PT808325E - Series de androstanos e pregnanos para modulacao alosterica do receptor de gaba - Google Patents

Description

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DESCRICÃO "Séries de androstanos e pregnanos para modulação alostérica do receptor de GABA." 0 presente invento refere-se a métodos, composições e compostos para modular a excitabilidade cerebral animal por via do complexo de receptor de ácido gama-aminobutírico A (GABAa) - ionóforo de cloreto (GRC). O presente invento refere-se, especificamente, a métodos, composições, e compostos para modular a excitabilidade cerebral através de ligação ao local receptor de neuroesteróides no GRC.

Antecedentes do Invento A excitabilidade cerebral define-se como o nível de vigília de um animal, um contínuo que varia desde o coma até às convulsões, e é regulado por vários neurotransmissores. Em geral, os neurotransmissores são responsáveis por regular a condutância de iões através de membranas neuronais. Em repouso, a membrana neuronal possui um potencial (ou tensão de membrana) de aproximadamente -80 mV, sendo o interior da célula negativo em relação ao exterior da célula. O potencial (tensão) é o resultado do equilíbrio de iões (K+, Na + , Cí, aniões orgânicos) através da membrana neuronal semipermeável. Os neurotransmissores são armazenados em vesículas pré-sinápticas e são libertados sob a influência de potenciais de acção neuronal. Quando libertado para a fenda sináptica, um transmissor químico excitador tal como a acetilcolina causará a despolarização da membrana (variação de potencial de -80 mV para -50 mV). Este efeito é mediado por receptores nicotínicos pós-sinápticos que são estimulados por acetilcolina, a aumentar a permeabilidade da membrana a iões Na+. O potencial reduzido da membrana estimula a excitabilidade neuronal na forma de um potencial de acção pós-sináptica.

No caso do GRC, o efeito na excitabilidade cerebral é mediado por GABA, um neurotransmissor. O GABA tem uma profunda influência na excitabilidade cerebral global porque até 40% dos neurónios no cérebro utilizam GABA como neurotransmissor. O GABA regula a excitabilidade de neurónios individuais, regulando a condutância de iões cloreto através da membrana neuronal. 0 GABA interage com o seu local de reconhecimento no GRC para facilitar o fluxo

W W $*?* Jto ν . ί,ν <ί/ 85 094 ΕΡ 0 808 325/ΡΤ 2 de iões cloreto, até um gradiente electroquímico do GRC, para a célula. Um aumento intracelular nos níveis deste anião causa hiperpolarização do potencial transmembranar, tornando o neurónio menos susceptívol a entradas excitadoras (ou seja, excitabilidade de neurónio reduzida). Por outras palavras, quanto maior a concentração de ião cloreto no neurónio, menor a excitabilidade cerebral (o nível de vigília).

Está bem documentado que o GRC é responsável pela mediação de ansiedade, actividade apopléctica, e sedação. Deste modo, o GABA e as drogas que actuam como o GABA ou facilitam os efeitos de GABA (por exemplo, os barbituratos e benzodiazepinas (BZ) terapeuticamente úteis como o Valium) produzem os seus efeitos terapêuticos úteis interagindo com locais reguladores específicos no GRC.

Observou-se também que uma série de metabolitos esteróides interagem com o GRC para alterar a excitabilidade cerebral (Majewska, M.D. et al., Science 232:1004-1007 (1986); Harrison, N.L. et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 241:346-353 (1987)). Antes do presente invento, os trabalhadores no campo não reconheciam a utilidade terapêutica destes metabolitos esteróides, devido a uma não total compreensão da potência e do local de acção. 0 presente invento refere-se, em parte, a uma aplicação farmacêutica do conhecimento ganho a partir da compreensão mais desenvolvida da potência e do local de acção de certos compostos esteróides.

Demonstrou-se que a hormona ovariana progesterona e os seus metabolitos têm profundos efeitos na excitabilidade cerebral (Backstrom, T. et al., Acta Obstet. Gynecol. Scand. Suppl. 130:19-24 (1985); Pfaff, D.W. e McEwen, B.S.; Science 219:808-814 (1983); Gyermek et al., J. Med. Chem. 11:117 (1968); e Lambert, J. et al., Trends Pharmacol. 8:224-227 (1987)). Os níveis de progesterona e dos seus metabolitos variam com as fases do ciclo menstrual. Documentou-se bem que a progesterona e os seus metabolitos diminuem antes do início da menstruação. Também se documentou bem a recorrência mensal de certos sintomas físicos antes do início da menstruação. Estes sintomas, que se associaram ao síndroma pré-menstrual (PMS), incluem tensão, ansiedade, e enxaqueca (Dalton, K., Premenstrual Syndrome and Progesterone Therapy, 2' edição, Chicago: Chicago yearbook, 1984). Pacientes com PMS têm uma recorrência mensal de sintomas que estão presentes no

85 094 ΕΡ 0 808 325/ΡΤ 3 período pré-menstrual e ausentes no pós-menstrual.

De forma semelhante, corrclacionou-se também, temporariamente, uma redução na progesterona com um aumento na frequência de apoplexia em epilépticos femininos (ou seja, epilepsia catamenial; Laidlaw, J., "Catamenial epi/epsy", Lancet, 1235-1237 (1956)). Observou-se uma correlação mais directa com uma redução nos metabolitos de progesterona (Rosciszewska et al., J. Neuroí. Neurosurg. Psych. 49:47-51 (1986)). Adicionalmente, para pacientes com epilepsia generalizada primária de pequeno mal, correlacionou-se a incidência temporal das apoplexias com a incidência dos sintomas de síndroma pré-menstrual (Backstrom, T. et al., J. Psychosom. Obstet. Gynaecol. 2:8-20 (1983)). Verificou-se que o esteróide desoxicorticosterona é eficaz no tratamento de pacientes com períodos de actividade epiléptica correlacionados com os seus ciclo menstruais (Aird, R.B. e Gordan, G., J. Amer. Med. Soc. 145:715-719 (1951)).

Um síndroma também relacionado com níveis baixos de progesterona é a depressão pós-parto (PND). Imediatamente após o parto, os níveis de progesterona diminuem drasticamente conduzindo ao início de PND. Os sintomas de PND variam desde a depressão moderada até à psicose que requer hospitalização; a PND está associada a ansiedade grave e irritabilidade. A depressão associada a PND não é susceptível de tratamento através de antidepressivos clássicos e as mulheres que sofrem de PND apresentam uma maior incidência de PMS (Dalton, K., 1984).

No conjunto, estas observações implicam um papel crucial para a progesterona e a desoxicorticosterona e, mais especificamente, para os seus metabolitos, na regulação homostática da excitabilidade cerebral, o que se manifesta como um aumento na actividade apopléctica ou nos sintomas associados a epilepsia catamenial, PMS, e PND. A correlação entre os reduzidos níveis de progesterona e os sintomas associados a PMS, PND, e epilepsia catamenial (Backstrom et al.. 1983; Dalton, K., 1984) impeliu a utilização de progesterona no seu tratamento (Mattson et a!., em Advances in epileptology: XVh Epi/epsy International Symposium, Raven Press, New York, 279-282, 1984, e Dalton, K., 1984). No entanto, a progesterona não é, de forma consistente, eficaz no tratamento dos síndromas supramencionados. Por exemplo, não existe uma relação dose-resposta para a progesterona no 85 094 ΕΡ 0 808 325/ΡΤ & tratamento de PMS (Maddocks, et a!., Obstet. Gynecol. 154:573-581 (1986); Dennerstein, et aí., Brítish Medica! Journal, 290:16-17 (1986)).

As publicações e referências referidas, acima e adiante, neste fascículo, são aqui incluídas por referência.

Sumário do Invento

De acordo com um primeiro aspecto do presente invento, proporciona-se um composto seleccionado do grupo que consiste em: 3a-hidroxi-3p-(3'-metilbut-3'-en-1 '-inil)-5p-pregnan-20-ona; 3a-hidroxi-3p-(3'-metilbut-3'-en-1 '-inil)-5a-pregnan-20-ona; 3p-(ciclopropil)etinil-3a-hidroxi-5p-pregnan-20-ona; e 3a,21 -di-hidroxi-3p-fluorometil-5a-pregnan-20-ona; ou um seu 3-éster, 20-éster, 21-éster, 3,20-diéster ou 3,21-diéster fisiologicamente aceitável.

De acordo com um segundo aspecto do presente invento, proporciona-se um composto seleccionado do grupo que consiste em: 21-hemissuccinato de 3a,21-di-hidroxi-3p-trifluorometil-19-nor-5p-pregnan-20-ona, sal de sódio; bis-hemissuccinato de 3a,20a-di-hidroxi-21 -metil-5a-pregnano; 21-hemissuccinato de 3a,21 -di-hidroxi-3p-etenil-5a-pregnan-20-ona; 21-hemifumarato de 3a,21-di-hidroxi-3p-trifluorometii-5p-pregnan-20-ona, sal de sódio; 21 -metilsuccinato de 3a,21 -di-hidroxi-3p-trifluorometil-5p-pregnan-20-ona; 21-propionato de 3a,21 -di-hidroxi-3p-trifluorometil-5p-pregnan-20-ona; 21-hemissuccinato de bis(3a,21 -di-hidroxi-3p-trifluorometil-5p-pregnan-20-ona); e 21-hemissuccinato de bis(3a,21 -di-hidroxi-3p-etinil-5p-pregnan-20-ona).

Os compostos preferidos do invento incluem 3a-hidroxi-3p-(3'-metilbut-3'-en-1'-inil)-5p-pregnan-20-ona; 21-hemissuccinato de 3a,21-di-hidroxi-3p-

85 094 ΕΡ 0 808 325/ΡΤ 5 trifiuorometil-19-nor-5p-pregnan-20-ona, sal de sódio; e 3p-(ciclopropil)etinil-3a-hidroxi-5p-pregnan-20-ona.

Num terceiro aspecto, o invento proporciona uma composição farmacêutica, compreendendo uma quantidade eficaz de um composto do primeiro e segundo aspectos do invento; e um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitável.

Em outros aspectos, o invento proporciona a utilização de um composto do primeiro e segundo aspectos do invento, no fabrico de um medicamento para - o tratamento de tensão ou ansiedade num sujeito animal; - aliviar a actividade apopléctica num sujeito animal; - reduzir ou aliviar a insónia num sujeito animal; - o tratamento de perturbações no humor, de preferência depressões, num sujeito animal; - o tratamento de síndroma pré-menstrual ou depressão pós-parto num sujeito animal; e - induzir anestesia num sujeito animal. O presente invento refere-se a métodos, composições, e compostos para modular a excitabilidade cerebral. Mais especificamente, o invento refere-se à utilização de derivados de esteróides hidroxilados em 3a, que actuam num local recentemente identificado do complexo GR, para modular a excitabilidade cerebral de uma forma que aliviará a tensão, ansiedade, insónia, perturbações de humor (tais como depressão) que sejam susceptíveis a agentes activos em GR, e actividade apopléctica. As composições e compostos eficazes para tais tratamentos encontram-se dentro do âmbito do invento.

Os compostos usados no invento e que formam parte do invento são moduladores da excitabilidade do sistema nervoso central visto serem mediados pela sua capacidade de regular canais de iões cloreto, associados ao complexo receptor de GABA. As experiências da requerente estabeleceram que os compostos utilizados no invento e os do invento têm actividade anticonvulsiva e ansiolítica semelhantes às acções de agentes ansiolíticos conhecidos, tais como as BZ, mas actuam num local distinto, no complexo GR. A relação de metabolitos endógenos de progesterona com processos //· ,,> „ <t. i&f

85 094 ΕΡ 0 808 325/ΡΤ 6 associados à reprodução (ciclo do estro e gravidez) está bem estabelecida (Marker, R.E., Kamm, O., e McGrew, R.V., "Isolation of epi-pregnanol-3-one-20 trom human pregnancy urine", J. Am. Chem. Soc. 59:616-618 (1937)). Antes do presente invento, no entanto, não era conhecido como tratar desordens por modulação da excitabilidade cerebral através da utilização de metabolitos de progesterona. Deste modo, este invento refere-se a métodos, composições, e compostos para tratar desordens modulando a excitabilidade cerebral, utilizando os compostos deste invento. As desordens representativas tratadas no presente invento são epilepsia, ansiedade, síndroma pré-menstrual (PMS), depressão pós-parto (PND), perturbações de humor (tais como depressão) que são susceptíveis a agentes activos no GR, e insónia. Os compostos do invento podem também ser utilizados para induzir anestesia.

Descrição detalhada das concretizações preferidas

Os compostos do invento e os usados no invento são derivados de várias pregnan-20-onas hidroxiladas em 3a; 3a-21-pregnanodiol-20-onas; 3a-20-pregnanodiois; e androstanos hidroxilados em 3a, e seus derivados éster, derivados esses que são referidos como prodrogas. A expressão "prodroga" denota um derivado de uma droga de acção directa conhecida, derivado esse que tem características de entrega e valor terapêutico melhorados quando comparado com a droga, e que se transforma na droga activa por um processo químico ou enzimático; ver Notari, R.E., "Theory and Practice of Prodrug Kinetics",Methods in Enzymology, 112:309-323 (1985); Bodor, N., "Novel Approaches in Prodrug Design", Drugs of the Future, 6(3):165-182 (1981); e Bundgaard, H., "Design of Prodrugs: Bioreversible-Derivatives for Various Functional Groups and Chemical Entities", em Design of Prodrugs (H. Bundgaard, ed.), Elsevier, New York (1985). Deve-se salientar que alguns dos derivados sintéticos que fazem parte do presente invento podem não ser verdadeiras prodrogas porque, em adição às características anteriores, possuem também actividade intrínseca. No entanto, para os fins deste pedido serão referidos como prodrogas.

Os nossos estudos (Gee, K.W. et a/., European Journal of Pharmacology, 136:419-423 (1987)) demonstraram que os esteróides hidroxilados em 3a utilizados no invento são ordens de grandeza mais potentes como moduladores do complexo GR, do que relatado por outros (Majewska, M.D. et ai (1986) e 4/$y 7 85 094 „ -'J- ^ _ _ /? ί' (p~ ' ú* *“ ΕΡ 0 808 325/ΡΤ

Harrison, N.L. et al (1987)). Majewska et al. e Harrison et aí ensinam que os esteróides hidroxilados em 3a, reduzidos em 5, apenas são capazes de níveis de eficácia muilo menores. Os nossos dados experimentais in vitro e in vivo demonstram que a elevada potência desses esteróides permite que sejam terapeuticamente úteis na modulação de excitabilidade cerebral por via do complexo GR. Os esteróides mais potentes, úteis no presente invento, incluem os derivados dos principais metabolitos de progesterona e de desoxicorticosterona. Estes esteróides podem ser especificamente utilizados para modular a excitabilidade cerebral em tensão, ansiedade, insónia, perturbações de humor (tais como depressão) que são susceptíveis a agentes activos no GR, e desordens apoplécticas de uma maneira terapeuticamente benéfica. Para além disso, demonstrámos que estes esteróides interagem num único local do complexo GR, distinto de outros locais conhecidos de interaeção (isto é, barbiturato, BZ, e GABA) onde os efeitos terapeuticamente benéficos na tensão, ansiedade, sono, perturbações de humor e desordens de apoplexia foram previamente induzidos (Gee, K.W. e Yamamura, H.I., em In CentraI Nervous System Disorders, páginas 123-147, D.C. Horvell, ed, 1985; Loyd, K.G. e Morselli, P.L., em Psychopharmacology: The Third Generation of Progress, páginas 183-195, H.Y., Meltzer, ed, Raven Press, N.Y., 1987). Estes compostos são desejáveis pela sua duração, potência e actividade oral (junto com outras formas de administração).

Definições

Em conformidade com o presente invento e como se utiliza aqui, os seguintes termos e expressões definem-se com o seguinte significado, a menos que se estabeleça explicitamente o contrário. 0 termo "alquilo" refere-se a grupos alifáticos saturados incluindo grupos de cadeia linear, cadeia ramificada, e cíclicos, podendo todos estar opcionalmente substituídos. Grupos alquilo adequados incluem metilo, etilo, e afins, e podem estar opcionalmente substituídos. O termo "alcenilo" refere-se a grupos insaturados que contêm pelo menos uma dupla ligação carbono - carbono e incluem grupos de cadeia linear, cadeia ramificada, e cíclicos, podendo todos estar opcionalmente substituídos. O termo "alcinilo" retere-se a grupos hidrocarboneto insaturados que 8 Μ j?!/ 85 094 ΕΡ 0 808 325/ΡΤ C ,_4 t contêm pelo menos uma tripla ligação carbono - carbono e incluem grupos de cadeia linear, cadeia ramificada, e cíclicos, podendo todos eles ter insaturação adicional. Quandu presentes na posição 3β, os grupos alcinilo podem estar substituídos com um radical C, halogenado ou não halogenado, um radical C2-C5 de cadeia linear, saturado ou insaturado, halogenado ou não halogenado, um radical C3-C6 cíclico (cicloalquilo), ou um radical C5-C6 aromático ou um radical heterocíclico de 4, 5 ou 6 membros, ligado por C- ou N-, contendo 1, 2 ou 3 heteroátomos seleccionados do grupo que consiste em oxigénio, azoto, e enxofre, excluindo radicais heterocíclicos com 2 ou mais átomos de 0 ou S adjacentes. Os grupos alcinilo preferidos possuem de dois a quatro átomos de carbono. O termo "acilo" refere-se ao grupo alcanoílo -C(0)R onde R é alquilo, alcenilo, alcinilo, arilo, ou aralquilo.

As expressões "opcionalmente substituído" ou "substituído" referem-se a grupos substituídos com um a três substituintes, seleccionados independentemente de alquilo inferior, arilo, alcenilo, alcinilo, alcoxi, amino, tio, halogéneo, halogenoalquilo, tiohalogenoaiquilo, acilo, nitro, hidroxi, e ceto. A expressão "ésteres farmaceuticamente aceitáveis" refere-se a ésteres dos compostos do primeiro aspecto do invento que resultam da combinação de um composto deste invento com um ácido orgânico ou inorgânico.

Compostos preferidos adicionais são os compostos do invento que sejam ésteres de grupos hidroxilo nas posições 3 e/ou 20. Os ésteres preferidos são os descritos pelos seus respectivos ácidos: acético, propiónico, maleico, fumárico, ascórbico, pimélico, succínico, glutárico, bismetilenossalicílico, metanossulfónico, etanodissulfónico, oxálico, tartárico, salicílico, cítrico, glucónico, itacónico, glicólico, p-aminobenzóico, aspártico, glutâmico, gama-aminobutírico, a-(2-hidroxietilamino)propiónico, glicina e outros α-aminoácidos, fosfórico, sulfúrico, glucurónico e 1 -metil-1,4-di-hidronicotínico.

Os seguintes métodos de síntese e exemplos referem-se à preparação de compostos que fazem parte do presente invento e que são utilizados no presente invento. 8b 094

EP 0 808 325/PT J-f- Métodos de síntese

Os compostos em conformidade com o invento podem ser preparados por qualquer método conveniente, por exemplo usando técnicas convencionais, tais como as descritas em "Steroids Reactions" Djerassi, publicado em 1963, por Holden-Day, Inc., San Francisco, ou "Organic Reactions in Steroid Chemistry", Fried and Edwards, publicado em 1972, por Van Nostrand-Reinhold Co., New York.

Os compostos do invento podem ser preparados por qualquer técnica adequada conhecida na arte. Métodos gerais

Prepararam-se os 20-hidroxipregnanos por redução de 20-cetopregnanos com agentes redutores convencionais.

