposobów stosowania).

Pochodne steroidowe objęte niniejszym wynalazkiem opisane są następującymi wzorami strukturalnymi:

wzór 2

182 898 wzór 3 wzór 4 wzór 5 wzór 6

Powyższe związki mogą być w postaci farmaceutycznie dopuszczalnych estrów i soli związków opisanych wzorami 1-6, łącznie z solami addycyjnymi z kwasami. Uważa się, że 3 a-hydroksyl może być zamaskowany w postaci farmaceutycznie dopuszczalnego estru, gdyż ester może zostać rozszczepiony, podobnie jak pro lek ulega przekształceniu w lek. Estry takie nazywa się rozszczepialnymi estrami.

W niniejszym opisie, o ile nie zaznaczono inaczej, użyte określenia mają następujące znaczenia:

Określenie „alkil” oznacza nasycone grupy alifatyczne o łańcuchach prostych, rozgałęzionych lub grupy cykliczne, wszystkie one mogą być ewentualnie podstawione. Typowe grupy alkilowe to metyl, etyl itp., również ewentualnie podstawione.

Określenie „alkeny 1” oznacza grupy nienasycone zawierające co najmniej jedno wiązanie podwójne węgiel-węgiel o łańcuchach prostych, rozgałęzionych oraz grupy cykliczne, z których wszystkie mogą być ewentualnie podstawione.

182 898

Określenie „alkinyl” oznacza nienasycone grupy węglowodorowe zawierające co najmniej jedno wiązanie potrójne węgiel-węgiel i obejmuje łańcuchy proste, łańcuchy rozgałęzione oraz grupy cykliczne, z których każdy może zawierać dodatkowe nienasycenie. Jeżeli w pozycji 3β występuje grupa alkinylowa, może być ona podstawiona chlorowcowanym lub niechlorowcowanym rodnikiem C_1? nasyconymi lub nienasyconymi rodnikami C₂-C₆, chlorowcowanym lub niechlorowcowanym rodnikiem prostołańcuchowym, rodnikiem cyklicznym C₃-C₆ (cykloalkilem) albo aromatycznym rodnikiem C₅-C₆, albo 4, 5 lub 6-członowym rodnikiem heterocyklicznym przyłączonym na atomie węgla lub azotu i zawierającym 1,2 lub 3 heteroatomy wybrane z grupy obejmującej tlen, azot i siarkę, wyłączając rodniki heterocykliczne z dwoma lub więcej sąsiadującymi atomami S lub O. Korzystne są grupy alkinylowe zawierające od dwóch do czterech atomów węgla.

Określenie „alkoksy” dotyczy grupy eterowej -OR, w której R oznacza alkil.

Termin „aryloksy” dotyczy grupy eterowej -OR, w której R oznacza aryl.

Określenie „aryl” oznacza grupy aromatyczne zawierające co najmniej jeden pierścień posiadający układ sprzężonych elektronów π obejmujący aryle i biaryle, z których każdy może być ewentualnie podstawiony.

Określenie „aryl karbocykliczny” oznacza grupy, w których atomy pierścienia aromatycznego są atomami węgla. Karbocykliczne grupy arylowe obejmują grupy fenylowe i nafty lowe, które mogą być ewentualnie podstawione. Korzystnie podstawiony fenyl posiada od jednego do trzech podstawników korzystnie niższy alkil lub grupy amino, hydroksy, niższy alkoksyl, chlorowiec, niższy acyl oraz nitro.

Określenie „aryloalkil” oznacza grupy alkilowe podstawione grupą arylową. Korzystną grupą aryloalkilową jest benzyl lub podobna. Może ona być ewentualnie podstawiona.

Określenie „dialkiloamino” oznacza grupę -NRR, w której R i R niezależnie oznaczają niższe grupy alkilowe lub obie tworzą resztę grupy morfolinowej. Korzystne grupy dialkiloaminowe obejmują grupę dimetyloaminową, dietyloaminową oraz morfolinową.

Określenie „acyl” oznacza grupę -C(O)R, w której R oznacza alkil, alkenyl, aryl lub aryloalkil.

Określenie „ewentualnie podstawiony” lub „podstawiony” odnosi się do grup podstawionych podstawnikami, od jednego do trzech, niezależnie wybranymi spośród niższych alkili, aryli, alkenyli, alkinyli, grup alkoksy, amino, tio, chlorowco, chlorowcoalkilo, trichlorowcoalkilo, acylo, nitro, hydroksy oraz keto.

Określenie „niższy” odnosi się do organicznych rodników zawierających od jednego do czterech atomów węgla. Grupy takie mogą być prostołańcuchowe, rozgałęzione lub cykliczne.

Określenie „farmaceutycznie dopuszczalny ester lub sól” odnosi się do estrów lub soli związków przedstawionych wzorami 1-6 pochodzących od kombinacji związków według wynalazku i kwasów organicznych lub nieorganicznych.

Przykładowe podstawniki w związkach o wzorze 1 mają znaczenia:

R oznacza wodór lub niższy alkil, niższy alkenyl lub niższy alkinyl;

Rj oznacza metylen, β-hydroksymetyl lub grupę β-cyjano; oraz fizjologicznie dopuszczalne ich 3-estry, 20-estry oraz 3,20-diestry; pod warunkiem, że gdy R, jest grupa β-cyjano, wówczas R nie jest atomem wodoru.

Jednakże w sposobie wykonywania, R_t może być grupą cyjanową, gdy R jest atomem wodoru.

Korzystną grupą związków o wzorze 1 są związki, w których Rjest wodorem.

Inną grupą korzystnych związków o wzorze 1 są związki, w których R1 jest grupą cyjanową.

Przykłady korzystnych związków o wzorze 1 obejmują, lecz nie ograniczają się do nich: 3a-hydroksy-17-metyleno-5a-androstan; 3a-hydroksy-17β-hydroksymetylo-5α-androstan albo 3a-hydroksy-17(20) (Z)-metoksymetyleno-5a-androstan.

Przykładowe podstawniki w związkach o wzorze 2 mają znaczenia:

R oznacza wodór, chlorowiec lub niższą grupę alkoksy;

182 898

R, oznacza alkenyl, alkoksyalkil, chlorowcoalkoksyalkil, trifluorometyl, azydoalkil, cyjanoalkil lub monochlorowcometyl;

R₂ oznacza atom wodoru, grupę ketonową lub grupę 1 la-dialkiloaminową;

R₃ oznacza grupę β-acetylową, ketal grupy β-hydroksyacetylowej, grupę β-trifluoroacetylową, grupę P-(hydroksyacetylową), grupę [3-hydroksyacetylo-l 7 β-hy droksy, grupę β-metoksymetyloacetylową, grupę P-(etosky)-metylo-2'-metylenoacetylową, grupę p-(l'-hydroksyetylową), grupę ^(l'-hydroksy propylową), grupę p-(2'-hydroksy izopropylową), grupę β-sukcinyloksyacetylową grupę β-hydroksyacetylo bursztynianu sodu, grupę β-acetoksyacetylową, grupę β-sulfoksyacetylowa, grupę β-metyloacetylową, grupę β-chloroacetylową np. grupę β-chloroacetylową, grupę β-etynylową lub β-etylową, razem z atomem węgla 17, z którym ta grupa etylowa jest związana oraz atomem tlenu tworzy 17(20) epoksy grupę; oraz ich fizjologicznie dopuszczalne 3-estry, 20-estry, 21-estry, 3,20-diestry oraz 3,21-diestry, pod warunkiem, że gdy R₂ oznacza grupę 1 Ια-Ν,Ν-dialkiloaminową R nie jest atomem wodoru.

Korzystnie w związkach o wzorze 2 R oznacza atom wodoru albo niższy alkil.

Korzystniej R jest atomem wodoru.

Inna korzystna grupą związków o wzorze 2 są związki, w których R_t oznacza niższy alkenyl, niższy alkinyl, trifluorometyl, alkoksymetyl oraz monochlorowcometyl. Korzystniej, Rj jest alkenylem C₂-C₄, alkinylem C₂-C₄ lub trifluorometylem. Szczególnie korzystne są związki, gdzie R_I jest etynylem lub trifluorometylem.

Dodatkową grupą korzystnych związków o wzorze 2 są związki, w których R₃ jest acetylem, hydroksyalkilem, hydroksyacetylem lub ich estrami z fizjologicznie dopuszczalnymi kwasami.

Korzystniejsze są związki, w których R₃ jest acetylem lub β-sukcinylooksyacetylem, acetylem.

Przykłady takich związków obejmują, choć nie ograniczają się do nich:

3α-hy droksy-17 β-etynylo-5α-androstan; 3 β-etyny lo-3a-hydroksy-5 β-pregnan-20-on,

3α-hydroksy-5β-5β-(2'-propenylo)-5β-pregnan-20-on, 3β-etynylo-3α-hydroksy-5α-pregnan-20-on, 3β-(chłoroetynyło)-3α-hydroksy-5β-pregnan-20-on, 3 β-etyny lo-3α-hydroksy-5β-pregnan-20-on, 3a-hy droksy-3 β-etynylo-5α-pregnan-20-on, 3α,20α-dihydroksy-3β-etynylo-5a-pregnan, 3α,21 -dihydroksy-3 β-etynylo-5 β-pregnan-20-on, 3 β-(3'-bromo-1 -propynylo)-3a-hydroksy -5β-pregnan-20-on, 21-octan 3a,21-dihy droksy-3 β-etynylo-5β-pregnan-20-onu, 3β-etynylo-3α-hydroksy-5β-pregnan-l 1,20-dion, 21-hemibursztynian 3a,21 -dihydroksy-3β-etynylo-5 β-pregnan-20-onu, 3α,20α-dihydroksy-3β-etynylo-5 β-pregnan, 3a,20a-dihydroksy-3β-etynylo-5a-pregnan, 3α,20β-dihydroksy-3 β-etyny lo-5a-pregnan, 3a-hydroksy-3 β-(2'-propynylo)-5a-pregnan-20-on, 3 β-etyny lo-3a-hy droksy-21 -metoksy-5 β-pregnan-20-on; 3a-hy droksy-3 β-chlorometylo-5α-pregnan-20-on, 3cc-hy droksy-3 β-fluoro-metylo-5α-pregnan-20-on, β-bromoetylo-3α-hydroksy-5α-pregnan-20-on, 3a-hydroksy-3β-jodometylo-5a-pregnan-20-on, 3a-hy droksy-3 β-trifluoromety lo-5a-pregnan-20-on, 3a-hy droksy-3 β-trifluoromety lo-5 β-pregnan-20-on, 21-octan 3a,21-dihy droksy-3 β-trifluorometylo-5β-pregnan-20-onu, 3a,21-dihy droksy -3 β-trifluorometylo-5β-pregnan-20-on, 3α-hydroksy-3β-trifluorometylo-5 β-pregnan-1 1,20-dion, sól sodowa 21-hemibursztynianu 3α,21-dihydroksy-3β-trifluorometylo-5β-pregnan-20-onu, 3a-hy droksy-3 β-trifluoromeΐylo-5 β-pregnan-17(20)-en; 3a,20a-dihydroksy-21 -ety lo-5a-pregnan, 3a,20a-dihydroksy-2 l-metylo-5a-pregnan, 3α,20α-dihydroksy-2β-izopropoksy-5α-pregnan, 3a,20 α-dihydroksy-2β-etoksy-5α-pregnan, 3α,20α-dihydroksy-2β-etoksy-5α-pregnan, 3a,20a-dihydroksy-2β-n-propoksy-5α-pregnan, 3α,20α-dihydroksy-3β-etynylo-5α-pregnan, 3a,20β-dihy droksy -3 β-metylo-5 β-pregnan, 3a,20-dihy droksy-3 [3,20-dimety lo-5 β-pregnan, 3a,20a-dihydroksy-3β,21 -dimetylo-5a-pregnan, 3a,20a-dihydroksy-3 β-ε!γηγΙο-5β-pregnan, 3α,20β-dihydroksy-3 β-etynylo-Sβ-pregnan, 3α,20β-dihydroksy-3β-metylo-5α-pregnan, 3α,20β-dihydroksy-3β-etynylo-5 a-pregnan, 3a-hydroksy-3 β-metoksymetylo-5α-pregnan-20-on, 3β-(etoksymetylo)-3α-hydroksy-5 a-pregnan-20-on, 3β-(Γ-heksynylo)-3α-hydroksy-5β-pregnan-20-on, 3β-azydometylo)-3α-hydroksy-5a-pregnan-20-on, 3a-hydroksy-3 β(2', 2', 2' - trifluoroetoksymetylo)-5a-pregnan-20-on,

182 898

3a-hydroksy-3p-propoksymetylo-5a-pregnan-20-on, 3p-cyjanometylo-3a-hydroksy-5a-pregnan-20-on, 3^(3-metylobut-2-en-1 -ynylo)-3a-hydroksy-5p-pregnan-20-on, 3β-(Γ-heptynynylo)-3cc-hydroksy-53-pregnan-20-on, 3β-cyklopropyloetyny lo-3a-hydroksy-5β-pregnan-20-on, 3β-(Γ-oktynylo)-3(x-hydroksy-5β-pregnan-20-on, 3β-cyklopropyloetynylo-3α-hydroksy-5β-pregnan-20-on oraz 3β-cyklopropyloetynylo-3α-hydroksy-5α-pregnan-20-on.

Przykłady podstawników, w związkach o wzorze 3 mają znaczenia:

R oznacza wodór lub niższy alkil, niższy alkenyl lub niższy alkinyl;

Rj oznacza grupę β-acetylową, ketal grupy β-hydroksyacetylowej, grupę β-trifluoroacetylową, grupę β-(hydroksyacetylową), grupę β-łlydroksyacetylo-17β-hydroksy, grupę β-metoksymetyloacetylową, grupę β-(etoksy)-metylo-2'-metylenoacetylow¾ grupę β-( Γ-hydroksy ety Iową), grupę β-(Γ-hydroksypropylową), grupę β-(2'-hydroksyizopropylową), grupę β-sukcynyloksyacetylową, grupą β-hydroksyacetylo bursztynianu sodu, grupę β-acetoksyacetylową, grupę β-sulfoksyacetylową, grupę β-metyloacetylową, grupę β-chlorowcoacetylową, np. grupę β-chlorowcoacetylową, grupę β-etynylową lub β-etylową, razem z atomem węgla 17, z którym ta grupa etylowa jest związana oraz atomem tlenu tworzy 17(20) grupę epoksy; oraz fizjologicznie dopuszczalne ich 3-estry, 20-estry, 21-estry, 3,20-diestry oraz 3,21-diestry, pod warunkiem, że omawiany związek nie jest 3a-hydroksy-5a-preg-9(ll)-en-20-onem, 3a,21-dihydroksy-5a-preg-9(ll)-en-20-onem ani 21-acetoksy-3a-hydroksy-5a-preg-9(l l)-en-20-onem ani ich pochodnymi esterowymi.

Korzystnie w związkach o wzorze 3 R oznacza atom wodoru albo alkinyl, korzystniej atom wodoru.

Dodatkową grupą korzystnych związków o wzorze 3 są związki, w których R, oznacza acetyl, hydroksyalkil, hydroksyacetyl lub ich estry z fizjologicznie dopuszczalnymi kwasami. Korzystniej Rj oznacza acetyl lub β-sukcinyloksyacetyl, zwłaszcza acetyl.

Przykłady korzystnych związków obejmują, ale nie ograniczają się do nich: 3cc-hydroksy-3β-trifluorometylo-5β-pregn-9(l l)-en-20-on oraz 3α-hydroksy-3β-metyIo-5α-pregn-9-en-20-on.

Przykłady podstawników w związkach o wzorze 4 mają znaczenia:

R oznacza wodór lub niższy alkil, niższy alkenyl czy niższy alkinyl;

Rj ma znaczenie takie jak przy związkach o wzorze 3; oraz fizjologicznie dopuszczalne ich 3-estry, 20-estry, 21-estry, 3,20-diestry oraz 3,21-diestry, pod warunkiem, że omawiany związek nie jest 3a-hydroksy-5 β-pregn-1 l-en-20-onem ani jego pochodnymi 3-estrowymi.

Korzystna jest grupa związków o wzorze 4, w których R oznacza atom wodoru, grupę trifluorometyIową albo niższy alkinyl, najkorzystniej Rjest atomem wodoru.

Dodatkową grupą korzystnych związków o wzorze 4 są związki, w których R_t oznacza acetyl, hydroksyalkil, hydroksyacetyl lub ich estry z fizjologicznie dopuszczalnymi kwasami. Korzystniejsze są związki, w których Rj jest acetylem lub β-sukcynyloksyacetylem, zwłaszcza acetylem.

Przykłady korzystnych związków obejmują, ale nie ograniczają się do nich: 3a-hydroksy-3 β-trifluorometylo-5 β-pregn-11 -en-20-on, 3α,20β-dihydroksy-5β-pregn-11 -en; 3a-hydroksy-3β-metylo-5α-pregn-ll-en-20-on oraz 3α,20β-dihydroksy-5β-pregn-11-en, 3β-etynylo-3a-hydroksy-5 β-pregn-11 -en-20-on.

Przykłady podstawników w związkach o wzorze 5 mają znaczenia:

R oznacza wodór lub niższy alkil, niższy alkenyl lub niższy alkinyl;

R, oznacza β-formyl, metylen, β-hydroksymetyl, metoksymetylen lub grupę β-cyjanową oraz ich fizjologicznie dopuszczalne 3-estry, 20-estry i 3,20-diestry.

Przykłady korzystnych związków obejmują, lecz nie ograniczają się tylko do nich: 3α-hydroksy-17β-formylo-5α-19-norandrostan i 3a-hydroksy-17(20) (Z)-metoksymetyleηο-5α-19-norandrostan.

Przykładowe podstawniki w związkach o wzorze 6 mają następujące znaczenia:

R oznacza wodór lub niższy alkil, niższy alkenyl czy niższy alkinyl;

182 898

Rj ma znaczenie takie jak podane przy wzorze 3; oraz ich fizjologicznie dopuszczalne 3-estry, 20-estry, 21-estry, 3,20-diestry i 3,21-diestry.

Korzystnie, w związkach o wzorze 6 R oznacza niższy alkenyl, niższy alkinyl lub grupę trifluorometylową.

Korzystniej, R oznacza niższy alkinyl lub grupę trifluorometylową

Dodatkową grupą korzystnych związków o wzorze 6 są związki, w których R_t oznacza acetyl, hydroksyalkil, hydroksyacetyl lub ich estry z fizjologicznie dopuszczalnymi kwasami. Korzystniejsze są związki, w których Rj jest acetylem lub β-sukcynyloksyacetylem, zwłaszcza acetylem.

Dalszymi korzystnymi związkami o wzorach 1-6 są estry utworzone z grupami hydroksylowymi w pozycjach 3 i/lub 20. Korzystne są estry następujących kwasów: octowego, propionowego, maleinowego, fumarowego, askorbinowego, pimelinowego, bursztynowego, glutarowego, bismetylenosalicylowego, metanosulfonowego, etano-di-sulfonowego, szczawiowego, winowego, salicylowego, cytrynowego, glukonowego, itakonowego, glikolowego, p-aminobenzoesowego, asparaginowego, glutaminowego, γ-aminomasłowego, a-(2-hydroksyetyloamino)-propionowego, glicyny i innych α-aminokwasów, fosforowego, siarkowego, glukuronowego oraz l-metylo-l,4-dihydronikotynowego.

Inną grupą bardziej korzystnych związków są związki o wzorach 1-6, w których podstawnik 3β jest etynylem lub trifluorometylem, natomiast w pozycji 17 steroidu znajduje się jedno z ugrupowań: β-acetyl, 3-(l'-hydroksyetyl) lub 17 (20) (Z) -en.

Przykłady korzystnych związków obejmują, lecz nie ograniczają się do; 3cc-hydroksy-33-metylo-5p-19-norpregn- 17(20) (Z)-en, 3a-hydroksy-19-nor-5a-pregnan-cis-17(20) (Z)-en, 3a-hydroksy-5|3-l 9-norpregn-17(20) (Z)-en, 3a-hydroksy-3p-metylo-5a-19-norpregn-17(20) (Z)-en, 3p-etynylo-3a-hydroksy-5p-19-norpregn-17(20) (Z)-en oraz 3a-hydroksy-3 β-trifluorometylo-5 β-19-norpregn-17-(20) (Z)-en.

Korzystne są również następujące związki: 3a-hydroksy-3 β-trifluorometylo-19nor-5β-pregnan-20-on, 3a-hydroksy-3 β-trifluorometylo-19-nor 5a-pregnan-20-on, 3a-hydroksy-3 β-trifluorometylo-5 βΐ 9-norpregn-17(20) (Z)-en, 3cc,21 -dihydroksy-3 β-trifluorometylo-19-nor-5β-pregnan-20-on, 21-hemibursztynian 3α, 21 -dihydroksy-3 β-trifluorometylo-19nor-5β-pregnan-20-onu i jego sól sodowa.

