CZ155397A3 - Androstanová a pregnanová řada pro allosterickou modulaci GABA receptoru - Google Patents

Description

Androstanová a pregnanová řada pro allosterickou modulaci⁰ OASBA ' receptoru

Oblast techniky

Vynález se týká způsobů, přípravků a sloučenin 'í'Rro 5 modulaci excitability mozku živočichů prostřednictvím komplexu receptor γ-aminomáselné kyseliny A (GABA_a) - chloridový ionofor (GRC). Konkrétně je vynález zaměřen na způsoby, přípravky a sloučeniny pro modulaci excitability mozku prostřednictvím vazby na receptorové místo neurosteroidů na GRC.

Dosavadní stav techniky

Excitabilita mozku je definována jako hladina aktivace živočicha, zahrnující nepřetržitě stavy od bezvědomí po křeče, a je regulována různými neurotransmitery. Neurotransmitery jsou obecně odpovědné za regulaci konduktance iontů neuronálními membránami. V klidu má neuronální membrána potenciál (neboli napětí membrány) přibližně -80 mV, přičemž vnitřní prostor buňky je vzhledem k vnějšímu prostoru negativní. Potenciál (napětí) je výsledkem iontové (K⁺, Na⁺, Cl, organické anionty) rovnováhy na neuronální semipermeabilní membráně.

i

Neurotransmitery jsou uchovávány v presynaptických váčcích a jsou uvolňovány pod vlivem neuronálních akčních potenciálů. Při uvolnění do synaptické štěrbiny vyvolá excitační chemický transmiter, jako je acetylcholin, depolarizaci membrány (změnu potenciálu z -80 mV na -50 mV). Tento efekt je zprostředkováván postsynaptickými nikotinovými receptory, které jsou stimulovány acetylcholinem ke zvýšení propustnosti membrány pro ionty Na⁺. Snížený potenciál membrány stimuluje neuronální excitabilitu ve formě postsynaptického akčního potenciálu.

V případě GRC je účinek na excitabilítu mozku zprostředkováván neurotransmiterem GABA. GABA má významný vliv na celkovou excitabilítu mozku, protože je jako neurotransmiter používán až 40 % neuronů v mozku. GABA reguluje excitabilítu jednotlivých neuronů tím, že reguluje konduktanci chloridových iontů neuronální membránou. GABA interaguje s příslušným rozpoznávacím místem na GRC, a tak usnadňuje tok chloridových gradientu GRC do buňky, tohoto aniontu způsobuje potenciálu, a tudíž menší iontů podél elektrochemického Intracelulární nárůst hladiny hyperpolarizaci transmebránového náchylnost neuronu vůči excitačním vstupům (tj . sníženou excitabilítu neuronu). Jinými slovy, čím vyšší je koncentrace chloridového iontu v neuronu, tím nižší je excitabilita mozku (hladina aktivace).

Je dobře dokumentováno, že GRC je odpovědný za zprostředkování úzkosti, záchvatové aktivity a uklidnění. GABA a léčiva, která působí jako GABA nebo usnadňují účinky GABA (například terapeuticky použitelné barbituráty a benzodiazepiny (BZ), jako je valium), tedy vykonávají své terapeutické účinky interakcí se specifickými regulačními místy na GRC.

Bylo rovněž pozorováno, že řada steroidních metabolitů interaguje s GRC a mění tak excitabilítu mozku (Majewska M.D. a d., Science 232:1004-1007 (1986); Harrison. N.L. a d., J. Pharmacol. Exp. Ther. 241:346-353 (1987)). Před tímto vynálezem nebyla terapeutická použitelnost těchto steroidních metabolitů pracovníky v oboru rozpoznána z důvodu nedostatečného pochopení síly a místa účinku. Přihlašovaný vynález se částečně týká farmaceut i-cké aplikace znalostí, získaných na základě rozvinutějšího poznání intenzity a místa působení určitých steroidních sloučenin.

Bylo demonstrováno, že ovariální hormon progesteron a jeho metabolity mají významný vliv na excitabilítu mozku (Backstrom, T. ad., Acta Obstet. Gynecol. Scand. Suppl. 130:19-24 (1985); Pfaff, D.W. a McEwen, B.S., Science 219:808-814 (1983); Gyermek a d., J. Med. Chem. 11:117 (1968); a Lambert, J. a d., Trends

Pharmacol. 8:224-227 (1987)). Hladina progesteronu a jeho metabolitů se mění s fázemi menstruačního cyklu. Je dobře dokumentováno, že množství progesteronu a jeho metabolitů před nástupem menses klesá. Rovněž bylo dobře dokumentováno měsíční opakování určitých fyzických příznaků před nástupem menses. Tyto příznaky, které souvisejí s premenstruálním syndromem (PMS), zahrnují stres, úzkost a migrénové bolesti hlavy (Dalton, K., Premenstrual Syndrome and Progesterone Therapy, 2. vyd., Chicago: Chicago yearbook, 1984). Pacientky s PMS mají měsíční opakování příznaků, které jsou přítomny v premenstruu a nepřítomny v postmenstruu.