Prepararam-se os 21-hemissuccinatos a partir de derivados de pregnan- 20- ona que foram primeiro bromados com bromo molecular para obter os 21- bromopregnanos correspondentes. Fizeram-se então reagir os compostos de bromo com vários ácidos dióicos, tais como o ácido succínico, na presença de uma amina, para produzir 21-hidroxiésteres. Converteram-se então os ésteres resultantes dos ácidos dióicos nos seus sais de sódio, por meios convencionais.

Os ésteres podem ser formados usando reacções bem conhecidas na arte entre o grupo hidroxilo dos compostos discutidos acima e um ácido orgânico, um halogeneto ácido, um anidrido ácido, ou um éster, onde os ácidos orgânicos são, por exemplo, ácido acético, propiónico, maleico, fumárico, ascórbico, pimélico, succínico, glutárico, bismetilenossalicílico, metanossulfónico, etanodissulfónico, oxálico, tartárico, salicílico, cítrico, glucónico, itacónico, glicólico, p-aminobenzóico, aspártico, glutâmico, γ-aminobutírico, a-(2-hidroxietilamino)propiónico, glicina e outros α-aminoácidos, fosfórico, sulfúrico, glucurónico, e 1-metil-1,4-di-hidronicotínico 85 094

é ΕΡ 0 808 325/ΡΤ 10

Substituintes em 3β

Halogenome ti!o

Os compostos 3p-mono-halogenometiio do presente invento podem ser preparados por tratamento de um 3-espiro-2'-oxiranoesteróide com uma fonte de iões halogeneto num solvente inerte, tal como halogeneto de tetrametilamónio em tolueno, e preferencialmente uma fonte de protões, tal como o ácido acético.

Alquilo saturado ou insaturado

Podem-se preparar outros esteróides substituídos em 3 pela adição de um reagente organometálico a um 3-cetoesteróide no qual se podem proteger outros grupos funcionais reactivos, quando necessário. Assim, os compostos 3-alcinilo podem ser preparados usando um acetileto de lítio em solventes inertes ou com um reagente preparado in situ a partir de 1,2-dibromoetileno e butil-lítio como reagente organometálico. De modo semelhante, os compostos 3-alcenilo podem ser preparados por reacção de um 3-cetoesteróide com um reagente organometálico de vinilo, tal como o brometo de vinilmagnésio. Para produzir os compostos contendo um grupo 3-alcenilo podem ser utilizados, também, compostos nos quais se remove a insaturação para o local de reacção, tais como brometo de alilmagnésio. De modo semelhante, a utilização de um alquilo de Grignard, tal como o iodeto de metilmagnésio, conduzirá a compostos 3-alquilo.

Trífluorometilo 0 grupo trifluorometilo pode ser preparado por reacção de um 3-cetoesteróide com trimetiltrifluorometilsilano, catalisada por ião fluoreto.

Compostos oxigenados em 21

Oxidação de 21-metilo com tetra-acetato de chumbo

Podem ser preparados vários compostos deste tipo por uma sequência de reacções na qual se oxida pregnan-20-ona com tetra-acetato de chumbo para produzir um derivado 21-acetoxi, por hidrólise do acetato para produzir um 21-álcool, e por acilação com um derivado de ácido carboxílico adequado, tal como um anidrido ou cloreto ácido, ou outro reagente capaz de substituir o hidrogénio do grupo hidroxilo, tal como cloreto de metanossulfonilo. 11 85 094 ΕΡ 0 808 325/ΡΤ

Pregnan- 7 7-enos

Estes podem ser formados pela reacção de um 1 7-cetoosteróide com um reagente de Wittig tal como o ileto resultante de um tratamento de brometo de /7-propiltrifenilfosfónio com uma base forte tal como o t-butóxido de potássio. 3,20-Dióis

Um pregnan-3,20-diol pode ser formado por adição de um hidreto de boro, tal como o diborano, à dupla ligação de um pregnan-17-eno, seguida de oxidação do organoborano assim formado com, por exemplo, peróxido de hidrogénio alcalino, para produzir o 20-ol. Em alternativa, os pregnan-3,20-diois podem ser formados pela redução de um grupo 20-ona num grupo 20-ol. Os reagentes adequados são reagentes de hidreto tais como boro-hidreto de sódio ou dissolvendo metais como o sódio em /7-propanol e semelhantes.

Exemplos (Referência)

Exemplo 1 a. 20-cetal de 3a-hidroxi-5f]-pregnan-20-ona

Agitou-se uma mistura de 3a-hidroxi-5p-pregnan-20-ona (10,8 g; 34 mmol), etilenoglicol (45 ml), e ortoformato de trietilo (30 ml), à temperatura ambiente, durante 5 minutos. Adicionou-se, depois, ácido p-toluenossulfónico (200 mg) e continuou-se a agitar à temperatura ambiente, durante 1,5 horas. Verteu-se a pasta espessa resultante para uma solução de NaHC03 saturada (250 ml). Recolheu-se por filtração o sólido precipitado, lavou-se cuidadosamente com água fria e secou-se. Dissolveu-se este produto semi seco em CH2CI2 (350 ml) e secou-se sobre K2C03 anidro. Filtrou-se, depois, a solução do cetal e usou-se assim no passo seguinte. b. 5p-pregnan-3,20-diona, 20-cetal

Agitou-sc a solução anterior de 20-cetal de 3n<-hidroxi-5p-pregnan-20-ona em CH2CI2, com N-metilmorfolina-N-óxido (8,8 g; 75 mmol), e crivos moleculares de 4A em pó (58 g), sob N2 durante 15 minutos. Adicionou-se então perrutenato de tetrapropilamónio (400 mg) e continuou-se a agitar à temperatura ambiente, durante 2 horas. Fez-se passar a mistura verde escura resultante através de uma coluna curta de Florisil e eluiu-se com CH2CI2. 85 094 * ; J'

EP 0 808 325/PT 12 ^

Combinaram-se as fracções contendo o produto (TLC) e evaporaram-se. Cristalizou-se então o produto bruto numa mistura de EtOAc:Hx (1:1) para produzir o composto do Lítulo (10,3 g) na forma dc varetas compridas. c. Preparação do reagente de lítio a partir de Ί,2-dibromoetileno Carregou-se, com 1,2-dibromoetileno (mistura cis/trans, 98%, Aldrich, 0.164 ml, 2 mmol, PM = 186, d = 2,246), um balão de 100 ml de três tubuladuras, equipado com um borbulhador de gás N2, um termómetro, e um funil de escoamento. Adicionou-se THF seco (15 ml) e arrefeceu-se a solução até -78°C em banho de acetona-gelo seco. Adicionou-se gota a gota /7-BuLi (2,5 M em THF; 1,6 ml; 4 mmol) durante um período de 10 minutos. Agitou-se a mistura a esta temperatura durante 1 hora e usou-se o reagente resultante imediatamente no passo seguinte. d. 3p-Etinil-3a-hidroxi-5p-pregnan-20-ona

Tratou-se gota a gota a solução anterior do reagente em THF, que se manteve a -78°C, com uma solução de 20-cetal de 5p-pregnan-3,20-diona (180 mg; 0,5 mmol) em THF (15 ml). Durante a adição, manteve-se a temperatura a baixo de -70°C. Continuou-se a agitar a esta temperatura, durante 15 minutos (100% de conversão como se detectou por TLC). Retirou-se o banho de arrefecimento e extinguiu-se a solução resultante com HCI 2 N (pH 6). Removeu-se o solvente e dissolveu-se o resíduo em acetona (10 ml). Após a adição de HCI 2 N (4 ml), agitou-se a solução à temperatura ambiente durante 0,5 horas. Neutralizou-se a mistura com solução diluída de NaHC03. Recolheu-se, por filtração, o sólido precipitado (158 mg; 93%), lavou-se com água, e secou-se. Purifica-se então o produto bruto por cristalização em EtOAc ou numa mistura de acetona-hexano para produzir o composto do título; p.f. 196-197°C; TLC-R, 0,45 (hexano:acetona = 7:3).

Exemplo 2 (Referência) bis(hemissuccinato) de 3a,20p-di-hidroxi-5p-pregnano dissódico

Tratou-se uma suspensão de 3a,20p-di-hidroxi-5p-pregnano (Steraloids; 250 mg; 0,78 mmol) em 5 ml de piridina seca com anidrido succínico (200 mg; 2,0 mmol). Aqueceu-se a mistura a 100°C durante um total de 10 h. Adicionou-se mais 6 mmol de anidrido succínico, em três porções, enquanto se aquecia a mistura reaccional. Concentrou-se a mistura escura (0,05 mmHg; 13 85 094 ΕΡ 0 808 325/ΡΤ /. & te·· 30°C) para remover ο solvente e depois aqueceu-se a 90°C (0,05 mmHg) para retirar o excesso de anidrido succínico. Cristalizou-se de novo o resíduo em éter/hexanos produzindo um sólido que consistia principalmente em ácido succínico. Concentraram-se as águas-mães e submeteram-se a cromatografia em coluna (sílica gel flash, eluída com CH2CI2/MeOH/HOAc 95/5/0,1) produzindo um sólido branco que se recristalizou em éter/hexano. Trabalhou-se o bis(hemissuccinato), p.f. 81-90°C, para obter o bis(sal de sódio).

Dissolveu-se o bis(hemissuccinato) (100 mg; 0,192 mmol) num volume mínimo de metanol. Adicionou-se gota a gota uma solução de NaHC03 (2 equivalentes; 33 mg; 0,393 mmol) em 0,6 ml de água. Após 3 horas, concentrou-se a solução in vacuo para produzir um sólido branco.

Exemplo 3 (Referência) 3a-Hidroxi-3fi-trífluorometU-5a-pregnan-20-ona e 3p~hidroxi-3a-trífluorometil-5a-pregnan-20-ona

Adicionou-se F3CSi(CH3)3 0,5 M (em THF; 2,5 mi; 1,25 mmol) a uma solução de 20-etilenocetal de 5cc-pregnan-3,20-diona (356 mg; 0,987 mmol) em THF seco (5 ml). Arrefeceu-se até 0°C a solução incolor resultante, e adicionou-se /7-Bu4NF*xH20 (alguns cristais). Retirou-se o banho de arrefecimento. Observou-se a libertação de um gás (Me3SiF), e a solução reaccional ficou amarela. Agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 30 minutos. A TLC (hexano/acetona 3:1) mostrou o consumo total dos materiais de partida; a nova "mancha" moveu-se quase com a frente de solvente. Seguidamente, adicionou-se HCI 1 N ("3 ml), e agitou-se a mistura bifásica resultante, à temperatura ambiente, durante a noite. A TLC (hexano/acetona 3:1) apresentava naquele momento uma única "mancha" com um R, de “0,5. Por outro lado, quando se usou CH2CI2, haviam duas "manchas" próximas, sendo a do cimo a do produto minoritário. Adicionou-se éter e água. Submeteu-se a camada aquosa a contra-extracção com éter. Lavaram-se, com NaHC03 saturado e salmoura, as camadas orgânicas combinadas, secaram-se (MgS04), filtraram-se, e evaporaram-se sob pressão reduzida para produzir um sólido branco cristalino (espumoso), que se submeteu a cromatografia flash usando como eluente, CH2CI2. A evaporação das primeiras fracções forneceu 3a-hidroxi-3p- 85 094 ΕΡ 0 808 325/ΡΤ 14

trifluorometil-5a-pregan-20-ona (10 mg). A posterior eluição da coluna proporcionou 3p-hidroxi-3a-trifluorometil-5a-pregnan-20-ona (200 mg), que com base em 19F RMN e.GC-MS continha também 1,5% de produto minoritário (ou seja, 3a-hidroxi-3p-trifluorometil-5a-pregnan-20-ona). Para remover esta impureza, efectuou-se a recristalização em hexano/acetato de etilo 60:40 quente; não se formaram cristais. Finalmente, o 3p-hidroxi-3a-trifluorometil-5a-pregnan-20-ona (145 mg) de pureza elevada pôde ser obtido submetendo a mistura 97,5:1,5 acima a uma outra cromatografia flash com CH2CI2, p.f. 181-3°C.

Exemplo 4 (Referência) 3(i-Hidroxi- 3 α-etenil· 5[)-pregnan~2 0-ona e 3a-hidroxi-3fi-eteni/-5fi-pregnan- 20-ona.

Tratou-se uma solução de 5p-pregnan-3,20-diona, 20-cetal, (1,18 g; 3,3 mmol) em THF seco (20 ml), com brometo de vinilmagnésio (1 M em THF; 3,7 mmol; 3,7 ml) a -70°C. Após ter-se agitado a mistura a esta temperatura durante 5 minutos e depois à temperatura ambiente durante 2,5 horas, extinguiu-se com solução saturada de NH4CI (10 ml). Removeu-se o solvente e extractou-se o resíduo com EtOAc. Lavou-se a camada orgânica com água, solução diluída de NaHC03, água, e salmoura. Após secagem sobre MgS04 anidro, filtrou-se e evaporou-se a solução para produzir o produto bruto (1,2 g). Depois, dissolveu-se este produto bruto em acetona (20 ml). Após ter-se adicionado HCI 1 N (10 ml), agitou-se a solução à temperatura ambiente durante 15 h. Removeram-se os solventes e extractou-se o resíduo com CH2CI2. Lavou-se a camada orgânica com água, solução diluída de NaHC03, água, e salmoura. Após secagem sobre MgS04 anidro, filtrou-se e evaporou-se a solução para produzir o produto bruto (890 mg). Depois, dissolveu-se este produto bruto numa pequena quantidade de CH2CI2 e verteu-se numa coluna de sílica gel. Por eluição com uma mistura de tolueno:acetona (94:6) resultou 3a-etenil-3p-hidroxi-5p-pregnan-20-ona (126 mg), como primeira fracção. A eluição adicional com a mesma mistura de solventes produziu 3p-etenil-3a-hidroxi-5p-pregnan-20-ona (189 mg), p.f. 113-116°C. 15 85 094 ΕΡ 0 808 325/ΡΤ

Exemplo 5 (Referência) a. 3a-Hidroxi-5a-androstan-17-ona

Adicionou-se ácido trifluoroacético (3,3 g) a uma solução de 3p-hidroxi-5a-androstan-17-ona (6 g) e azodicarboxilato de dietilo (5,04 g) em THF (50 ml) e a mistura tornou-se amarela. Depois, adicionou-se trifenilfosfina (7,6 g). A mistura rfiaccional tornou-se incolor e libertou-se calor. Adicionou-se benzoato de sódio após 5 minutos e depois adicionou-se água (100 ml) Extractou-se a mistura com cloreto de metileno (3x 80 ml) e secou-se a camada orgânica sobre sulfato de magnésio. Removeu-se o solvente in vacuo e hidrolisou-se o produto bruto com hidróxido de potássio (10%, 10 ml) em metanol (150 ml) durante 1 h. Depois, removeu-se a maior parte do metanol in vacuo e submeteu-se o restante material a partição entre cloreto de metileno e cloreto de amónio. Purificou-se o produto (4,7 g; 78%) por cromatografia (CH2CI2:acetona = 9:1). b. 3a-hidroxi-21 -metil-5a-pregn-17(20)(Z)-eno

Adicionou-se 3a-hidroxi-5a-androstan-17-ona (2 g; 6,9 mmol) a reagente de Wittig produzido a partir de brometo de propiltrifenilfosfónio (13,3 g) e f-butóxido de potássio (3,9 g) em THF (20 ml). Manteve-se a mistura reaccional em refluxo durante 12 h e arrefeceu-se até 25°C. Depois, adicionou-se uma solução de cloreto de amónio (60 ml) e separou-se a camada orgânica através de um funil de separação. Extractou-se a camada aquosa com cloreto de metileno (2x 50 ml). Secou-se a solução orgânica sobre carbonato de potássio e removeu-se o solvente in vacuo. Purificou-se o produto bruto por cromatografia (acetona: cloreto de metileno: hexano = 1:2:7) para produzir 0,84 g de produto (39%). Era uma mistura de isómeros Z e E (Z:E = 13:1). c. 3 a- t-ButHdimetilsiloxi-21 -meti/-5 a-pregn-17(20) (Z)-eno.

Agitou-se, durante 12 h, a mistura de 5a-3a-hidroxi-21-metilpregn-17(20)(Z)-eno (0,84 g; 2,66 mmol), TBDMSCI (1,2 g; 8,0 mmol) e imidazolo (0,91 g; 13,3 mmol) em cloreto de metileno (10 ml) e DMF (30 ml) e depois adicionou-se cloreto de amónio. Depois, extractou-se com cloreto de metileno (3x 40 ml) e lavou-se com salmoura (50 ml). Secou-se a solução orgânica sobre carbonato de potássio e depois removeu-se o solvente e verificou-se que existia ainda algum DMF. Dissolveu-se novamente em éter e lavou-se com salmoura (2x 50 ml) e depois secou-se sobre carbonato de potássio. A cromatografia com hexano resultou em 1,14 g do produto puro (100%).

85 094 ΕΡ 0 808 325/ΡΤ 16 d. 3a-t-ButildimetHsiloxi-20a-hidroxi-21-metil-5a-pregnano

Adicionou-se, gota a gota, a 0°C, complexo de THF-diborano (solução 1 M em THF; 5,3 ml), a uma solução de 3a-t-butildimetilsiloxi-21 -metil-5a-preg-17(20)(Z)-eno (1,14 g; 2,66 mmol) em THF (30 ml). Deixou-se aquecer a mistura reaccional até 25°C, durante 1 h. Depois, adicionou-se muito lentamente, a 0°C, uma solução de hidróxido de sódio (20%; 10 ml) seguida por uma adição de peróxido de hidrogénio (30%; 10 ml). Adicionou-se então cloreto de amónio aquoso e separou-se a camada de THF através de um funil de separação. Extractou-se a camada aquosa com éter (2x 40 ml). Secou-se a solução orgânica sobre carbonato de potássio e removeu-se o solvente in vacuo. Obteve-se o produto puro por cromatografia em coluna (0,52 g; 44%). e. 3a,20a-Di-hidroxi-21-metíl-5a-pregnano

Adicionou-se uma solução, preparada misturando HF (48%; 5 ml) e CH3CN (30 ml), a um balão contendo 3a-t-butildimetilsiloxi-20a-hidroxi-21-metil-5a-pregnano (0,51 g) e surgiu um precipitado branco. Agitou-se a mistura reaccional durante 1 h e depois filtrou-se. Lavou-se, três vezes, o sólido branco com éter e isso deu resultados analíticos satisfatórios (0,3 g; 79%); p.f. 227-231 °C.

Exemplo 6 (Referência) 3 a, 2 7 -Di-hidroxiSp-trifluorometUSp-19-norpregnan-20-ona

Adicionou-se MeOH (1 ml) e BF3-OEt2 (1,4 ml; 11,3 mmol) a uma solução de 3a-hidroxi-3p-trifluorometil-5p-19-norpregnan-20-ona (300 mg; 0,87 mmol) em tolueno (15 ml). Arrefeceu-se a mistura resultante até 0°C e adicionou-se Pb(0Ac)4 (0,54 g; 1,21 mmol). Aqueceu-se a mistura reaccional até 25°C com agitação durante 45 minutos e depois adicionou-se solução de NaHC03 (saturada, 30 ml), e agitou-se a mistura durante 1 hora. Verteu-se num funil de separação contendo água (50 ml) e extractou-se com éter (3x 40 ml). Lavou-se a solução etérea com salmoura (50 ml) e depois secou-se sobre K2C03. Dissolveu-se o produto bruto, obtido por remoção de solvente, em MeOH (25 ml), e adicionou-se solução de K2C03 (sat.; 8 ml). Agitou-se a mistura reaccional durante 5 horas e depois verteu-se a mistura reaccional num funil de separação contendo 50 ml de água. Extractou-se então com CH2CI2 (3x 30 ml). Secaram-se, sobre K2C03, os extractos combinados e purificou-se por 85 094 ΕΡ 0 808 325/ΡΤ

17 cromatografía ο material bruto obtido para produzir o produto (160 mg) junto com o subproduto 21-metoxi (40 mg). Purificou-se adicionalmente o produto por recristalizaçào em acetona a 10% em hexano para produzir 88 mg do produto puro (28%) na forma de um sólido branco, p.f. 140-142°C.