Korzystne są również następujące związki: 3a,20a-dihydroksy-19-nor-5a-pregnan, 3a-hydroksy-3 β-trifluorometylo-19-nor5 β-pregnan-20-on, 3a-hydroksy-3 β-metylo-5α-19-norpregnan-20-on, 3 β-etynylo-3a-hydroksy-19-nor-5 β-pregnan-20-on, 3 β-etynylo-3a-hy droksy-5β-l 9-norpregn-17(20) (Z)-en, 3a-hydroksy-3β-metylo-5β-l 9-norpregn-17 (20) (Z)-en, 3a-hydroksy-3β-metylo-5β-l 9-norpregn-17 (20) (Z)-en i 21-hemibursztynian 3a,21-dihydroksy-3 β-trifluorometylo-19-nor-5β-pregnan-20-onu oraz jego sól sodowa.

Najkorzystniejszymi związkami według wynalazku są: 3α-hydroksy-3β-(3'-metylobut-3'-en-l'-ynylo)-^-pregnan-20-on; 3a-hydroksy-3β-(3'-metylo-but-3'-en-l'-ynylo)-5a-pregnan-20-on; 3a-hydroksy-3 β-trifluoromety lo-5a-pregnan-20-on; 3a-hydroksy-3β-trifluoromety lo-5β-pregn-11 -en-20-on; 3a,21 -dihydroksy-3 β-trifluorometylo-19-nor-5 β-pregnan-20-on; 3 β-(cyklopropylo)etynylo-3a-hydroksy-5 β-pregnan-20-on; 3a,20a-dihydroksy-3 [3-etynylo-5a-prcgnan; 3α, 21 -dihydroksy-3 β-etynylo-5a-pregnan-20-on oraz 3a,21-dihydroksy-3 β-fluorometylo-5α-pregnan-20-on lub ich fizjologicznie dopuszczalne 3-estry 20-estry, 21-estry, 3,20-diestry czy 3,21-diestry.

W ramach niniejszego wynalazku, szczególnie korzystne są następujące estry: sól sodowa 21 -hemibursztynianu 3α,21-dihydroksy-3β-trifluorometylo-19-nor-5β-pregnan-20-onu; bis hemibursztynian 3a,20a-dihydroksy-21-metylo-5a-pregnanu; 21-hemibursztynian 3a,21-dihydroksy-3β-etenylo-5α-pregnan-20-onu; 21-octan; 3a,21 -dihydroksy-3 β-metylo-5α-pregnan-20-onu; sól sodowa 21-hemifumaranu; 3a,21-dihydroksy-3 β-trifluorometylo-5β-pregnan-20-onu; 21-bursztynian metylu 3a,21-dihydroksy-3 β-trifluorometylo-5β-pregnan-20-onu; 21 propionian 3α,21 -dihydroksy-3 β-trifluorometylo-5 β-pregnan-20-onu; 21 -hemibursztynian bis(3a,21 -dihydroksy-3 β-trifluorometylo-5 β-pregnan-20-onu); 21 -hemibursztynian bis(3a,21 -di

182 898 hydroksy-33-etynylo-5p-pregnan-20-onu); oraz N-(3a-hydroksy-33-metylo-5a-pregnan-20-ylidyn)etanoloamina.

Poniżej przedstawiono przykłady syntezy związków według wynalazku. Związki chemiczne według wynalazku mogą być otrzymywane dowolnym znanym sposobem np. opublikowanym w „Steroid Reactions” przez Djerassi'ego w 1963 r. (Holden-Day, Inc., San Francisco) lub w „Organie Reactions in Steroid Chemistry” przez Fried'a i Edwards'a (Van Nostrand-Reinhold Co., New York, 1972).

20-Hydroksypregnany otrzymuje się poprzez redukcję 20-keto pregnanów za pomocą tradycyjnych czynników redukujących.

21-Hemibursztyniany otrzymuje się z pochodnych pregnan-20-onu, które najpierw bromuje się bromem cząsteczkowym w celu uzyskania odpowiednich 21-bromopregnanów. Następnie uzyskane bromozwiązki poddaje się reakcji z różnymi kwasami dikarboksylowymi, np. kwasem bursztynowym w obecności aminy w celu otrzymania 21 -hydroksyestrów. Otrzymane estry kwasów dikarboksylowych przekształca się konwencjonalnymi metodami w sole sodowe.

Estry można otrzymywać z wykorzystaniem dobrze znanych reakcji grupy hydroksylowej w powyższych związkach z kwasem organicznym, halogenkiem kwasowym, bezwodnikiem kwasowym lub estrem, gdzie kwasami organicznymi sąnp.: kwas octowy, propionowy, maleinowy, fumarowy, askorbinowy, pimelinowy, bursztynowy, glutarowy, bismetylenosalicylowy, metanosulfonowy, etano-di-sulfonowy, szczawiowy, winowy, salicylowy, cytrynowy, glukonowy, itakonowy, glikolowy, p-aminobenzoesowy, asparaginowy, glutaminowy, γ-aminomasłowy, a-(2-hydroksyetyloamino)-propionowy, glicyna i inne α-amino kwasowy, fosforowy, siarkowy, glukuronowy oraz l-metylo-l,4-dihydronikotynowy.

3(3-Podstawniki

Chlorowcometyl

Związki 3(3-monochlorowcometylowe według wynalazku można otrzymać poprzez działanie jonów chlorowcowych na 3-spiro-2'oksiranosteroid w obojętnym rozpuszczalniku, np. halogenku tetrametyloamoniowego w toluenie w obecności źródła protonów np. kwasu octowego.

Nasycone lub nienasycone alkile

Inne 3-podstawione steroidy mogą być otrzymywane poprzez addycję reagenta metaloorganicznego do 3-ketosteroidu, w którym, ewentualnie zabezpiecza się inne reaktywne grupy funkcyjne. Tak więc, związki 3-alkinylowe mogą być otrzymywane z użyciem acetylenku litu w obojętnych rozpuszczalnikach lub z reagentem otrzymywanym in situ z 1,2 -dibrometylenu i butylolitu jako związku metaloorganicznego. Podobne związki o wzorze 1, w których R jest grupą alkeny Iową mogą być otrzymywane w reakcji 3-ketosteroidu z winylowym reagentem metaloorganicznym takim jak bromek winylomagnezowy. Związki, w których nienasycenie przenoszone jest do miejsca reakcji, takie jak bromek allilomagnezowy mogą być również użyte do otrzymania związków zawierających grupę 3-alkenyIową. Podobnie, zastosowanie alkilowego związku Grignarda np. jodku metylomagnezowego prowadzi do otrzymania 3-alkilozwiązków.

Trifluorometyl

Grupa trifluorometylowa może być wprowadzana w reakcji 3-ketosteroidy z trimetylotrifluorometylosilanem katalizowanej jonem fluorkowym.

Związki utlenione w pozycji 21

Utlenianie grupy 21-metylowej tetraoctanem ołowiu

Różne związki tego typu można otrzymać w sekwencji reakcji, w których pregnan-20-on utleniany jest tetraoctanem ołowiu do pochodnej 21-acetoksy, której hydroliza prowadzi do 21-alkoholu, który można acylować odpowiednią pochodną kwasu karboksylowego np. bezwodnikiem lub chlorkiem kwasowym lub innym reagnetem zdolnym do podstawienia atomu wodoru grupy hydroksylowej np. chlorkiem metanosulfonylowym.

182 898

Pregnan-17-eny

Związki te mogą być otrzymywane w reakcji 17-ketosteroidu z reagentem Wittiga np. ylidem otrzymanym przez działanie silnej zasady takiej jak t-butoksylan potasu na bromek n-propylotrifenylofosfoniowy.

3,20-Diole

Pregnan-3,20-diol można otrzymać poprzez addycję wodorku boru np. broetanu do wiązania podwójnego pregan-17-enu i następnie utlenienie powstałego związku boroorganicznego np. alkalicznym nadtlenkiem wodoru dając 20-oL Alternatywnie, pregnan-3,20-diole można otrzymywać poprzez redukcję grupy ketonowej w pozycji 20 do 20-olu. Dogodnymi reagentami są tu reagenty wodorkowe, takie jak borowodorek sodu lub rozpuszczone metale np. sód w n-propanolu itp.

Przy kłady

Przykład 1

20-ketal 3a-hydroksy-5 P-pregnan-20-onu

Mieszaninę 3a-Hydroksy-5p-pregnan-20-onu (10,8 g, 34 mmol), glikolu etylenowego (45 ml) oraz ortomrówczanu trietylu (30 ml) mieszano w temperaturze pokojowej przez 5 min. Następnie dodano kwas p-toluenosulfonowy (200 mg) i kontynuowano mieszanie przez 1,5 godziny. Otrzymaną gęstą pastę wylano do nasyconego roztworu NaHCO₃ (250 ml). Wytrącony osad odsączono, dokładnie przemyto zimną wodą i suszono. Taki półsuchy produkt rozpuszczono w CH₂C1₂ (350 ml) i suszono nad bezw. K₂CO₃. Roztwór ketalu następnie odsączono i użyto do następnego etapu.

b. 20-ketal 5p-pregnan-3,20-dionu

Powyższy roztwór 20-ketalu 3a-hydroksy-5P-pregnan-20-onu w CH₂CI₂ mieszano z N-tlenkiem-N-metylomorfoliny (8,8 g, 75 mmol) oraz sproszkowanymi sitami molekularnymi 48 (58 g) pod azotem przez 15 minut. Następnie dodano nadrutenian tetrapropyloamoniowy (400 mg) i kontynuowano mieszanie w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Powstałą ciemnozieloną mieszaninę przepuszczono przez krótką kolumnę z Florisilem i eluowano CH₂C1₂. Frakcje zawierające produkt (TLC) połączono i odparowano. Surowy produkt krystalizowano z mieszaniny EtOAc:Hx (1:1) uzyskując związek tytułowy (10,3 g) w postaci podłużnych kryształów.

c. Otrzymywanie reagenta litowego z 1,2-dibromoetylenu

100 ml trójszyjną kolbę wyposażoną w bełkotkę do N₂, termometr i wkraplacz napełniono 1,2-dibromoetylenem (mieszanina cis/trans, 98%, Aldrich, 0,164 ml, 2 mmol, mw=186, d=2,246). Dodano suchy THF (15 ml) i roztwór oziębiono do temperatury -78°C za pomocą łaźni aceton-suchy lód. W ciągu 10 minut wkroplono n-BuLi (2,5 M w THF, 1,6 ml, 4 mmol). Mieszanie w tej temperaturze kontynuowano przez 1 godzinę i powstały reagent użyto niezwłocznie do następnego etapu.

d. 3 β-etynylo-3cc-hydroksy-5 P-pregnan-20-on

Do powyższego roztworu reagenta w THF o temperaturze -78°C wkroplono roztwór 20-ketalu 5P-pregnan-3,20-dionu (180 mg, 0,5 mmol) w THF (15 ml). W czasie dozowania utrzymywano temperaturę poniżej -70°C. Mieszanie kontynuowano w tej temperaturze przez 15 minut (100% konwersji w oparciu o TLC). Usunięto łaźnię chłodzącą i powstały roztwór potraktowano 2N HC1 (pH 6). Usunięto rozpuszczalnik, a pozostałość rozpuszczono w acetonie (10 ml). Po dodaniu 2N HC1 (4 ml) roztwór mieszano w temperaturze otoczenia przez 0,5 godziny. Mieszaninę zobojętniono rozcieńczonym roztworem NaHCO₃. Wytrącone ciało stałe (158 mg, 93%) odsączono, przemyto wodą i suszono. Surowy produkt oczyszczono następnie przez krystalizację z EtOAc lub z mieszaniny aceton-heksan otrzymując związek tytułowy; t.t. 196-197°C, TLC-R_f 0,45 (heksan:aceton 7:3).

Przykład 2

Sól dwusodowa bis(hemibursztynianu) 3a,20p-dihydroksy-5p~pregnanu

Do zawiesiny 3a,20P-dihydroksy-5p-pregnanu (Steraloids; 250 mg, 0,78 mmol) w 5 ml suchej pirydyny dodano bezwodnik bursztynowy (200 mg, 2,0 mmol). Mieszaninę ogrzewano

182 898 w temperaturze 100°C przez 10 godzin. Dodatkowe 6 mmoli bezwodnika bursztynowego dodano w trzech porcjach w czasie ogrzewania mieszaniny reakcyjnej. Ciemną mieszaninę zatężono (0,05 mmHg, 30°C) usuwając rozpuszczalnik i następnie ogrzewano do 90°C (0,05 mmHg) w celu usunięcia nadmiaru bezwodnika bursztynowego. Pozostałość rekrystalizowano ż mieszaniny eter/heksan otrzymując ciało stałe zawierające głównie kwas bursztynowy. Przesącz zatężono i poddano chromatografii kolumnowej (żel krzemionkowy, elucja mieszaniną 95/5/0,1 Ch₂Cl₂/MeOH/HOAc) otrzymując białe ciało stałe, które rekrystalizowano z mieszaniny eter/heksan. Bis(hemibursztynian), t.t. 81-90°C przeprowadzono w sól dwusodową.

Bis (hemibursztynian) (100 mg, 0,192 mmol) rozpuszczono w minimalnej objętości metanolu. Następnie wkroplono NaHCO₃ (2 równoważniki, 33 mg, 0,393 mmol) w 0,6 ml wody. Po 3 godzinach roztwór zatężono pod próżnią otrzymując białe ciało stałe.

Przykład 3

3a-Hydrosky-3p-trifluorometylo-5a-pregnan-20-on oraz 3|3-Hydroksy-3a-trif[uorometylo-5a-pregnan-20-on

Do roztworu 20-etenyloketalu 5a-pregnan-3,20-dionu (356 mg, 0,987 mmol) w suchym THF (5 ml) dodano 0,5M F₃CSi(CH₃)₃ (w THF; 2,5 ml, 1,25 mmol). Powstały bezbarwny roztwór oziębiono do temperatury 0°C i dodano n-Bu₄NFxH₂O (kilka kryształków). Usunięto łaźnię chłodzącą i obserwowano wydzielanie się gazu (Me₃SiF), natomiast roztwór reakcyjny przybrał barwę żółtą. Kontynuowano mieszanie w temperaturze pokojowej przez 30 minut. TLC (3:1 heksan/aceton) wykazał całkowite zużycie materiału wyjściowego; pojawiła się nowa plamka poruszająca się niemal z czołem rozpuszczalnika. Następnie dodano IN HC1 (~3 ml) i powstałą mieszaninę dwufazową mieszano przez noc w temperaturze pokojowej. TLC (3:1 heksan/aceton) wykazał teraz pojedynczą plamkę o Rf-0,5. Stosując CH₂C1₂ zaobserwowano dwie bliskie planiki, z których górna odpowiada produktowi ubocznemu. Następnie dodano wody i eteru. Warstwę wodną ekstrahowano eterem. Połączone warstwy organiczne przemyto nasyconym NaHCO₃ oraz solanką suszono MgSO₄, odsączono i odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymując białe krystaliczne ciało stałe, które chromatografowano z zastosowaniem CH₂C1₂ jako eluentu.

Odparowanie wczesnych frakcji dostarczyło 3a-hydroksy-33-trifluorometylo-5a-pregnan-20-on (10 mg).

Dalsza elucja z kolumny dała 3p-hydroksy-3a-trifluorometylo-5a-pregnan-20-on (200 mg), który na podstawie ¹⁹F NMR oraz GC-MS również zawierał 1,5% produktu ubocznego (np. 3 a-hydroksy-3p-trifluorometylo-5a-pregnan-20-on). W celu usunięcia zanieczyszczenia zastosowano rekrystalizacją z gorącego układu heksan/octan etylu 60:40 lecz nie uzyskano kryształów. W końcu 3p-hydroksy-3a-trifluorometylo-5a-pregnan-20-on wysokiej czystości (145 mg) uzyskano w wyniku dodatkowej chromatografii z zastosowaniem CH₂C1₂,1.1. 181-3°C.

Przykład 4

[3-Hydroksy-3a-etenylo-5 P-pregnan-20-on oraz 3a-Hydroksy-3 β-etenylo-S β-pregnan-20-on

Do roztworu 20-ketalu 53-pregnan-3,20-dionu (1,18 g, 3,3 mmol) w suchym THF (20 ml) dodano bromek winylomagnezowy (IM w THF, 3,7 mmol, 3,7 ml) w temperaturze -70°C. Następnie mieszano roztwór reakcyjny w tej temperaturze przez 5 minut i następnie w temperaturze pokojowej przez 2,5 godziny. Następnie dodano nas. roztwór NH₄C1 (10 ml). Rozpuszczalnik usunięto, a pozostałość ekstrahowano EtOAc. Warstwę organiczna przemyto wodą, rozcieńczonym NaHCO₃, wodą oraz solanką. Po wysuszeniu nad bezwodnym MgSO₄ roztwór odsączono i odparowano uzyskując produkt surowy (1,2 g). Produkt ten rozpuszczono w acetonie (20 ml). Po dodaniu IN HC1 (10 ml) roztwór mieszano w temperaturze pokojowej przez 15 godzin. Rozpuszczalniki usunięto, a pozostałość ekstrahowano CH₂C1₂. Warstwę organiczną przemyto wodą rozcieńczonym NaHCO₃, wodą oraz solanką. Po wysuszeniu nad bezwodnym MgSO₄ roztwór odsączono i odparowano uzyskując produkt surowy (890 mg). Produkt surowy rozpuszczono w małej ilości CH₂C1₂ i naniesiono na kolumnę z żelem krze

182 898 mionkowym. Podczas elucji układem toluen:aceton (94:6) otrzymano 3P-Hydroksy-3a-etenylo-5P-pregnan-20-on (126 mg) jako pierwszą frakcję. Dalsza elucja tym samym układem rozpuszczalników dała 3a-Hydroksy-3p-etenylo-5P-pregnan-20-on (189 mg), 1.1. 113-116°C.

Przykład 5

a. 3a-Hydroksy-5a-androstanon-17

Do roztworu 3p-hydroksy-5a-androstanonu-17 (6 g) i azodikarboksylanu dietylowego (5,04 g) w THF dodano kwas trifluorooctowy (3,3 g); mieszanina zabarwiła się na żółto. Wtedy dodano trifenylofosfinę (7,6 g). Reakcja stała się bezbarwna i rozgrzała się . Po 5 minutach dodano benzoesan sodowy i wodę (100 ml). Mieszaninę ekstrahowano chlorkiem metylenu (3x80 ml) i warstwy organiczne wysuszono siarczanem magnezu. Rozpuszczalnik usunięto w próżni i surowy związek hydrolizowano wodorotlenkiem potasowym (10%, 10 ml) w metanolu (150 ml) przez 1 godzinę. Większość metanolu usunięto w próżni a pozostałość poddano podziałowi pomiędzy chlorek metylenu i roztwór chlorku amonowego. Produkt (4,7 g, 78%) oczyszczono chromatograficznie (CH₂C1₂:aceton = 9:1).

b. 3a-Hydroksy-21-metylo-5a-pregnen-17(20) (Z)

3a-Hydroksy-5a-androstanon-17 (2 g, 6,9 mmol) dodano do odczynnika Wittiga, przygotowanego z bromku propylotrifenylofosfoniowego (13,3 g) i /-butanolanu potasowego (3,9 g) w THF (20 ml). Reakcję ogrzewano do wrzenia przez 12 godzin i ochłodzono do temperatury 25°C. Dodano roztwór chlorku amonowego (60 ml) i warstwę organiczną oddzielono w rozdzielaczu. Warstwę wodną ekstrahowano chlorkiem metylenu (2x50 ml). Roztwór organiczny wysuszono nad węglanem potasowym i rozpuszczalnik usunięto w próżni. Surowy produkt oczyszczano chromatograficznie (aceton:chlorek metylenu:heksan=l:2:7) otrzymując 0,84 g produktu (39%). Stanowił on mieszaninę Z i E izomerów (Z:E= 13:1).

c. 3a-t-Butylodimetylosililoksy-21-metylo-5a-pregnen-17 (20) (Z)

Mieszaninę 5a-3a-hydroksy-21-metylopregnenu-17 (20) (Z) (0,84 g, 2,66 mmol), TBDMSC1 (1,2 g, 8,0 mmol) i imidazolu (0,91 g, 13,3 mmol) w chlorku metylenu (10 ml) i DMF (30 ml) mieszano przez 12 godzin i dodano chlorek amonowy. Całość ekstrahowano chlorkiem metylenu (3x40 ml) i przemyto solanką (50 ml). Roztwór organiczny wysuszono nad węglanem potasowym odparowano rozpuszczlanik i stwierdzono, że wciąż jest obecny DMF. Rozpuszczono zatem pozostałość w eterze i przemyto solanką (2x50 ml) i suszono węglanem potasowym. Chromatografia w heksanie dała czysty produkt 1,14 g (100%).

d. 3a-t-Butylodimetylosililoksy-20a-hydroksy-21 -metylo-5apregnan

Do roztworu 3a-t-butylodimetylosililoksy-21-metylo-5a-pregnenu-17 (20) (Z) (1,14 g, 2,66 mmol) w THF (30 ml) wkroplono kompleks diboran-THF (IM roztwór w THF, 5,3 ml) w temperaturze 0°C. Reakcję pozostawiono do osiągnięcia 25°C na 1 godzinę. Potem dodano, bardzo wolno, w temperaturze 0°C, roztwór wodorotlenku sodowego (20%, 10 ml) i następnie nadtlenek wodoru (30%, 10 ml). Dodany wodny roztwór chlorku amonowego i warstwę THF oddzielono w rozdzielaczu. Warstwę wodna ekstrahowano eterem (2x40 ml). Roztwór organiczny wysuszono węglanem potasowym i rozpuszczalnik odparowano w próżni. Czysty produkt otrzymano chromatograficznie (0,52 g, 44%).

e. 3a,20a-dihydroksy-21-metylo-5a-pregnan

Roztwór przygotowany przez zmieszanie HF (48%, 5 ml) i CH₃CN (30 ml) wprowadzono do kolby zawierającej 3a-t-butylo-dimetylosililoksy-20a-hydroksy-21-metylo-5a-pregnan (0,51 g); pojawił się bezbarwny osad. Mieszaninę reakcyjną mieszano przez 1 godzinę i przesączono. Bezbarwny osad przemyto eterem trzy razy, co dało zadowalający wynik analityczny (0,3 g, 79%), 1.1. 227-231°C.