Podobným způsobem bylo snížení hladiny progesteronu časově korelováno se zvýšením frekvence záchvatů u epileptických žen (tj. katameniální epilepsie; Laidlaw, J. „Catamenial epilepsy, Lancet, 1235-1237 (1956)). Přímější korelace byla pozorována s úbytkem metabolitů progesteronu (Rosciszewska ad., J. Neurol. Neurosurg. Psych. 49:47-51 (1986)). Kromě toho u pacientek s primárními generalizovanými malými záchvaty epilepsie byl časový výskyt záchvatů korelován s výskytem příznaků premenstruálního syndromu (Backstrom, T. a d., J. Psychosom. Obstet. Gynaecol. 2:8-20 (1983)). Jako účinný při léčbě pacientek s epileptickými záchvaty korelovanými s menstruačními cykly se ukázal steroid deoxykortikosteron (Aird, R.B. a Gordan, G., J. Amer. Med. Soc. 145:715-719 (1951)) .

Dalším syndromem, souvisejícím s nízkou hladinou progesteronu, je postnatální deprese (PND). Bezprostředně po porodu dramaticky poklesne hladina progesteronu, což vede k nástupu PND. Příznaky PND se pohybují od mírné deprese k psychóze vyžadující hospitalizaci; PND je spojena se silnou úzkostí a iritabilitou. Deprese spojené s PND nejsou přístupné léčbě klasickými antidepresivy a ženy trpící PND vykazují zvýšený výskyt PMS (Dalton, K., 1984).

Souhrnně z těchto pozorování vyplývá zásadní role progesteronu a deoxykortikosteronu a konkrétně jejich metabolitů při homeostatické regulaci excitability mozku, která se projevuje jako zvýšení aktivity záchvatů nebo příznaky spojené s katameniální epilepsií, PMS a PND. Korelace mezi sníženou hladinou progesteronu a příznaky spojenými s PMS, PND a katameniální epilepsií (Backstrom a d., 1983; Dalton, K.,

1984) inspirovala použití progesteronu při jejich léčbě (Mattson a d., in: Advances in epileptology: XVth Epilepsy International Symposium, Raven Press, New York, 279-282, 1984, a Dalton, K., 1984). , Progesteron však není při léčbě výše uvedených syndromů konzistentně účinný. Například neexistuje vztah dávka-odpověď pro progesteron při léčbě PMS (Maddocks a d., Obstet. Gynecol. 154:573-581 (1986); Dennerstein. a d.,

British Medical Journal, 290:16-17 (1986)).

Podstata vynálezu

Vynález se týká způsobů, přípravků a sloučenin pro modulaci excitability mozku. Konkrétně se vynález týká použití 3a-hydroxylovaných derivátů steroidů, působících na nově identifikovaném místě na komplexu GR, k modulaci excitability mozku způsobem, který zmírňuje stres, úzkost, nespavost, poruchy nálady (jako je deprese), které jsou přístupné GRaktivním prostředkům, a záchvatovou aktivitu. Přípravky a sloučeniny účinné při takovéto léčbě spadají do rozsahu vynálezu.

Sloučeniny používané podle vynálezu a tvořící jeho součást jsou modulátory excitability centrálního nervového systému, zprostředkované jejich schopností regulovat chloridové kanálky související s komplexem receptorů GABA. Původci vynálezu experimentálně zjistili, že sloučeniny podle vynálezu mají antikonvulsivní a anxiolytickou účinnost podobnou jako známá anxiolytika, například BZ, ale působí na konkrétním místě komplexu GR.

Vztah endogenních metabolitů progesteronu k procesům souvisejícím s reprodukcí (menstruační cyklus a těhotenství) je znám (Markér, R.E., Kamm, 0. a McGrew, R.V., „Isolation of epipreganol-3-one-20 from human pregnancy urine, J. Am. Chem. Soc. 59:616-618 (1937)). Před tímto vynálezem však nebylo známo, jak tyto poruchy léčit modulací mozkové excitability použitím metabolitů progesteronu. Vynález je proto zaměřen na způsoby, přípravky a sloučeniny pro léčbu poruch modulací mozkové excitability pomocí sloučenin podle vynálezu. Příklady poruch léčitelných podle vynálezu jsou epilepsie, úzkost, premenstruální syndrom (PMS), postnatální deprese (PND), poruchy nálady (jako je deprese), které jsou přístupné GRaktivním prostředkům, a nespavost. Sloučeniny podle vynálezu mohou být používány rovněž k vyvolání anestesie.