Exemplo 7 (Referência) 3/j-Etinil-3u, 2 0 a-di-hidroxi- 5β-pregnano e 3p-etinil-3a,20p-di-hidroxi-5p- pregnano

Adicionou-se boro-hidreto de sódio (200 mg; 5,3 mmol) a uma solução de 3[^-etinil-3(t-hidroxi-5p-pregnan-20-ona (0,31 g; 0,91 mmol) em metanol (20 ml) e agitou-se a 25°C durante 1 hora. Adicionou-se então solução de cloreto de amónio (50 ml) e extractou-se a mistura com CH2CI2 (3x 30 ml). Uma cromatografía (Et0Ac:Hex = 3:7) resultou em 3p-etinil-3a,20p-di-hidroxi- δβ-pregnano (200 mg; 65%) como produto principal: p.f. 221-223°C. Purificou-se adicionalmente o produto minoritário, 3p-etinil-3a,20a-di-hidroxi-δβ-pregnano, por uma outra cromatografía (acetato de etilo a 25-30% em hexano; 16 mg; 5%): p.f. 187-188°C.

Exemplo 8 (Referência) 3 a, 21 -Di-hidroxi-3p-etinil-5p-pregnan-20-ona e 3a-hidroxi-3fi-etinil-21-metoxi-5p-pregnan-20-ona

Adicionou-se uma solução aquosa de K2C03 a 10% (3,75 ml) a uma solução de 21-acetato de 3a,21-di-hidroxi-3p-etinil-5p-pregnan-20-ona (725 mg; 1,81 mmol) em 45 ml de metanol a 0°C. Após ter-se agitado durante 30 minutos à temperatura ambiente, arrefeceu-se de novo a mistura até 0°C e adicionou-se uma solução aquosa 2 N de HOAc (1,8 ml). Adicionou-se a mistura reaccional a uma mistura de EtOAc/água. Extractou-se, duas vezes, a camada aquosa com EtOAc e extractaram-se as camadas orgânicas reunidas, com uma solução de salmoura, secaram-se (Na2S04) e concentraram-se. A purificação por cromatografía flash (20 cm de sílica gel numa coluna de 4 cm de diâmetro, eluída com 2 litros de acetona a 20%/hexano) originou 582 mg (90%) do diol na forma de um sólido branco, p.f. 155,5-157°C.

Fm preparações de maior escala do 3a,21-diol, isolou-se uma impureza menos polar, p.f. 176-178,5°C e verificou-se ser 3a-hidroxi-3p-etinil- 18 85 094 ΕΡ 0 808 325/ΡΤ formada provavelmente como subproduto na 21 -metoxi-5p-pregnan-20-ona, preparação do 21-acetato.

Exemplo 9 (Referência) 3{j-Etenil-3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona e 3a-etenil-3fi-hidroxi-5a-pregnan-20-ona

Tratou-se uma solução de 20-cetal de 5a-pregnan-3,20-diona, (720 mg; 2 mmol) em THF seco (20 ml) com brometo de vinilmagnésio (1 M em THF, 4 mmol, 4 ml) a -78°. Após ter-se agitado a mistura a esta temperatura, durante 5 horas, extinguiu-se com solução 2 N de HCI (2 ml). Removeu-se o solvente e depois dissolveu-se o resíduo em acetona (25 ml). Após ter-se adicionado HCI 2 N (10 ml), agitou-se a solução à temperatura ambiente, durante 15 h. Removeram-se os solventes e extractou-se o resíduo com CH2CI2. Lavou-se a camada orgânica com água, solução diluída de NaHC03, água, e salmoura. Após secagem sobre MgS04 anidro, filtrou-se e evaporou-se a solução para produzir o produto bruto (1 g). Dissolveu-se então este produto bruto numa pequena quantidade de CH2CI2, e verteu-se numa coluna de sílica gel. Por eluição com mistura de toluenoracetona (95:5) resultou 3p-etenil-3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona (250 mg) como primeira fracção, p.f. 163-165°C. A eluição adicional com a mesma mistura de solventes produziu 3a-etenil-3p-hidroxi-5a-pregnan-20-ona (150 mg).

Exemplo 10 (Referência) 3a-Hidroxi-3fi-trifluorometH-5p-19-norpregnan-20-ona A uma solução de 3a-hidroxi-3p-trifluorometil-5a-19-norpregn-1 7(20)(Z)-eno (2,6 g; 7,3 mmol) em THF (80 ml), adicionou-se gota a gota complexo de diborano-THF (solução 1 M em THF, 22 ml), a 25°C. A reacção completou-se numa hora e depois adicionou-se, muito devagar, uma solução de hidróxido de sódio (20%, 50 ml) a 0°C, seguida de uma adição de peróxido de hidrogénio (30%, 30 ml). Adicionou-se então água e separou-se a camada de THF através de um funil de separação. Extractou-se a camada aquosa com cloreto de metileno (2x 40 ml). Secou-se a solução orgânica sobre carbonato de potássio e removeu-se o solvente in vacuo. De uma coluna rápida (hex..-acetona = 1:1) resultaram 1,8 g de produto que se submeteram a oxidação com PCC (PCC: 2,1 g; 9,6 mmol; acetato de sódio: 0,8 g; 9,6 mmol). tí%.

Vá 85 094 0 ΕΡ 0 808 325/ΡΤ ϋ·*. W* 19

Purificou-se ο produto puro (700 mg; 26%) por cromatografia em coluna usando como eluente acetato de etilo e hexano (15:85); p.f. 151,5-153,0°C.

Exemplo 11 (Referência) a. 3(R)-Espiro-2 '-oxirano-5a-17β-hidroxiandrostano

Aqueceu-se em refluxo durante 1,5 horas uma mistura de iodeto de trimetilsulfoxónio (6,82 g; 31 mmol) e t-butóxido de potássio (3,5 g; 31 mmol) em THF (30 ml) e depois arrefeceu-se até 25°C. Adicionou-se então 17p-hidroxi-5a-androstan-3-ona (3 g; 10,3 mmol) e agitou-se a mistura reaccional a 25°C durante 2 horas. Depois, adicionou-se água e extractou-se a mistura com éter (3x 80 ml). Secou-se o extracto sobre carbonato de potássio e a remoção do solvente resultou em 3 g de produto bastante puro (rendimento bruto, 96%) que se usou no passo seguinte. b. 3p-Metil-3a-hidroxi-5a-androstan-17-ona A uma solução de 3(R)-espiro-2'-oxirano-5a-17p-hidroxiandrostano (3 g; 9,9 mmol) em THF (50 ml) sob Ar, adicionou-se hidreto de alumínio e lítio (LAH, solução 1 M em THF; 10 ml) e aqueceu-se a mistura em refluxo durante 5 minutos e depois arrefeceu-se até 25°C. Adicionou-se solução de cloreto de amónio (aquosa saturada; 70 ml) e extractou-se então a mistura com CH2CI2 (3x 70 ml). Secou-se a solução orgânica sobre carbonato de potássio e depois adicionou-se 4-metilmorfolin-N-óxido (2,9 g; 25 mmol) e crivos moleculares moídos (4 A; 10 g). Agitou-se então a mistura durante 20 minutos e adicionou-se perrutenato de tetrapropilamónio (200 mg). A reacção completou-se em 1,5 h e filtrou-se a mistura reaccional através de Florísil que se enxaguou com mistura de CH2CI2 em éter (1:2). Purificou-se, por cromatografia (EtOAc a 30%em hexano), o material resultante para produzir o produto (2,5 g; 83%). c. 3β,21 -Dimetil-3a-hidroxi-5a-pregn-17(20)(Z)-eno

Adicionou-sc 3β metil-3a-hidroxi-5a-androstan-1 7-ona (0,5 g;1,65 mmol) a um reagente de Wittig preparado agitando a mistura de brometo de /7-propiltrifenilfosfónio (2,55 g; 6,6 mmol) e f-butóxido de potássio (0,75 g; 6,6 mmol) em THF (20 ml) durante 30 minutos, e aqueceu-se a mistura em refluxo durante 18 horas. Extinguiu-se então a reacção com solução de cloreto de amónio e extractou-se com CH2CI2. Obteve-se o produto puro (420 mg; 77%) 20 85 094 ΕΡ 0 808 325/ΡΤ por cromatografia (EtOAc a 20% em hexano). d. 3<X,20 a-Di-hidroxi-3p, 21-dimetil-5a-pregnano

Adicionou-se, gota a gota, a 0°C, complexo de THF diborano (solução 1 M em THF; 2,6 ml) a uma solução de 3p,21-dimetil-3a-hidroxi-5a-pregn-17(20)(Z)-eno (0,42 g; 1,27 mmo!) em THF (30 ml). Deixou-se a mistura reaccional aquecer até 25°C durante 2 h. Depois, adicionou-se muito lentamente, a 0°C, uma solução de hidróxido de sódio (2 N; 10 ml), seguida por uma adição de peróxido de hidrogénio (30%; 10 ml). Agitou-se a mistura reaccional a 25°C durante 1 h. Adicionou-se então cloreto de amónio aquoso e separou-se a camada de THF através de um funil de separação. Extractou-se a camada aquosa com CH2CI2 (2x 40 ml). Secou-se a solução orgânica sobre carbonato de potássio e removeu-se o solvente in vacuo. Obteve-se o produto por cromatografia em coluna (0,17 g; 38%). Purificou-se adicionalmente por recristalização para obter 110 mg de produto: p.f. 200-203°C.

Exemplo 12 (Referência) 3 a, 21 -Di-hidroxi-3fi-trifluorometil-5p-pregnan-20-ona

Arrefeceu-se até 0°C uma solução de 21-acetato de 3a,21-hidroxi-3p-trifluorometil-5p-pregnan-20-ona, (1,36 g; 3,06 mmol) em MeOH (75 ml). Depois, adicionou-se gota a gota uma solução de K2C03 (aquosa a 10%; 6,45 ml; 4,67 mmol). Após ter-se agitado durante 1,5 horas a 0°C, adicionou-se gota a gota uma solução de ácido acético (aquosa a 2 N; 2,5 ml; 5,0 mmol) e deixou-se aquecer a mistura até à temperatura ambiente. Adicionaram-se EtOAc, CH2CI2 e água (100 ml de cada) e misturou-se intimamente. Isolou-se a fase orgânica, lavou-se com soluções aquosas de NaHC03 e NaCI, secou-se sobre MgS04 e evaporou-se in vacuo. Purificou-se o resíduo por cromatografia flash em coluna (hexano/EtOAc 3:1) para produzir um sólido branco (973 mg; 79%), p.f. 148-150°C.

Exemplo 13 (Referência) 21-hemissuccinato sódico de 3a,21 -Di-hidroxi-3p-etini/-5fi-pregnan~20-ona

Tratou-se, a 0°C, uma solução de 3a,21 -di-hidroxi-3p-etinil-5p-pregnan-20-ona (535 mg; 1,49 mmol) em 2 ml de piridina seca com anidrido succínico sólido (1,2 equivalentes; 180 mg; 1,80 mmol). Após ter-se aquecido até à ΕΡ Ο 808 325/ΡΤ 21

temperatura ambiente, deixou-se a mistura reaccionai a agitar durante 48 h. A remoção do solvente in vacuo e a trituração do resíduo com hexano (2x 10 ml) originaram um sólido pegajoso que se dissolveu, tanto quanto foi possível, em CH2CI2 e se adicionou a 13 cm de sílica de flash numa coluna de 2 cm de diâmetro. A eluição com um gradiente de acetona a 5%/CH2CI2 a acetona a 100% originou 667 mg do ácido desejado.

Para remover os sais de piridínio, dissolveu-se o ácido em EtOAc e extractou-se com uma solução aquosa 0,01 N de HCI arrefecida em gelo (30 ml). Secou-se a camada orgânica sobre Na2S04 e concentrou-se. Dissolveu-se o resíduo, 633 mg, p.f. 62-68°C, em metanol e adicionou-se uma solução aquosa de 116 mg (0,253 mmol) de NaHC03. Após ter-se agitado durante 3,5 horas, removeu-se o solvente sob pressão reduzida e triturou-se o resíduo com uma mistura de éter/hexano. 0 sólido amarelo claro obtido, massa de 616 mg, era solúvel em água a >20 mg/ml.

Exemplo 74 (Referência) 3p-Fluorometil-3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona

Manteve-se em refluxo, durante a noite, uma mistura de /7-Bu4NF»xH20 (7,873 g) e benzeno (50 ml) com uma ratoeira de Dean Stark. Concentrou-se então a mistura (pressão normal), que não era uma solução límpida, até "10 ml e deixou-se arrefecer até à temperatura ambiente. Adicionou-se, à solução concentrada anterior, uma solução de etilenocetal de 3(R)-5a-pregnan-3-espiro-2'-oxirano-20-ona (2,55 g; 6,81 mmol) em benzeno seco (15 ml + 5 ml para enxaguar), usando uma agulha de extremidade dupla. Concentrou-se a solução resultante, usando uma montagem de destilação de pequeno percurso, até "10 ml e manteve-se em refluxo durante 15 minutos. Visto ser muito difícil aplicar pontualmente a solução reaccionai concentrada, na placa de TLC, adicionou-se benzeno seco (5 ml). A TLC (CH2CI2/acetona 100:1 ou hexano/acetona 3:1) mostrou algum material de partida por reagir, para além de duas novas "manchas" menos polares. Concentrou-se novamente a mistura reaccionai e depois manteve-se em refluxo durante 30 minutos; a TLC (após a diluição da mistura com benzeno) mostrava, nesta altura, consumo quase total do epóxido inicial. Tal como anteriormente, concentrou-se a mistura e manteve-se em refluxo durante um certo tempo. Deve aqui salientar-se que esta reacção só ocorre quando a mistura estiver muitíssimo concentrada. Após a mistura ter

8b 094 EP 0 808 325/PT

22 voltado à temperatura ambiente (dando um sólido amarelo claro), adicionou-se éter e água. Uma vez que não se dissolveu todo o sólido, adicionou-se CH2CI2. Submeteu-se a camada aquosa a contra - extracção com CH2CI2. Lavaram-se ns extractos orgânicos combinados com água (x2), secaram-se (Na2S04), filtraram-se, e evaporaram-se sob pressão reduzida para proporcionar um sólido branco (3,33 g) cujo 1H RMN mostrou ser uma mistura 4:1 de etilenocetal de 3p-fluorometil-3u-hidroxi-5a-pregnan-20-ona e etilenocetal de 3a-fluoro-3p-hidroximetil-5u-pregnan-20-ona.

Para hidrolisar o cetal, adicionaram-se ao sólido anterior acetona (100 ml), água (5 ml), e p-Ts0H»H20 (143 mg; 0,752 mmol). Ajustou-se o pH adicionando-lhe HCI até ficar ligeiramente ácido. Aqueceu-se a mistura com uma pistola de aquecimento durante uns momentos para obter uma solução límpida, que se agitou à temperatura ambiente durante 2 h. A mistura tornou-se turva, por isso adicionou-se CH2CI2 para obter uma solução límpida. A TLC indicou o término da reacção. Removeu-se o solvente sob pressão reduzida, originando um sólido branco ao qual se adicionaram CH2C!2 e H20. Submeteu-se a camada aquosa a contra - extracção com CH2CI2. Lavaram-se as camadas orgânicas combinadas, com NaHC03 saturado, secaram-se (MgS04), filtraram-se e evaporaram-se sob pressão reduzida para proporcionar um sólido branco cristalino (2,5 g) cujo ΊΗ RMN mostrou ser uma mistura 4:1 de 3a-fluorometil-3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona e 3a-fluoro-3p-hidroximetil-5a-pregnan-20-ona. A cromatografia flash em coluna desta mistura com CH2CI2 como eluente proporcionou o 3p-fluorometil-3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona desejado (1,41 g; 59%); p.f. 201-203°C.

Exemplo 15 (Referência) 3p-Etinií-3a,20a-di-hidroxi-5a-pregnano e 3/]-etinil-3a,20fi-di-hidroxi-5a-pregnano

Adicionou-se boro-hidreto de sódio (200 mg; 5,3 mmol) a uma solução de 3p-etini!-3a-hidroxi-5a prcgnan-20-ona (0,32 g; 0,94 mmol) em metanol (20 ml) e agitou-se a 25°C durante 1 h. Adicionou-se então solução de cloreto de amónio (50 ml) e extractou-se a mistura com CH2CI2 (3x 30 ml). A cromatografia (EtOAc:Hex = 3:7) resultou em 3p-etinil-3a,20p-di-hidroxi-5a-pregnano (192 mg; 60%) como produto principal: p.f. 195,5-197,5°C; e 3p-etinil-3a,20a-di-hidroxi-5a-pregnano como produto minoritário (19 mg; 6%); 85 094 ΕΡ 0 808 325/ΡΤ 23

p.f. 210-215°C (decomp.).

Exemplo 16

Bis-hemissuccinato de 3a,20a-Di-hidroxi-21-metil-Ba-pregnano A um balão seco contendo 3a,20a-di-hidroxi-21-metil-5a-pregnano (350 mg; 1,05 mmol), adicionou-se piridina (anidra, 5 ml) e depois adicionou-se anidrido succínico (1g, 10 mmol). Aqueceu-se a mistura num banho de óleo a 100°C durante 20 h e depois arrefeceu-se até 25°C. Misturou-se com solução de HCI (1 N, 70 ml) e extractou-se com EtOAc (3x 40 ml) e secaram-se os extractos sobre Na2S04. Obteve-se o produto (0,54 g) por cromatografia (MeOH a 7% e HOAc a 0,3% em CH2CI2) e purificou-se adicionalmente por recristalização em EtOAc para produzir 334 mg do produto (60%); p.f. 159-162,5°C.

Exemplo 17 (Referência) a. 3,3-Etilenodioxi-5fi-pregn-17(20)(Z)-eno

Adicionou-se 5p-3-etilenodioxiandrostan-17-ona (6 g) a reagente de Wittig produzido a partir de brometo de etiltrifenilfosfónio (15 g) e f-butóxido de potássio (4,5 g) em THF (15 ml). Manteve-se a mistura reaccional em refluxo durante 2 h e arrefeceu-se até 25°C. Depois, adicionou-se cloreto de metileno (80 ml) e uma solução de cloreto de amónio (60 ml) e separou-se a camada orgânica através de funil de separação. Extractou-se a camada orgânica com cloreto de metileno (2x 50 ml). Secou-se a solução orgânica sobre carbonato de potássio e removeu-se o solvente in vacuo. Removeu-se a maior parte do fosforóxido lavando com hexano. Dissolveu-se o produto obtido (6 g) em acetona (100 ml), e adicionou-se ácido clorídrico (2 N; 10 ml). Purificou-se por cromatografia o produto bruto (5,5 g) obtido por tratamento básico seguido de extracção de cloreto de metileno, para produzir 4,5 g de produto (83%). Obteve-se o estereoisómero puro por repetidas recristalizações em hexano. b. 3a-Hidroxi-3fi-trifluorometil-5p-pregn-( 17)(20)(Z)-eno

Adicionou-se trifluorometiltrimetilsilano (solução 0,5 M em THF, 9,5 ml) a 0°C a uma solução de 5p-pregn-17(20)(Z)-en-3-ona (950 mg; 3,17 mmol) em THF (15 ml). A solução tornou-se gradualmente castanha e a reacção terminou em 30 minutos. Adicionou-se água (30 ml) e recolheu-se a camada orgânica. 85 094 ΕΡ 0 808 325/ΡΤ 24

Extractou-se a camada aquosa com éter (3x 50 ml) e secou-se a solução orgânica sobre carbonato de potássio. Isolou-se o produto puro (680 mg; 58%) por cromatografia em coluna usando acetato de etilo e hcxano (1:9) como eluente.