Przykład 6

3α,21 -Dihydroksy-3 P-trifluorometylo-5 β-l 9-norpregnanon-20

Do roztworu 3a-hydroksy-33-trifluorometylo-5P-19-norpregnanonu-20 (300 mg, 0,87 mmol) w toluenie (15 ml) dodano MeOH (1 ml) i BF₃Et₂O (1,4 ml, 11,3 mmol). Uzyskaną mieszaninę ochłodzono do temperatury 0°C i dodano Pb (OAc)₄ (0,54 g, 1,21 mmol). Mieszaninę reakcyjną ogrzano do 25°C w trakcie 45 minutowego mieszania; dodano roztwór

182 898

NaFICO₃ (nasycony, 30 ml) kontynuując mieszanie przez 1 godzinę. Całość przeniesiono do rozdzielacza z wodą (50 ml) i ekstrahowano eterem (3x40 ml). Roztwory eterowe przemyto solanką (50 ml) i wysuszono nad węglanem potasowym. Surowy produkt, otrzymany po usunięciu rozpuszczalnika rozpuszczono w MeOH (25 ml) i dodano roztwór K₂CO₃ (nasycony, 8 ml). Reakcję mieszano przez 5 godzin a następnie przeniesiono do rozdzielacza zawierającego 50 ml wody. Ekstrahowano CH₂C1₂ (3x30 ml). Połączone ekstrakty wysuszono nad węglanem potasowym a surową masę oczyszczono chromatograficznie otrzymując produkt (160 mg) obok 21-metoksy, ubocznie powstałego, (40 mg). Produkt dalej oczyszczano poprzez krystalizacje z 10% acetonu w heksanie otrzymując 88 mg czystego związku (28%), bezbarwnego ciała stałego, 1.1. 140-142°C.

Przykład 7

3P-Etynylo-3a,20a-dihydroksy-5 β-pregnan i 3 p-etynylo-3a,20[3-dihydroksy-5β-pregnan

Do roztworu 3P-etynylo-3a-hydroksy-5p-pregnanonu-20 (0,31 g, 0,91 mmol) w metanolu (20 ml) dodano borowodorek sodowy (200 mg, 5,3 mmol) i całość mieszano w temperaturze 25°C przez 1 godzinę. Następnie dodano roztwór chlorku amonowego (50 ml) i mieszaninę ekstrahowano CH₂Cl₂ (3x30 ml). Chromatografia (EtOAc:heksan=3:7) dała 3-etynylo-3a,20p-dihydroksy-5p-pregnan (200 mg, 65%) jako główny produkt, 1.1. 221-223°C. Ubocznie powstały, 3 β-etyny lo-3a,20a-dihydroksy-5 β-pregnan został oczyszczony przez kolejną chromatografię (25-30% octan etylu w heksanie, 16 mg, 5%), 1.1. 187-188°C.

Przykład 8

3α,21 -Dihydroksy-3 β-etyny lo-5 β-pregnanon-20 i 3a-hydroksy-3 β-etyny lo-21 -metoksy-5 β-pregnanon-20

Do roztworu 21-octanu 3a,21-dihydroksy-3 β-etynylo-5β-pregnanonu-20 (725 mg, 1,81 mmol) w 45 ml metanolu w temperaturze 0°C, dodano wodny roztwór K₂CO₃ (3,75 ml). Po 30 minutach mieszania w temperaturze pokojowej, mieszaninę ponownie ochłodzono do 0°C i dodano 2N wodny HOAc (1,8 ml). Reakcje przeniesiono do mieszaniny EtOAc/woda. Warstwę wodną dwukrotnie ekstrahowano EtOAc i połączone frakcje przemyto solanką wysuszono (Na₂SO₄) i zatężono. Oczyszczanie metodą chromatografii typu flash (20 cm żelu krzemionkowego w kolumnie o średnicy 4 cm, eluowanego 2 litrami 20% acetonu w heksanie) dało 582 mg (90%) diolu w postaci bezbarwnego ciała stałego, 1.1. 155,5-157°C.

W syntezie prowadzonej w większej skali, mniej polarne zanieczyszczenia zostały wydzielone, 1.1. 176-178,5°C i okazały się być 3ot.-hydroksy-3β-etynylo-21-metoksy-5β-pregnanonem-20, prawdopodobnie powstałym jako produkt uboczny w syntezie 21-octanu.

Przykład 9 βEtenylo-3cc-hydroksy-5α-pregnanon-20 i 3 β-etenylo-3 β-hydroksy-5α-pregnanon-20

Na roztwór 20-ketalu 5a-pregnandionu-3,20 (720 mg, 2 mmol) w suchym THF (20 ml) podziałano bromkiem winylomagnezowym (IM w THF, 4 mmol, 4 ml) w temperaturze -78°C. Po 5 godzinach mieszania w tej temperaturze, reakcję zakończono dodając roztwór 2N HC1 (2 ml). Rozpuszczalnik usunięto a pozostałość rozpuszczono w acetonie (25 ml). Po dodaniu 2N HC1 (10 ml), roztwór mieszano w temperaturze pokojowej przez 15 godzin. Rozpuszczalniki usunięto a pozostałość ekstrahowano CH₂C1₂. Warstwę organiczną przemyto wodą rozcieńczonym roztworem NaHCO₃, wodą i solanką. Po wysuszeniu nad MgSO₄, roztwór przesączono i odparowano otrzymując surowy produkt (1 g). Rozpuszczono go w małej ilości CH₂C1₂ i naniesiono na kolumnę z żelem krzemionkowym. Elucja mieszaniną toluen:aceton (95:5) dała jako pierwszy, 3β-etenylo-3α-hydroksy-5α-pregnanon-20 (250 mg), t. t. 163-165°C. Dalsza elucja tą samą mieszaniną rozpuszczalników dostarczyła 3β-etenylo-3 β-hydroksy-5oc-pregnanon-20 (150 mg).

Przykład 10

3a-Hy droksy-3 β-trifluorometylo-5 β-19-norpregnanon-20

Do roztworu 3α-hydroksy-3β-trifluorometylo-5α-19-norpregnenu-17 (20) (Z) (2,6 g, 7,3 mmol) w TFIF (80 ml), wkroplono kompleks diboran-THF (IM roztwór w THF, 22ml) w temperaturze 25°C. Reakcja dobiegła do końca w ciągu 1 godziny, po czym dodano bardzo

182 898 wolno w 0°C roztwór wodorotlenku sodowego (20%, 50 ml), a następnie nadtlenek wodoru (30%, 30 ml). Dodano wodę a warstwę THF oddzielono w rozdzielaczu. Warstwę wodną ekstrahowano chlorkiem metylenu (2x40 ml). Organiczny roztwór wysuszono węglanem potasowym i rozpuszczalnik usunięto w próżni. Szybkie przepuszczenie przez kolumnę (heksan:aceton 1:1) dało 1,8 g produktu poddanego następnie utlenianiu PCC (PCC, 2,1 g, 9,6 mmol; octan sodowy, 0,8 g, 9,6 mmol). Czysty produkt (700 mg, 26%) oczyszczano na kolumnie chromatograficznej stosując octan etylu i heksan (15:85); 1.1. 151,5-153,0°C.

Przykład 11

a. 3(R)-Spiro-2'-oksiran-5a-173-hydroksyandrostan

Mieszaninę jodku trimetylosulfoniowego (6,82 g, 31 mmol) i /-butanolami potasowego (3,5 g, 31 mmol) ogrzewano do wrzenia w THF (30 ml) przez 1,5 godziny a następnie ochłodzono do temperatury 25°C. Dodano 17p-hydroksy-5a-androstanon-3 (3 g, 10,3 mmol) i mieszając reakcję prowadzono w 25°C przez 2 godziny. Następnie dodano wodę i mieszaninę wyekstrahowano eterem (3x80 ml). Ekstrakt wysuszono nad węglanem potasowym, a po usunięciu rozpuszczalnika uzyskano 3 g zupełnie czystego produktu (wydajność surowego produktu 96%), który został użyty w następnym etapie.

b. 3 β-Metylo-3a-hydroksy-5a-androstanon-17

Do roztworu 3(R)-spiro-2'-oksiran-5a-17p-hydroksyandrostanu (3 g, 9,9 mmol) w THF (50 ml), pod argonem, dodano wodorek litowoglinowy (LAH IM roztwór w THF, 10 ml); mieszaninę ogrzewano do wrzenia przez 5 minut i ochłodzono do 25°C. Dodano roztwór chlorku amonowego (wodny, nasycony, 70 ml) i mieszaninę ekstrahowano CH₂C1₂ (3x70 ml). Roztwór organiczny wysuszono nad węglanem potasowym i dodano AMlenek 4-metylomorfoliny (2,9 g, 25 mmol) oraz sproszkowane sita molekularne (4A, 10 g). Mieszaninę mieszano przez 20 minut i dodano nadrutenian tetrapropyloamoniowy (200 mg). Reakcja dobiegała końca po 1,5 godziny i mieszaninę reakcyjną przesączono przez Florisil, przepłukany następnie mieszaniną CH₂C1₂ i eteru (1:2). Uzyskany materiał oczyszczano przez chromatografię (30% EtOAc w heksanie) otrzymując produkt (2,5 g, 83%).

c. 3p,21-Dimetylo-3cc-hydroksy-5a-pregnen-17 (20) (Z)

Do odczynnika Wittiga, przygotowanego drogą mieszania przez 30 minut bromku n-propylotrifenylofosfoniowego (2,55 g, 6,6 mmol) i r-butanolanu potasowego (0,75 g, 6,6 mmol) w THF (20 ml), dodano 3p-metylo-3a-hydroksy-5a-androstanon-17 (0,5 g, 1,65 mmol) i mieszaninę ogrzewano do wrzenia przez 18 godzin. Czysty produkt (420 mg, 77%) otrzymano w wyniku chromatografii (20% EtOAc w heksanie).

d. 3ct,20a-Dihydroksy-3 β,21 -dimetylo-5a-pregnan

Do roztworu 3β,21-dimetylo-3α-hydroksy-5α-pregnenu-17 (20) (Z) (0,42 g, 1,27 mmol) w THF (30 ml) wkroplono kompleks diboranu i THF (IM roztwór w THF, 2,6 ml) w temperaturze 0°C. Reakcję pozostawiono do ogrzania się do 25°C w ciągu 2 godzin. Zatem dodano bardzo powoli roztwór wodorotlenku sodowego (2N, 10 ml) w 0°C, a następnie nadtlenek wodoru (30%, 10 ml). Reakcję mieszano w 25°C przez 1 godzinę. Dodano wodny roztwór chlorku amonowego i warstwę THF oddzielono w rozdzielaczu. Warstwę wodną wyekstrahowano CH₂C1₂ (2x40 ml). Roztwór organiczny wysuszono nad węglanem potasowym i rozpuszczalnik usunięto w próżni. Produkt otrzymano po chromatografii kolumnowej (0,17 g, 38%). Dalsze oczyszczanie drogą krystalizacji doprowadziło do uzyskania 110 mg produktu, 1.1. 200-203°C.

Przykład 12

3oc,21 -Dihydroksy-3 β-trifluorometylo-5 β-pregnanon-20

Roztwór octanu 3a,21 -dihydroksy-3β-trifluorometylo-5β-pregnanonu-20 (1,36 g, 3,06 mmol) w MeOH (75 ml) ochłodzono do temperatury 0°C. Następnie wkroplono roztwór K₂CO₃ (10% wodny, 6,45 ml, 4,67 mmol). Po 1,5 godziny mieszania w 0°C, dodano roztwór kwasu octowego (2N wodny, 2,5 ml, 5,0 mmol) i mieszaninę pozostawiono do osiągnięcia temperatury pokojowej.

182 898

Dodano EtOAc, CH₂C1₂, wodę (po 100 ml) i starannie mieszano. Fazę organiczna oddzielono, przemyto wodnymi roztworami NaHCO₃ i NaCl, wysuszono nad MgSO₄ i odparowano w próżni. Pozostałość oczyszczono za pomocą chromatografii kolumnowej typu flash (heksan/EtOAc 3:1) otrzymując bezbarwne ciało stałe (973 mg, 79%), 1.1. 148-150°C.

Przykład 13

Sól sodowa 21-monobursztynianu 3a,21-dihydroksy-3p-etynylo-5p-pregnanonu-20

Na roztwór 3a,21-dihydroksy-3p-etynylo-5[3-pregnanonu-20 (535 mg, 1,49 mmol) w 2 ml suchej pirydyny, w 0°C, podziałano stałym bezowdnikiem bursztynowym (1,2 równoważnika; 180 mg, 1,80 mmol). Po ogrzaniu do temperatury pokojowej, reakcję mieszano przez 48 godzin. Usunięcie rozpuszczalnika w próżni i triturowanie otrzymanej pozostałości z użyciem heksanu (2x20 ml) dało gumowate ciało stałe, które rozpuszczono w miarę możliwości w CH₂C1₂ i naniesiono na warstwę żelu krzemionkowego wysokości 13 cm znajdującego się w kolumnie o średnicy 2 cm. Eluowanie z zastosowaniem gradientu od 5% aceton/CH₂Cl₂ do 100% acetonu doprowadziło do uzyskania 667 mg pożądanego kwasu.

W celu usunięcia soli pirydyniowych, kwas rozpuszczono w EtOAc i ekstrahowano ochłodzonym w lodzie 0,01 N wodnym roztworem HC1 (30 ml). Warstwę organiczną wysuszono Na₂SO₄ i zatężono. Pozostałość, 633 mg, 1.1. 62-68°C, rozpuszczono w metanolu i dodano wodny roztwór 116 mg (0,253 mmol) NaHCO₃. Mieszano przez 3,5 godziny, następnie usunięto rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałość triturowano mieszaniną eter/heksan. Otrzymane jasno żółte ciało stałe, ważące 616 mg, rozpuszczało się w wodzie w stopniu > 20 mg/ml.

Przykład 14

3P-Fluorometylo-3a-hydroksy-5a-pregnanon-20

Mieszaninę n-Bu₄NF x H₂O (7,873 g) i benzenu ogrzewano do wrzenia przez noc pod nasadką Dean-Starka. Następnie mieszaninę, nie będącą klarownym roztworem, zatężono (pod normalnym ciśnieniem) do ~10 ml i pozostawiono do osiągnięcia temperatury pokojowej. Do tego zatężonego roztworu dodano roztwór ketalu etylenowego 3(R)-5a-pregnan-spiro-2'-oksiranonu-20 (2,55 g, 6,81 mmol) w suchym benzenie (15 ml + 5 ml na spłukanie), poprzez igłę dwustronną. Otrzymany roztwór zatężono do objętości ~10 ml, z zastosowaniem aparatu do skróconej destylacji, i ogrzewano do wrzenia przez 15 minut. Dodano suchy benzen (5 ml), ze względu na trudności z naniesieniem tego stężonego roztworu reakcyjnego na płytę do TLC. TLC (100:1 CH₂Cl₂/aceton lub 3:1 heksan/aceton) wykazała, poza dwiema mniej polarnymi plamkami, pewną ilość wyjściowego materiału. Mieszaninę reakcyjną ponownie zatęzono i ogrzewano do wrzenia przez 30 minut; TLC (po rozcieńczeniu mieszaniny benzenem) obecnie wykazała prawie całkowity zanik wyjściowego epoksydu. Jak uprzednio, mieszaninę zatężono i ogrzewano do wrzenia przez chwilę. Należy tu zaznaczyć, że ta reakcja zachodzi tylko wtedy gdy mieszanina jest bardzo stężona. Po osiągnięciu przez mieszaninę temperatury pokojowej (co prowadzi do pojawienia się jasnożółtego ciała stałego), dodano wodę i eter. Ponieważ substancja stała nie rozpuściła się, dodano jeszcze CH₂C1₂. Warstwę widna ponownie ekstrahowano CH₂C1₂. Połączone ekstrakty organiczne przemyto wodą (x2), wysuszono (Na₂SO₄), przesączono i odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymując bezbarwne ciało stałe (3,33 g), które, jak wykazał 'H NMR, była mieszanina ketalu etylenowego 3β-Αυorometylo-3a-hydroksy-5a-pregnanonu-20 i ketalu etylenowego 3a-fluoro-3p-hydroksymetylo-5a-pregnanonu-20.

Celem zhydrolizowania ketalu, do powyższej substancji stałej dodano aceton (100 ml), wodę (5 ml) i -p-TsOH-H₂O (143 mg, 0,752 mmol). Wartość pH została nastawiona poprzez dodanie HC1 do osiągnięcia odczynu słabo kwaśnego. Mieszaninę ogrzewano przez moment za pomocą dmuchawy elektrycznej do otrzymania klarownego roztworu, który mieszano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Mieszanina stała się mętna, więc dodano CH₂C1₂ celem otrzymania klarownego roztworu. TLC wykazało zakończenie reakcji. Rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując bezbarwne ciało stałe, do którego dodano CH₂C1₂ i wodę. Warstwę wodną ponownie ekstrahowano CH₂C1₂. Połączone warstwy

182 898 organiczne przemyto nasyconym roztworem wodnym NaHCO₃, wysuszono (MgSO₄), przesączono i odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem dostarczając bezbarwne krystaliczne ciało stałe (2,5 g), które, jak wykazało jego 'H NMR, było mieszanina 4:1 3a-fluorometylo-3 a-hydroksy-5a-pregnanonu-20 i 3a-fluoro-3p-hydroksymetylo-5a-pregnanonu-20. Chromatografia kolumnowa typu flash, tej mieszaniny, z CH₂C1₂ jako eluentem, dała pożądany 3p-fluorometylo-3a-hydroksy-5a-pregnanon-20 (1,41 g, 59%) 1.1. 201-203°C.

Przykład 15

P-Etynylo-3cc,20a-dihydroksy-5a-pregnan i 3 β-etynylo-3a,20p-dihydroksy-5a-pregnan

Do roztworu 3p-etynylo-3a-hydroksy-5a-pregnanonu-20 (0,32 g, 0,94 mmol) w metanolu (20 ml) dodano borowodorek sodowy (200 mg, 5,3 mmol) i całość mieszano w temperaturze 25°C przez 1 godzinę. Następnie dodano roztwór chlorku amonowego (50 ml) i mieszaninę ekstrahowano CH₂C1₂ (3x30 ml). Chromatografia (EtOAc:heksan = 3:7) dała w wyniku jako główny produkt, 3p-etynylo-3a,20p-dihydroksy-5a-pregnan (192 mg, 60%), t. t. 195,5-197,5%°C; oraz jako produkt uboczny, 3p-etynylo-3cc,20a-dihydroksy-5cc-pregnan (19 mg, 6%), 1.1. 210-215°C (rozkład).

Przykład 16

Bis(monobursztynian) 3a,20-dihydroksy-21 -metylo-5a-pregnanu

Do wysuszonej kolby zawierającej 3a,20a-dihydroksy-21-metylo-5a-pregnan (350 mg, 1,05 mmol) dodano pirydynę (bezwodną, 5 ml) i następnie bezwodnik bursztynowy (1 g, 10 mmol). Mieszaninę ogrzewano w łaźni olejowej w 100°C przez 20 godzin a następnie ochłodzono do 25°C. Wymieszano z roztworem HC1 (IN, 70 ml), całość ekstrahowano EtOAc (3x40 ml) a ekstrakty wysuszono nad Na₂SO₄. Produkt (0,54 g) uzyskano w wyniku chromatografii (7% MeOH i 0,3% HOAc w CH₂C1₂) i dalej oczyszczano za pomocą krystalizacji z EtOAc, otrzymując 334 mg produktu (60%), 1.1. 159-162,5°C.