Sloučeniny podle vynálezu jsou deriváty různých 3ahydroxylovaných pregnan-20-onů, 3a-21-pregnandiol-20-onů, 3a20-pregnandiolů a 3a-hydroxylovaných androstanů a jejich esterových, etherových, sulfonátových, sulfátových, fosfonátových, fosfátových, oximových (imino) a thiazolidinových derivátů, kteréžto deriváty se označují jako prekursory („prodrugs). Výraz „prekursor („prodrug) označuje derivát známého přímo působícího léčiva, který ve srovnání s léčivem má lepší uvolňovací charakteristiky a terapeutickou hodnotu a transformuje se na aktivní léčivo enzymatickým nebo chemickým procesem, viz Notáři, R.E., „Theory and Practice of Prodrug Kinetics, Methods in Enzymology, 112:309-323 (1985)/ Bodor, N., „Novel Approaches in Prodrug Design, Drugs of the Future, 6(3):165-182 (1981), a Bundgaard, H., „Design of Prodrugs: Bioreversible Derivatives for Various Functional Groups and Chemical Entities, in: Design of Prodrugs (H. Bundgaard, ed.), Elsevier, New York (1985). Je nutno poznamenat, že některé syntetické deriváty, tvořící součást vynálezu, nemusejí být pravé prekursory, protože mají kromě výše uvedených charakteristik také vlastní aktivitu. Pro účely tohoto vynálezu se však označují jako prekursory.

Naše studie (Gee, K.W. a d., European Journal of Pharmacology, 136:419-423 (1987)) ukázaly, že 3a-hydroxylované steroidy, používané podle vynálezu, jsou jako modulátory komplexu GR řádově účinnější než bylo dosud uváděno (Majewska, M.D. a d. (1986) a Harrison, N.L.. a d. (1987)). Majewska a Harrison uvádějí, že 3a-hydroxylované 5-redukované steroidy mají schopnost dosahovat pouze mnohem nižší účinnosti. Naše experimentální data in vitro a in vivo ukazují, že vysoká účinnost těchto steroidů umožňuje jejich terapeutické použití při modulaci mozkové excitability přes komplex GR. Mezi nejúčinnější steroidy, použitelné podle vynálezu, patří deriváty hlavních metabolitů progesteronu a deoxykortikosteronu. Tyto steroidy mohou být terapeuticky příznivým způsobem používány konkrétně k modulaci mozkové excitability při stresu, úzkosti, nespavosti, poruchách nálady (jako je deprese), které jsou přístupné GR-aktivním prostředkům, a záchvatových poruchách. Navíc jsme prokázali, že tyto steroidy interagují se specifickým místem na komplexu GR, které je odlišné od jiných známých míst interakce (tj. barbituráty, BZ a GABA), kde již byly popsány terapeuticky příznivé účinky na stres, úzkost, spánek, poruchy nálady a záchvatové poruchy (Gee, K.W. a Yamamura, H.I., in: Central Nervous System Disorders, str. 123-147, D.C. Horvell, ed., 1985; Lloyd, K.G. a Morselli, P.L., in: Psychopharmacology: The Third Generation of Progress, str. 183-195. H.Y. Meltzer, ed., Raven Press, N.Y., 1987). Tyto sloučeniny jsou žádoucí pro svou trvanlivost, účinnost a orální účinnost (spolu s jinými formami aplikace).

Steroidní deriváty podle vynálezu jsou sloučeniny jednoho z těchto strukturních vzorců:

Η

Vynález zahrnuje rovněž farmaceuticky přijatelné estery a soli sloučenin vzorce 1 až 6 včetně adičních solí s kyselinami. Má se za to, že 3a-hydroxyl může být maskován jako farmaceuticky přijatelný ester proto, že ester se odštěpuje při přeměně prekursoru na léčivo. V tomto případě se zde označují jako odštěpitelné estery.

V popisu vynálezu se používají dále uvedené výrazy v následujícím významu, není-li uvedeno jinak:

Výraz „alkyl se vztahuje na nasycené alifatické skupiny zahrnující skupiny s přímým řetězem, rozvětveným řetězem a cyklické skupiny, které mohou být všechny popřípadě substituovány. Vhodné alkylové skupiny zahrnují methyl, ethyl apod. a mohou být popřípadě substituovány.