Exemplo 18 (Referência) a. 3u-Hidroxi-5frpregn-11 -en-20-ona

Adicionou-se lentamente, a -78°C, durante 15 minutos, hidreto de tri-r-butoxialumínio e lítio (1 M em THF; 5,7 mmol) a uma solução de δβ-pregn-11 -en-3,20-diona (Sigma; 1,5 g; 4,77 mmol) em THF (40 ml). Deixou-se aquecer a mistura reaccional até 25°C, durante 12 h. Submeteu-se a mistura a partição entre cloreto de amónio e éter e purificou-se o material bruto assim obtido por cromatografia em coluna (acetona a 10-20% em hexano; 1,3 g de produto; 86%). b. 3a-Hidroxi-5β-20,20-etiíenodioxipregn-11-eno

Adicionou-se ácido p-toluenossulfónico (0,1 g) a uma mistura de 3a-hidroxi-5p-pregn-11 -en-20-ona (1,3 g), etilenoglicol (8 ml) e trimetilorto-formato (20 ml) e agitou-se a mistura reaccional durante 1 h. Um tratamento normal (bicarbonato de sódio e éter) seguido de remoção de solvente resultou no produto bruto que se purificou por cromatografia (acetona:Hex - 1:4; 1,2 g; 81%). c. 5β-20,2 O-Etilenodioxi-5β-pregn-11-en-3-ona

Agitou-se, a 25°C, durante 1 hora, uma mistura de 3a-hidroxi-20,20-etilenodioxi-5p-pregn-11-eno (1,2 g), acetato de sódio (0,53 g) e PCC (1,4 g) e depois filtrou-se através de Florísil, eluindo com cloreto de metileno e éter (1:2). Obteve-se o produto puro por cromatografia em coluna (acetona:hexano = 1:9; 0,71 g; 60% ). d. 3 a-Hidroxi-3fi-trifluorometil-5β-pregn-11-en-20-ona

Adicionou-se trifluorometiltrimetilsilano (solução 0,5 M em THF, 6 ml) a uma solução de 5p-20-etilenodioxipregn-11-en-3-ona (710 mg; 1,98 mmol) em THF (15 ml), e depois fluoreto de tetrabutilamónio (20 mg) a 0°C. A solução tornou-se gradualmente castanha e a reacção terminou em 1 hora. Adicionou-se água (30 ml) e recolheu-se a camada orgânica. Extractou-se a camada aquosa 85 004 ΕΡ 0 808 325/ΡΤ 25

com éter (3χ 40 ml) e secou-se a solução orgânica sobre carbonato de potássio. Hidrolizou-se o produto bruto obtido por remoção do solvente, com HCI (2 N; 5 ml) em acetona (40 ml). Isolou-se então o produto puro (554 mg; 73%) por cromatografia em coluna usando como eluente acetato de etilo e hexano (1:5), p.f. 160-162,5°C.

Exemplo 19 (Referência) 21-acetato de 3a, 21Di-hidroxi-3p-etinil-5[í-pregnan-20-ona

Tratou-se com 2 mi de metanol uma suspensão de 3p-etiníl-3a-hidroxi-5p-pregnan-20-ona (1,00 g; 2,92 mmol) em 35 ml de tolueno. Arrefeceu-se a solução resultante num banho de gelo/água e adicionou-se BF3-Et20 puro (Aldrich; 5,8 ml; 5,02 g; 35,4 mmol). Adicionou-se tetra-acetato de chumbo sólido (Aldrich; 1,96 g; 4,42 mmol) em algumas porções. Inicialmente formou-se uma solução purpúrea clara que, à medida que se continuou a agitar a 0°C, tornou-se castanha clara. Agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 3 h e depois arrefeceu-se de novo até 0°C. Adicionou-se a mistura reaccional fria a uma mistura de 52 ml de uma solução saturada de NaHC03, água e gelo moído. Extractou-se a mistura resultante com EtOAc (2x 75 ml). Extractaram-se as camadas orgânicas combinadas com uma solução saturada de NaCI, secaram-se (Na2S04) e concentraram-se. Purificou-se o produto bruto por cromatografia em coluna (25 cm de sílica gel flash numa coluna de 5 de diâmetro eluída com 3 litros de acetona a 20%/hexano) resultando 749 mg (64%) do acetato, p.f. 196-198°C.

Exemplo 20 (Referência) 2 7-acetato de 3a,2 7-Di-hidroxi-3p-trífluorometU-5p-pregnan-20-ona

Sob árgon anidro, dissolveu-se 3a-hidroxi-3p-trifluoro-metil-5p-pregnan-20-ona (1,94 g; 5,02 mmol) em tolueno (86 ml) e MeOH (5,2 ml). Adicionou-se eterato de trifluoreto de boro (10,4 ml; 84,3 mmol) através dc uma seringa. Depois, adicionou-se tetra-acetato de chumbo (2,89 g; 6,51 mmol). Agitou-se a mistura durante 70 minutos, verteu-se em água e extractou-se três vezes com CH2CI2. Combinaram-se as fases orgânicas, lavaram-se com soluções aquosas de NaHC03 e NaCI, secaram-se sobre MgS04 e evaporaram-se in vacuo para originar um sólido amarelo pálido (2,18 g). Purificou-se este sólido por cromatografia flash em coluna (CH2CI2/EtOAc a

85 094 ΕΡ 0 808 325/ΡΤ 26 s/ i, 150:1 e hexano/EtOAc a 4:1) para originar um sólido branco (1,54 g; 69%). p.f. 167-1 68,5°C.

Exemplo 21 (Referência) 3a-Hidroxi-3p-trifluorometil-5fi-pregnan-20-ona

Referência: Krishnamurti, R.; Bellew, D. R.; Surya Prakash, G. K. J. Org.

Chem. 1991, 56, 984.

Adicionou-se F3CSi(CH3)3 0,5 M (em THF; 0,5 ml; 0,25 mmol) a uma solução de 20-etilenocetal de 5p-pregnan-3,20-diona (60 mg; 0,166 mmol) em THF (3 m!) seco. Arrefeceu-se a solução incolor resultante até 0°C, e adicionou-se n-Bu4NF»xH20 (alguns cristais). Retirou-se o banho de arrefecimento, e deixou-se aquecer a mistura até à temperatura ambiente. Ao contrário da mesma reacção envolvendo 20-etilenocetal de 5a-pregnan-3,20-diona, a reacção anterior não ficou amarela, e também não houve formação de gás. A TLC (hexano/acetona 3:1) não mostrou qualquer formação de produto. A seguir, adicionou-se F3CSi(CH3)3 0,5 M (em THF; 0,5 ml; 0,25 mmol). Agitou-se a mistura resultante à temperatura ambiente durante alguns minutos. A TLC apresentou uma nova "mancha" que tinha um R, próximo de 1, mas havia ainda presente algum material de partida por reagir. Deste modo, adicionou-se mais F3CSi(CH3)3 0,5 M (em THF; 0,5 ml; 0,25 mmol). Agitou-se novamente a mistura à temperatura ambiente durante algum tempo. Nenhuma cetona de partida por reagir. Adicionou-se HCI 1 N (~3 ml), e agitou-se a mistura bifásica resultante, à temperatura ambiente, durante a noite. A "mancha" que se formou como resultado da trifluorometilação tinha agora desaparecido completamente, e existiam duas novas "manchas" menos polares, sendo a inferior o produto principal. Diluiu-se então a mistura com éter e água. Separou-se a camada aquosa e extractou-se com éter. Lavaram-se as camadas orgânicas combinadas com NaHC03 saturado e salmoura, secaram-se (MgS04), filtraram-se, e evaporaram-se sob pressão reduzida para originar um sólido cristalino branco (espumoso). Os RMN de 'H e 19F deste sólido revelaram a presença de dois epímeros numa razão de 85:15. Efectuou-se a separação destes dois epímeros por cromatografia flash com hexano/acetona 15:1. A evaporação das primeiras fraeções deu o isómero minoritário, que não foi caracterizado e que se assumiu ser 3p-hidroxi-3a-trifluorometil-3P-pregnan-20-ona. ΕΡ Ο 808 325/ΡΤ jt; 27 φ.- £ A eluição adicional da coluna originou 3a-hidroxi-3p-trifluorometil-5p-pregnan-20-ona (50 mg).

Exemplo 22 (Referência) 3a-Hidroxi-3fi-trífluorometil-5fi- 7 9-norpregn-17(20)(Z)-eno A 0°C, adicionou-se trifluorometiltrimetilsilano (solução 0,5 M em THF; 8,6 ml) a uma solução de 5β-19-norpregn-17(20)(Z)-en-3-ona (823 mg; 2,88 mmol) em THF (30 ml). A solução tornou-se gradualmente castanha e a reacção terminou em 30 minutos. Adicionou-se água (30 ml) e recolheu-se a camada orgânica. Extractou-se a camada aquosa com éter (3x 50 ml) e secou-se a solução orgânica sobre carbonato de potássio. Isolou-se o produto puro (800 mg; 78%) por cromatografia em coluna usando acetato de etilo e hexano (1:9) como eluente.

Exemplo 23 (Referência) 3a, 21 -Hidroxi-3fl-meti/-5a-pregnan-20-ona, 2 7-acetato

Arrefeceu-se uma solução de 3a-hidroxi-3p-metil-5a-pregnan-20-ona (3,00 g; 9,02 mmol) em tolueno seco (110 ml) e metanol (6 ml) num banho de gelo seco/acetona até -75°C. Adicionou-se, através de uma seringa, BF3-Et20 puro (Aldrich; 18 ml; 146 mmol), seguido de tetra-acetato de chumbo sólido (4,39 g; 9,90 mmol) em porções. Não se observou reacção a -75°C e deixou-se aquecer a mistura reaccional até -10°C, ao longo de 4 h. Deixou-se aquecer a mistura reaccional até 0°C, durante mais 90 minutos. Por HPLC, o material de partida é a principal espécie presente. Após uma hora a 0°C, arrefeceu-se de novo a mistura reaccional até -15°C e adicionou-se mais 1,94 g de tetra-acetato de chumbo, e deixou-se aquecer a mistura reaccional até 0°C. Após 30 minutos, a HPLC (detector de dispersão) deu a razão não corrigida de produto e material de partida de 10:1, e após mais 45 minutos, arrefeceu-se a mistura reaccional até -10°C e adicionou-se a uma mistura arrefecida com gelo de 100 ml de EtOAc, 165 ml de uma solução saturada de NaHC03 e gelo moído. Separou-se a camada aquosa e lavou-se com EtOAc (2x 150 ml). Lavaram-se então as camadas orgânicas reunidas, duas vezes cada, com água e uma solução saturada de NaCI. Após secagem sobre Na2S04, removeu-se o solvente e recristalizou-se o resíduo em EtOAc, proporcionando 1 g de acetato contaminado com material de partida. Concentraram-se as águas-mães in vauuo 85 094 ΕΡ 0 808 325/ΡΤ 28

e trituraram-se com duas porções de 100 ml de hexano. Combinou-se o resíduo das lavagens com hexano com o material recristalizado e recristalizou-se uma segunda vez. 0 sólido resultante estava contaminado com 2,8% de material de partida (por HPLC). Uma terceira recristalização originou 1,087 g (31% de rendimento) do acetato que continha < 2% de material de partida.

Exemplo 24 (Referência) 27-fosfato dissódico de 3a,21 -Di-hidroxi-5fi-pregnan-20-ona

Adicionou-se a uma solução de 21 -bromo-3a-hidroxi-5p-pregnan-20-ona (1,0 g; 2,5 mmol) em 10 ml de THF à temperatura ambiente, hidrogenofosfato de dibenzilo (2,1 g; 7,55 mmol) e trietilamina (1,085 ml; 7,8 mmol), com agitação. Manteve-se então a mistura reaccional em refluxo durante 2,5 h e depois arrefeceu-se até à temperatura ambiente. Depois, adicionou-se diclorometano (25 ml) e transferiu-se a solução para um funil de separação, lavou-se com HCI 1 N, NaHC03 aquoso saturado, secou-se sobre MgS04 e concentrou-se in vacuo para originar o dibenzilfosfato na forma de um óleo bruto (943 mg). Dissolveu-se o óleo em EtOH (50 ml) e adicionaram-se algumas gotas de ácido sulfúrico. Carregou-se o balão com 400 mg de Pd a 5%/C e depois submeteu-se a solução agitada a 1 atm de gás H2 à temperatura ambiente até a reacção terminar. Retirou-se o catalisador por filtração e concentrou-se a solução num resíduo. Dissolveu-se este resíduo em MeOH:água 4:1 (20 ml) e titulou-se até pH 11 com NaOH 2N. Adicionou-se mais 50 ml de MeOH e após repouso a 0°C durante 1 h, separou-se, por filtração, o fosfato inorgânico sólido. Concentrou-se a solução in vacuo e lavou-se o resíduo com tolueno quente (“50 ml) e depois dissolveu-se num volume mínimo de MeOH. Adicionou-se lentamente acetona, a esta solução, até precipitar um sólido. Centrifugou-se a mistura, separou-se o solvente por decantação e transferiu-se o sólido molhado para um frasquinho e secou-se sob vácuo para produzir o composto do título na forma de um sólido hidroscópico.

Exemplo 25 (Referência) 21-fosfato dissódico de 3α,21 -Di-hidroxi-3fi-meti/-5a-pregnan-20-ona

Adicionou-se a uma solução de 21-bromo-3a-hidroxi-3p-metil-5cc-pregnan-20-ona (1,0 g; 2,43 mmol) em 10 ml de THF à temperatura ambiente, hidrogenofosfato de dibenzilo (2,1 g; 7,3 mmol) e trietilamina (1,085

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ml; 7,53 mmol), com agitação. Manteve-se então a mistura reaccional em refluxo durante 4,5 h e depois arrefeceu-se até à temperatura ambiente. Depois, adicionou-se diclorometano (25 ml) e transferiu-se a solução para um funil de separação, lavou-se com HCI 1 N, NaHC03 aquoso saturado, secou-se sobre MgS04 e concentrou-se in vacuo para originar o dibenzilfosfato na forma de um óleo bruto (1,205 g). Dissolveu-se o dibenzilfosfato (790 mg; 1,3 mmol) em EtOH:THF 2:1 (30 ml) com algumas gotas de ácido sulfúrico, carregou-se com Pd a 5%/C (180 mg; 20% em peso) e submeteu-se a 50 psi de H2 à temperatura ambiente até a reacção terminar por TLC. Retirou-se o catalisador por filtração e concentrou-se o filtrado. Dissolveu-se o resíduo em MeOH:água a 4:1 (10 ml) e titulou-se até pH 11 com NaOH 1 M. Tratou-se a solução com acetona até precipitar um sólido que facilmente se pode filtrar, após o que se arrefeceu a mistura até 0°C e se filtrou para isolar 260 mg de um sólido bruto. Dissolveu-se o sólido em 20 ml de água formando uma solução turva que se filtrou e depois concentrou para originar 220 mg do composto do título na forma de sólido branco.

Exemplo 26 (Referência) a. 20,20-Etilenodioxi-5a-pregnan-3-ona

Preparou-se o composto do título com cerca de 90% de rendimento global partindo de 3p-hidroxi-5a-pregnan-20-ona, usando o método descrito para o composto 5β. b. 3fi-Etinil-3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona,20-cetal e 3a-etinil-3p-hidroxi-5a-pregnan-20-ona, 20-ceta/

Carregou-se um balão de 250 ml com três tubuladuras, equipado com uma entrada de gás, um termómetro e um condensador, com complexo de acetileto de lítio-EDA (2,75 g; 90%; 27,5 mmol). Adicionou-se benzeno seco (60 ml) e borbulhou-se gás acetileno através da mistura, a uma taxa moderada. Aqueceu-se, depois, a mistura até 50-55°C num banho de óleo e tratou-se por partes com 20-cetal de 5a-pregnan-3,20-diona (9 g; 25 mmol). Continuou-se a agitar a esta temperatura durante 5 h e depois à temperatura ambiente durante outras 17 h. Arrefeceu-se a suspensão resultante até 10°C e tratou-se com solução de NaCI saturada (5 ml). Removeu-se o solvente e tomou-se o resíduo em água. Recolheu-se por filtração o produto insolúvel em água, lavou-se com água, secou-se sob vácuo. Recristalizou-se então este produto bruto em EtOAc

85 094. ΕΡ 0 808 325/ΡΤ 30 para produzir 20-cetal de 3a-etinil-3p-hidroxi-5a-pregnan-20-ona (3,35 g). Evaporaram-se as águas-mães até à secura e purificou-se o resíduo por nrnmatngrafia em coluna sobre sílica gel. A eluição com uma mistura de tolueno:acetona (92:8) deu a cetona de partida por reagir (1,3 g) seguida de 3p-etinil-3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona,20-cetal (1,3 g) como segunda fracção. A eluição adicional com a mesma mistura de solventes produziu o 3a-etinil-3p-hidroxi-5a-pregnan-20-ona,20-cetal (270 mg) mais polar. c. 3p-Etinil-3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona

Dissolveu-se 3p-etinil-3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona, 20-cetal (550 mg) numa mistura de acetona (20 ml) e HCI 2 N (10 ml) e agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 15 h. Removeram-se os solventes e extractou-se o resíduo com CH2CI2. Lavou-se a camada orgânica com água, solução diluída de NaHCOg, água, e salmoura. Após secagem sobre MgS04 anidro, filtrou-se e evaporou-se a solução para produzir o produto bruto (414 mg). Dissolveu-se então este produto bruto numa pequena quantidade de CH2CI2 e verteu-se numa coluna de sílica gel. A eluição com mistura de tolueno:acetona (92:8) originou o composto do título (280 mg), p.f. 175-177°C. d. 3a-EtinU-3p-nitro-oxi-5a-pregnan-20-ona

Arrefeceu-se até -20°C uma solução de 3a-etinil-3p-hidroxi-5a-pregnan-20-ona, 20-cetal (2,15 g) em CHCI3 (45 ml) e tratou-se com anidrido acético (20 ml). Adicionou-se então ácido nítrico fumante (4 ml) e agitou-se a mistura a esta temperatura durante 45 minutos. Após ter-se aquecido até -5°C, verteu-se a solução amarela numa mistura de NaOH 2 N (70 ml) e água (150 ml) para produzir a solução resultante de pH 3-4. Depois extractou-se com CHCI3, lavou-se com água, solução saturada de NaHC03, salmoura, secou-se (MgS04) e evaporou-se para produzir o composto do título na forma de um material viscoso (3 g), que se utilizou assim no passo seguinte. e. 3fi-EtinU-3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona e 3a-etinil-3fi-hidroxi-5a-pregnan-20-ona

Recebeu-se o produto bruto (3 g) do passo anterior numa mistura de THF e água (30 ml; 1:1) e adicionou-se AgN03 (516 mg). Após ter-se agitado à temperatura ambiente durante 15 h, removeram-se os solventes e extractou-se o resíduo com CH2CI2. Lavou-se a camada orgânica com água, solução diluída de NaHC03, água, e salmoura. Após secagem sobre MgS04 anidro, filtrou-se e

Jr β’ ^ ς,** 85 094 ΕΡ 0 808 325/ΡΤ 31 evaporou-se a solução para produzir o produto bruto (2 g). Dissolveu-se então este produto bruto numa pequena quantidade de CH2CI2 e verteu-se numa coluna de sílica gel. A eluição com uma mistura de tolueno:acetona (93:7) originou, como primeira fracção, 3p-etinil-3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona (550 mg). A eluição adicional com a mesma mistura de solventes produziu 3u-etinil-3p-hidroxi-5a-pregnan-20-ona (460 mg), o mais polar.