Przykład 17

a. 3,3-Etylenodioksy-5p-pregnanem-17 (20) (Z)

5p-3-Etylenodioksyandrostanon-17 (6 g) wprowadzono do odczynnika Wittiga otrzymanego z bromku etylotrifenylofosfoniowego (15 g) i /-butanolanu potasowego (4,5 g) w THF (15 ml). Reakcję prowadzono we wrzeniu przez 2 godziny i ochłodzono do temperatury 25°C. Następnie dodano chlorek metylenu (80 ml) oraz roztwór chlorku amonowego (60 ml) i warstwę organiczną oddzielono w rozdzielaczu. Warstwę wodną ekstrahowano chlorkiem metylenu (2x50 ml). Roztwór organiczny wysuszono nad węglanem potasowym a rozpuszczalnik usunięto w próżni. Większość tlenku fosforowego została usunięta przez przemywanie heksanem. Otrzymany produkt (6 g) rozpuszczono w acetonie (100 ml) i dodano kwas solny (2N, 10 ml). Surowy produkt (5,5 g) otrzymany drogą podstawowej przeróbki i ekstrakcji chlorkiem metylenu oczyszczono chromatograficznie otrzymując 4,5 g związku (83%). Czysty stereoizomer otrzymano drogą wielokrotnej krystalizacji z heksanu.

b. 3cc-Hydroksy-3p-trifluorometylo-5p-pregnen-17 (20) (Z)

Do roztworu 5p-pregnen-17 (20) (Z)-onu-3 (950 mg, 3,17 mmol) w THF (15 ml) dodano w temperaturze 0°C trifluorometylotrimetylosilan (0,5 M roztwór w THF, 9,5 ml). Roztwór stawał się stopniowo brązowy i reakcja była zakończona w ciągu 30 minut. Dodano wodę i zebrano warstwę organiczną. Warstwę wodną ekstrahowano eterem (3x50 ml) i roztwór organiczny suszono nad węglanem potasowym. Czysty produkt (680 mg, 58%) otrzymano w wyniku chromatografii kolumnowej stosując jako eluent octan etylu i heksan (1:9).

Przykład 18

a. 3cc-Hydroksy-5 β-pregnen-11 -on-20

Do roztworu 5 β-pregnen-ll-dionu-3,20 (Sigma, 1,5 g, 4,77 mmol) w THF (40 ml) dodano powoli, w ciągu 15 minut, wodorek tri-t-butoksylitowoglinowy (1 M w THF, 5,7 mmol) w temperaturze -78°C. Mieszaninę reakcyjną pozostawiono na 12 godzin do osiągnięcia 25°C. Mieszaninę poddano podziałowi pomiędzy eter i roztwór chlorku amonowego, a otrzymany surowy związek był oczyszczany przez chromatografię kolumnową (10-20% acetonu w heksanie, 1,3 g, 86%).

182 898

b. 3a-Hydroksy-5p-20,20-etylenodioksypregnen-l 1

Do mieszaniny 3a-hydroksy-5p-pregnen-ll-onu-20 (1,3 g), glikolu etylenowego (8 ml) i ortomróczanu trimetylu (20 ml) dodano kwas p-toluenosulfonowy (0,1 g), i reakcję prowadzono, mieszając, przez 1 godzinę. Typowa przeróbka (kwaśny węglan sodowy i eter) a następnie odparowanie rozpuszczalników dała w wyniku surowy produkt, który oczyszczono chromatograficznie (acetomheksan = 1:4, 1,2 g, 81%).

c. 5p-20,20-Etylenodioksy-5P-pregnen-l l-on-3

Do roztworu 5P-20-etylenodioksypregnen-ll-onu-3 (710 mg, 1,98 mmol) w THF (15 ml) dodano trifluorometylotrimetylosilan (0,5 M roztwór w THF, 6 ml) a następnie fluorek tetrabutyloamoniowy (20 mg) w temperaturze 0°C. Roztwór stawał się stopniowo brązowy i reakcja została zakończona w ciągu 1 godziny. Dodano wodę (30 ml) i zebrano warstwę organiczną. Warstwę wodną ekstrahowano eterem (3x40 ml) i roztwór organiczny wysuszono nad węglanem potasowym. Po odparowaniu rozpuszczalnika uzyskano surowy produkt, który poddano hydrolizie w obecności kwasu solnego (2 N, 5 ml) w acetonie (40 ml). Czysty produkt (554 mg, 73%) wydzielono za pomocą chromatografii kolumnowej stosując jako eluent octan etylu i heksan (1:5). T. t. 160-162,5°C.

Przykład 19

-Octan 3α,21 -dihydroksy-3 P-etynylo-5 p-pregnanonu-20

Zawiesinę 3p-etynylo-3a-hydroksy-5P-pregnanonu-20 (1,00 g, 2,92 mmol) w 35 ml toluenu traktowano 2 ml metanolu. Otrzymany roztwór ochłodzono w wodzie z lodem i dodano czysty BF₃Et₂O (Aldrich; 5,8 ml, 5,02 g, 35,4 mmol). Następnie porcjami dodawano stały czterooctan ołowiu (Aldrich; 1,96 g, 4,42 mmol). Początkowo powstały jasnoczerwony roztwór, w trakcie mieszania w 0°C, staje się jasnobrązowy. Mieszanie kontynuowano przez 3 godziny w temperaturze pokojowej, po czym mieszaninę ponownie ochłodzono do 0°C. Oziębioną mieszaninę reakcyjną dodano do mieszaniny 52 ml nasyconego roztworu NaHCO₃, wody i pokruszonego lodu. Powstałą mieszaninę ekstrahowano EtOAc (2x75 ml). Połączone warstwy organiczne ekstrahowano nasyconym roztworem NaCl, suszono (Na₂SO₄) i zatężono. Surowy produkt oczyszczono za pomocą chromatografii kolumnowej (25 cm żelu krzemionkowego typu flash w kolumnie szerokości 5 cm eluowanego 3 litrami 20% acetonu w heksanie), otrzymując 749 mg (64%) octanu, 1.1. 196-198°C.

Przykład 20

-Octan 3α,21 -dihydroksy-3 p-trifluorometylo-5 p-pregnanonu-20

3a-hydroksy-33-trifluorometylo-5p-pregnanon-20 (1,94 g, 5,02 mmol) rozpuszczono w toluenie (86 ml) i metanolu (5,2 ml) w atmosferze suchego argonu. Za pomocą strzykawki dodano eterat trifluorku boru (10,4 ml, 84,3 mmol). Następnie dodano czterooctan ołowiu (2,89 g, 6,51 mmol). Całość mieszano przez 70 minut, wylano do wody i ekstrahowano trzy razy CH₂C1₂. Połączone fazy organiczne przemyto wodnymi roztworami NaHCO₃ i NaCl, wysuszono nad MgSO₄ i odparowano w próżni, otrzymując jasnożółte ciało stałe (2,18 g). Pozostałość tą oczyszczano stosując chromatografię kolumnową typu flash (CH₂Cl₂/EtOAc 4:1) otrzymując bezbarwne ciało stałe (1,54 g; 69%). T. t. 167-168,5°C.

Przykład 21

3a-Hydroksy-3 3-trifluorometylo-5 P-pregnanon-20

Odsyłacz: Krishnamurti, R.; Bellew, D. R.; Surya Prakash, G. K. J. Org. Chem. 1991, 56, 984.

Do roztworu 20-ketalu etylenowego 5P-pregnandionu-3,20 (60 mg, 0,166 mmol) w suchym THF dodano 0,5 M F₃CSi(CH₃)₃ (w THF; 0,5 ml, 0,25 mmol). Otrzymany przezroczysty roztwór ochłodzono do temperatury 0°C i dodano n-Bu₄NF-xH₂O (kilka kryształków). Usunięto łaźnię chłodzącą i pozwolono aby mieszanina ogrzała się do temperatury pokojowej. W przeciwieństwie do tej samej reakcji z udziałem ketalu-20 etylenowego 5a-pregnandionu-3,20, powyższa reakcja nie zabarwia się na żółto, a także nie następuje wydzielanie się gazu. TLC (3:1 heksan/aceton) nie wykazała powstawania jakiegokolwiek produktu. Kolejno, dodano 0,5 M F₃CSi(CH₃)₃ (w THF; 0,5 ml, 0,25 mmol). Otrzymaną mieszaninę mieszano

182 898 kilka minut w temperaturze pokojowej. TLC wykazała nową plamkę o R_f zbliżonym do 1, a także pewną ilość nie przereagowanego, wyjściowego związku. Dodano zatem więcej 0,5 M F₃CSi(CH₃)₃ (w THF; 0,5 ml, 0,25 mmol). Mieszaninę reakcyjną znowu krótką chwilę mieszano w temperaturze pokojowej. Nie stwierdzono nie przereagowanego, wyjściowego ketonu. Dodano 1 N HC1 (~3 ml) i otrzymaną dwufazową mieszaninę pozostawiono na mieszadle przez noc. Plamka powstała w wyniku trifluorometylowania obecnie całkowicie zanikła, a pojawiły się dwie nowe mniej polarne plamki, z których niżej położona była głównym produktem. Mieszaninę reakcyjna rozcieńczono wodą i eterem. Warstwę wodna oddzielono i wyekstrahowano eterem. Połączone warstwy organiczne przemyto nasyconym NaHCO₃ i solanką, wysuszono (MgSO₄) i odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, otrzymując bezbarwny, krystaliczny (piankowy) produkt stały. ’H NMR oraz ¹⁹F NMR tego związku wykazały obecność dwóch epimerów w proporcji 85:15. Rozdziału obu epimerów dokonano za pomocą chromatografii typu flash stosując 15:1 heksan/aceton.

Uboczny izomer, którego nie charakteryzowano, otrzymany w wyniku odparowania wcześniejszych frakcji, był zapewne 33-hydroksy-3a-trifluorometylo-5p-pregnanonem-20.

Dalsza elucja kolumny pozwoliła uzyskać 3a-hydroksy-3P-trifluorometylo-5p-pregnanon-20.

Przykład 22

3a-Hydroksy-33-trifluorometylo-5P-19-norpregnen-17 (20) (Z)

Do roztworu 5|3-19-norpregnen-17 (20) (Z)-onu-3 (823 mg, 2,88 mmol) w THF (30 ml) dodano trifluorometylotrimetylosilan (0,5 M roztwór w THF, 8,6 ml). Roztwór stopniowo zmienił barwę na brązową i reakcja była zakończona w ciągu 30 minut. Dodano wodę i zebrano warstwę organiczną, Warstwę wodną ekstrahowano eterem (3x50 ml) i organiczny roztwór wysuszono nad węglanem potasu. Czysty produkt (800 mg, 78%) wydzielono na kolumnie chromatograficznej eluując mieszanina octanu etylu i heksanu (1:9)

Przykład 23

-Octan 3α,21 -hydroksy-3 3-metylo-5a-pregnanonu-20

Roztwór 3a-hydroksy-33-metylo-5a-pregnanonu-20 (3,00 g, 9,02 mmol) w suchym toluenie (110 ml) i metanolu (6 ml) ochłodzono do temperatury -75°C w łaźni suchy lód/aceton. Czysty BF₃-Et₂O (Aldrich; 18 ml, 146 mmol) dodano za pomocą strzykawki, a następnie porcjami stały czterooctan ołowiu (4,39 g, 9,90 mmol). Żadna reakcja nie zaszła w temperaturze -75°C i reakcje pozostawiono do ogrzania się do -10°C na okres ponad 4 godzin. Przez dodatkowe 90 minut mieszanina reakcyjna ogrzewała się osiągając 0°C. HPLC wykazało, że substrat jest wciąż głównym składnikiem mieszaniny. Po 1 godzinie w 0°C, mieszaninę reakcyjną ochłodzono do -15°C, dodano następne 1,94 g czterooctanu ołowiu i podwyższono temperaturę do 0°C. Po 30 minutach, HPLC (detektor rozproszeniowy) wykazało obecność produktu i substratu w nieskorygowanej proporcji 10:1, po 45 minutach mieszaninę reakcyjną ochłodzono do -10°C i wylano na mieszaninę 100 ml EtOAc, 165 ml nasyconego roztworu NaHCO₃ i pokruszonego lodu. Warstwę wodną oddzielono i przemyto EtOAc (2x150 ml). Każdą ciekłą warstwę organiczną przemyto dwukrotnie wodą i nasyconym roztworem NaCl. Po wysuszeniu nad Na₂SO₄, rozpuszczalnik odparowano a pozostałość krystalizowano z EtOAc otrzymując 1 g octanu zanieczyszczonego substratem. Ługi pokrystaliczne zatężono w próżni i triturowano dwiema 100 ml porcjami heksanu. Pozostałość po odmyciu heksanem połączono z krystalizowanym materiałem i przekrystalizowano powtórnie. Otrzymane ciało stałe było zanieczyszczone 2,8% substratu (według HPLC). Trzecia krystalizacja dała 1,087 g (wydajność 31 %) octanu zawierającego <2% substratu.

Przykład 24

Sól dwusodowa 21-fosforanu 3a,21-dihydroksy-5p-pregnanonu-20

Do roztworu 21-bromo-3a-hydroksy-53-pregnanonu-20 (1,0 g, 2,5 mmol) w 10 ml THF, w temperaturze pokojowej, mieszając, dodano kwaśny fosforan dibenzylowy (2,1 g, 7,55 mmol) i trietyloaminę (1,085 ml, 7,8 mmol). Reakcję ogrzewano do wrzenia przez 2,5 godziny i ochłodzono do temperatury pokojowej. Dodano dichlorometan (25 ml) i roztwór

182 898 przeniesiono do rozdzielacza, przemyto 1 N HC1, nasyconym wodnym NaHCO₃, wysuszono MgSO₄ i zatężono w próżni otrzymując dibenzylofosforan w postaci surowego oleju (943 mg). Olej ten rozpuszczono w EtOH (50 ml) i dodano kilka kropel kwasu siarkowego. Do kolby wprowadzono 400 mg 5% Pd/C i mieszany roztwór poddano działaniu 1 atm. H₂ w temperaturze pokojowej aż do całkowitego zakończenia reakcji. Katalizator odsączono a roztwór zatężono do sucha. Pozostałość rozpuszczono w 4:1 MeOH:H₂O (20 ml) i miareczkowano do pH 11 za pomocą 2 N NaOH. Dodano następne 50 ml MeOH i odsączono wykrystalizowane, w trakcie przechowywania mieszaniny w temperaturze 0°C, nieorganiczne fosforany. Roztwór zatężono w próżni a pozostałość przemyto gorącym toluenem (~50 ml) i rozpuszczono w minimalnej objętości MeOH. Do tego roztworu dodawano powoli aceton aż do pojawienia się osadu. Mieszaninę poddano odwirowaniu, rozpuszczalnik zdekantowano a mokry osad przeniesiono do fiolki i wysuszono w próżni uzyskując tytułowy związek w postaci higroskopijnego ciała stałego.

Przykład 25

Sól dwusodowa 21-fosforanu 3a,21-dihydroksy-3|3-metylo-5a-pregnanonu-20

Do roztworu 21-bromo-3a-hydroksy-33-metylo-5a-pregnanonu-20 (1,0 g, 2,43 mmol) w 10 ml THF, w temperaturze pokojowej, mieszając, dodano kwaśny fosforan dibenzylowy (2,1 g, 7,3 mmol) i trietyloaminę (1,085 ml, 7,53 mmol). Reakcję ogrzewano do wrzenia przez 4,5 godziny i ochłodzono do temperatury pokojowej. Dodano dichlorometan (25 ml) i roztwór przeniesiono do rozdzielacza, przemyto 1 N HC1, nasyconym wodnym NaHCO₃, wysuszono MgSO₄ i zatężono w próżni otrzymując dibenzylofosforan w postaci surowego oleju (1,205 g). Dibenzylofosforan (790 mg, 1,3 mmol) rozpuszczono w 2:1 EtOH:THF (30 ml) i dodano kilka kropel kwasu siarkowego, dodano 5% Pd/C (180 mg, 20% wagowo) poddano działaniu 50 H₂ pod ciśnieniem 0,35 Mpa w temperaturze pokojowej aż do całkowitego zakończenia reakcji według TLC. Katalizator odsączono a przesącz zatężono. Pozostałość rozpuszczono w 4:1 MEOH:woda (10 ml) i miareczkowano do pH 11 za pomocą 1 M NaOH. Roztwór traktowano acetonem strącając łatwo sączalne osady, po czym mieszaninę ochłodzono do temperatury 0°C i odsączono 260 mg surowego związku. Osad rozpuszczono w 20 ml wody otrzymując mętny roztwór, z którego, po przesączeniu i zatężeniu, uzyskano 220 mg tytułowego związku w postaci bezbarwnego osadu.

Przykład 26

a. 20,20-Etylenodioksy-5a-pregnanon-3

Tytułowy związek otrzymano z wydajnością około 90% wychodząc z 3^hydroksy-5a-pregnanonu-20, postępując tak jak opisano dla związku 5β.

b. 20-Ketal 3β-etynylo-3α-hydroksy-5α-pregnanonu-20 i 20-ketal 3α-etynylo-3β-hydroksy-5cc-pregnanonu-20

W trójszyjnej kolbie pojemności 250 ml, zaopatrzonej we wlot gazu, termometr i chłodnicę, umieszczono kompleks EDA acetylenku litu (2,75 g, 90%, 27,5 mmol). Dodano suchy benzen (60 ml) i, w umiarkowanym tempie, przedmuchiwano przez mieszaninę gazowy acetylen, Mieszaninę ogrzewano następnie w temperaturze 5O-55°C, w łaźni olejowej, i dodawano porcjami 20-ketal 5a-pregnandionu-3,20 (9 g, 25 mmol). Mieszanie kontynuowano w tej temperaturze przez 5 godzin a następnie 17 godzin w temperaturze pokojowej. Uzyskaną zawiesinę ochłodzono do 10°C i traktowano nasyconym roztworem NaCl (5 ml). Rozpuszczalnik odparowano a pozostałość przeniesiono do wody. Nierozpuszczalny w wodzie produkt odsączono, przemyto wodą i wysuszono w próżni. Surowy związek przekrystalizowano z EtOAc otrzymując 20-ketal 3α-etynylo-3β-hydroksy-5α-pregnanonu-20 (3,35 g). Ługi pokrystaliczne odparowano do sucha a pozostałość oczyszczono za pomocą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym. Elucja z użyciem mieszaniny toluemaceton (92:8) dała nie przereagowany wyjściowy keton (1,3 g) a następnie, w drugiej frakcji, 20-ketal 3β-eΐynylo-3a-hydroksy-5a-pregnanon-20 (1,3 g). Dalsze eluowanie z zastosowaniem tej samej mieszaniny rozpuszczalników pozwoliło na wydzielenie bardziej polarnego 20-ketalu 3a-etynylo-3β-hydroksy-5α-pregnanonu-20 (270 mg).

182 898

c. 33-etynylo-3a-hydroksy-5a-pregnanon-20

20-Ketal 3p-etynylo-3a-hydroksy-5a-pregnanonu-20 (550 mg) rozpuszczono w mieszaninie acetonu (20 ml) i 2N HC1 (10 ml) i całość mieszano w temperaturze pokojowej przez 15 godzin. Rozpuszczalniki odparowano a pozostałość ekstrahowano CH₂C1₂. Warstwę organiczną przemyto wodą rozcieńczonym roztworem NaHCO₃, wodą i solanką. Po wysuszeniu nad bezwodnym MgSO₄, roztwór przesączono i odparowano otrzymując surowy produkt (414 mg), który rozpuszczono w małej ilości CH₂C1₂ i naniesiono na kolumnę z żelem krzemionkowym. Elucja mieszaniną toluen:aceton (92:8) dała tytułowy związek (280 mg), t.t. 175-177°C.

d. 3a-Etynylo-3 P-nitrooksy-5a-pregnanon-20

Roztwór 20-ketalu 3o.-etynylo-3P-hydroksy-5a-pregnanonu-20 (2,15 g) w CHC1₃ (45 ml) ochłodzono do temperatury -20°C i podziałano nań bezwodnikiem octowym (20 ml). Następnie dodano dymiący kwas azotowy (4 ml) i całość mieszano w tej temperaturze przez 45 minut. Po ogrzaniu do -5°C, żółty roztwór wylano do mieszaniny 2N NaOH (70 ml) i wody (150 ml), otrzymując roztwór o pH 3-4. Roztwór ten ekstrahowano CHC1₃, przemyto wodą nasyconym roztworem NaHCO₃, solanką wysuszono (MgSO₄) i odparowano otrzymując tytułowy związek w postaci lepkiej masy (3 g), który jako taki został użyty do następnego etapu syntezy.

e. 3p-Etynylo-3a-hydroksy-5a-pregnanon-20 i 3a-etynylo-3[3-hydroksy-5a-pregnanon-20.

Surowy produkt (3 g) z poprzedniego etapu, przeniesiono do mieszaniny THF i wody (30 ml, 1:1), i dodano AgNO₃ (516 mg). Całość mieszano 15 godzin w temperaturze pokojowej, po czym usunięto rozpuszczalniki a pozostałość ekstrahowano CH₂C1₂. Warstwę organiczną przemyto wodą rozcieńczonym roztworem NaHCO₃, wodą i solanką. Po wysuszeniu nad bezwodnym MgSO₄, roztwór przesączono i odparowano, otrzymując surowy produkt (2 g). Rozpuszczono go w małej ilości CH₂C1₂ i naniesiono na kolumnę z żelem krzemionkowym. Elucja mieszaninątoluen:aceton (93:7) dostarczyła 33-etynylo-3a-hydroksy-5cc-pregnanon-20 (550 mg). Dalsza elucja tą samą mieszaniną rozpuszczalników dała bardziej polarny 3a-etynylo-3P-hydroksy-5a-pregnanon-20 (460 mg).