Výraz „alkenyl se vztahuje na nenasycené skupiny, které obsahují alespoň jednu dvojnou vazbu uhlík-uhlík, a zahrnuje skupiny s přímým řetězem, rozvětveným řetězcem a cyklické skupiny, které mohou být všechny popřípadě substituovány.

Výraz „alkinyl se vztahuje na nenasycené uhlovodíkové skupiny, které obsahují alespoň jednu trojnou vazbu uhlíkuhlík, a zahrnuje skupiny s přímým řetězcem, rozvětveným řetězcem a cyklické skupiny, které mohou všechny popřípadě obsahovat další nenasycení. Je-li alkinylová skupina přítomna v poloze 3β, může být substituována halogenovaným nebo nehalogenovaným Ci radikálem, 0₂-0₆ nasyceným nebo nenasyceným halogenovaným nebo nehalogenovaným radikálem s přímým řetězcem, C₃-C_s cyklickým (cykloalkylovým) radikálem nebo C₅-C_s aromatickým radikálem nebo 4, 5 nebo 6členným C- nebo N-vázaným heterocyklickým radikálem obsahujícím 1, 2 nebo 3 heteroatomy vybrané ze skupiny zahrnující kyslík, dusík a síru s vyloučením heterocyklických radikálů se dvěma nebo více sousedícími atomy 0 nebo S. Výhodné alkinylové skupiny mají dva až čtyři uhlíkové atomy.

Výraz „alkoxy označuje ether -OR, kde R je alkyl.

Výraz „aryloxy označuje ether -OR, kde R je aryl.

Výraz „aryl se vztahuje na aromatické skupiny, které mají alespoň jeden kruh s konjugovaným systémem n elektronů, a zahrnuje karbocyklický aryl a biaryl, které mohou být popřípadě substituovány.

Výraz „karbocyklický aryl se vztahuje na skupiny, kde kruhové atomy na aromatickém kruhu jsou uhlíkové. Karbocyklické arylové skupiny zahrnují fenyl a naftyl, popřípadě substituované. Substituovaný fenyl má přednostně jeden až tři substituenty, kterými jsou výhodně nižší alkyl, amino, hydroxy, nižší alkoxy, halogen, nižší acyl a nitro.

Výraz „aralkyl se vztahuje na alkylovou skupinu substituovanou arylovou skupinou. Vhodné aralkylové skupiny zahrnují benzyl apod. a mohou být popřípadě substituovány.

Výraz „dialkylamino se vztahuje na skupinu -NRR, kde R a R nezávisle představují nižší alkylové skupiny nebo společně tvoří zbytek morfolinoskupiny. Vhodné dialkylaminoskupiny zahrnují dimethylamino, diethylamino a morfolino.

Výraz „acyl se vztahuje na alkanoylovou skupinu -C(O)R, kde R je alkyl, alkenyl, alkinyl, aryl nebo aralkyl.

Výraz „popřípadě substituovaný nebo „substituovaný se vztahuje na skupiny substituované jedním až třemi substituenty, nezávisle vybranými ze skupiny zahrnující nižší alkyl, aryl, alkenyl, alkinyl, alkoxy, amino, thio, halo, haloalkyl, trihaloalkyl, acyl, nitro, hydroxy a keto.

Výraz „nižší se zde uvádí v souvislosti s organickými radikály s jedním až čtyřmi uhlíkovými atomy. Může se jednat o skupiny s přímým řetězcem, rozvětveným řetězcem nebo cyklické.

Výraz „farmaceuticky přijatelné estery nebo soli se vztahuje na estery nebo soli vzorců 1 až 6, odvozené z kombinace sloučeniny podle vynálezu a organické nebo anorganické kyseliny.

Jako příklady substituentů, které mohou být použity ve sloučeninách vzorce 1, je možno uvést:

R je vodík, nižší alkyl, nižší alkenyl nebo nižší alkinyl,

Ri je methylen, β-hydroxymethyl nebo β-kyan, a jejich fyziologicky přijatelné 3-estery, 20-estery a 3,20diestery, s podmínkou, že je-li R_x β-kyan, pak R není vodík.

Ve způsobových nárocích však může být R_x kyan, je-li R vodík.

Výhodnou skupinou sloučenin vzorce 1 jsou sloučeniny, kde R je vodík.

Jinou výhodnou skupinou jsou sloučeniny vzorce 1, kde R_x je kyan.

Příklady výhodných sloučenin vzorce 1 zahrnují, aniž by se na ně omezovaly: 3a-hydroxy-17-methylen-5a-androstan, 3ahydroxy-17β-hydroxymethyl-5a-androstan nebo 3a-hydroxy17(20) (Z)-methoxymethylen-5a-androstan.