Exemplo 27 (Referência)

Sa^l-Di-hidroxiSp-trifluorometil-Sfl-pregnan^O-ona, 21-hemissuccinato

Sob atmosfera anidra de árgon, dissolveram-se em piridina anidra 3a,21 -di-hidroxi-3|)-trifluorometil-5p-pregnan-20-ona (920 mg; 2,29 mmol), anidrido succínico (457 mg; 4,57 mmol) e dimetilaminopiridina (14 mg). Após ter-se agitado durante 16 horas, adicionou-se mais dimetilaminopiridina (7 mg). Após ter-se agitado por mais 3 horas, removeu-se o solvente in vacuo. Removeu-se a piridina residual por evaporação a partir de uma solução em tolueno. Purificou-se o resíduo por cromatografia flash em coluna (CH2CI2/MeOH; gradiente de 100:1 a 50:1) para produzir um resíduo branco semi-sólido (1,1 g). Dissolveu-se este sólido ligeiramente impuro em CH2CI2, lavou-se com água (3x 50 ml) e secou-se sobre MgS04. Removeu-se o solvente in vacuo para produzir um sólido branco (883 mg; 77%). 21 -hemissuccinato de 3a,21-Di-hidroxi-3fi-trífluorometil-5fi-pregnan-20-onar sal de sódio

Dissolveu-se 21-hemissuccinato de 3a,21-di-hidroxi-3p-trifluorometil-5p-pregnan-20-ona (859 mg; 1,71 mmol) em MeOH (35 ml). Depois, adicionou-se-lhe gota a gota NaHC03 (143 mg; 1,70 mmol) em água (10 ml). Adicionou-se mais MeOH (10 ml). Após ter-se agitado durante 2,5 horas, evaporou-se o solvente. Adicionou-se tolueno e evaporou-se in vacuo. Friccionou-se o resíduo com éter/hexano e depois com hexano para originar um sólido branco. Adicionou-se MeOH e removeu-se. Adicionou-se heptano e removeu-se in vacuo. Friccionou-se o resíduo com hexano e secou-se in vacuo para originar um sólido branco (878 mg; 98%).

, , .zs^**?* 85 094 ΕΡ 0 808 325/ΡΤ 32

Exemplo 28 (Referência) 3β-e tini/- 3 oc-hidroxi- 5Pprcgnan 11 -en-20-ona A uma solução de c/s/frans-dibromoetileno (236 mg; 1,27 mmol) em 5 ml de THF seco a -78°C, adicionou-se gota a gota BuLi 1,6 M em hexanos (1,6 ml; 2,54 mmol) e agitou-se a mistura durante 30 minutos. Baixou-se então a temperatura até -90°C e adicionou-se, através de uma cânula, uma solução de 5p-pregn-1 1-en-3,20-ona em 10 ml de THF durante 10 minutos e agitou-se a mistura reaccional a -90°C durante mais 30 minutos, após o que se adicionaram 3 ml de NH4CI aquoso saturado e se agitou a mistura até à temperatura ambiente. Reduziu-se o nível de solvente sob vácuo até "5 ml e depois submeteu-se a partição entre acetato de etilo e água (25 ml cada), e lavou-se a camada orgânica com NaCI aquoso saturado, secou-se sobre MgS04 e concentrou-se in vacuo para originar um sólido bruto. A cromatografia flash em 6 polegadas de sílica gel numa coluna de 2 cm, recolhendo fracções de 10 ml, eluindo com tolueno:acetona a 95:5, resultou em 142 mg (65,5%) do composto do título, p.f. 147-50°C.

Exemplo 29 (Referência) 3β- Trífluorometil-3a-hidroxi-5 α-19-norpregnan-20-ona

Obteve-se este composto como subproduto na preparação de 3a-hidroxi-3p-trifluorometil-5p-19-norpregnan-20-ona (ver, Exemplo 10). Isola-se a partir das fracções cromatográficas adequadas: p.f. 178-179°C.

Exemplo 30 (Referência) 3^n-Heptinil)-3a-hidroxi-5fi-pregnan -20-ona ^

Tratou-se uma solução de 1-heptino (0,327 ml; 2,5 mmol) em THF seco (15 ml) com n-BuLi (2,5 M em THF; 2,5 mmol; 1 ml) a -78°C. Após ter-se agitado a mistura a esta temperatura durante 1 hora, adicionou-se uma solução de 20-(1,2-etanodi-il-acetal) cíclico de 5p-pregnan-3,20-diona (360 mg; 1 mmol) em THF seco (15 ml) e agitou-se a mistura a -78°C durante 1 hora. Extinguiu-se então com solução de HCI 2 N (1 ml). Removeu-se o solvente e depois dissolveu-se o resíduo em acetona (10 ml). Após a adição de HCI 2 N (10 ml), agitou-se a solução à temperalura ambiente durante 1 hora. 33 # 85 094 ΕΡ 0 808 325/ΡΤ

Adicionou-se solução saturada de NaHC03 para neutralizar o ácido. Removeram-se os solventes e extractou-se o resíduo com EtOAc. Lavou-se a camada orgânica com água, solução diluída de NaHCOg, água, e salmoura. Após secagem sobre MgS04 anidro, filtrou-se e evaporou-se a solução para produzir o produto bruto (400 mg). Dissolveu-se então este produto bruto numa pequena quantidade de CH2CI2 e verteu-se numa coluna de sílica gel. A eluição com mistura de toluenoracetona (93:7) originou 3p-(1-heptinil)-3a-hidroxi-3p-pregnan-20-ona (260 mg) na forma de um sólido incolor; p.f. 121-123°C.

Usou-se um método análogo para preparar: 3p-(1-hexinil)-3a-hidroxi-5p-pregnan-20-ona; 3p-(1 -octinil)-3a-hidroxi-5p-pregnan-20-ona; 3p-ciclopro-piletinil-3a-hidroxi-5p-pregnan-20-ona; 3p-(3-metilbut-2-en-1-inil)-3a-hidroxi-5p-pregnan-20-ona; e 3p-(3,3-dimetilbutinil)-3a-hidroxi-5p-pregnan-20-ona.

Exemplo 31 3β- CicíopropiletiniI-3 a-hidroxiSp-pregnan -20-ona a. 20(1,2-etanodi-ilacetal) cíclico de 3fi-(5-Cloro-1 -pentinii)-3a-hidroxi-5p-pregnan-20-ona

Tratou-se uma solução de 5-cloropentino (0,5 ml; 4,8 mmol) em THF seco (15 ml) com n-BuLi (2,4 M em THF; 4,8 mmol; 2 ml) a -60°C. Após ter-se agitado a mistura a -78°C durante 0,5 horas, adicionou-se uma solução de 20-(1,2-etanodi-ilacetal) cíclico de 5p-pregnan-3,20-diona (560 mg; 1,56 mmol) em THF (15 ml) e agitou-se a mistura a -78°C durante 1 hora. Retirou-se o banho de arrefecimento e extinguiu-se a mistura com solução de NH4CI (3 ml). Removeu-se o solvente e extractou-se o resíduo com EtOAc. Lavou-se a camada orgânica com água, solução diluída de NaHC03, água, e salmoura. Após a secagem sobre MgS04 anidro, filtrou-se e evaporou-se a solução para produzir o produto bruto (660 mg). Usou-se este produto bruto assim no passo seguinte. b. 3fi-Ciclopropiletinil-3a-hidroxi-5fi-pregnan -20-ona

Tratou-se uma solução de di-isopropilamina (0,4 ml; 3 mmol) em THF seco (15 ml) com A7-BuLi (2,5 M em THF; 3 mmol; 1,2 ml) a -60°C. Após ter-se agitado a mistura a -78°C durante 0,5 horas, adicionou-se uma solução de 85 094 ΕΡ 0 808 325/ΡΤ 34

Βίί&ί>-'

.'5> 20-(1,2-etanodi-ilacetal) cíclico de 3p-(5-cloro-1-pentinil)-3a-hidroxi-5p-pregnan-20-ona (100 mg; 0,22 mmol) em THF (15 ml). Retirou-se o banho de arrefecimento e agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 0,5 h. Extinguiu-se então a mistura com solução de NH4CI (3 ml). Removeu-se o solvente e depois dissolveu-se o resíduo em acetona (40 ml). Após adição de HCI 1 N (4 ml), agitou-se a solução à temperatura ambiente durante 15 minutos. Adicionou-se solução saturada de NaHC03 para neutralizar o ácido. Removeram-se os solventes e extractou-se o resíduo com EtOAc. Lavou-se a camada orgânica com água, solução diluída de NaHC03, água, e salmoura. Após secagem sobre MgS04 anidro, filtrou-se e evaporou-se a solução para produzir o produto bruto (120 mg). Dissolveu-se então este produto bruto numa pequena quantidade de CH2CI2 e verteu-se numa coluna de sílica gel. A eluição com mistura de tolueno:acetona (95:5) originou 3p-(ciclopropiletinil)-3a-hidroxi-5p-pregnan-20-ona (55 mg) na forma de um sólido incolor; p.f. 123-138°C; TLC R, (hexano:acetona 7:3) 0,29.

Será obvio para um perito na arte que os compostos descritos acima podem existir como misturas de diastereómeros, que podem ser separadas em diastereómeros individuais. A resolução dos diastereómeros podem ser efectuada de forma conveniente por cromatografia gasosa ou líquida ou por isolamento a partir de fontes naturais. A menos que aqui seja especificado o contrário, a referência no fascículo e reivindicações aos compostos do invento, como se discutiram acima, pretende incluir todos os isómeros, quer separados, quer em suas misturas.

Quando os isómeros estão separados, a actividade farmacológica desejada predominará, com frequência, num dos diastereómeros. Como aqui se divulga, estes compostos revelam um elevado grau de estereoespecificidade. Em particular, os compostos possuindo a maior afinidade para o complexo receptor de GABA são os que possuem esqueletos de esteróide de 3a-hidroxipregnano, substituído em 3β.

Os compostos do invento e os usados no invento, que são não tóxicos, farmaceuticamente aceitáveis, naturais ou sintéticos, que actuam directamente, e formas "prodrogas" de progesterona, desoxicorticosterona, e metabolitos de androstano, têm até agora actividade desconhecida no cérebro no complexo receptor de GABAa. 0 presente invento tira partido da verificação deste 35 ΕΡ Ο 808 325/ΡΤ Μ

Φ -U mecanismo e actividade, previamente desconhecidos.

As composições farmacêuticas deste invento são preparadas em formas de unidade de dosagem convencionais, incorporando um composto activo do invento ou uma mistura desses compostos, com um transportador farmacêutico não tóxico em conformidade com os procedimentos aceites, numa quantidade não tóxica suficiente para produzir a actividade farmacodinâmica desejada num sujeito, animal ou humano. De preferência, a composição contém o ingrediente activo numa quantidade activa mas não tóxica, seleccionada de cerca de 1 mg a cerca de 500 mg de componente activo por unidade de dosagem. Esta quantidades depende da actividade biológica específica desejada e da condição do paciente. Os fins desejáveis das composições e métodos deste invento são no tratamento de tensão, ansiedade, PMS, PND, e apoplexias como as causadas por epilepsia para melhorar ou prevenir os ataques de ansiedade, tensão muscular, e depressão comuns em pacientes que sofrem destas anormalidades do sistema nervoso central. Mais um fim desejável da composição e métodos é o tratamento de insónia e a produção de actividade hipnótica. Um outro fim desejável dos compostos e métodos é a indução de anestesia, em particular por administração intravenosa. O transportador farmacêutico empregue pode ser, por exemplo, sólido, líquido ou de libertação ao longo do tempo (ver por exemplo Remington's Pharmaceutical Sciences, 14‘ Edição, 1970). Transportadores sólidos representativos são a lactose, terra alba, sacarose, talco, gelatina, ágar, pectina, goma arábica, estearato de magnésio, ácido esteárico, celulose microcristalina, hidrogéis poliméricos e semelhantes. Os transportadores líquidos são tipicamente o propilenoglicol, o glicofurol, soluções aquosas de ciclodextrinas, xarope, óleo de amendoim, e azeite e emulsões semelhantes. De modo semelhante, o transportador ou diluente pode incluir qualquer material de retardação bem conhecido na arte, tal como o monoestearato de glicerol ou diestearato de glicerol, sozinhos ou com cera, microcápsulas, microesferas, lipossomas, e/ou hidrogéis.

Pode-se utilizar uma vasta variedade de formas farmacêuticas. Assim, quando se usa um transportador sólido, a preparação pode ser simplesmente triturada e micronizada, em óleo, comprimida, colocada numa cápsula de gelatina dura ou cápsula com revestimento entérico, em pó micronizado ou na

85 094 ΕΡ 0 808 325/ΡΤ 36 forma de pelete, ou na forma de um trocisco ou pastilha. Os compostos do invento e usados no invento podem também ser administrados na forma de supositórios para administração rectal. Os compostos podem ser misturados num material como a manteiga de cacau e polietilenoglicóis ou outro material não irritante adequado, que seja sólido à temperatura ambiente, mas líquido à temperatura rectal. Quando se utiliza um transportador líquido, a preparação pode estar na forma de um líquido, tal como uma ampola, ou na forma de uma suspensão líquida aquosa ou não aquosa. As formas de dosagem líquidas necessitam também de conservantes farmaceuticamente aceitáveis e semelhantes. Adicionalmente, devido às baixas doses que serão necessárias, com base nos dados aqui divulgados, a administração parentérica, a pulverização nasal, a administração bucal e sublingual, e os emplastros cutâneos de libertação controlada são também formas farmacêuticas adequadas para administração tópica. O método de produzir actividade ansiolítica, anticonvulsiva, de alteração de humor (tal como antidepressiva) ou hipnótica, em conformidade com este invento, compreende a administração de um compostos do invento a um sujeito que necessite dessa actividade, normalmente preparado numa composição como foi descrito acima, com um transportador farmacêutico, numa quantidade não tóxica suficiente para produzir a dita actividade.

Durante o período menstrual, os níveis de metabolitos excretados variam aproximadamente quatro vezes (Rosciszewska et al., 1986). Deste modo, a terapia para controlar os sintomas envolve manter a paciente a um nível de metabolitos de progesterona mais elevado do que o normal, no estado pré-menstrual das pacientes de PMS. Os níveis no plasma, de metabolitos principais e activos são monitorizados durante os períodos pré-menstrual e pós-menstrual da paciente. A quantidade administrada dos compostos do invento, tanto isoladamente, como na forma de suas misturas, é assim calculada para atingir um nível que exercerá actividade receptora de GABA igual ou superior ao nível de metabolitos de progesterona num sujeito normal, durante o estado pré-menstrual. A via de administração pode ser qualquer via que transporte eficazmente o composto activo para os receptores de GABAa que se pretende estimular. A administração pode ser efectuada por via parentérica, entérica, rectal,

85 094 ΕΡ Ο 808 325/ΡΤ 37 intravaginal, intradérmica, intramuscular, sublingual, ou nasal; preferem-se as vias oral, intramuscular e dérmica. Por exemplo, uma dose num emplastro dérmico pode fornecer o ingrediente activo ao paciente durante um período de até uma semana. No entanto, a via parentérica é preferida para o estado epiléptico.

Potência e Eficácia no Loca/ de GR

Os dados experimentais in vitro e in vivo mostram que os metabolitos de progesterona/desoxicorticosterona que ocorrem naturalmente e os seus derivados interagem com elevada afinidade num local de reconhecimento novo e específico no complexo GR para facilitar a conductância de iões cloreto através das membranas neuronais sensíveis a GABA (Gee et aí., 1987; Harrison et ai, 1987).

Os peritos na arte sabem que a modulação da ligação de [35S]f-butilbiciclofosforotionato ([35S]TBPS) é uma medida da potência e eficácia de drogas que actuam no complexo GR, drogas essas que podem ter potencial valor terapêutico no tratamento de desordens de tensão, ansiedade, e apoplexia (Squires, R.F., et ai, "[35S]t-Butylbicyclophophorothionate binds with high affinity to brain-specific sites coupled to gamma aminobutyric acid-A and ion recognition site", Mo/. Pharmaco/., 23:326, 1983; Lawrence, L.J., et a!., "Benzodiazepine anticonvulsant action: gamma-aminobutyric acid-dependent modulation of the chloride ionophore", Biochem. Biophys. Res. Comm., 123:1130-1137, 1984; Wood, et al., "In vitro characterization of benzodiazepine receptor agonists, antagonists, inverse agonists and agonist/antagonists", Pharmaco!. Exp. Ther., 231:572-576, (1984)).

Realizámos várias experiências para determinar a natureza da modulação de [35S]TBPS quando afectada por compostos do invento. Verificámos que estes compostos interagem com um novo local do complexo GR, o qual não coincide com o do barbiturato, da benzodiazepina ou com qualquer outros locais previarnente conhecidos. Para além disso, estes compostos possuem potência e eficácia elevadas no complexo GR, com exigências estruturais rigorosas para essa actividade.

Os procedimentos para a realização deste ensaio são plenamente discutidos em: (1) Gee, et a!., 1987; e (2) Gee, K.W., L.J. Lawrence, e H.l.

85 094 ΕΡ 0 808 325/ΡΤ 38

Yamamura, Molecular Pharmacology, 30:218 (1986). Estes procedimentos foram realizados do seguinte modo:

Retiraram-se os cérebros de ratinhos macho Sprague-Dawley imediatamente a seguir ao seu sacrifício e dissecaram-se, sobre gelo, os córtices cerebrais. Preparou-se um homogeneizado de P2 da forma previamente descrita (Gee et a!., 1986). Resumidamente, homogeneizaram-se suavemente os córtices em sacarose 0,32 M seguida de centrifugação a 1000xg durante 10 minutos. Recolheu-se o sobrenadante e centrifugou-se a 9000xg durante 20 minutos. Fez-se uma suspensão da pelete de P2 resultante na forma de uma suspensão a 10% (peso molhado inicial/volume) em tampão fosfato de Na/K, 50 mM (pH 7,4) NaCI 200 mM, para formar o homogeneizado.

Incubaram-se alíquotas de cem microlitros (μΙ) do homogeneizado de P2 (0,5 miligramas (mg) de proteína) com [35S]TBPS (70-110 curies/milimole; New England Nuclear, Boston, MA) 2 nanomolar (nM) na presença ou ausência dos esteróides que ocorrem naturalmente ou dos seus derivados sintéticos a testar. Dissolveram-se os compostos testados em dimetilsulfóxido (Backer Chem. Co. Phillipsbury, NJ) e adicionaram-se à mistura de incubação em alíquotas de 5 μΙ. Perfez-se com tampão um volume final de mistura de incubação de 1 ml. Definiu-se ligação não específica como a ligação na presença de TBPS 2mM. Avaliou-se o efeito e a especificidade de GABA (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO) realizando todos os ensaios na presença de GABA mais (+ )bicuculina (Sigma Chem. Co.). As incubações, mantidas a 25°C durante 90 minutos (em condições de estado estacionário), foram terminadas por filtração rápida através de filtros de fibra de vidro (N.° 32, Schleicher and Schuell, Keene, NH). Quantificou-se a radioactividade ligada ao filtro, por espectrofotometria de cintilação líquida. Analisaram-se os dados cinéticos e as curvas de resposta à dose de composto/[35S]TBPS por regressão não linear usando um procedimento iterativo computadorizado para obter constantes de velocidade e valores de IC50 (concentração de composto à qual ocorre metade da inibição máxima de ligação de [35S]TBPS basal).