Przykład 27

-Monobursztynian 3cc-21 -dihydroksy-3 p-trifluorometylo-5 P-pregnanonu-20

3o,21-Dihydroksy-3p-trifluorometylo-5p-pregnanon-20 (920 mg, 2,29 mmol), bezwodnik bursztynowy (457 mg, 4,57 mmol) i dimetyloaminopirydynę (14 mg) rozpuszczono w bezwodnej pirydynie, w atmosferze suchego argonu. Po 16 godzinach mieszania dodano więcej dimetyloaminopirydyny (7 mg). Mieszano jeszcze 3 godziny i usunięto rozpuszczalnik pod próżnią. Resztki pirydyny usunięto poprzez odparowywanie z toluenem. Pozostałość oczyszczono stosując chromatografię kolumnową typu flash (CH₂Cl₂/MeOH; gradient 100:1 do 50:1) otrzymując bezbarwną szklistą masę (1,1 g). To nieznacznie zanieczyszczone ciało stałe rozpuszczono w CH₂Cł₂, przemyto wodą (3x50 ml) i wysuszono nad MgSO₄. Rozpuszczalnik odparowano otrzymując bezbarwne ciało stałe (883 mg, 77%).

Przykład 28 β-Etyny lo-3a-hydroksy-5 β-pregnen-11 -on-20

Do roztworu cis/trans dibromoetylenu (236 mg, 1,27 mmol) w 5 ml suchego THF w temperaturze -78°C dodano kroplami BuLi w mieszaninie heksanów (1,6 ml, 2,54 mmol) i całość mieszano przez 30 minut. Następnie temperaturę obniżono do -90°C i dodawano roztwór 5β-pregnen-1 l-on-3,20 w 10 ml THF poprzez kapilarę w ciągu 10 minut; mieszaninę reakcyjną mieszano przez następne 30 minut w temperaturze -90°C a następnie dodano 3 ml nasyconego, wodnego NH₄C1 i mieszano do osiągnięcia temperatury pokojowej. Ilość rozpuszczalnika zmniejszono pod próżnią do ~5 ml, dodano octan etylu i wodę (po 25 ml), warstwę organiczną przemyto wodnym, nasyconym NaCl, wysuszono MgSO₄ i zatężono w próżni otrzymując surową masę. Za pomocą chromatografii typu flash, na 16 cm warstwie żelu krzemionkowego w kolumnie o średnicy 2 cm, z użyciem eluenta toluen:aceton 95:5, zbierając frakcje po 10 ml, wydzielono 142 mg tytułowego związku, t.t. 147-50°C.

182 898

Przykład 29 β-Trifluoromety lo-3a-hydroksy-5cc-19-norpregnanon-20

Związek ten otrzymano jako produkt uboczny w syntezie 3cc-hydroksy-3P-trifluoromety!o-5[3-19-norpregnanonu-20 (w przykładzie 10). Wyodrębniono go z właściwych frakcji chromatograficznych: t.t. 178-179°C.

Przykład 30 β-( 1 -Heptyny lo)-3a-hydroksy-5 3-pregnanon-20

Na roztwór 1-heptynu (0,327 ml, 2,5 mmol) w suchym THF (15 ml), w temperaturze -78°C, podziałano n-BuLi (2,5M w THF, 2,5 mmol, 1 ml). Po 1 godzinie miesza w tej temperaturze, dodano roztwór cyklicznego 20-(1,2-etanodiyl acetalu) 5p-pregnandionu-3,2- (360 mg, 1 mmol) w suchym THF (15 ml) i mieszanie kontynuowano w -78°C przez 1 godzinę. Reakcję zakończono przez dodanie 2N roztworu HC1 (1 ml). Nasycony roztwór NaHCO₃ dodano celem zneutralizowania kwasu. Rozpuszczalniki usunięto a pozostałość rozpuszczono w acetonie (10 ml). Po dodaniu 2N HC1 (10 ml) roztwór mieszano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Roztwór nasycony NaHCO₃ dodano celem neutralizacji kwasu. Rozpuszczalniki usunięto a pozostałość ekstrahowano EtOAc. Warstwę organiczną przemyto wodą, rozcieńczonym roztworem NaHCO₃, wodą i solanką. Po wysuszeniu nad bezwodnym MgSO₄, roztwór przesączono i odparowano, otrzymując surowy produkt (400 mg). Ten surowy produkt rozpuszczono następnie w małej ilości CH₂C1₂ i naniesiono na kolumnę z żelem krzemionkowym. Elucja z użyciem mieszaniny toluen:aceton (93:7) dała 3β-(1 -heptynylo)-3a-hydroksy-5P-pregnanon-20 (260 mg) w postaci bezbarwnego ciała stałego; t.t. 121-123°C.

Analogiczne metody zasotsowano do syntezy: 3p-(l-heksynylo)-3a-hydroksy-53-pregnanonu-20, 3p-(l-oktynylo)-3a-hydroksy-5p-pregnanonu-20, 3|3-cyklopropyloetynylo-3a-hydroksy-5p-pregnanonu-20, 3p-(3-metylobuten-2-ynyl-l)-3a-hydroksy-5p-pregnanonu-20 i 33-(3,3-dimetylobutynylo)-3a-hydroksy-5P-pregnanonu-20.

Przykład 31

P-Cyklopropyloetynylo-3a-hydroksy-5 P-pregnanon-20

a. Cykliczny 20-(1,2-etanodiyl acetal) 3p-(5-Chloro-l-pentynylo)-3a-hydroksy-53-pregnanonu-20

Na roztwór 5-chloropentynu (0,5 ml, 4,8 mmol) w suchym THF (15 ml) działano n-BuLi (2,4M w THF, 4,8 mmol, 2 ml) w temperaturze -60°C. Całość mieszano przez 0,5 godziny w temperaturze -78°C a następnie dodano roztwór cyklicznego 20-(1,2-etanodiyl acetalu) 5p-pregnandionu-3,20 (560 mg, 1,56 mmol) w THF (15 ml) i mieszanie kontynuowano przez 1 godzinę w -78°C. Usunięto łaźnię chłodzącą i mieszaninę zneutralizowano dodając roztwór NH₄C1 (3 ml). Rozpuszczalnik odparowano a pozostałość ekstrahowano EtOAc. Warstwę organiczną przemyto wodą, rozcieńczonym roztworem NaHCO₃, wodą i solanką, Po wysuszeniu nad bezwodnym MgSO₄, roztwór przesączono i odparowano otrzymując surowy produkt (660 mg), który został użyty do następnego etapu syntezy.

b. 3P-Cyklopropyletynylo-3a-hydroksy-5p-pregnanon-20

Do roztworu diizopropyloaminy (0,4 ml, 3 mmol) w suchym THF (15 ml) dodano n-BuLi (2,5M w THF, 3 mmol, 1,2 ml) w temperaturze -60°C. Całość mieszano przez 0,5 godziny w -78°C a następnie dodano roztwór cyklicznego 20-(1,2-etanodiyl acetalu) 3β-(5-ε1ι1οro-l-pentynylo)-3α-hydroksy-5β-pregnanonu-20 (100 mg, 0,22 mmol) w THF (15 ml). Usunięto łaźnię chłodzącą i całość mieszano przez 0,5 godziny w temperaturze pokojowej. Reakcję zneutralizowano dodając roztwór NH₄C1 (3 ml). Rozpuszczalnik odparowano a pozostałość rozpuszczono w acetonie (40 ml). Po dodaniu IN HC1 (4 ml) roztwór mieszano w temperaturze pokojowej przez 15 min. Dodano nasycony roztwór NaHCO₃ celem neutralizacji kwasu. Rozpuszczalnik usunięto a pozostałość ekstrahowano EtOAc. Warstwę organiczną przemyto wodą, rozcieńczonym roztworem NaHCO₃, wodą i solanką. Po wysuszeniu nad bezwodnym MgSO₄ roztwór przesączono i odparowano otrzymując surowy produkt (120 mg). Następnie rozpuszczono go w małej ilości CH₂C1₂ i naniesiono na kolumnę wypełnioną żelem krzemionkowym.

182 898

Eluowanie mieszaniną toluen:aceton (95:5) dało bezbarwne ciało stałe, 3p~(cyklopropyletynylo)-3a-hydroksy-5p-pregnanon-20 (55 mg); t.t. 123-138°C; TLC R_t(heksan:aceton 7:3) 0,29.

Związki według wynalazku mogą występować w postaci mieszanin diastereomerów, które mogą zostać rozdzielone na indywidualne stereoizomery. Rozdzielenie diastereomerów można przeprowadzić za pomocą chromatografii gazowej i cieczowej lub przez wyizolowanie ze źródeł naturalnych. O ile nie zaznaczono inaczej, wszystkie izomery, zarówno rozdzielone jak i ich mieszaniny wchodzą w zakres niniejszego wynalazku. Gdy izomery są rozdzielone, pożądana aktywność farmakologiczna często dominuje w jednym z nich. Jak stwierdzono, związki te wykazują bardzo wysoki stopień stereo-specyficzności. Zwłaszcza, że związki posiadające największe powinowactwo do receptorów GABA, są związki ze szkieletem steroidowym 3 3-podstawionego-3a-hy droksy pregnanu.

Związki według wynalazku i stosowane w środkach według wynalazku, będące nietoksycznymi, farmakologicznie dopuszczalnymi, naturalnymi i syntetycznymi, działającymi wprost i „prolekowymi” formami metabolitów progesteronu, deoksykortykosteronu i androstanu, wykazały nieoczekiwaną, nierozpoznaną dotychczas aktywność wobec kompleksu receptora GABA_a w mózgu. Niniejszy wynalazek wykorzystuje odkrycie tych wcześniej nieznanych mechanizmów i aktywności.

Środki farmaceutyczne według wynalazku, sporządza się jako typowe kompozycje w postaci jednostek odpowiednich do podawania, utworzonych z substancji aktywnej, według wynalazku, lub mieszaniny substancji aktywnej z nietoksycznym nośnikiem farmaceutycznym, zgodnie z przyjętymi procedurami, w nietoksycznej ilości, wystarczającej do wytworzenia pożądanej farmakologicznej aktywności w podmiocie, zwierzęciu lub człowieku. Korzystnie, kompozycja zawiera aktywny składnik w ilości skutecznej lecz nietoksycznej, na przykład około 1 mg do 500 mg aktywnego składnika na podawaną dawkę. Konkretna ilość zależy od specyficznej aktywności związku i od stanu pacjenta. Leczone stany obejmują leczenie stresu, stanów lękowych, PMS, PND i napadów padaczkowych, takich jak stany wywołane przez epilepsję, w celu osłabienia lub uniknięcia ataków lękowych, tężenia mięśni, i depresji typowych dla pacjentów cierpiących na te zaburzenia ośrodkowego układu nerwowego. Dodatkowym pożądanym celem stosowania środka według wynalazku jest leczenia bezsenności i wywołanie aktywności hipnotycznej. Innym pożądanym celem stosowania kompozycji jest wywołanie anestezji, szczególnie przez dożylne dozowanie.

Jako nośnik farmakologiczny może być stosowany, na przykład, zarówno nośnik stały, jak i ciekły lub powodujący przedłużone działanie (patrz, na przykład, Remingtońs Pharmaceutical Sciences, 14th Edition, 1970). Przykładowymi stałymi nośnikami są laktoza, kaolin, sacharoza, talk, żelatyna, agar, pektyna, guma arabska, stearynian magnezu, kwas stearynowy, celuloza mikrokrystaliczna, polimeryczne hydrożele i podobne. Typowymi ciekłymi nośnikami są glikol propylenowy, glikofurol, wodne roztwory cyklodekstryn, syrop, olej arachidowy, oliwa z oliwek i podobne emulsje. Podobnie nośnik lub rozcieńczalnik mogą zawierać dowolny ogólnie znany materiał przedłużający działanie, taki jak monostearynian gliceryny, czy distearynian gliceryny sam lub z woskiem, mikrokapsułkami, mikrokulkami, liposomami i/lub hydrożelami.

Przykładowa kompozycja farmaceutyczna w postaci tabletek może składać się z:

3oc-hydroksy-3p-(3'-metylobut-3'en-r-ynylo)-5P-pregnan-20-onu 25,00 mg celulozy mikrokrystalicznej 37,25mg talku 37,25mg i stearynianu magnezu 0,50mg

Całość 3a-hydroksy-3p-(3'-metylobut-3' en-l'-ynylo)-5p-pregnan-20-onu, celulozy mikrokrystalicznej i połowę talku miesza się i granuluje do 10% pasty. Otrzymany produkt granulowany przesiewa się, suszy i miesza z pozostałym talkiem i stearynianem magnezu. Z otrzymanego granulatu prasuje się tabletki.

182 898

Jak podano powyżej środek według wynalazku może być stosowany w szerokiej gamie postaci farmaceutycznych. A więc, jeśli jest stosowany stały nośnik, przygotowanie może polegać na walcowym rozdrabnianiu mikrocząsteczkowym, w oleju, tabletkowaniu, umieszczeniu w twardej żelatynie lub jelitowo pokrywanych kapsułkach, w postaci mikrocząsteczkowego proszku lub granulek, łub w postaci pastylek do ssania. Substancje według wynalazku mogą być również podawane w postaci czopków do stosowania doodbytniczego. Związki mogą zostać wymieszane z takim materiałem jak, masło kakaowe i glikole polietylenowe lub z innym, właściwym nie podrażniającym materiałem, który jest stały w temperaturze pokojowej ale ciekły w temperaturze wewnątrz odbytniczej. Przy stosowaniu z ciekłym nośnikiem, preparat może być w postaci cieczy na przykład w ampułkach lub w postaci wodnej lub niewodnej zawiesiny. Ciekłe postacie dawek wymagają również farmaceutycznie dopuszczalnych środków konserwujących i podobnych. Ponadto, również właściwą formą podawania domiejscowego będą małe dawki do podawania pozajelitowego takie jak, spray do nosa, podjęzykowo i do policzków, oraz skórne plastry o przedłużonym działaniu.

Uzyskiwanie działania przeciw lękowego, przeciw drgawkowego, przeciwdziałającego zmiennym nastrojom (takiego jak działanie antydepresyjne) lub działania hipnotycznego obejmuje podawanie, w razie potrzeby takiego działania, środka według wynalazku, zazwyczaj w postaci kompozycji z nośnikiem farmaceutycznym, w ilości nietoksycznej, wystarczającej do wytworzenia takiego działania.

Podczas miesiączek, poziom wydzielanych metabolitów zmienia się w przybliżeniu czterokrotnie (Rosciszewska i wsp., 1986). Dlatego terapia kontrolująca objawy, związana jest z utrzymywaniem wyższego poziomu metabolitów progesteronu, w organizmie pacjenta, niż normalne w przed miesiączkowym stanie PMS. Poziom aktywnych i istotniejszych metabolitów w plazmie, jest kontrolowany u pacjenta w czasie przed miesiączkowym i po miesiączkowym. Ilość związków według wynalazku, podawanych zarówno indywidualnie jak i w postaci mieszanin, jest tak obliczana, aby osiągnąć poziom, w którym aktywność receptorów GABA jest nasilona do poziomu, lub poziomu wyższego, od poziomu metabolistów w normalnym przypadku stanu przed miesiączkowego.

Droga podania może być dowolną drogą, która skutecznie przenosi aktywną substancję do stymulowanych receptorów GABA_a. Podawanie może odbywać się pozajelitowo, dojelitowo, doodbytniczo, dopochwowo, śródskómie, śródmięśniowo, podjęzykowo czy donosowo; doustne, śródmięśniowe i skórne drogi są korzystne. Na przykład, pojedyncza dawka w plastrze naskómym może dostarczyć aktywny składnik pacjentowi na okres do jednego tygodnia. Pozajelitowa droga podawania jest korzystna w status epilepticus.

Skuteczność i moc działania w kompleksie GR

Dane eksperymentalne in vitro i in vivo pokazują, że naturalnie występujące metabolity progesteronu/deoksykortykosteronu i ich pochodnych działają z wysokim powinowactwem przy nowych i specyficznie rozpoznanych miejscach w kompleksie GR w celu ułatwienia przewodnictwa jonów chlorkowych przenikających do GABA przez wrażliwą membranę (Gee i wsp., 1987; Harrison i wsp., 1987).

Wiadomo, że modulacja wiązania [³⁵S]t-butylobicyklofosforotionianu ((³⁵S]TBPS) jest miarą mocy i skuteczności działania leków w kompleksie GR, które to leki mogą wykazywać potencjalną wartość terapeutyczną w leczeniu stresu, lęku czy napadów padaczki (Sąuires, R.F., i wsp., „³⁵S]t-Butylbicyclophosphorothionate binds with high affinity to brainspecific sites coupled to a gamma aminobutyric acid-A and ion recognition site”, Mol. Pharmacol., 23:326, 1983; Lawrence, L.J., i wsp., „Benzodiazepine anticonvulsant action: gammaaminobutyric acid-dependent modulation of the chloride ionophore”, Biochem. Biophys. Res. Comm., 123:1130-1137, 1984; Wood, i wsp., ,Jn vitro characterization of benzodiazepine receptor agonists, antagonists, inverse agonists and agonist/antagonists”, Pharmacol, Exp. Ther., 231:572-576, (1984)). Przeprowadzono szereg doświadczeń celem oznaczenia natury modulacji [³⁵S]TBPS jaką uzyskuje się w wyniku oddziaływania związków według wynalazku. Stwierdzono, że związki te działają na nowe miejsce w kompleksie GR, które to miejsce nie

182 898 pokrywa się z miejscami działania barbituranu, benzodiazepiny lub innymi uprzednio poznanymi miejscami. Dalej, związki te posiadają wyższą moc i skuteczność działania w kompleksie GR, w porównaniu ze ściśle określonymi wymaganiami strukturalnymi dla tego typu aktywności.

Procedury dla przeprowadzenia tej próby zostały omówione w opracowaniach (1) Gee, i wsp., 1987.; i (2) Gee, K.W., L.J. Lawrence, and H.I. Yamamura, Molecular Pharmacology, 30:218 (1986).

Postępowano następująco:

Pobrano mózgi samców szczurów rasy Sprague-Dawley, które wyizolowano natychmiast po uśmierceniu osobników, a ich korę mózgową spreparowano na lodzie. Homogenizat P₂ przygotowano zgodnie z opisem (Gee i wsp., 1986). W skrócie, pobrane kory mózgowe poddano homogenizacji w 0,32 M sacharozie, a następnie odwirowano przy 1000xg w ciągu 10 minut. Supematant zebrano i odwirowano przy 9000xg w ciągu 20 minut. Końcowy P₂ aglomerat zawieszono w postaci 10% (pierwotna mokra masa/objętość) zawiesiny w 50 mM buforze fosforanowym Na/K (pH 7.4) 200 mM NaCl do utworzenia homogenizatu.

Pobrano 100 mikrolitrowe (ml) próbki zhomogenizowanego P₂ (0,5 miligrama (mg) białka) i poddano inkubacji z 2 nanomolamym (nM [³³S]TBPS (70-110 kiur/milimol; New England Nuclear, Boston, MA) w obecności, lub bez udziału naturalnie występujących steroidów lub ich syntetycznych pochodnych w celu przeprowadzenia testów. Testowane związki rozpuszczono w sulfotlenku dimetylu (Baker Chem., Co., Phillipsbury, NJ) i dodano do mieszaniny inkubowanej w 5 μΐ próbkach. Następnie mieszaninę inkubowaną dopełniono buforem do objętości 1 ml. Niespecyficzne wiązanie zostało zdefiniowane jako wiązanie w obecności 2 mM TBPS. Efekt i specyfikę GABA (Sigma Chem. Co., St.Louis, MO) oceniono po przeprowadzeniu wszystkich prób w obecności GABA plus (+)bikukulina (Sigma Chem. Co). Inkubację przeprowadzono w temperaturze 25°C, w ciągu 90 minut (warunki stanu ustalonego) i zakończono szybką filtracją przez filtry z włókna szklanego (No. 32, Schleicher and Schuell, Keene, NH). Radioaktywność związaną na filtrze zmierzono za pomocą cieczowej spektrofotometrii scyntylacyjnej. Dane kinetyczne i krzywe dawka-odpowiedź efektu oddziaływania związek/[³⁵S]TBPS zanalizowano przy użyciu metody nieliniowej regresji, stosując komputerową iteratową procedurę, otrzymując stałe współczynniki i wartości IC₅₀ (stężenie związku, przy którym otrzymuje się połowę maksymalnego inhibitowania podstawowego [³⁵S]TBPS wiązania).

Dane eksperymentalne otrzymane w tej próbie również są opublikowane przez Gee i wsp., 1987. Dane przedyskutowane w tej pracy są zawarte w opublikowanym zgłoszeniu patentowym nr WO93/03732. Odwrotnie niż w tym opracowaniu, zidentyfikowane miejsce steroidowego wiązania jest wyraźnie różne od miejsca GABA/bikukulina. Przesunięcie krzywych dawka-odpowiedź wywołane było bikukuliną, podczas gdy inhibitowanie wiązania [³⁵S]TBPS spowodowane alfaksalonem, nie jest równoległe. To wskazuje, że miejsca GABA i steroidu nie zachodzą na siebie.

Przeprowadzono drugi komplet eksperymentów w celu wykazania, że steroidy, barbiturany i benzodiazepiny nie mają wspólnego miejsca wiązania na receptorze GABA. Próba została przeprowadzona zgodnie z procedurą przedstawioną powyżej. Końcowe dane kinetyczne pokazują, że dysocjacja wiązania [³⁵S]TBPS, zainicjowana przez nasycenie stężenia 3cc-hydroksy5oc-pregnan-20-onu jest wzmacniana przez 100 μΜ pentobarbital sodu. Ten efekt wykazuje, że 3a-OH-5cc-pregnanon-20 (steroid) i pentobarbital (barbituran) przyłączają się do niezależnych miejsc.

W trzecim komplecie eksperymentów badano współoddziaływanie pomiędzy 3a-hydroksy-5a-pergnan-20-onem i pentobarbitalem sodu na potencjalizację wiązania (³H) flunitrazepamu (FLU). Te eksperymenty w dalszym ciągu podtrzymują tezę, że steroidy nie mają wspólnego miejsca działania z benzodiazepinami i barbituranami W tej serii eksperymentów, badano wpływ zmiennych stężeń 3a-hydroksy-5a-pregnanonu-20 na wiązanie (³H) FLU w obecności lub bez udziału maksymalnie stymulującego stężenia pentobarbitalu sodu.

182 898

Ponieważ pentobarbital sosu ma większe maksimum skuteczności niż 3a-hydroksy-5a-pergnanon-20 w potencjalizowaniu wiązania (³H) FLU, to 3a-hydroksy-5a-pregna-non-20 powinien ostatecznie zablokować efekt pentobarbitalu sodu, jeśli tylko obydwa wzajemnie ze sobą konkurują do tej samej pozycji. Tego jednak nie zaobserwowano. Zatem, dane te nadal podtrzymują konkluzję, że pewne steroidy, łącznie ze związkami według wynalazku i stosowane według wynalazku, wzajemnie oddziaływują z nowym miejscem oddalonym od miejsca kontrolowanego przez barbiturany lub BZ w kompleksie GR. Z powodu tego niezależnego miejsca działania, przyjmuje się, że te związki steroidowe będą miały inny profil terapeutyczny niż barbiturany i BZ.

Różne związki poddano skriningowi w celu oznaczenia ich potencjału jako modulatorów wiązania [³⁵s]TBPS w in vitro. Próby te przeprowadzono zgodnie z powyższą procedurą. W oparciu o te próby, określono wymagania dotyczące struktury aktywności dla ich specyficznych oddziaływań w kompleksie GR i uszeregowano ich moc działania i skuteczność. Tabela 1 przedstawia dane IC₅₀ i maksymalną inhibicję kilku związków, łącznie z zastrzeżonymi. IC₅₀ jest definiowane jako stężenie związków inhibitujące 50% kontrolnych [³⁵S) TBPS wiązań. Jest to wskazanie mocy związków in vitro. Maksimum inhibitowania jest wskazaniem skuteczności związków in vitro.

Tabela 1

	IC50	Imax
33-cyklopropyletynylo-3a-hydroksy-53pregnanon-2 0	22	94
3a-hydroksy-3p-(3'-metylobuten-3-ynylo-l')5β- pregnanon-2 0	24	91
3a-hydroksy-3p-metylo-5P-19-norpregnanon-2 0	26	94
3a, 2 0a-dihydroksy-21-etylo-5a-pregnan	27	13
3β-(cyklopropylo)etynylo-3a-hydroksy-5bpregnanon-20	32	97
3a,20a-dihydroksy-21-metylo-5a-pregnan	35	28
3a-hydroksy-5a-pregnanon-20	37	95
3a-hydroksy-3β-metylo-5β-pregnanon-20	37	98
3β-etynylo-3a-hydroksy-5β-pregnanon-20	39	101
3β-etynylo-3α-hydrokΞy-19-nor-5β-pregnanon-20	44	93
3β-(5'-chloropentynyl-1')-3α-hydroksy-5βpregnanon-20	44	98
3β-etenylo-3α-hydroksy-5β-pregnanon-2 0	46	100
3α-hydroksy-3β-etynylo-5α-pregnanon-20	53	91
3a-hydroksy-30~metylo-5a-pregnanon-20	62	97
21-monobursztynian bis(3α,2l-dihydroksy-3β- etynylo-5β-pregnanonu-2 0	68	56
21-octan 3α,21-dihydroksy-5a-pregnanonu-20	75	99
3α,21-dihydroksy-5a-pregnanon-20 (5a-THDOC)	76	100
3α-hydroksy-3β-trifluorometylo-19-nor-5βpregnanon-2 0	76	100
3a-hydroksy-21-metylo-50-pregnanon-20	78	100

182 898 ciąg dalszy tabeli 1

	IC50	Imax
3a-hydroksy-3β-(3'-metylobuten-3'-ynyl-1')5a-pregnanon-20	88	95
3a-hydroksy-3P,21-dimetylo-5a-pregnanon-2 0	89	85
3a-hydroksy-3β-metylo-5 α-19-norpregnanon-2 0	91	80
3α,20a(S)-dihydroksy-5a-pregnan	99	46
N-(3a-hydroksy-33-metylo-5a-pregnanylideno2 0)etanoloamina	101	93
3β-et enylo-3α-hydroksy-5a-pregnanon-20	113	88
21-monobursztynian 3α,21-dihydroksy-5apregnanon-20	117	91
21-octan 3α,21-dihydroksy-5p-pregnanonu-20	119	49
3α, 20a-dihydroksy-3P-metylo-5a-pregnan	166	52
3a, 20-dihydroksy-20-metyło-5a-pregnan	176	40
21-monobursztynian 3α,21-dihydroksy-3P- etynylo-5p-pregnanonu-20	179	82
21-monobursztynian bis(3α,21-dihydroksy-3Ptrifluorometyło-5β-pregnanonu-2 0)	189	23
3 a-hydroksy-3 β-fluorometylo-5a-pregnanon-20	200	77
3a, 20a-dihydroksy-33-etynylo-5a-pregnan	202	56
3a-hydroksy-3β-trifluorometylo-5βpregnen-ll-on-2 0	203	99
sól sodowa 21-monobursztynianu 3α,21- dihydroksy-3 β-metylo-5a-pregnanonu-2 0	211	104
3a-hydroksy-3β-triflurometyło-5β-pregnanon-20	211	98
3α, 21-dihydroksy-3P-etynylo-5P-pregnanon-2 0	216	104
21-monobursztynian 3α,21-dihydroksy-3P- metylo-5a-pregnanon-20	241	92
3 a-hydroksy-3 β-me tyło-5a-pregnen-11-on-2 0	242	76
3a-hydroksy-3β-trifluorometylo-5a-pregnanon20	244	44
3a, 21-dihydroksy-3P-trifluorometylo-19-nor5β-pregnanon-20	246	100
sól sodowa 21-monobursztynianu 3a,21- dihydroksy-5α-pregnanonu-20	251	92
3a-hydroksy-3β-trifluorometyło-19-nor-5apregnanon-2 0	251	40
21-octan 3α, 21-dihydroksy-3P-etynylo-5P- pregnanonu-2 0	251	101
3α,21-dihydroksy-3β-metyło-5a-pregnanon-20	258	96
21-octan 3α,21-dihydroksy-3P-metylo-5a- pregnanonu-2 0	284	93
3α, 21-dihydroksy-3β-etenylo-Sa-pregnanon-20	288	101
3α, 21-dihydroksy-3β-trifluoromety1ο-5βpregnanon-20	354	102
3α, 21-dihydroksy-3β-trifluoromety1ο-5βpregnanon-2 0	370	88

182 898 ciąg dalszy tabeli 1

	IC50	Imax
21-monobursztynian 3α, 21-dihydroksy-3P- et eny1o-5α-pregnanonu-2 0	377	89
3α, 20(j-dihydroksy-3p-metylo-5[j-pregna.n	455	105
3α,20a-dihydroksy-3P, 21-dimetylo-5a-pregnan	507	48
sól sodowa 21-monobursztynianu 3a,21- dihydroksy-3p-trifluorometylo-19-nor-5β- pregnanonu-2 0	530	101
sól sodowa 21-monobursztynianu 3a,21- dihydroksy-3p-etynylo-5P-pregnanonu-20	540	102
sól sodowa 21-monofumaranu 3α,21-dihydroksy- 3 β-tri fluorometyło-5 β-pregnanonu-2 0	546	102
3α,20α-dihydrokΞy-3β-etynylo-5β-pregnan	557	98
3α,21-dihydroksy-3β-trifluorometyΙο-5αpregnanon-20	592	101
21-monobursztynian 3α,21-dihydroksy-3β- tri fluorometyło-5β-pregnanonu-20	648	101
3α,20β-dihydrokΞy-3β-etynylo-5β-pregnan	688	77
sól sodowa 21-monobursztynianu 3α,21- dihydroksy-33-trifluorometyło-5β-pregnanonu20	712	99
3α,20β-dihydroksy-3β-etynylo-5α-pregnan	774	107
monometylowy 21-bursztynian 3α,21-dihydroksy3β-trifluorometyło-5β-pregnanonu-20	480	86
3a-hydroksy-33-metylo-21,21,21trifluorometyło-5a-pregnanon-2 0	915	101
3α,20β-dihydroksy-3β-metylo-5α-pregnan	924	99
3a-hydroksy-33-metylo-5a-pregnen-16-on-20	955	100
3a-hydroksy-33-metylo-5a-pregnandion-ll,20	958	100
2l-bromo-3α-hydroksy-3β-trifluorometyło-5βpregnanon-2 0	1530	102
estradiol	>1000	I*
progesteron	>1000	I*
kortykosteron	>1000	I*
cholesterol	>1000	I*

I* - nieaktywny

182 898

Jak pokazano w tabeli 1, związki według wynalazku i stosowane według wynalazku posiadają niski wskaźnik IC₅₀, które to stężenie konieczne jest do uzyskania 50% maksymalnego inhibitowania wiązania [³⁵S] TBPS, podczas gdy związki takie jak steroidy płciowe (estradiol i progesteron), głukokortykozoidy (kortykosteron) i cholesterol posiadają wysoką wartość IC₅₀ i są zasadniczo nieaktywne. Oczekiwano, że steroidy hormonalne i cholesterol nie będą wykazywały żadnej, tutaj opisanej, terapeutycznej wartości. Formalnie, aby odróżnić unikalną klasę steroidów od hormonalnych steroidów, nazwano je neuroaktywnymi steroidami. Jakkolwiek, steroidy płciowe takie jak progesteron mogą być metabolizowane w organizmie do steroidów bliskich 3a-hydroksy-5a-pregnanonu-20. Tak więc progesteron może być uważany za prolek (prekursor leku). Dane TBPS korelują dobrze z danymi w odniesieniu do poboru jonu ³⁶C1 potencjalizowanego przez różne 3a-hydroksylowane steroidy opisane w Purdy R.H., i wsp., J.Med. Chem. 33:1572-1581 (1990) i także dane te dobrze korelują z elektrofizjologicznymi danymi otrzymanymi przez pomiar wzmocnienia prądu indukowanego przez GABA we wstrzykniętej komórce jajowej z ludzkimi receptorami GABA. To wskazuje, że próba TBPS jest pomiarem przybliżonym zdolności steroidów do allosterycznego modulowania aktywności kanału CF.

Związki wykazujące częściowe działanie

O ile pożądane działanie terapeutyczne powinno wiązać się z najmniej niepożądanymi działaniami ubocznymi, o tyle ważnym aspektem wynalazku jest odkrycie agonistów z częściową akty wnością związków z grupą 5a-pregnan-3a-20a-hydroksyIową i 5[3-pregnan-3ct, 20 β-hydroksylową lub ich pochodnymi i prolekami tych związków. W dodatku, podgrupa steroidów neuroaktywnych, inna niż te dwie grupy, również wykazuje częściową skuteczność w próbie TBPS (tabela 1). U pacjentów, którzy oczekują poprawy w stanach lękowych i drgawkach, hipnoza nie jest pożądana. U pacjentów, którzy oczekują poprawy w stanach bezsenności, środek znieczulający nie jest pożądany. Związki i działania opisano jako agonistyczne, które mają częściową aktywność o oczekiwanym działaniu pożądanym, przy minimalnym działaniu ubocznym.

Ponadto, zdolność tych związków do wzmocnienia zależnego od GABA zwiększenia przepływu CF była ograniczona w porównaniu z 3a-hydroksy-5a-pregnan-20-onem w komórce jajowej Xenopus ze wstrzykniętym receptorem GABA ludzkich genów.

Kiedy układ ekspresyjny komórki jajowej Xenopus stosowano do zbadania granicy skuteczności niektórych steroidów neuroaktywnych przeprowadzono następujące postępowanie. Do komórek jajowych Xenopus laevis (faza IV), które pozbawiono pęcherzyka stosując metodę trawienia kolagenazą [3 godziny w temperaturze 18-23°C, 2 mg ml’¹ kolagenazy A w soli Bartha bez jonów Ca²⁺) wstrzyknięto transkrypty cRNA ludzkiego receptora GABAa złożonego z podjednostki cci βΐ i γΐ. Główny kompleks receptora GABAa składa się z podjednostek αβγ. Komórki jajowe pojedynczo utrzymywano w 96-studzienkowej płytce (200 pL normalnego roztworu Bartha na studzienkę z dodatkiem 50 IU ml'¹ penicyliny, 50 mg streptomycyny i 100 mg mF¹ gentomycyny) przez 9 dni w temperaturze 19-20°C. Prądy indukowane przez agonistów mierzono na komórkach jajowych Xenopus, przy stałym potencjale wynoszącym 60 mV z użyciem wzmacniacza napięcia Axoclamp 2A (Axon Instruments) w układzie dwóch elektrod. Mikroelektrody mierzące napięcie i przepływający prąd wypełnione były 3M KC1, a opory 1-3 ohma mierzono w standardowym, w zewnątrz komórkowym roztworze soli. Komórki jajowe przechłodzono w urządzeniu Ringer (120 mM NaCl; 2 mM KC1; 1,0 mM CaCl2; 5 mM HEPES pFI 7,4) w przedziale 5-7 ml min'¹ w temperaturze pokojowej (17-21°C).

Wszystkie leki stosowano w układzie przenikania płynu przez przestrzenie międzykomórkowe. Steroidy (ΙΟ^-2 M) przygotowano w postaci koncentratów w DMSO lub etanolu, a następnie rozcieńczono w roztworze Ringera do odpowiedniego stężenia. Końcowe stężenie roztworów DMSO i etanolowego sięgało 0,2% obj./objętość nie wywołując efektu reakcji GABA. Koncentraty wszystkich innych leków przygotowano w roztworze Ringera. Wygenerowany prąd membranowy przepuszczano przez filtr dolnoprzepustowy przy użyciu magnetofonu FM (Racal Storę 4DS) do dalszych analiz.

182 898

Zalety w stosunku do progesteronu

Korelacja pomiędzy obniżonymi poziomami progesteronu i objawami związanymi z PMS, PND i epilepsją menstruacyjną (Backstrom, i wsp., 1983; Dalton, K., 1984) doprowadziła do zastosowania progesteronu w ich leczeniu (Mattson, i wsp., 1984; i Dalton, 1984). Jednakże, progesteron nie jest jednoznacznie skuteczny w leczeniu wyżej wymienionych objawów. Na przykład, nie istnieje zależność dawka-odpowiedź przy progesteronie w leczeniu PMS (Maddopcks, i wsp., 1987). Wyniki te są przewidywalne gdy są rozważane w świetle studiów in vitro wykazujących, że progesteron ma małą aktywność wobec kompleksu GR, jak widać z tabeli 1, w porównaniu z metabolitami progesteronu.

Korzystne działanie progesteronu prawdopodobnie uzależnione jest od zmiennej konwersji progesteronu w aktywne metabolity progesteronu. Zastosowanie specyficznych metabolitów progesteronu w leczeniu wyżej wymienionych objawów wyraźnie przewyższa stosowanie progesteronu z uwagi na ich wysoką aktywność i skuteczność (patrz, Gee, i wsp., 1987 i powyższa tabela 1).

Brak hormonalnych działań ubocznych

Wykazano również, że neuroaktywne steroidy nie mają działań ubocznych ze względu na brak powinowactwa do receptorów progesteronu i innych hormonalnych steroidów. Dane te otrzymano po przeprowadzeniu prób według Gee, i wsp., 1988 w celu określenia działania metabolitów i pochodnych progesteronu, i progestiny R5020 na wiązanie [³H] R5020 z receptorami progesteronu w macicy szczura (Gee i wsp., 1988).

³H-progesteron (0,15 nM) inkubowano z cytoplazmą macicy szczura w obecności badanych związków. Specyficzne wiązania określono po inkubacji i porównywano z kontrolną próbą bez tych związków. Wyniki wyrażono w procentach blokowania wiązania. Jeśli związki łączą się z receptorem progesteronu z wysokim powinowactwem, to należałoby oczekiwać 100% inhibitowania wiązania przy badanych stężeniach. Neuroaktywne steroidy wykazują mniej niż 10% inhibitowania, co wskazuje że są nieaktywne jako środki o działaniu progesteronowym.

Różne działania hormonalne reprezentatywnych steroidów neuroaktywnych dalej badano poprzez ich moc działania estrogennego, mineralokortykoidowego i glukokortykoidowgo. Działania te analizowano poprzez monitorowanie zdolności tych związków do inhibitowania wiązania hormonów steroidowych do ich odpowiednich receptorów hormonów. Wyniki tych eksperymentów przedstawiono w publikacji patentowej WO93/03732.

Wyniki tych eksperymentów jasno wykazują, że neuroaktywne steroidy nie mają silnego powinowactwa do powyższych receptorów steroidowych. Tak więc nie należy przewidywać ubocznego działania hormonalnego z takich wiązań z receptorami steroidowymi.

Działanie przeciwdrgawkowe

Przeprowadzono również badania w celu oznaczenia fizjologicznego związku wzajemnego oddziaływania neuroaktywnych steroidów i receptorów GABA poprzez ocenę zdolności związków według wynalazku i stosowanych według wynalazku, do zapobiegania drgawkom wywołanych metrazolem u myszy. Wstrzykiwano myszom różne dawki testowanych związków według wynalazku na 10 minut przed wstrzyknięciem metrazolu. Czas do początku drgawek klonicznych mięśni (drgawki przedniej kończyny) wywołany metrazolem określano obserwując każdą mysz przez 30 minut. U kontrolowanych myszy metrazol (85 mg/kg) wywoływał drgawki u 95% zwierząt. Zdolność szeregu związków, według wynalazku i stosowanych w wynalazku, do przeciwdziałania drgawkom przedstawiono w tabeli 2.