Os dados experimentais obtidos para este ensaio estão também publicados em Gee, et a!., 1987. Os dados discutidos nesta referência estão apresentados e descritos no Pedido PCT publicado n.° W093/03732, publicado a 04 de Março de 1993. Em contraste, o local de ligação de esteróide 39 " ^ ΕΡ Ο 808 325/ΡΤ identificado por este trabalho é distinto do local de GABA/bicuculina. 0 desvio nas curvas de resposta à dose induzido por bicuculina quando a inibição da ligação de [SRS]TBPS é causada por alfaxalona, não é paralelo. Isto indica que os locais do GABA e de esteróides não coincidem.

Realizou-se uma segunda série de experiências para demonstrar que os esteróides, os barbituratos e as benzodiazepinas não partilham um local de ligação comum no receptor de GABA. Realizou-se o ensaio em conformidade com os procedimentos delineados acima. Os dados cinéticos resultantes mostram que a dissociação da ligação de [35S]TBPS iniciada pela concentração de saturação de 3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona é potenciada por pentobarbital de Na 100 μΜ. Este efeito é uma indicação de que a 3a-OH-5a-pregnan-20-ona (esteróide) e o pentobarbital (barbiturato) se ligam a locais independentes.

Uma terceira série de experiências examinou as interacções entre a 3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona e o pentobarbital de Na na potência da ligação de (3H)flunitrazepam (FLU). Estas experiências apoiam adicionalmente a reivindicação de que os esteróides não partilham um local de acção comum com as benzodiazepinas e os barbituratos. Nesta série de experiências, o efeito de variar as concentrações de 3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona na ligação de (3H)FLU na presença ou ausência de uma concentração de máxima estimulação de pentobarbital de Na. Uma vez que o pentobarbital de Na tem maior eficácia máxima do que a de 3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona na potenciação da ligação de (3H)FLU, a 3a-hidroxi-5ot-pregnan-20-ona deveriam acabar por antagonizar o efeito de pentobarbital de Na se os dois interagirem de forma competitiva no mesmo local. Isto não é o que se observou. Deste modo, os dados apoiam adicionalmente a nossa conclusão de que certos esteróides incluindo os compostos do invento e os usados no invento interagem com um local novo distinto do local regulador do barbiturato ou de BZ no complexo GR. Devido a este local de acção independente, prevê-se que estes compostos esteróides tenham perfis terapêuticos diferentes daqueles dos barbituratos e BZ.

Pesquisaram-se vários compostos para determinar o seu potencial como moduladores de ligação de [35S]TBPS in vitro. Efectuaram-se esses ensaios em conformidade com os procedimentos discutidos acima. Com base nesses ensaios, estabelecemos os requisitos de estrutura-actividade para a sua interacção específica no complexo GR e a sua classificação por ordem de saasseí»

85 094 ΕΡ 0 808 325/ΡΤ 40 potência e eficácia. 0 Quadro I proporciona a IC50 e a inibição máxima de vários compostos, incluindo exemplos dos reivindicados no pedido. Define-se IC50 cornu a concentração de compostos para inibir 50% da ligação de [35S]TBPA de controlo. Trata-se de um indicador da potência in vitro de um composto. A inibição máxima é um indicador da eficácia in vitro de um composto.

QUADRO 1 IC5o Imax 3p-ciclopropiletinil-3a-hidroxi-5p-pregnan-20-ona 22 94 3a-hidroxi-3p-(3'-metilbut-3'-en-1 '-inil)-5p-pregnan-20-ona 24 91 3a-hidroxi-3p-metil-5p-19-nor-pregnan-20-ona 26 94 3a,20a-di-hidroxi-21-etil-5a-pregnano 27 13 3p-(ciclopropil)etinil-3a-hidroxi-5p-pregnan-20-ona 32 97 3a,20a-di-hidroxi-21 -metil-5a-pregnano 35 28 3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona 37 95 3a-hidroxi-3p-metil-5p-pregnan-20-ona 37 98 3p-etinil-3a-hidroxi-5p-pregnan-20-ona 39 101 3p-etinil-3a-hidroxi-19-nor-5p-pregnan-20-ona 44 93 3P-(5'-cloropentin-1 '-il)-3a-hidroxi-5p-pregnan-20-ona 44 98 3p-etenil-3a-hidroxi-5p-pregnan-20-ona 46 100 3a-hidroxi-3p-etinil-5a-pregnan-20-ona 53 91 3a-hidroxi-3p-metil-5a-pregnan-20-ona 62 97 21-hemissuccinato de bis(3af21-di-hidroxi-3|3-etinil-5p-pregnan-20-ona) 68 56 21-acetato de 3a,21-di-hidroxi-5a-pregnan-20-ona 75 99 3a,21-di-hidroxi-5a-pregnan-20-ona, (5a-THD0C) 76 100 3a-hidroxi-3p-trifluorometil-19-nor-5p-pregnan-20-ona 76 100 3a-hidroxi-21-metil-5p-pregnan-20-ona 78 100 3a-hidroxi-3p-(3'-metilbut-3'-en-1'-inil)-5a-pregnan-20-ona 88 95 3a-hidroxi-3p,21-dimetil-5a-pregnan-20-ona 89 85 3a-hidroxi-3p-metil-5a-19-nor-pregnan-20-ona 91 80 3a,20a(S)-di-hidroxi-5a-pregnano 99 46 N-(3a-hidroxi-3p-metil-5a-pregnan-20-iiidino)etanolamina 101 93 3p-etenil-3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona 113 88 21-hemissuccinato de 3a,21-di-hidroxi-5a-pregnan-20-ona 117 91 21-acetato de 3a,21-di-hidroxi-5p-pregnan-20-ona 119 49 3u,20u-di-hidroxi-3p-metil-5a prcgnono 166 52 41 85 094 ΕΡ 0 808 325/ΡΤ

J 3a,20-di-hidroxi-20-metil-5a-pregnano 176 40 21-hemissuccinato de 3a,21-di-hidroxi-3P-etinil-5p-pregnan- 20-ona 179 82 21-hemissuccinato de ΐ3ί3(3α,21^ί-Ι"^Γθχί-3β-ΐπ1;ΙϋθΓ·θΓηβΐΠ-5β-ρΓβ9ηθη-20-οη3) 189 23 3α- ΐΉ6ι·οχί-3β-·ΙΊυοΓθΓηβΐίΙ-5α-ρΓβ9η3η-20-οη3 200 77 3a,20a-di-hidroxi^-etinil-5a-pregnano 202 56 3α-Ιιϊ6ΐΌχί-3β-ίπίΙυοΓθΓηβΐίΙ-όβ-ρ^η-11 -en-20-ona 203 99 21-hemissuccinato de 3a,21-di-hidroxi-3β-metil-5α-pregnan-20-ona, sal de sódio 211 104 3a-hidroxi^-trifluorometil^-pregnan-20-ona 211 98 3a,21-di-hidroxi^-etinil^-pregnan-20-ona 216 104 21-hemissuccinato de 3a,21-di-ΐνιόΐΌχί-3β-ιηβΐίΙ-5α-ρΓβ9η3η-20-οη3 241 92 3a-hidroxi^-metil-5a-pregn-11-en-20-ona 242 76 3α-όί6ΐΌχί-3β-ΐπίΙυοι·οηηβίίΙ-5α-ρ^η3η-20-οη3 244 44 3a,21-di-hidroxi^-trifluorometil-19-ηοΓ-5β-ρΓβ9π8η-20-οη3 246 100 21-hemissuccinato de 3a,21-di-hidroxi-5a-pregnan-20-ona , sal de sódio 251 92 3α-ΙΥ^ι·οχί-3β-ίπ1ΊυοΐΌΓηβΐίΙ-19-nor-5a-pregnan-20-ona 251 40 3a,21-di-hidroxi^-etinil^-pregnan-20-ona, 21-acetato 251 101 3a,21-di-hidroxi^-metil-5a-pregnan-20-ona 258 96 3α,21-di-hidroxi-3β-metil-5α-pregnan-20-ona, 21-acetato 284 93 3a,21-di-hidroxi^-etenil-5a-pregnan-20~ona 288 101 3a,21-di-hidroxi^-trifluorometil^-pregnan-20-ona 354 102 21-acetato de 3a,21-di-Ι^ΐΌχί-3β-ΐπ'1ΊυοΓΌΓηβΐίΙ-5β-ρΓβ9η3η-20-οη3 370 88 21-hemissuccinato de 3a,21-di-hidroxi-3β-etenil-5α-pregnan-20-ona 377 89 3a,2C^-di-hidroxi^-metil^-pregnano 455 105 3α,20β-di-hidroxi-3β,21-dimetil-5α-pregnano 507 48 21-hemissuccinato de 3α,21-όι-Ι"Γ^ι·οχί-3β-ΐπ·ΙΊυοΓθΓηβΐΠ-19-nor-5p-pregnan-20-ona, sal de sódio 530 101 21-hemissuccinato de 3α,21-όί-Ιιϊ6Γθχί-3β-8ίιηϊΙ-5β-ρΓβ9η3η-20-ona, sal de sódio 540 102 21-hemifumarato de 3α,21-6ϊ-Ιιί6ΓΌχϊ-3β-ΐπίΙυοΓθ[τιβΐίΙ-5β-pregnan-20-ona, sal de sódio 546 102 3a,20a-di-hidroxi^-etinil^-pregnano 557 98

«, ,ΐϊνα**''

85 094 ΕΡ 0 808 325/ΡΤ 42 3a,21 -di-hidroxi-3p-fluorometil-5a-pregnan-20-ona 592 101 21-hemissuccinato de 3a,21-di-hidroxi-3ptrifluorometil-5p-pregnan-20-una 648 101 3a,20p-di-hidroxi-3p-etinil-5p-pregnano 688 77 21-hemissuccinato de 3a,21-di-hidroxi-3p-trifluorometil-5p-pregnan-20-ona, sal de sódio 712 99 3a,20p-di-hidroxi-3p-etinil-5a-pregnano 774 107 21-metilsuccinato de 3a,21-di-hidroxi-3p-trifluorometil-5p-pregnan-20-ona 48U 86 3a-hidroxi-3p-metil-21,21,21-trifluorometil-5a-pregnan-20-ona 915 101 3a,20p-di-hidroxi-3p-metil-5a-pregnano 924 99 3a-hidroxi-3p-metil-5a-pregn-16-en-20-ona 955 100 3a-hidroxi-3p-metil-5a-pregnan-11,20-diona 958 100 21-bromo-3a-hidroxi-3p-trifluorometil-5p-pregnan-20-ona 1530 102 estradiol >1000 1* progesterona >1000 1* corticosterona >1000 1* colesterol >1000 1* * = Inactivo.

Tal como pode ser observado a partir do Quadro 1, os compostos do invento e utilizados no invento têm IC50 baixos, que são a concentração necessária para conseguir 50% da inibição máxima de ligação de [35S]TBPS, enquanto que os compostos tais como os esteróides sexuais (estradiol e progesterona), os glucocorticóides (corticosterona) e o colesterol que possuem uma IC50 elevada são essencialmente inactivos. Deste modo, prevê-se que os esteróides hormonais e o colesterol não terão per se qualquer valor terapêutico para as indicações aqui descritas. A fim de distinguir esta classe única de esteróides dos esteróides hormonais, estes são agora denominados esteróides neuroactivos. No entanto, os esteróides sexuais, tais como a progesterona, podem ser metabolizados no organismo em esteróides semelhantes a 3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona. Assim, a progesterona pode ser considerada como uma prodroga. Os dados de TBPS correlacionam-se bem corn os dados de captação do ião 36CI potencializada por vários esteróides hidroxilados em 3a descritos em Purdy R.H., et al., J. Med. Chem 33:1572-1581 (1990), aqui incorporado como rcfcrôncia e esses dados também se correlacionam bem com

85 094 ΕΡ 0 808 325/ΡΤ 43 dados electrofisiológicos obtidos por medição da actividade dos esteróides para potenciar a corrente induzida por GABA no oócito injectado com receptores de GABA humanos. Isto indica que o ensaio de TBPS é uma medida aproximada da capacidade dos esteróides para modular de forma alostérica a actividade do canal de Cl'.

Compostos com Actividade Parcial

Na medida em que a actividade terapêutica desejada deve ser proporcionada ao paciente com o mínimo de efeitos secundários indesejados, um aspecto notável deste invento envolve a verificação de agonistas com actividade parcial nesses compostos com um grupo 5a-pregnan-3u,20u-hidroxilo, 5β-ρ^ηθη-3α,20β-|·ι'^ΓθχΠο ou os derivados e prodrogas desses compostos. Em adição, um subconjunto de esteróides neuroactivos diferentes dos destes dois grupos mostram também eficácia parcial no teste de TBPS (Quadro 1). Para os pacientes que desejem a melhoria de ansiedade ou convulsões, não se deseja a hipnose. Para os pacientes que desejem melhorar a insónia, não se deseja a anestesia. Os compostos e actividades descritos como agonistas com actividade parcial esperada para o efeito desejado com mínimo efeito não desejado.

Para além disso, a capacidade desses compostos para potenciarem o aumento da corrente de Cl mediado por GABA era limitada em comparação com a da 3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona em oócito de Xenopus injectado com genes de receptores de GABAa humanos.

Quando se usou o sistema de expressão do oócito de Xenopus para testar a propriedade de eficácia limite de alguns esteróides, neuroactivos, realizou-se o seguinte procedimento. Injectaram-se oócitos de Xenopus laevis (estádio VI) que foram "desfoliculados" usando o método da digestão por colagenase [3 horas; 18-23°C; 2 mg.ml'1 colagenase "A" em solução salina de Barth com sais de Ca2+ omitidos) com transcritos de ARNc da subunidade ai β1 e γ1 do complexo receptor de GABAa humano. O principal complexo receptor de GABAa é constituído por subunidades αβγ. Mantiveram-se, individualmente, os oócitos injectados, em placas de 96 alvéolos (200 μΙ por alvéolo de solução de Bath normal suplementada com penicilina 50 UI ml'1, estreptomicina 50 mg.ml1 e gentomicina 100 mg.ml'1) durante até 9 dias a 19-

85 094 ΕΡ 0 808 325/ΡΤ 44 20°C. Registaram-se as correntes induzidas por agonistas a partir de tensão fixada em oócitos de Xenopus a um potencial de conservação de -60 mV, usando um amplificador de fixação de tensão Axoclamp 2 A (Axon Instruments) no modo de fixação de tensão de dois eléctrodos. Encheram-se os microeléctrodos sensor de tensão e de passagem de corrente com KCI 3M, e resistências de 1-3 ΜΩ quando medidas na solução salina extracelular padrão. Sobrearrefeceram-se continuamente os oócitos com Ringer de rã (120 mM de NaCI; 2 mM de KCI; 1,0 mM de CaCI2; 5 mM de HEPES pH 7,4) a uma taxa de 5-7 ml.min1, à temperatura ambiente (17-21°C).

Aplicaram-se todas as drogas através do sistema de perfusão . Prepararam-se os esteróides (10'2 M) na forma de soluções concentradas de reserva, em DMSO ou em etanol, e depois diluíram-se na solução de Ringer na concentração adequada. A concentração final em DMSO e etanol foi 0,2% v/v, uma concentração que não teve qualquer efeito nas respostas suscitadas por GABA. Fizeram-se soluções de reserva de todas as outras drogas em solução de Ringer. Filtraram-se com passagem baixa as respostas de corrente de membrana a 100 Fiz e registaram-se numa fita magnética usando um gravador de fitas FM (Racal Store 4DS) para análise posterior.

Vantagens sobre a Progesterona

As correlações entre níveis reduzidos de progesterona e os sintomas associados a PMS, PND, e epilepsia catamenial (Backstrom, et al., 1983; Dalton, K., 1984) conduziram ao uso de progesterona no seu tratamento (Mattson, et a!., 1984; e Dalton, 1984). No entanto, a progesterona não é, de forma consistente, eficaz no tratamento dos síndromas supracitados. Por exemplo, não existe relação entre dose - resposta para a progesterona no tratamento de PMS (Maddocks, et a!., 1987). Estes resultados são previsíveis quando se consideram à luz dos resultados dos nossos estudos in vitro que demonstram que a progesterona tem uma potência muito baixa no complexo GR, tal como se observa no Quadro I, em comparação com determinados metabolitos de progesterona. O efeito benéfico da progesterona está provavelmente relacionado com a conversão variável de progesterona em metabolitos activos de progesterona. A utilização de metabolitos de progesterona específicos no tratamento dos 4 j&f Λ/y ,.jr» ‘ ' «sés#*"' 2¾¾ ΐ,-ρΛ*^ M i- 85 094 ΕΡ 0 808 325/ΡΤ 45 síndromas supramencionados é claramente superior à utilização de progesterona baseada na potência e eficácia elevadas dos metabolitos e dos seus derivados (ver Gee, ct a!., 1 987, e Quadro I acima).

Sem Efeitos Secundários Hormonais

Foi também demonstrado que os esteróides neuroactivos não têm efeitos secundários hormonais pela falta de afinidade pelos receptores de progesterona e de outros esteróides hormonais. Obtiveram-se os dados realizando ensaios em conformidade com os procedimentos descritos em Gee, et ai. 1988 previamente para determinar o efeito de metabolitos de progesterona e de seus derivados e de progestina R5020 na ligação de [3H]R5020 ao receptor de progesterona em útero de rato (Gee et al. 1988).

Incubou-se 3H-progesterona (0,15 nM) com o citosol de útero de rato na presença dos compostos de teste. Determinaram-se as ligações específicas após a incubação e compararam-se com a incubação de controlo sem os compostos. Os resultados são expressos em percentagem de inibição de ligação. Se os compostos se ligam ao receptor de progesterona com elevada afinidade, será esperada uma inibição de ligação de 100% à concentração testada. Os esteróides neuroactivos exibem menos de 10% de inibição o que indica serem inactivos como agentes progesténicos.

Estudaram-se ainda várias actividades hormonais de esteróides neuroactivos representativos através de testes às suas potenciais actividades estrogénica, de mineralocorticoide e de glucocorticoide. Analisaram-se estas actividades monitorizando a capacidade dos compostos para inibir a ligação das hormonas esteróides aos seus respectivos receptores de hormona. Os resultados destas experiências são revelados no pedido PCT publicado W093/03732, publicado em 04 de Março de 1993.

Os resultados destas experiências mostram claramente que os esteróides neuroactivos não possuem uma forte afinidade por qualquer dos receptores de esteróide anteriores. Assim, não possuirão efeitos secundários hormonais previstos, que resultariam de tais ligações a receptor de esteróides. 85 094

EP 0 808 325/PT ^ A 46 tf vv.·

Actividade Anticonvulsiva

Realizaram-se também experiências para determinar a relevância fisiológica de interacções de esteróides neuroactivos e receptores de GABA, avaliando a capacidade dos compostos do invento e dos usados no invento para prevenir convulsões induzidas por metrazol em ratinhos. Injectaram-se ratinhos com várias doses dos compostos de teste do invento, 10 minutos antes da injecção de metrazol. Determinou-se o tempo para o início do mioclono (presença de actividade clónica nos membros dianteiros) induzido pelo metrazol observando cada um dos ratinhos durante um período de 30 minutos. Nos ratinhos de controlo, o metrazol (85 mg/kg) induzirá convulsão em 95% dos animais. A capacidade de vários compostos do invento e usados no invento para proteger os ratinhos contra a convulsão é apresentada no Quadro 2. QUADRO 2: Actividade Antimetrazoi de Esteróides Neuroactivos em Ratos.