182 898

Tabela 2

Działanie przeciwmetrazolowe neuroaktywnych steroidów u myszy

Nazwa	Sposób podania	Baza	Dawka mg/kg	Skuteczność %
33-cyklopropyloetynylo-3a-hydroksy-5ppregnanon-20	IP	50% hpbcd	10	87,5
3a-hydroksy-3P-(3' -metylobutenyl-3' yn.yl-1')-5p-pregnanon-20	IP	50% hpbcd	10	100
3a-hydroksy-5a-pregnanon-20	IP	50% hpbcd	10	100
3ahydroksy-jp-metylo-5P-pregnanon-20	IP	50% hpbcd	10	70
3P-etynylo-3a-hydroksy-5P-pregnanon-20	IP	50% hpbcd	10	100
3P~etynylo -3a-hydroksy-19-nor-5f) pregnanon-2 0	IP	50% hpbcd	10	87,5
3β-(1-heksynylo)-3a-hydroksy-5Ppregnanon-20	IP	50% hpbcd	10	37,5
3P~etenylo-3ct-hydroksy-5P-pregnanon-20	IP	50% hpbcd	10	87,5
3a-hydroksy-3P-etynylo-5a-pregnanon-20	IP	5 0% hpbcd	10	87,5
3 α-hydroksy- 3 β -me tyl o - 5a-pr egnanon- 2 0	IP	50% hpbcd	10	100
21-monobursztynian bis(3α,21- di hydrok sy-3 β-e tyny1o-5 β-pr egnanonu-2 0	IP	50% hpbcd	10	37,5
21-octan 3α,21-dihydroksy-5a- pregnanonu-2 0	IP	50% hpbcd	10	50
3α, 21-dihydroksy-5a-pregnanon-20 (5a-THD0C)	IP	5 0% hpbcd	10	87,5
3α-hydroksy-3β-trίfluorometylo-19-nor- 5 β-pr egnanon-2 0	IP	50% hpbcd	10	100
3β-etynylo-3α-hydroksy-5β-pregnen-llon-2 0	IP	50% hpbcd	10	75
3a-hydroksy-3β-(3'-metylobuten-3'ynyl-1')-5a-pregnanon-20	IP	50% hpbcd	10	87,5
3 a-hydroksy-3 β-me tyło-5a-19norpregnanon-20	IP	mikro zaw.	10	37,5
3a,20a(S)-dihydroksy-5a-pregnan	IP	mikro zaw.	10	30
3P-etenylo-3a-hydroksy-5a-pregnanon-20	IP	50% hpbcd	10	100
21-octan 3α,21-dihydrokΞy-5β- p r egnanonu-2 0	IP	50% hpbcd	100	25
3cc, 20a(S) -dihydroksy-3p-metylo-5(Xpregnan	IP	mikro zaw.	10	60
21-monobursztynian 3α,21-dihydroksy-3βetynylo-5P-pregnanonu-20	IP	woda	10	50
21-monobursztynian bis(3a,21- dihydroksy-3β-trifluorometylo-5β- pregnanonu-2 0	IP	50% hpbcd	10	25

182 898 ciąg dalszy tabeli 2

- 1 ----------------------------------------------------------------------------- 3a-hydroksy-3p-f luorometylo-5a- pregnanon-2 0	IP	50% hpbcd	10	14,3
sól sodowa 21-monobursztynianu 3a,21dihydroksy-3P-metylo-5a-pregnanonu-2 0	IP	mikro zaw.	10	11,11
3a-hydroksy-3P-trifluorometylo-5Ppregnanon-2 0	IP	50% hpbcd	10	62,5
3α,21-dihydroksy-3P-etynylo-5Ppregnanon-2 0	IP	50% hpbcd	10	18,8
monobursztynian 3α,21-dihydroksy-3P- metylo-5-pregnanonu-20	IP	woda	10	37,5
3a-hydroksy-3P-trifluorometylo-5apregnanon-20	IP	50% hpbcd	10	62,5
3α,21-dihydroksy-3P-trifluorometylo-19nor-5 β-pregnanon-2 0	IP	50% hpbcd	10	118,8
sól sodowa monobursztynianu 3α,21dihydroksy-5 α-pregnanonu-20	IP	woda	10	100
3a-hydroksy-33-trifluorometylo-19-nor5a-pregnanon-20	IP	50% hpbcd	10	25
21-octan 3α,21~dihydroksy-3P~etynylo- 5 β-pregnanonu-2 0	IP	50% hpbcd	10	62,5
3α,21-dihydroksy-33-metylo-5apregnanon-20	IP	50% hpbcd	10	87,5
21-octan 3α,2l-dihydroksy-3P-metylo-5apregnanonu-2 0	IP	50% hpbcd	10	10
3α,21-dihydroksy-33-trifluorometylo-5ppregnanon-2 0	IP	50% hpbcd	10	50
21-octan 3α, 21-dihydroksy-3P- trifluor orne ty1o-5 β-pregnanonu-2 0	IP	50% hpbcd	10	62,5
3α-hydroksy-3β-trifluorometylo-5β-19norpregnen-17(Z)	IP	5 0% hpbcd	10	25
3a,20-dihydroksy-3β,20-άίιηθ1γ1ο-5β-	IP	mikro	10	22,2
pregnan		zaw.
3a,20a-dihydroksy-3p,21-dimetylo-5apregnan	IP	dmso	10	0
sól sodowa 21-monobursztynianu 3α,21άίΗγάτοΚεγ-όβ-ΐΓίίluorometylo-19-nor5P-pregnanonu-20	IP	woda	10	50
sól sodowa 21-monobursztynianu 3α,21dihydroksy-3 β-e tynylo-5 β-pregnanonu-2 0	IP	woda	10	50
sól sodowa 21-monofumaranu 3a,21- dihydroksy-3β-trifluorometylo-5β- pregnanonu-2 0	IP	woda	10	50
3α,21-dihydroksy-3β-fluorometylo-5apregnanon-20	IP	50% hpbcd	10	25
21-monobursztynian 3α,21-dihydroksy-3βtrifluorometylo-5β-pregnanonu-20	IP	woda	10	50
3α,20β-dihydroksy-3β-etynylo-5β-pregnan	IP	50% hpbcd	10	25
sól sodowa 21-monobursztynianu 3a,21dihydroksy-3β-trifluorometylo-5β- pregnanonu-2 0	IP	woda	10	62,5
3 a,2 0 β-dihydroksy-3 β-e tynylo-5 a-pregnan	IP	5 0% hpbcd	10	37,5

182 898

Zdolność neuroaktywnych steroidów do zabezpieczania zwierząt przed działaniem innych chemicznych czynników drgawkowych wykazano dla 3a-hydroksy-5a-pregnanonu-20, 3a,21-dihydroksy-5oc-pregnanonu-20 i 3a-hydroksy-33metylo-5|3-pregnanonu-20. Testy przeciw drgawkowe prowadzono podobnie do opisanych powyżej. Stosowano następujące chemiczne środki wywołujące drgawki: metrazol (85 mg/kg); (+)bicuculinę (2,7 mg/kg); picrotoksynę (3,15 mg/kg); strychninę (1,25 mg/kg); lub nośnik (0,9% solanka). Obserwację myszy rozpoczęto natychmiast po wstrzyknięciu środka wywołującego drgawki lub nośnika i obserwowano myszy przez okres 30 do 45 minut Rejestrowano liczbę zwierząt z drgawkami tonicznymi i/lub klonicznymi. W teście maksymalnego elektrowstrząsu doprowadzano prąd 50 mA o 60 Hz za pomocą elektrod rogówkowych przez 200 msek, aby wywoływać toniczną padaczkę. Zdolność substancji do znoszenia składnika tonicznego określano w punkcie końcowym. Na ogół potencjał depresyjny określano w teście wirującego pręta w okresie 10 minut po wstrzyknięciu związków, kiedy to określano liczbę myszy stojących na obracającym się pręcie (6 obrotów na minutę) przez 1 minutę w jednej z trzech prób. ED₅₀ (dawka, przy której występuje połowa maksymalnego efektu) określano dla każdej serii i przedstawiono w tabeli 3. Wyniki ilustrują, że neuroaktywne steroidy, w porównaniu z innymi klinicznie użytecznymi środkami antykonwulsyjnymi, są wysoce skuteczne przy profilach zbliżonych do BZ clonazepamu. Obserwacje te demonstrują terapeutyczną przydatność tych związków jako modulatorów pobudzenia mózgu, która odpowiada wysokiemu powinowactwu do wzajemnego oddziaływania z kompleksem GR in vitro.

T a b e I a 3

Działanie przeciwdrgawkowe przykładowych neuroaktywnych steroidów i wybranych znanych środków przeciwdrgawkowych u myszy

ED50 (mg/kg)
Związek	RR	MES	MTZ	BIC	PICRO	STR
3α5α''’ -P	30	28,6	4,9	12,3	10,2	>300
Sa-THDOC'·’	22,9	26,7	8,1	17,8	5,6	>300
3a-hydroksy-33metylo-5apregnanon- 2 0(bl	246,2	>100	6,3	61,9	35,4	>100
Clonazepam*	0,184	93	0,009	0,0086	0,043	NP
Phenobarbi tal*	69	22	13	38	28	95
Phenytoin*	65	10	NP	NP	NP	★ *
Progabide* * *	-	75	30	30	105	75
Valproate*	426	272	149	360	387	293

Użyte skróty:

RR (wirujący pręt), MES (maksymalny wstrząs elektryczny), MTZ (metrazol), BIC (bicuculina), PICRO (picrotoksyna), STR (strychnina), NP (nie zabezpiecza).

^W Rozpuszczony w 20% hy droksypropy Ιο-β-cy klodekstrynie w wodzie. Sposób podania steroidów i czynników przeciwdrgawkowych, odpowiednio dootrzewny oraz podskórny.

Dane przeciwdrgawkowe, Swinyard & Woodhead, „General Principles: experimental detection, ąuantification and evaluation ofanticonvulsants”, w: Antiepileptic Drugs, D.M. Woodbury, J.K.Penry, C.E.Pippengcr, str. 111 (Raven Press, New York), 1982.

^(b’ Baza zawiera 0,32% hydroksypropylometylocelulozy i 4% TWEEN 80 w roztworze soli.

Maksymalne zabezpieczenie 50% na poziomie 55-100 mg/kg.

Czynniki drgawkowe w tej serii badań podawano dożylnie, wszystkie dane pochodząz: Worms i wsp., „Gamma-aminobutyric acid (GABA) receptor simulation. Neuropharmacological profiles of progabide (SL 76002)and SL 75102, with emphasis ontheiranticonvulsant spectra¹', Journal ofPharmacology andExperimental Therapeulics 220: 660-671 (1982).

182 898

Działanie zmniejszające niepokój

Następujące doświadczenia wykazały, że metabolity progesteronu 3a-OH-5a-pregnan-20-onu i 3cc-OH-5p-pregnan-20-onu są skutecznymi środkami obniżającymi niepokój na czterech modelach zwierzęcych, u których mierzono działania behavioralne związków obniżających niepokój. Wymienione dwa związki ilustrują wynalazek. Dane dotyczące ich syntetycznych pochodnych i pomiarów przedstawiono również w tabelach 4-6. Tymi czterema modelami zwierzęcymi stosowanymi do pomiaru działań behawioralnych związków obniżających niepokój są: 1) test przechodzenia jasno/ciemno; 2) podwyższony labirynt-plus; 3) test konfliktu Gellera-Seiftera oraz 4) test Vogela.

a) Test przechodzenia jasno/ciemno

Test zmiany jasno/ciemno (Crawley and Goowin, Pharmacol.Biochem.Behav. 13:67-70 1980) bazuje na obserwacji, że gryzonie naturalnie dążą do odkrywania nowego środowiską ale otwarte jasno oświetlone obszary wywołują niechęć u gryzoni i inhibitują zachowania eksploracyjne (Christmas and Maxwell, Neuropharmacol. 9:17-29 1970; File, J.Neurosci. Meth.2:2l9-238 1980). Wykazano, że różne klinicznie ustalone środki obniżające niepokój, takie jak diazepam, clonazepam i pentobarbital, zwiększają liczbę przejść między oświetlonymi boksami a ciemnymi boksami, podczas gdy leki nie obniżające niepokoju nie wykazywały takiego działania behawioralnego (Crawley i wsp. Neuropharmacol. 23:531-537 (1984)).

Samce myszy N.I.H. Swiss-Webster (Harlan, Harlan, Indianapolis, IN) o wadze 15-20 g zamknięto w klatkach etylenowych wymoszczonych trocinami po 4 na klatkę. W pomieszczeniu kolonijnym regulowano warunki otoczenia (22°) przy 12 godzinnym cyklu jasno/ciemno (0600-1800 godz.). Pożywienie i woda były dostępne ad libidum, za wyjątkiem okresu prowadzenia próby. Doświadczenie prowadzono od 0700-1500 godzin i grupy były przeciwważone na czas efektów dziennych. Myszom podawano lek lub nośnik tylko raz.

Stosowana metoda stanowiła modyfikację metod uprzednio opisanych (Wieland i wsp. Br.Res. 565:263-268)). Urządzenie zawierało dwie 2-przedziałowe automatyczne komory do badań (Model RXYZCM16, Omnitech Electronics, Columbus, OH). Przedział otwarty był połączony z przedziałem zamkniętym poprzez przejście 7,5 x 7,5 cm. Otwarty przedział był jasno oświetlony za pomocą 200 W żarówek żarowych. Pomieszczenie doświadczalne utrzymywano w ciemności. Przerwy w wiązce podczerwonej w każdej z komór rejestrowano automatycznie przez podłączenie do komputera za pomocą Digiscan Analyzer (Omnitech Electronics) i analizowano dane przy użyciu Lab Animal Monitoring System (Omnitech Electronics).

Myszom N.I.H. Swiss-Webster podawano nośnik lub badany związek dootrzewnowo (IP), po 10 minutach umieszczono je w środku przedziału oświetlonego. W 10 minutowym okresie testu mierzono liczbę przejść pomiędzy komorą oświetloną i komorą ciemną całkowitą aktywność w komorze oświetlonej i czas spędzony w komorze oświetlonej.

Podanie 3a-OH-5a-pregnan-20-onu i 3a-OH-5p-pregnan-20-onu w teście przechodzenia jasno/ciemno dało znaczącą krzywą dawka-reakcja w stosunku do liczby przejść pomiędzy boksem ciemnym a boksem oświetlonym. Porównania wykazały, że liczba przejść dla dawek obu 3cc-OH-5a-pregnan-20-onu i 3a-OH-5p-pregnan-20-onu była znacznie większa w badanych dawkach w porównaniu z próbą kontrolną (test Dunnetta).

Poza tym zarówno 3a-OH-5a-pregnan-20-on i 3a-OH-5P-pregnan-20-on dały znaczący (p < 0,01) wzrost aktywności w dawkach 10 & 20 mg/kg w porównaniu z grupami kontrolnymi (test Dunnetta). Nie stwierdzono żadnych znaczących różnic pomiędzy tymi dwoma związkami, w którejkolwiek badanej dawce.

b) Podwyższony labirynt-plus

Podstawowa teoretyczna dla testu podwyższonego labiryntu-plus jest podobna do zasady testu zmiany jasno/ciemno. Jak opisał Pellow i wsp. J.Neurosci.Meth. 14:149-167 (1985) podwyższone urządzenie labirynt-plus zaprojektowane jest w celu wykorzystania naturalnej niechęci myszy do otwartych przestrzeni. Urządzenie składa się z dwóch ramion otwartych i dwóch ramion zamkniętych. Test podwyższonego labiryntu-plus pozwala na dwa pomiary

182 898 niepokoju, liczby wejść do otwartych ramion i czasu spędzonego w otwartych ramionach, oba wyrażone jako procent całkowitej liczby wejść i czasu spędzonego w otwartym ramieniu w stosunku do obu w otwartych ramionach i zamkniętych ramionach.

Samce myszy N.I.H. Swiss-Webster (Harlan, Harlan, Indianapolis, IN) o wadze 15-20 g zamknięto w klatkach etylenowych wymoszczonych trocinami po 4 na klatkę. W pomieszczeniu kolonijnym regulowano warunki otoczenia (22°) przy 12 godzinnym cyklu jasno/ciemno (0600-1800 godz.). Pożywienie i woda były dostępne ad libidum, za wyjątkiem okresu prowadzenia próby. Doświadczenie prowadzone od 0700-1500 godz. i grupy były równoważone dla czasu efektów dziennych. Myszom podawano tylko raz lek lub nośnik.

Stosowana metoda była uprzednio opisana (Lister, Psychopharmacol.92·. 180-185 (1987)). Urządzenie zawierało dwa otwarte ramiona prostopadłe do dwóch zamkniętych ramion podwyższonych 50 cm od podłogi. Każde ramię miało długość 50 cm i ścianki zamkniętych ramion miały wysokość 40 cm. Labirynt był całkowicie wykonany z czarnego pleksiglasu. Nad każdym otwartym ramieniem znajdowały się 200 W żarówki żarowe tworząc ostry kontrast pomiędzy otwartymi ramionami i zamkniętymi ramionami.

minut po iniekcji myszy N.I.H. Swiss-Webster umieszczono w środku labiryntu-plus przodem do otwartego ramienia. W ciągu 5 minutowego okresu próby mierzono liczbę wejść do otwartych ramion i zamkniętych ramion oraz czas spędzony w ramionach otwartych i ramionach zamkniętych. Wszystkie cztery łapy musiały być w ramieniu dla pomiaru zależnej zmiennej. Zatem czas spędzony w środku labiryntu nie był liczony tak, że całkowity czas w otwartych ramionach mógł nie być równy 5 minutom.

Oba 3a-OH-5a-pregnan-20-on i 3a-OH-5p-pregnan-20-on w teście podwyższonego labiryntu-plus, wykazały zwiększony stosunek wejść do otwartych ramion w stosunku do dawek. 3a-OH-5a-pregnan-20-on dawał znaczący wzrost wejść przy 20 mg/kg (p < 0,05), podczas gdy 3cc-OH-53-pregnan-20-on daje znaczący wzrost wejść przy 5 mg/kg (p < 0,05), 7,5 mg/kg (p < 0,01), i 10 mg/kg (p < 0,02).

Ponadto, 3a-OH-5a-pregnan-20-on i 3oc-OH-5p-pregnan-20-on wykazują zależne od dawki zwiększenie czasu przebywania w otwartych ramionach. 3oc-OH-5cc-pregnan-20-on daje znaczące zwiększenie czasu spędzonego w otwartych ramionach w dawce 10 mg/kg (p < 0,01), podczas gdy 3a-OH-5p-pregnan-20-on daje znaczące zwiększenie czasu przebywania w otwartych ramionach w dawce 7,5 mg/kg (p < 0,01) i 10 mg/kg (p < 0,01).

Wyniki tych doświadczeń podano w opublikowanym zgłoszeniu patentowym WO 93/037323. Tabela 4 pokazuje zestawienie obniżające niepokój działania związków stosowanych w wynalazku przy użyciu podwyższonego labiryntu-plus w takich samych warunkach jak opisane powyżej.

Tabela 4

Działanie obniżające niepokój u myszy w Labiryncie-plus

Nazwa	Droga	Nośnik	Dawka mg/kg	% próby kontrolnej
3a-Hydroksy-33~(3'-metylobut-3'en-1'-ynylo)-53~pregnan.-20-onu	IP	50% hpbcd	10	155
3cc-Hydroksy-5ct-pregnan-2 0-on	IP	50% hpbcd	20	147,3
33-Etynylo-3a-hydroksy-33pregnan20-on.	IP	50% hpbcd	1	186,6
33-Etynylo-3a-hydroksy-19-nor-33pregnan-20-on	IP	50% hpbcd	10	172
3P-Etenylo-3a-hydroksy-5fpregnan- 2 0-on	IP	50% hpbcd	10	151

182 898 ciąg dalszy tabeli 4

3 a-Hydroksy-3 β - e tynylo-5 apregnan20-on	IP	50% hpbcd	10	213
3a-Hydroksy-33-metylo-5a-pregnan20-on	IP	50% hpbcd	5	165,6
21-0ctan 3α,21-dihydroksy-5a- pregnan-2 0-on	IP	50% hpbcd	10	133
3a-Hydroksy-33-trifluorometyło19-nor-5 β-pregnan-2 0-on	IP	50% hpbcd	10	173,8
33-Etynylo-3a-hydroksy-5p-pregnll-en-20-on	IP	50% hpbcd	10	233 ।
3ct-Hydroksy-3P- (3 ' -metylobut-3 ' en-1'-ynylo)-5a-pregnan-20-on	IP	50% hpbcd	10	141 |
3P-Etenylo-3a-hydroksy-5apregnan-2 0-on	IP	50% hpbcd	5	154,3
3a-20a-Dihydroksy-33-metylo-5apregnan	IV	mikro sól.	10	174,5
21-Hemibursztynian 3α,21- dihydroksy-3 β-etynylo-5 β-pregnan20-onu	IP	50% hpbcd	10	164,2
21-Hemibursztynian bis (3a,21dihydroksy-3β-trifluoroπletylo-5βpregnan-20-onu	IP	50% hpbcd	10	92
3a-Hydroksy-3β-fluorometyło-5αpragnan-20-on	IP	50% hpbcd	20	150,7
3a-Hydroksy-3p-trifluorometylo- 5βρηβρηηη-2 0-on	IP	50% hpbcd	.20	197,6
3α,21-Dihydroksy-3P-etynylo-5Ppregnan-20-on	IP	50% hpbcd	10	162
3α,21-Dihydroksy-3βtrifluorometyło-19-nor-5βpregnan-20-on	IP	50% hpbcd	10	140
3a-Hydroksy-3β-trifluorometylo19-nor-5a-pregnan-20-on	IP	50% hpbcd	10	161
21-0ctan 3a,21-dihydroksy-3P- etynylo-5p-pregnan-20-onu	IP	50% hpbcd	10	159
3α,21-Dihydroksy-3β- trifluorometyło-δβ-pregnan-20-on	IP	50% hpbcd	10	237
3P-Etynylo-3a-hydroksy-3Ppregnan-11,20-dion	IP	50% hpbcd	5	235,9
21-Octan 3a,21-dihydroksy-3P- trfluorometyło-5β-pregnan-20-onu	IP	50% hpbcd	5	143,3
3a-Hydroksy-3P-trifluorometylo53pregnan-ll,20-dion	IP	50% hpbcd	10	112
3α,20a-Dihydroksy-3P,21-dimetylo5α-pregnan	IIP 1 1	dmso	10	73
Sól sodowa 21-hemibursztynianu 3α,21-dihydroksy-3P- trifluorometyło-19-nor-5βpregnan-20-onu	IP i	woda	20 1	161,1

182 898 ciąg dalszy tabeli 4

Sól sodowa 21-hemibursztynianu 3α, 21-dihydroksy-3β-etynylo-5βpregnan-20-onu	PO	woda	10	159
Sól sodowa 21-hemifumaranu 3α,21dihydroksy-3P-trifluorometylo5 βρΓegnan-2 0-onu	IP	woda	50% hpbcd	126
3α, 21-Dihydroksy-3β-fluorometylo5a-pregnan-20-on	IP	50% hpbcd	10	109
3 cc, 20b-Dihydroksy-33-etynylo-53pregnan	IP	dmso	10	178
Sól sodowa 21-hemibursztynianu 3α,21-dihydroksy-3β- trifluorometylo-5β-pregnan-20-onu	IP	woda	20	172,8

c/ Test konfliktu Gellera-Seiftera

Wykorzystano model zwierzęcy ludzkiego niepokoju stosując warunkowy odruch konfliktu u szczurów w celu upewnienia się co do anksiolitycznych (obniżających niepokój) własnościach leków. U szczurów wytwarzano odruch warunkowy na nacisk prętem do wyraźnego nasilenia według dwóch harmonogramów behavioralnych (Geller and Seifter, Psychopharmacologia 1:482-492 (1960)). Pierwszy harmonogram obejmował naciskanie prętem o zmiennej proporcji, bez karania. Drugi harmonogram stanowił składnik o ustalonej proporcji przy każdym naciśnięciu prętem dającym wyraźne nasilenie i karanie. Składnik karania powoduje stan konfliktu u zwierzęcia. Składnik bez karania pozwala na obserwowanie każdej reakcji środka tłumiącego działanie jakie może posiadać lek. Reakcja obniżająca niepokój powinna zwiększyć reakcję ukarania bez wpływu na reakcję nie karania.

Test konfliktu prowadzono na samcach szczurów albinosów Sprague-Dawley (Charles River Labs, Wilmington, MA) o wadze 250-300 g i trzymano je na ścisłej diecie z pożywieniem w pastylkach Purina Lab Chow przy dostępnej wodzie za każdym razem utrzymując wagę ciała na poziomie 85% młodych dorosłych karmionych bez ograniczeń. Szczury były zamykane indywidualnie w 12 godzinnym cyklu jasno/ciemno przy świetle włączonym od 0700 - 1900.

Działania przeciw niepokojowe (karanie-łagodzenie) i reakcję środka tłumiącego 3a-OFI-5a-pregnan-20-onu i 3a-OH-5a-pregnan-20-onu mierzono u szczurów za pomocą testu konfliktu Gellera i Seiftera (1960). W tym 63 minutowym teście głodne szczury wykazywały reakcje naciskania dźwigni w celu otrzymania nagrody w postaci słodzonego mleka. Harmonogram ze wzmocnieniem składał się ze składników karzących i nie karzących zmieniających się w przybliżeniu co 15 minut. Szczury były trenowane w komorze do badań (Coulbourm Instruments) z dźwignią zamontowaną w ścianie, z małym wgłębieniem, które dostarczało 0,1 ml nagrody mlecznej (1 część skondensowanego mleka Eagle, 2 części wody), i metalową siatką za pomocą której karano - wstrząs na łapy. Do programowania i rejestrowania stosowano minikomputer DEC PDP 11/73 z SKED (State System).

182 898

Szczury początkowo uczyły się reagować na ciągle nasilany harmonogram i szybko postępujący do 30 sekund, 1 minuty, 2 minuty w harmonogramie zmiennych przerw (VI). Przy harmonogramie ciągłego nasilania, szczury otrzymywały nagrodę w postaci mleka po każdym naciśnięciu dźwigni; przy harmonogramie VI nagroda mleczna była dostępna w nieczęstych i zmiennych interwałach, ewentualnie przeciętnie raz na 2 minuty. Wówczas wprowadzono cztery 3 minutowe okresy „konfliktu” do nie karzącej bazy VI; pierwszy rozpoczęto po 3 minutach wykonywania VI a inne zmiennie pomiędzy 12 minutowymi okresami reakcji VI. W okresie konfliktu, który był sygnalizowany światłem i dźwiękiem, ponownie wprowadzono harmonogram ciągły nasilony i każde naciśnięcie dźwigni dostarczało zarówno nagrodę mleczną jak i krótką (0,25 msek) karę w postaci wstrząsu na łapę. Początkowa intensywność wstrząsu wynosiła 0,2 mA i była codziennie zwiększana w przyrostach 0,02 mA w celu stopniowego tłumienia naciskania dźwigni do 5 reakcji lub mniej na okres konfliktu. Ten trening zajął 4-6 tygodni, po którym ustabilizowane niskie udziały odpowiedzi obserwowano w trakcie okresów konfliktu i stale wysokie udziały okresów bez karania. Wywołane lekiem zwiększenie udziału reakcji karzących przyjęto jako wskaźnik działania przeciw niepokoju, podczas gdy obniżenie udziału reakcji nie karzących przyjęto jako wskaźnik reakcji depresji lub opanowania.

Zsumowano działania 3a-OH-5a-pregnan-20-onu i 3a-OH-5p-pregnan-20-onu w teście konfliktu. Oba związki dają duże zwiększenie w udziale reakcji karania, sugerujące, że oba byłyby czynne jako środki przeciw niepokojowi. Szczytowe działanie 3a-OH-5P-pregnan-20-onu zaobserwowano w dawce 2 mg/kg a 3a-OH-5a-pregnan-20-onu w dawce 4,4 mg/kg po podaniu podskórnym. (Dla analizy statystycznej i z uwagi na małą liczbę testów dla każdej dawki, wszystkie testy z każdym związkiem były łączone dla porównania z testami kontrolnymi nośników, stosując t-test dla pokrewnych oznaczeń: dla 3a-OH-5a-pregnan-20-onu, p< 0,02 i dla 3a-OH-5p-pregnan-20-onu, p < 0,008).

Tabela 5 pokazuje zestawienie działań środków według wynalazku przeciw niepokojowi przy użyciu testu Gellera-Seiftera w opisanych powyżej warunkach doświadczenia.

Tabela 5

Działanie obniżające niepokój u szczurów w teście Gellera/Seiftera

Związki	Droga	Nośnik	Dawka mg/kg	Geller/Seifter % próby kontrolnej
3a-Hydroksy-53-pregnan-20-on	SC	50% hpbcd	2	860,5
3 α-Hydroksy-5 α-pregnan-2 0-on	SC	50% hpbcd	5	471,8
3β-Etynylo-3«-hydroksy-5βpregnan-2 0-on	SC	50% hpbcd	2	751,1
3α-Hydroksy-3β-etynylo-5αpregnan-2 0-on	SC	50% hpbcd	8	830,2
3a-Hydroksy-33-metylo-5apregnan-2 0-on	SC	50% hpbcd	4	1384,6
3a-Hydroksy-3β- trifluorometylo-19-nor-5βpregnan-20-on	SC	5 0% hpbcd	4	1073,1

182 898 ciąg dalszy tabeli 5

33-Etenylo-3a-hydroksy-5apregnan-20-on	PO	50% hpbcd	12	1092,2
3 α-Hydroksy-3 β-fluorome tylo5a-pregnan-2 0-on	SC	50% hpbcd	8	1005
3 cc-Hydr oksy- 3 β- trifluorometylo-5β-pregn-llen-20on	SC	50% hpbcd	4	508,3
3α-Hydroksy-3β- trif luorometylo-5β-pregnan- 2 0-on	SC	50% hpbcd	4	663,2
3α,21-Dihydroksy-3β- trifluorometylo-5β-pregnan- 2 0-on	SC	50% hpbcd	16	982,4
3α-Hydroksy-3βtrifluorometylo-5β-19norpregn-17(20)-en	SC	50% hpbcd	16	1130,3
21-0ctan 3α,21-dihydroksy-3βtrifluorometylo-5β-pregnan20-onu	SC	50% hpbcd	8	882,8
21-Hemibursztynian 3a,21dihydroksy-3β-etynylo5 βρτegnan-2 0-onu	po	Woda	16	1350,0
Sól sodowa 21- hemibur sz tyni anu 3 a, 21 - dihydroksy-3β- trif luorometylo-5β-pregnan- 20-onu	po	Woda	8	840,0
Sól sodowa 21hemibur s z tyni anu 3a,21dihydroksy-3βtrifluorometylo-5β-19norpregnan-20-on	po	Woda	8	2493,4
Kwas 3α-hydroksy-3β-πletylo5apregnano-20-spiro-2'(1',3'-tiazolidyno-4'karboksylowy	SC	50% hpbcd	16	900,0

d/ Test Vogela

Test Vogela bazuje na rozwinięciu konfliktu pomiędzy zachowaniem wysoce motywowanym a niechęcią. W tym teście wymagana jest silna motywacja. Zwierzę pozbawia się wody na 12-16 godzin w celu wytworzenia motywacji do picia. W trakcie okresu treningowego zwierzęta poddano testowaniu otoczenia tak, że stają się zaznajomione z piciem strumienia i minimalizowania strachu na nowe otoczenie. Po treningu, zwierzętom dano dostęp do wody na 2 godziny. W tym czasie zwierzęta będą piły i jadły ich normalną ilość wody i pożywienia, kompensując czas, w którym były tego pozbawione. Jednak ten test stale dąje silną motywację do picia w okresie testowania.

182 898

Będąc pozbawionymi wody przez 12 do 16 godzin, zwierzęta umieszczono w klatkach do badań gdzie pozwolono im pić przez 5 minut. Okres ten stosowano dla przyzwyczajenia zwierzęcia do otoczenia i picia ze strumienia. Po okresie treningu zwierzęta w zamieszkiwanych klatkach mają dostęp do wody i pożywienia przez 2 godziny. Pożywienie jest dostępne cały czas. Po 24 godzinach, podano lek zwierzęciu wewnątrz mózgowokomorowo.

Po wskazanym opóźnieniu po iniekcji zwierzęta ponownie umieszczono w klatce do badań na 10 minut. Komputer liczył każde liźnięcie zwierzęcia, i po dwudziestu liźnięciach aplikował łagodny bodziec elektryczny przez język i/lub łapy. Elektryczny bodziec stanowił prąd 0,6 mA trwający przez 100 msekund. Takie postępowanie wytwarzało w zwierzęciu stan konfliktu, który był redukowany przez podawanie stosowanych w klinikach środków obniżających niepokój (np. valium). Dla wykreślenia krzywych dawka-reakcja, oddzielnej grupie zwierząt wstrzykiwano zwiększające się dawki badanego leku i testowano przez ustalony z góry okres czasu.

Dane niektórych reprezentatywnych związków stosowanych w tych pomiarach zsumowano w tabeli 6.

Tabela 6

Działanie obniżające niepokój w teście Yogela u szczurów

Związki	Droga	Nośnik	Dawka mg/kg	Vogel % próby kontrolnej
3 a,2 0 a-Dihydroksy-2 β - i z opropoksy5a-pregnan	i . c . v.	g-CD	10ug	169,0
3a, 2 0-Dihydroksy-20-metylo-5ccpregnan	i.c.v.	g-CD	20 ug	178,0
3 a, 2 Oa-Dihydroksy-21-metyło-5apregnan	i . c. v.	g-CD	10 ug	157,9
3a,20a(S)-Dihydroksy-5a-pregnan	i . c . v.	b-CD	10 ug	193,0
3 a-Hydroksy-5a-pregnan-2 0-on	i.c.v.	b-CD	10 ug	431,1
3α, 2 0a-Dihydroksy-53-pregnan	i . c . v.	g-CD	10 ug	283,3
2p-Fluoro-3az 20a-dihydroksy-5apregnan	i . c . v.	g-CD	20 ug	264
3α,20a-Dihydroksy-21-etylo5a-pregnan	i . c . v	g-CD	20ug	225,8
3α,203-Dihydroksy-53-pregnan	i.c-v.	g-CD	20ug	267,3

Proleki

Działanie przeciwdrgawkowe i obniżające niepokój proleków wyjściowych związków 3a-hydroksy-5a-pregnan-20-onu i 3cc,21-dihydroksy-5a-pregnan-20-onu i ich pochodnych oceniano stosując tę samą procedurę jak opisano powyżej. Procentową ochronę kilku proleków 3a-hydroksy-5a-pregnan-20-onu przeciw atakowi wywołanemu metrazolem wykreślono względem czasu po podaniu związków (tabela 7).

182 898

Testowano również kilka dodatkowych proleków i wyniki przedstawiono w tabeli 8. Modyfikacja podstawowych związków 3a-hydroksy-5a-pregnan-20-onu i 3a,21-dihydroksy-5a-pregnan-20-onu przy grupach hydroksylowych w pozycji 3α i 21 różnymi estrami zachowuje ich aktywność biologiczną a w niektórych przypadkach taka modyfikacja zwiększa czas ochrony przewidziany dla związku. Zatem, związki według wynalazku mogą być modyfikowane dla zapewnienia działania przeciwdrgawkowego i obniżającego niepokój na pewien przeciąg czasu, z różnym stopniem ochrony.

Tabela 7

Działanie anty-metrazolowe prolekowych estrów 3a-hydroksy-5a-pregnan-20-onu (3a-(RCOO)-5a-pregnan-20-onu)

R	% ochrony 60 mg/kg 1 godzina
Metyl	25
Etyl	75
Propyl	75
Butyl	33
2-Propyl	75
4-Heptyl	16 (4 godziny)
Cyklobutyl	17
Fenyl	33
4-Chlorofenyl	50
4-Metoksyfenyl	17
3-Pirydyl	50 (20 godzin)
3- (l-Metylo-l,4-dihydropirydynyl)	63 (20 godzin)

W przeciwieństwie do benzodiazepin, neuroaktywne sterydy mogą również wywołać znieczulenia. Ich zdolność do wywołania znieczulenia przypuszczalnie wynika z ich zdolności do otwarcia kanału jonu chlorowego pod nieobecność GABA, której to zdolności nie posiadają benzodiazepiny. Zatem, neurosterydy mogą działać bezpośrednio pod nieobecność GABA przy tym receptorze a również „nie bezpośrednio” w obecności GABA. To „nie bezpośrednie działanie” nazywane jest „modulowaniem” receptora. Lambert i wsp. Trends Pharmacology Science 8:224-227 (1987).

Związki według wynalazku i stosowane w wynalazku mogą być także stosowane przy wskazaniach przeciwbólowych w wysokich dawkach. Jednak korzystną drogą podawania dla wywołania znieczulenia jest podawanie dożylne (i.v.). U zwierząt, własności leków przeciwbólowych mierzy się zdolnością leku do wytwarzania odruchu utraty postawy i ułożenia. Odruch postawy i ułożenia definiowany jest niezdolnością zwierzęcia do przyjęcia postawy w ciągu 30 sekund przy położeniu zwierzęcia na grzbiecie. Myszom podawano lek i. v. w boczną żyłę ogonową. Po podaniu, myszy ułożono na ich grzbietach i obserwowano utratę odruchu postawy i ułożenia. Przykłady ilustrujące przedstawiono w tabeli 8.

182 898

Tabela 8

Działanie znieczulające neuroaktywnych sterydów u myszy

Związki	Droga	Nośnik	Dawka mg/kg	Odruch utraty postawy
3α,21-Dihydroksy-3P-etynylo-5p- pregnan-2 0-on	iv	20% kremofor	10	100
3α-(Chloroetynylo)-3P-hydroksy-5P- pregnan-20-on	iv	Roztwór mikronizuj ący	20	100
3P~Etynylo-3a-hydroksy-5P-pregnan-20on	iv	10% hpbcd	30	100
3a-Hydroksy-3p-metylo-5a-preg-16-en- 20-on	iv	roztwór mikroni- zuj ący	50	100
3a-Hydroksy-5a-pregn-9-en-20-on	iv	roztwór mikronizuj ący	10	100
3a-Hydroksy-17(20)(Z)- metoksyme_tyleno-19-nor-5a-androstan	iv	roztwór mikronizuj ący	5	75
3a-Hydroksy-33-metylo-5p-pregnan-2 0on	iv	roztwór mikroni- zuj ący	2,5	100
2P-Etoksy-3a-hydroksy-5a-pregnan-20on	iv	20% kremofor	5	100
2p-Fluoro-3a-hydroksy-5cc-pregnan-20on	iv	roztwór mikroni- zuj ący	5	100
3a-Hydroksy-3P-metylo-21- metoksymetylo-5a-pregnan-20-on	iv	roztwór mikronizuj ący	20	100

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Cena 6,00 zł.

Claims (8)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Związek z grupy androstanów i pregnanów obejmujący;

   3a-hydroksy-3p-(3' -metylobut-3' -en-Γ -ynylo)-5p-pregnan-20-on; 3o.-hydroksy-3[3-(3' -metylobut-3' -en-Γ -ynylo)-5a-pregnan-20-on; 3a-hydroksy-3p-trifluorometylo-5a-pregnan-20-on; 3a-hydroksy-3 3-trifluorometylo-5 β-pregn-1 l-en-20-on; 3p-(cyklopropylo)etynylo-3a-hydroksy-3p-pregnan-20-on; 3α, 20a-dihydroksy-33-etynylo-5a-pregnan; 3α, 21-dihydroksy-3 P-etenylo-5a-pregnan-20-onu; 3α, 21 -dihydroksy-3 β-fluorometylo-5a-pregnan-20-on; lub ich fizjologicznie dopuszczalne 3-estry, 20-estry, 21-estry, 3,20-diestry lub 3,21-diestry.
2. 2. Związek z grupy obejmującej: sól sodową 21 -hemibursztynianu 3α, 21-dihydroksy-3 p-trifluorometylo-19-nor-5p-pregnan-20-onu; bis hemibursztynian 3α, 20a-dihydroksy-21-metylo-5a-pregnanu; 21-hemibursztynian 3α, 21-dihydroksy-3 3-etenylo-5a-pregnan-20-onu; 21-octan 3α, 21-dihydroksy-3 p-metylo-5a-pregnan-20-onu; sól sodową 21-hemifumaranu 3α, 21-dihydroksy-3 p-trifluorometylo-5p-pregnan-20-onu; metylo-21-bursztynian 3α, 21 -dihydroksy-3 p-trifluorometylo-5p-pregnan-20-onu; 21-propionian 3α, 21 -dihydroksy-3 β-trifluoromety lo-5β-pregnan-20-onu; 21-hemibursztynian bis (3α, 21 -dihydroksy-3 β-trifluorometylo-5p-pregnan-20-onu; 21-hemibursztynian bis (3α, 21 -dihydroksy-3p-etynylo-5p-pregnan-20-onu; i N-(3a-hydroksy-3 β-mety lo-5a-pregnan-20-ylideno)etanoloaminę.
3. 3. 3a-hydroksy-3p-(3' -metylobut-3' -en-1' -ynylo)-5p-pregnan-20-on.
4. 4. 3a-hydroksy-3β-trifluorometylo-5a-pregnan-20-on.
5. 5. 3a-hydroksy-3 β-trifluoromety lo-5 β-pregn-11 -en-20-on.
6. 6. Sól sodowa 21-hemibursztynianu 3α, 21-dihydroksy-3 β-trifluorometylo-19-nor-5 β-pregnan-20-onu.
7. 7. 3β-(cyklopropylo)etynylo-3α-hydroksy-5β-pregnan-20-on.
8. 8. Środek farmaceutyczny do modulowania pobudliwości mózgu zwierzęcego, zwłaszcza do łagodzenia stresu, niepokoju, aktywności ataków, redukowania lub łagodzenia bezsenności, zakłóceń nastroju, w szczególności depresji, objawów przed menstruacyjnych i depresji poporodowych oraz wywoływania znieczuleń,znamienny tym, że jako substancję czynną zawiera związek z grupy obejmującej:

   3α-hydroksy-3β-(3' -metylobut-3'-en-Γ-ynylo)-5β-pregnan-20-on; 3α-hydroksy-3β-(3 '-mety lobut-3'-en- l'-ynylo)-5a-pregnan-20-on; 3a-hydroksy-3 β-trifluorometylo-5a-pregnan-20-on; 3a-hydroksy-3 β-trifluorometylo-5 β-pregn-11 -en-20-on; 3 β-(cyklopropylo)etynylo-3a-hydroksy-3 β-pregnan-20-on; 3a,20a-dihydroksy-3β-etynylo-5a-pregnan; 3a,21-dihydroksy-3β-etenylo-5a-pregnan-20-onu; 3a,21-dihydroksy-3 β-fluoro-metylo-5a-pregnan-20-on; lub ich fizjologicznie dopuszczalne 3-estry, 20-estry, 21-estry, 3,20-diestry lub 3,21-diestry oraz sól sodową 21-hemibursztynianu 3a,21-dihydroksy-3 β-trifluoromety lo-19-nor-5β-pregnan-20-onu; bis hemibursztynian 3a,20a-dihydroksy-21-metylo-5a-pregnanu; 21-hemibursztynian 3α, 21-dihydroksy-3 β-etenylo-5α-pregnan-20-onu; 21-octan 3a,21-dihydroksy-3 β-mety lo-5a-pregnan-20-onu; sól sodową 21-hemifumaranu 3α,21 -dihydroksy-3 β-trifluoromety lo-5 β-pregnan-20-onu; mety lo-21 -bursztynian 3α,21 -dihy droksy-3 β-trifluorometylo-5 β-pregnan-20-onu; 21 -propionian 3α,21 -dihydroksy-3 β-trifluorometylo-5 β-pregnan-20-onu; 21 -hemibursztynian bis(3a,21 -dihydroksy-3 β-trifluoromety lo-5 β-pregnan-20-onu; 21-hemibursztynian bis (3a,21 -dihydroksy-3 β-etynylo-5β-pregnan-20-onu; i N(3a-hydroksy-3β-metylo-5α-pregnan-20-ylideno)etanoloaπlinę.

   182 898