Nome Via Veículo Dose mg/kg % Protegida 33-ciclopropiletinil-3a-hidroxi-5p-pregnan-20- ona IP 50% hpbcd 10 87,5 3a-hidroxi-33-(3'-metilbut-3'-en-1 '-ϊηϊΙ)-5β-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 100 3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 100 3a-hidroxi-3p-metil-5p-pregnan-20-ona IP Solução micron. 10 70 3p-etinil-3a-hidroxi-53-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 100 3p-etinil-3a-hidroxi-19-nor-5p-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 87,5 3β-(1-ΐΊ8χϊηϋ)-3α-Μ0ΓθΧΪ-5β-ρ^η3η-20-οη3 IP 50% hpbcd 10 37,5 3β-βΐϊηΐΙ-3α4ιϊάΓοχί-5β-ρΓθ9η3η-20-οη3 IP 50% hpbcd 10 87,5 3α-Μ0Γθχί-3β-βΐβηϋ-5α-ρΓβ9η3η-20-οη3 IP 50% hpbcd 10 87,5 3a-hidroxi-3p-metil-5a-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 100 it 8b 094

EP 0 808 325/PT 47 t, ?. 21-hemissuccinato de bis(3a,21-di-hidroxi^-etinil-5p-pregnan-20-ona) IP 50% hpbcd 10 37,5 21 acetato de 3a,21 -di-hidroxi-5a-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 50 3u,21-di-hidroxi-5a-pregnan-20-ona, (5a-THDOC) IP 50% hpbcd 10 87,5 3a-hidroxi-3p-trifluorometil-19-ηοΓ-5β-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 100 3β-eΐinil-3a-hidroxi-5β-pregn-11 -en-20-ona IP 50% hpbcd 10 75 3a-hidroxi-3β-(3'-metilbuΐ-3'-en-1 '-inil)-5a-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 87,5 3a-hidroxi-3p-metil-5a-19-nor-pregnan-20-ona IP Solução micron. 10 37,5 3a,20a(S)-di-hidroxi-5a-pregnano IP 50% hpbcd 10 30 3β-βίίηίΙ-3α-Ιϊ^Γοχί-5α-ρ^η3η-20-οη3 IP 50% hpbcd 10 100 21-acetato de 3a,21 -di-hidroxi^-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 25 3a,20a-di-hidroxi^-metil-5a-pregnano IP Solução micron. 100 60 21-hemissuccinato de 3α,21-όί-όί0Γθχί-3β-etinii-5p-pregnan-20-ona IP água 10 50 21-hemissuccinato de bis(3a,21-di-hidroxi-3p-trifiuorometil^-pregnan-20-ona) IP 50% hpbcd 10 25 3a-hidroxi-3p-fluorometil-5a-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 14,3 21-hemissuccinato de 3a,21 -di-hidroxi^-metil-5a-pregnan-20-ona, sal de sódio IP Solução micron. 10 11,11 3α-Ι^Γθχι-3β-ίπίΙυοΐΌηηβΐϋ-5β-ρ^η3η-20-οη3 IP 50% hpbcd 10 62,5 3α,21-di-hidroxi-3β-etinil-5β-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 18,8 21-hemissuccinato de 3a,21 -di-hidroxi^-metil-5a-pregnan-20-ona IP água 10 37,5 3α-hidroxi-3β-trífluorometil-5α-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 62,5 £ψ· *egfi £ψ· *egfi ..... 85 094 ΕΡ 0 808 325/ΡΤ 48 3a,21-di-hidroxi-3p-trifiuorometii-1 9-ηοΓ-5β-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 118,8 21-hemissuccinato de 3α,21 -di-hídroxi-5a-pregnan-20-ona, sal de sódio IP água 60 100 3a-hidroxi-3p-trifluorometil-19-nor-5a-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 25 21-acetato de 3a,21-di-hidroxi-3p-etinil-5p-pregnan-2U-ona IP 50% hpbcd 10 62,5 3a,21-di-hidroxi-3p-metil-5a-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 87,5 21-acetato de 3a,21 ^ΐ-Ι"ΐΐ5Γθχί-3β-ΐΎΐβΐ'ιΙ-5α-pregnan-20-ona IP Solução micron. 10 10 3a,21 -όί-Ι^Γθχϊ-3β-ΐπ1ΊυοΓθΐτ>βόΙ-5β-ρ^η3η-20-ona IP 50% hpbcd 10 50 21-acetato de 3a,21 ^ϊ-|·^Γθχϊ-3β-trifluorometil-5β-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 62,5 3α-hidroxi-3β-trifluorometil-5β-1 9-nor-pregn-17(Z)-eno IP 50% hpbcd 10 25 3a,20-di-hidroxi^,20-dimetil-56-pregnano IP Solução micron. 10 22,2 3a,20a-di-hidroxi^,21-dimetil-5a-pregnano IP DMSO 10 0 21-hemissuccinato de 3α,21^ΐ-ΙΥι0Γθχί-3β-trifluorometil-19-nor-5β-pregnan-20-ona, sal de sódio IP água 10 50 21-hemissuccinato de 3a,21 ^ΐ-Ι^ι·οχι-3β-βΐίηΐΙ-5β-ρ^η3η-20-οη3, sal de sódio IP água 10 50 21-hemifumarato de 3α,21-όϊ-όϊ0Γθχι-3β-trifluorometil-5β-pregnan-20-ona, sal de sódio IP água 10 50 3a, 21 ^ϊ-Ι^Γθχϊ-3β-ίΙυοΓοηηβΐίΙ-5α-ρ^ηθη-20-ona IP 50% hpbcd 10 25 21-hemissuccinato de 3a,21 -όί-Ι^Γθχί-3β-trifluorometil-5β-pregnan-20-ona IP água 10 50 3α,20β-di-hidroxi-3β-etinil-5β-pregnano IP 50% hpbcd 10 25 21-hemissuccinato de 3a,21 -όϊ^ΐόΓθχί-3β-trifluorometil-5β-pregnan-20-ona, sal de sódio IP água 10 62,5 3α,20β^ι-όϊόΐΌχΐ-3β-βΐιηϋ-5α-ρ^η3ηο IP 50% hpbcd 10 37,5 85 094 ΕΡ 0 808 325/ΡΤ 49 A capacidade dos esteróides neuroactivos para proteger animais^ctíntra

outros convulsivos químicos foi ainda demonstrada para 3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona, 3a,21 di hidroxi 5a pregnan-20-ona e 3a-hidroxi-3p-metil-5p-pregnan-20-ona. Os testes de anticonvulsivos são semelhantes aos descritos acima. Os convulsivos químicos seguintes são: metrazol (85 mg/kg); (+ )bicuculina (2,7 mg/kg); picrotoxina (3,15 mg/kg); estricnina (1,25 mg/kg); ou veículo (solução salina a 0,9%). Imediatamente após a injecção de convulsivo ou veículo, observaram-se os ratos durante um período de 30 a 45 minutos. Registou-se o número de animais com convulsões tónicas e/ou clónicas. No teste de electrochoque máximo, aplicou-se 50 mA de corrente a 60 Hz através dos eléctrodos da córnea durante 200 ms para induzir apoplexia tónica. Definiu-se como ponto final a capacidade dos compostos para extinguir o componente tónico. Determinou-se o potencial de depressão do SNC genérico através de um teste com bastonete rotativo, 10 minutos após a injecção de compostos, no qual se determinou o número de ratinhos que permaneceu num bastonete em rotação (6 rpm) durante 1 minuto num dos três ensaios. Determinou-se a ED50 (a dose à qual ocorre metade do efeito máximo) para cada uma das pesquisas e apresentam-se no Quadro 3, abaixo. Os resultados demonstram que os esteróides neuroactivos, em comparação com outros anticonvulsivos clinicamente úteis, são extremamente eficazes com perfis semelhantes aos da BZ clonazepam. Estas observações demonstram a utilidade terapêutica destes compostos como moduladores da excitabilidade cerebral, que está relacionada com a sua interacção de elevada afinidade com o complexo GR in vitro. (Segue Quadro) 50 85 094 / ... *.·<>< 4; ΕΡ 0 808 325/ΡΤ QUADRO 3: Actividade Anticonvulsiva de Esteróides Neuroactivos Exemplificados e Anticonvulsivos Conhecidos Seleccionados, em Ratinhos. ED50 (mg/kg) Composto RR MES MTZ BIC PICRO STR 3a5cc(a,-P 30 28,6 4,9 12,3 10,2 >300 5a-THnOC,a’ 22,9 26,7 8,1 17,8 5,6 >300 3a-hidroxi-3(Vmetil-5u- pregnan-20-ona11 246,2 >100 6,3 61,9 35,4 >100 Clonazepam* 0,184 93 0,009 0,0086 0,043 NP Phenobarbital* 69 22 13 38 28 95 Phenytoin * 65 10 NP NP NP * * Progabide* * * - 75 30 30 105 75 Valproate* 426 272 149 360 387 293 As abreviaturas são RR (metrazol); BIC (bicuculin< protecção). (al Dissolvido em hidroxipro para os esteróides e os con * Os dados de anti-convu experimental detection, Antiepileptic Drugs, D.M. (Raven Press, New York), lbl 0 veículo continha hid solução salina. ** Protecção máxima de 5 * * * Os convulsivos químic dados de Worm et al., G Neuropharmacological prof on their anticonvulsant Therapeutics 220:660-671 bastonete rotativo s); PICRO (picroto, pil-p-ciclodextrina a vulsivos foi, respec Isivos são de Swir quantification and Woodbury, J.K. Pe 982. roxipropilmetilcelulo 0% a 55-100 mg/kç os nos estudos de /; iamma-aminobutyrk les of progabide (SI spectra, Journal (1982). ; MES (electrochoque máximo); MTZ xina); STR (estricnina); NP (nenhuma 20% em água. A via de administração tivamente, IP e SC. lyard & Woodhead, General principies: evaluation of anticonvulsants, em nry, and C.E. Pippenger, eds., p 111, se a 0,32% e TWEEN 80 a 4% em 3- irogabido foram administrados IV, todos : acid (GABA) receptor stimulation. I. . 76002) and SL 75102, with emphasis of Pharmacology and Experimental

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Efeitos ansioiíticos

As experiências seguintes demonstram que os metabolitos de progesterona, 3a-OH-5a-pregnan-20-ona e 3oc-OH-5p-pregnan-20-ona são ansioiíticos eficazes em quatro modelos animais de ansiedade humana que mede os efeitos comportamentais de compostos ansioiíticos. Deve-se entender que estes dois compostos descrevem o invento como ilustração. Os dados dos seus derivados sintéticos nestas medições são também apresentados nos Quadros 4-6. Os quatro modelos animais usados para medir os efeitos comportamentais de compostos ansioiíticos são: 1) teste de transição luz/escuridão; 2) labirinto de braços com braços em cruz elevados; 3) teste de conflito Geller-Seifter e 4) teste de Vogel. a) Teste de transição Luz/Escuridão O teste de transição luz/escuridão (Crawley e Goodwin, Pharmacol. Biochem. Behav. 13:67-70 1980) baseia-se na observação de que os roedores têm tendência natural para explorar novos ambientes, mas as arenas abertas, fortemente iluminadas, provocam aversão aos roedores e inibem o comportamento exploratório (Christmas e Maxwell, Neuropharmacol. 9:17-29 1970; File, J. Neurosci. Meth. 2:219-238 1980). Uma variedade de ansioiíticos clinicamente comprovados incluindo diazepam, clonazepam e pentobarbital mostraram aumentar o número de transições entre a caixa iluminada e a caixa escura, ao passo que as drogas não ansiolíticas não demonstraram este efeito comportamental (Crawley et al., Neuropharmacol. 23:531-537 (1984)).

Alojaram-se 4 ratinhos machos N.I.H. Swiss-Webster (Harlan, Harlan, Indianapolis, IN), pesando 15-20 g, por gaiola, em gaiolas de polietileno com leito de serradura. Controlou-se o ambiente da sala da colónia (22°C) com um ciclo luz/escuridão de 12 horas (06:00-18:00 h). Disponibilizou-se comida e água ad iibitum, excepto durante o teste. Realizaram-se as experiências das 07:00-15:00 h e compensaram-se os grupos pelos efeitos da duração do dia. Administrou-se aos ratinhos droga ou veículo apenas uma vez. O método usado foi uma modificação dos métodos previamente descritos (Wieland et al., Br. Res. 565:263-268 (1991)). A montagem incluiu duas câmaras de teste de 2 compartimentos automatizados (Modelo RXYZCM16, Omnitech Electronics, Columbus, OH). 0 compartimento aberto comunicava

85 094 ΕΡ 0 808 325/ΡΤ com ο compartimento fechado através de uma passagem de 7,5x7,5 cm. 0 compartimento aberto estava fortemente iluminado usando uma lâmpada de luz incandescente de 200 W. A sala experimental foi mantida na escuridão.

Registaram-se automaticamente as interrupções nos feixes de infravermelhos em cada câmara estando ligados a um computador através de um Digiscan Analyzer (Omnitech Electronics) e analisaram-se os dados usando o Integrated Lab Animal Monitoring System (Omnitech Electronics).

Administrou-se, intraperitonealmente (IP), veículo ou droga de teste aos ratinhos N.I.H. Swiss-Webster, 10 minutos mais tarde colocaram-se no centro do compartimento iluminado. Mediu-se o número de transições entre a câmara iluminada e a câmara escura, a actividade total na câmara iluminada e o tempo despendido na câmara iluminada, durante um período de teste de 10 minutos. A administração de 3a-0H-5a-pregnan-20-ona e 3a-OH-5p-pregnan-20-ona no teste de transição luz/escuridão produziu uma curva de resposta à dose significativa em relação ao número de transições entre a caixa escura e a caixa iluminada. Comparações post-hoc mostraram que o número dos cruzamentos para doses do 3u-OH-5ot-pregnan-20-ona e do 3a-OH-5p-pregnan-20-ona aumentou significativamente nas doses testadas em relação ao controlo (teste t de Dunnett).

Adicionalmente, tanto a 3a-OH-5a-pregnan-20-ona como o 3a-OH-5p-pregnan-20-ona produziram aumentos significativos (p<0,01) na actividade a 10 & 20 mg/kg quando comparado com os grupos de controlo (íeste t de Dunnett). Não existiram diferenças significativas entre os dois compostos em qualquer dose testada. bj Labirinto com braços em cruz elevados A base teórica para o teste de labirinto com braços em cruz elevados é semelhante à do teste de transição luz/escuridão. Como descrito por Pellow et a!., J. Neurosci. Mcth. 14:149-167 (1985), a montagem de labirinto com braços em cruz elevados é concebido para utilizar a aversão natural dos ratinhos a espaços abertos. A montagem consiste em dois braços abertos e dois braços fechados. O teste de labirinto com braços em cruz elevados permite duas medições de ansiedade, o número de entradas nos braços abertos e o tempo despendido nos braços abertos, ambos expressos como uma percentagem do 53 53 4?* ...ί'ν.* bb υ«4 EP Ο 808 325/PT número total de entradas e tempo despendido em/sobre os braços abertos e os braços fechados.

Alojaram-se 4 ratinhos machos N.I.H. Swiss-Webster (Harlan, Indianapolis, IN), pesando 15-20 g, por gaiola, em gaiolas de polietileno com leito de serradura. Controlou-se o ambiente da sala da colónia (22°C) com um ciclo luz/escuridão de 12 horas (06:00-18:00 h). Disponibilizou-se comida e água ad Hbitum, excepto durante o teste. Realizaram-se as experiências das 07:00-15:00 h e compensaram-se os grupos pelos efeitos da duração do dia. Administrou-se aos ratinhos droga ou veículo apenas uma vez. O método usado foi previamente descrito (Lister, Psychopharmacol. 92:180-185 (1987)). A montagem incluiu dois braços abertos perpendiculares a dois braços fechados elevados 50 cm acima do solo. Cada braço tinha 50 cm de comprimento e as paredes dos braços fechados tinham 40 cm de altura. O labirinto era totalmente feito de "plexiglass" negro. Lâmpadas de luz incandescentes de 200 W estavam por cima de cada um dos braços abertos para produzir um forte contraste entre os braços abertos e os braços fechados.

Dez minutos após uma injecção, colocaram-se os ratos N.I.H. Swiss-Webster no centro do labirinto em cruz virados para um braço aberto. Durante os 5 minutos do período de teste, mediram-se o número de entradas nos braços abertos e nos braços fechados, e o tempo despendido nos braços abertos e nos braços fechados. Para medir a variável dependente, as quatro patas tinham de estar todas dentro de um braço. Deste modo, não se contabiliza o tempo despendido no centro do labirinto, logo o tempo total despendido nos braços abertos e nos braços fechados pode não igualar 5 minutos.

Tanto a 3a-OH-5a-pregnan-20-ona como a 3a-OH-5p-pregnan-20-ona, no teste de labirinto com braços em cruz elevados, demonstraram proporções aumentadas de entradas nos braços abertos, através das doses. A 3a-OH-5a-pregnan-20-ona produziu um aumento significativo nas entradas a 20 mg/kg (p<0,05), ao passo que a 3a-OH-5p-pregnan-20-ona produziu aumentos significativos nas entradas a 5 mg/kg (p<0,05), 7,5 mg/kg (p<0,01), e 10 mg/kg (p<0,01).

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Adicionalmente, a 3a-OH-5a-pregnan-20-ona e a 3a-OH-5p-pregnan-20-ona produziram aumentos, dependentes da dose, no tempo despendido nos braços abertos. A 3a-0H-5a-pregnan-20 ona produziu aumentos significativos no tempo despendido nos braços abertos a 10 mg/kg (p<0,01), ao passo que a 3u-0H-5p-pregnan-20-ona produziu aumentos significativos no tempo despendido nos braços abertos a 7,5 mg/kg (p<0,01) e 10 mg/kg (p<0,01).

Os resultados destas experiências encontram-se no pedido PCT publicado W093/03732, publicado a 04 de Março de 1993. O Quadro 4 apresenta o resumo das actividades ansiolíticas de compostos do invento e de compostos usados no invento usando o labirinto com braços em cruz elevados nas mesmas condições descritas atrás. QUADRO 4: Actividade Ansiolítica em Labirinto com braços em Cruz, em Ratinhos.

Nome Via Veículo Dose mg/kg % Controlo 3a-hidroxi-3p-(3'-metiIbut-3'-en-1 '-ίηίΙ)-5β-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 155 3<x-hidroxi-5a-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 20 143,7 3p-etinil-3a-hidroxi-5p-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 1 186,6 3p-etinil-3a-hidroxi-19-nor-5p-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 172 3p-etinil-3a-hidroxi-5p-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 151 3a-hidroxi-3p-etinil-5a-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 213 3a-hidroxi-3p-metil-5a-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 5 165,5 21-acetato de 3u,21-di-hidroxi-5a-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 133 3a-hidroxi-3p-trifluorometil-19-ηοΓ-5β-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 173,8 3p-etinil-3a-hidroxi-5p-pregn-11 -en-20-ona IP 50% hpbcd 10 233

8b 094 EP 0 808 325/PT

55 3a-hidroxi-3p-(3'-metilbut-3'-en-1 '-inii)-5a-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 141 3p-etenil-3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 5 154,3 3a,20a-di-hidroxi-3p-metil-5a-pregnano IV Solução micron. 10 174,5 21-hemissuccinato de 3a,21 -di-hidroxi-3p-etinil-5p-pregnan-20-uiid IP 50% hpbcd 10 164,2 21-hemissuccinato de bis(3a,21-di-hidroxi-3p-trifluorometil-5P-pregnan-20-ona) IP 50% hpbcd 10 92 3a-hidroxi-3p-fluorometil-5a-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 20 150,7 3a-hidroxi-3p-trifluorometil-5p-pregnan-20- ona IP 50% hpbcd 20 197,6 3a,21 -di-hidroxi-3p-etinil-5p-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 162 3a,21 -di-hidroxi-3p-trifluorometil-19-ηοΓ-5β-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 140 3a-hidroxi-3p-trifluorometil-1 9-nor-5a-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 161 21-acetato de 3a,21 -di-hidroxi-3p-etinil-5p-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 159 3a,21 -di-hidroxi-3p-trifluorometil-5p-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 237 3p-etinil-3a-hidroxi-5p-pregnan-11,20-diona IP 50% hpbcd 5 235,9 21-acetato de 3a, 21 -di-hidroxi-3p-trifluorometil-53-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 5 143,3 3a-hidroxi-3p-trifluorometil-5p-pregnan-11,20-diona IP 50% hpbcd 10 112 3a,20a-di-hidroxi-3p,21-dimetil-5a-pregnano IP DMSO 10 73 21-hemissuccinato de 3a,21-di-hidroxi-3p-trifluorometil-19-nor-5p-pregnan-20-ona, sal de sódio IP água 20 161,1 21-hemissuccinato de 3a,21 -di-hidroxi-3p-etinil-5p-pregnan-20-ona, sal de sódio PO água 10 159 21-hemifumarato de 3a,21-di-hidroxi-3p-trifluorometil-5p-pregnan-20-ona, sal de sódio IP água 50% hpbcd 126 mt 56 85 094 ΕΡ 0 808 325/ΡΤ a|í|y- f! 3oc,21-di-hidroxi-3p-fluorometil-5a-pregnan- 20-ona IP 50% hpbcd 10 109 3a,20p-di-hidroxi-3p-etinil-5(3-pregnano IP DMSO 10 178 21-hemissuccinato de 3a,21-di-hidroxi-3P-trifluorometil-5p-pregnan-20-ona, sal de sódio IP água 20 172,8 c) Teste de conflito de Geller-Seifter

Este modelo animal de ansiedade humana utiliza um estado condicionado de conflito em ratos para averiguar as propriedades ansioiíticas de drogas. Condicionam-se ratos a pressionar uma barra para o reforço positivo segundo dois programas de comportamento (Geller and Seifter, Psychopharmacologia 1:482-492 (1960)). O primeiro inclui pressionar a barra segundo um programa de razão variável sem punição. 0 segundo componente é um programa de razão fixa em que cada pressão na barra resulta num reforço positivo e numa punição. 0 componente punido produz um estado de conflito no animal. O componente não punido permite a observação de quaisquer efeitos depressivos de resposta que a droga possa possuir. Uma resposta ansiolítica aumentaria a resposta punida sem afectar a resposta não punida.

Usaram-se ratos machos Sprague-Dawley albinos (Charles River Labs, Wilmington, MA) pesando de 250-300 g para experiências de conflito e mantiveram-se numa dieta restrita de ração em peletes de Purina Lab Chow com água sempre disponível para manter o peso corporal a 85% dos níveis dos seus jovens adultos com alimentação livre. Alojaram-se individualmente os ratos com um ciclo de luz- escuridão de 12 horas com as luzes acesas das 07:00-19:00.

Mediram-se, em ratos, os efeitos anti-ansiedade (atenuação de punição) e de resposta depressiva, de 3a-0H-5a-pregnan-20-ona e de 3a-OH-5a-pregnan-20-ona, pelo teste de conflito de Geller e Seifter (1960). Neste teste de 63 minutos, os ratos famintos executam uma resposta de pressão da alavanca para obter uma recompensa de leite adoçado. 0 programa de reforço consiste nas componentes punição e não punição, alternando aproximadamente todos os 15 minutos. Treinaram-se os ratos em câmaras de teste (Coulbourn Instruments) com uma alavanca rnunlada numa parede, uma pequena concha que distribuía o 57 ΕΡ Ο 808 325/ΡΤ «ré recompensa de 0,1 ml de leite (1 parte de leite condensado Eagle:2 partes de água), e um chão de grelha metálica através do qual se administrava a punição de choques nos pés. Usou-se um minicomputador DEC PDP 11/73 correndo o SKED (State Systems) para programar e registar.

Inicialmente, os ratos aprenderam a responder num programa de reforço contínuo e rapidamente progrediram para programas de intervalos variável (VI) de 30 segundos, 1 minuto, 2 minutos. No programa de reforço contínuo, os ratos recebiam uma recompensa de leite a seguir a cada pressão na alavanca; nos programas de VI, as recompensas de leite eram fornecidas com intervalos variáveis e pouco frequentes, eventualmente numa média de uma vez por cada 2 minutos. Depois, introduziram-se quatro períodos de "conflito" de 3 minutos na linha de base de VI não punida; o primeiro começou após 3 minutos de execução de VI e os outros alternaram entre períodos de 12 minutos de resposta VI. Durante os períodos de conflito, que foram assinalados pela apresentação de uma luz e um som, esteve em vigor o programa de reforço contínuo e cada pressão na alavanca forneceu uma recompensa de leite e uma pequena punição de choque nos pés (0,25 ms). A intensidade do choque foi inicialmente 0,2 mA, e foi diariamente aumentada com incrementos de 0,02 mA para conter gradualmente a pressão da alavanca para 5 respostas, ou menos, por período de conflito. Este treino levou de 4-6 semanas, após o que se observaram taxas de resposta baixas estáveis, durante os períodos de conflito e taxas elevadas estáveis, nos períodos sem punição. Os aumentos provocados pela droga na taxa das respostas punidas foram considerados como um índice de actividade anti-ansiedade, enquanto que as diminuições na taxas das respostas não punidas foram consideradas como um índice de depressão ou sedação de resposta.

Os efeitos da 3a-OH-5a-pregnan-20-ona e da 3a-0H^-pregnan-20-ona no teste de conflito estão aqui resumidos. Ambos os compostos produziram grandes aumentos na taxa de respostas punidas, sugerindo que ambos seriam activos como agentes anti-ansiedade. O efeito máximo da 3a-OH-5p-pregnan-20-ona observou-se a 2 mg/kg e o da 3a-OH-5a-pregnan-20-ona a 4,4 mg/kg, a seguir a administração subcutânea. (Para análise estatística e devido ao pequeno número de testes para cada dose, combinaram-se todos os testes efectuados com cada composto para comparar com os testes de controlo com veículo, usando um teste t para as medições 85 094 ΕΡ 0 808 325/ΡΤ 58 relacionadas: para a 3a-OH-5ot-pregnan-20-ona, p<0,02; pregnan-20-ona, p<0,008). para a .j? ^ ... '-PA A-

3α-ΟΗ-5β- 0 Quadro 5 mostra o resumo de actividades ansiolíticas de compostos do invento e usados no invento usando o teste de Geller-Seifter nas condições experimentais descritas acima. QUADRO 5: Actividade Ansiolítica em Geller/Seifter, em Ratos.

Composto Via Veículo Dose mg/kg Geller/Seifter (% de Controlo) 3a-hidroxi-5p-pregnan-20-ona SC 50% hpbcd 2 860,5 3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona SC 50% hpbcd 5 471,8 3p-etinil-3a-hidroxi-5p-pregnan-20-ona SC 50% hpbcd 2 751,1 3a-hidroxi-3p-etinil-5a-pregnan-20-ona SC 50% hpbcd 8 830,2 3a-hidroxi-3p-metil-5a-pregnan-20-ona SC 50% hpbcd 4 1384,6 3a-hidroxi-3p-trifluorometil-19-nor-5p-pregnan-20-ona SC 50% hpbcd 4 1073,1 3|3-etinil-3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona PO 50% hpbcd 12 1092,3 3a-hidroxi-3p-fluorometil-5a-pregnan-20- ona SC 50% hpbcd 8 1005 3a-hidroxi-3p-trifluorometil-5p-pregn-11 -en-20-ona SC 50% hpbcd 4 508,3 3a-hidroxi-3p-trifluorometil-5p-pregnan- 20-ona SC 50% hpbcd 4 663,2 3<x,21 -di-hidroxí-3p-trif luorometil-5p-pregnan-20-ona SC 50% hpbcd 16 982,4 3a-hidroxi-3p-trifluorometil-5p-19-norpregnan-17(20)-eno SC 50% hpbcd 16 1130,3

SSKW!®®®*5

85 094 ΕΡ 0 808 325/ΡΤ 59

Prodroga Via Veículo Dose mg/kg Geller/Seifter (% de Controlo) 21-acetato de 3α,21-ό'ι-Ιιι0Γοχϊ-3β-trifluorometil-5p-pregnan-20-ona SC 50% hpbcd 8 882,8 21-hemissiccinato de 3oc,21-di-hidroxi-3p-etinil-5h-pregnan-20-ona PO água 16 1350,0 21 -hemissuccinato de 3a,21 -di-hidroxi-3[3-trifluorometil-5[Ppregnan-20-ona, sal de sódio PO água 8 840,0 21-hemissuccinato de 3a,21-di-hidroxi-3|3-trifluorometil-5h-1 9-nor-pregnan-20-ona, sal de sódio PO água 8 2493,4 3a-hidroxi-3|1-metil-5a-pregnano-20-espiro-2'-(1'3'-tiazolidina-4'- ácido carboxílico) SC 50% hpbcd 16 900,0 d) Teste de Vogel 0 teste de Vogel baseia-se no desenvolvimento de um conflito entre um comportamento de elevada motivação e uma aversão. Para este teste, a motivação forte é a sede. O animal é privado de água durante 12-16 horas para produzir a motivação para beber. Durante o período de treino, expõem-se os animais ao ambiente de teste de modo a que se habituem ao bebedouro e minimizem o receio a um ambiente novo. A seguir ao treino, permite-se que os animais tenham acesso à água durante 2 horas. Durante este tempo, os animais beberão e comerão as suas quantidades normais de água e comida, compensando o tempo de privação. No entanto, este programa ainda produz uma forte motivação para beber durante o período de teste.

Tendo sido privados de água durante um período de doze a dezasseis horas, coloca-se um animal numa gaiola de teste na qual se deixa beber livremente durante cinco minutos. Este período é usado para habituar o animal ao meio ambiente e ao bebedouro. Após este período de treino, os animais têm acesso a água e a comida na sua gaiola de alojamento durante 2 horas. A comida está sempre disponível. Vinte e quatro horas mais tarde, administra-se droga ao animal por via intracerebroventricular.

Após um atraso indicado, a começar a partir do tempo de injecção, colocou-se novamente o animal na gaiola de teste durante dez minutos.

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Um computador conta cada vez que o animal lambe, e após cada vinte e cinco lambidelas administra um estímulo eléctrico moderado através da língua e/ou dos pés. O estímulo eléctrico consiste numa corrente de 0,6 mA com uma duração de 100 ms. Este procedimento produz um estado de conflito no animal que se reduz pela administração de agentes ansiolíticos usados clinicamente (por exemplo, Valium). Para as curvas de resposta à dose, injectam-se grupos separados de animais com doses crescentes de droga de teste e testam-se num tempo predeterminado.

Os dados de alguns compostos representativos usando estas medições estão resumidos no Quadro 6. QUADRO 6: Actividade Ansiohtica no Teste de Vogel, em Ratos.

Composto Via Veículo Dose mg/kg Vogel (% de Controlo) 3a,20a-di-hidroxi-2p-isopropoxi-5a-pregnano i.c.v. g-CD 10 ug 169,0 3a,20-di-hidroxi-20-metil-5a-pregnano i.c.v. g-CD 20 ug 179,0 3a,20a-di-hidroxi-21-metil-5a-pregnano i.c.v. g-CD 10 ug 157,9 3a,20a(S)-di-hidroxi-5a-pregnano i.c.v. b-CD 10 ug 193,0 3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona i.c.v. b-CD 10 ug 431,1 3a,20a-di-hidroxi-5p-pregnano i.c.v. g-CD 10 ug 283,3 2p-fluoro-3a,20a-di-hidroxi-5a-pregnano i.c.v. g-CD 20 ug 264,9 3a,20a-di-hidroxi-21 -etil-5a-pregnano i.c.v. g-CD 20 ug 225,8 3a,203-di-hidroxi-5p-pregnano i.c.v. g-CD 20 ug 267,3

Prodrogas

Avaliaram-se as actividades anticonvulsiva e ansiolítica de prodrogas dos compostos básicos 3a-hidroxi-5-pregnan-20-ona e 3a,21-di-hidroxi-5a-pregnan-20-ona e os seus derivados usando os mesmos procedimentos descritos acima. Representou-se, em função do tempo, a percentagem de protecção por várias prodrogas de 3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona contra apoplexias induzidas por metazol, após a administração dos compostos (Quadro 7).

Testaram-se também várias prodrogas adicionais e apresentam-se os resultados MU Quadro 8. A modificação dos compostos básicos 3a hidroxi- 61 ΕΡ Ο 808 325/ΡΤ 5a-pregnan-20-ona e 3α,21-di-hidroxi-5a-pregnan-20-ona, nos grupos hidroxilo em 3a e 21, com vários ésteres, mantém a sua actividade biológica e em alguns casos essas modificações aumentaram o tempo de protecção proporcionado pelo composto. Deste modo, os compostos deste invento podem ser modificados para proporcionar as actividades anticonvulsiva e ansiolítica durante um período de tempo, com vários graus de protecção. QUADRO 7: Actividade Anti-Metrazo/ de Ésteres de Prodroga de 3cc-hidroxi-5a-pregnano-20-ona (3a-(RCOO)-5cc-pregnan-20-ona) R % de Protecção 60 mg/kg 1 hr, IP Metilo 25 Etilo 75 Propilo 75 Butilo 33 2-Propilo 75 4-Heptilo 16 (4 horas) Ciclobutilo 17 Fenilo 33 4-Clorofenilo 50 4-Metoxifenilo 17 3-Piridilo 50 (20 horas) 3-( 1 -Metil-1,4-di-hidropiridinilo) 63 (20 horas)

Ao contrário das benzodiazepinas, os esteróides neuroactivos podem também induzir anestesia. Pensa-se que a sua capacidade para induzir anestesia se deve à sua capacidade de abrir o canal de iões cloreto na ausência de GABA, que é uma propriedade que as benzodiazepinas não possuem. Deste modo, os neuroesteróides podem actuar directamente na ausência de GABA, no receptor, e também "indirectamente", na presença de GABA. Esta acção "indirecta" é denominada "modulação" do receptor. Lambert, et a/., Trends Pharmacology Science 8:224-227 (1987).

Os compostos do invento e os usados no invento podem também ser usados para indicações anestésicas em doses elevadas. No entanto, a via de administração preferida para induzir anestesia é a administração intravenosa (i.v.). Em animais, as propriedades anestésicas de uma droga medem-se pela 62 85 094 ΕΡ 0 808 325/ΡΤ capacidade da droga produzir um reflexo de perda de recuperação. Define-se o reflexo de perda de recuperação como a incapacidade de um animal se endireitar em 30 segundos quando colocado sobre as suas costas. Administrou-se, i.v., droga a ratinhos na veia lateral da cauda. A seguir à administração, colocaram-se os ratinhos sobre as suas costas e observou-se o reflexo de perda de recuperação. Apresentam-se no Quadro 8 resultados ilustrativos. QUADRO 8: Actividade Anestésica de Esteróides Neuroactivos, em Ratinhos.

Compostos Via Veículo Dose mg/kg Reflexo de perda de recuperação 3a,21-di-hidroxi-3p-etinil^-pregnan- 20-ona IV 20% cremóforo 10 100 38-(cloroetinil)-3a-hidroxi-5p-pregnan- 20-ona IV Solução de micronização 20 100 33-etinil-3oc-hidroxi-5p-pregnan-20-ona IV 10% hpbcd 30 100 3a-hidroxi-3p-metil-5a-pregn-16-en-20-ona IV Solução de micronização 50 100 3a-hidroxi-5a-pregn-9-en-20-ona IV Solução de micronização 10 100 3a-hidroxi-17(20)(Z)-metoximetileno-19-nor-5a-androstano IV Solução de micronização 5 75 3a-hidroxi-3p-metil^-pregnan'20-ona IV Solução de micronização 2,5 100 2p-etoxi-3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona IV 20% cremóforo 5 100 2p-fluoro-3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona IV Solução de micronização 5 100 3a-hidroxi-3|3-metil-21-metoximetil-5a- pregnan-20-ona IV Solução de micronização 20 100

Lisboa, 28. VjS

Por COCENSYS, INC.

Claims (13)

1. 8b 094 EP 0 808 325/PT 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Composto seleccionado do grupo que consiste em: 3a-hidroxi-3p-(3'-metilbut-3'-en-1 '-inil)-5p-pregnan-20-ona; 3a-hidroxi-3p-(3'-metilbut-3'-en-1 '-inil)-5a-pregnan-20-ona; 3p-(ciclopropil)etinil-3a-hidroxi-5p-pregnan-20-ona; e 3a,21 -di-hidroxi-3p-fluorometil-5a-20-ona; ou um seu 3-éster, 20-éster, 21-éster, 3,20-diéster, ou 3,21-diéster fisiologicamente aceitável.
2. 2. Composto seleccionado do grupo que consiste em: 21-humissuccinato de 3a,21 -di-hidroxi-3p-trifluorometil-19-nor-5p-pregnan-20-ona, sal de sódio; bis-hemissuccinato de 3a,20a-di-hidroxi-21-metil-5a~pregnano; 21 -hemissuccinato de 3a,21 -di-hidroxi-3p-etenil-5a-pregnan-20-ona; 21-hemifumarato de 3a,21-di-hidroxi-3p-trifluorometil-5p-pregnan-20-ona, sal de sódio; 3a,21-di-hidroxi-3p-trifluorometil-5p-pregnan-20-ona, 21-succinato de metilo; 3a,21 -di-hidroxi-3p-trifluorometil-5p-pregnan-20-ona, 21 -propionato; 21-hemissuccinato de bis(3a,21-di-hidroxi-3p-trifluorometil-5p-pregnan-20-ona); e 21 -hemissuccinato de bis(3a,21 -di-hidroxi-3p-etinil-5p-pregnan-20-ona).
3. 3. Composto de acordo com a reivindicação 1, que é 3a-hidroxi-3p-(3'-metilbut-3'-en-1'-inil)-5p-pregnan-20-ona.
4. 4. Composto de acordo com a reivindicação 2, que é 21-hemissuccinato de 3a,21-di-hidroxi-3p-trifluorometil-19-nor-5p-pregnan-20-ona, sal de sódio.
5. 5. Composto de acordo com a reivindicação 1, que é 3p-(ciclopropil)-etinil-3a-hidroxi-5p-pregnan-20-ona. 85 094 ΕΡ 0 808 325/ΡΤ 2/2
6. 6. Composição farmacêutica, compreendendo uma quantidade eficaz de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5; e um transportador ou diluente farmaceuticamcnte aceitável.
7. 7. Utilização de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5 no fabrico de um medicamento para o tratamento de tensão ou ansiedade num sujeito animal.
8. 8. Utilização de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5 no fabrico de um medicamento para aliviar a actividade de apoplexia num sujeito animal.
9. 9. Utilização de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5 no fabrico de um medicamento para reduzir ou aliviar a insónia num sujeito animal.
10. 10. Utilização de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5 no fabrico de um medicamento para o tratamento de perturbações de humor num sujeito animal.
11. 11. Utilização de acordo com a reivindicação 10, na qual a dita perturbação de humor é depressão.
12. 12. Utilização de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5 no fabrico de um medicamento para o tratamento de síndroma pré-menstrual ou de depressão pós-parto, num sujeito animal.
13. 13. Utilização de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5 no fabrico de um medicamento para induzir anestesia, um sujeito animal. Lisboa, , · . >- Por COCENSYS, INC. - O AGENTE OFICIAL -