Příklady substituentů, které mohou být použity ve sloučeninách vzorce 2, jsou:

R je vodík, halo nebo nižší alkoxy,

Ri je alkenyl, alkinyl, alkoxyalkyl, haloalkoxyalkyl, trifluormethyl, azidoalkyl, kyanalkyl nebo monohalomethyl

R₂ je vodík, ketoskupina nebo lla-dialkylaminoskupina,

R₃ je β-acetylová skupina, ketal β-hydroxyacetylové skupiny, β-trifluoracetylová skupina, β-(hydroxyacetyl)skupina, β-hydroxyacetyl-17β-hydroxyskupina, β-methoxymethylacetylová skupina, β-(ethoxy)-methyl-2'-methylenacetylová skupina, β—{1'— hydroxyethyl)skupina, β-(1'-hydroxypropyl)skupina, β-(2' hydroxyisopropyl)skupina, β-sukcinyloxyacetylová skupina, βhydroxyacetylnatriumsukcinátová skupina, β-acetoxyacetylová skupina, β-sulfoxyacetylová skupina, β-methylacetylová skupina, β-haloacetylová skupina, například β-chloracetylová skupina, βethinylová skupina nebo β-ethylová skupina, která spolu se 17uhlíkovým atomem, na nějž je vázána, a atomem kyslíku tvoří skupinu 17(20)epoxy, a jejich fyziologicky přijatelné 3-estery, 20-estery, 21estery, 3,20-diestery a 3,21-diestery, s podmínkou, že je-li R₂ lla-N,N-dialkylamino, R není vodík.

Výhodnou skupinu tvoří sloučeniny vzorce 2, kde R je vodík nebo nižší alkoxy. Ještě výhodnější jsou sloučeniny, kde R je vodík.

Jinou výhodnou skupinou jsou sloučeniny vzorce 2, kde Rj. je nižší alkenyl, nižší alkinyl, trifluormethyl, alkoxymethyl a monohalomethyl. Ještě výhodnější jsou sloučeniny, kde Ri je C₂C₄ alkenyl, C₂-C₄ alkinyl nebo trifluormethyl. Zvlášť výhodné jsou sloučeniny, kde R_x je ethinyl nebo trifluormethyl.

Další výhodnou skupinou jsou sloučeniny vzorce 2, kde R₃ je acetyl, hydroxyalkyl, hydroxyacetyl, nebo jejich estery s fyziologicky přijatelnými kyselinami. Ještě výhodnější jsou sloučeniny, kde R₃ je acetyl nebo β-sukcinyloxyacetyl. Zvlášť výhodné jsou sloučeniny, kde R₃ je acetyl.

Příklady výhodných sloučenin zahrnují, aniž by se na ně omezovaly: 3α-1ιγά^χγ-17β-βί1ιίηγ1-5α-3ηά^3ί3η, 3β-θί1ιβηγ1-3αhydroxy-5β-pregnan-20-on, 3α-1ιγάΓθχγ-3β- (2' -propenyl) -5βpregnan-20-on, 3β-ethenyl-3α-hydroxy-5α-pregnan-20-on, 3β(chlorethinyl) -3α-1ιγάηοχγ-5β-ρηθςη3η-20-οη, 3β-θί1ιίηγ1-3αhydroxy-5β-pregnan-20-on, 3α-1ιγά^χγ-3β-θ^ίηγ1-5β-ρ^ςη3η-20οη, 3α, 20α-dihydroxy-3β-ethinyl-5β-pregnan, 3α,21-dihydroxy-3βethinyl-5β-pregnan-20-on, 3β-(3'-brom-l-propinyl)-3a-hydroxy5β-pregnan-20-on, 3α,21-dihydroxy-3β-ethinyl-5β-pregnan-20-on21-acetát, 3β-ethinyl-3α-hydroxy-5β-pregnan-ll,20-dion, 3α,2113 dihydroxy-3p-ethinyl-5p-pregnan-20-on-21-hemisukcinát, 3α,20αdihydroxy-3p-ethinyl-5p-pregnan, 3α,20p-dihydroxy-3p~ethinyl5p~pregnan, 3α,20p-dihydroxy-3p-ethinyl-5a-pregnan, 3a-hydroxy3β-(2' -propinyl)-5a-pregnan-20-on, 3p-ethinyl-3a-hydroxy-21methoxy-5p-pregnan-20-on, 3a-hydroxy-3p-chlormethyl-5a-pregnan20-on, 3a-hydroxy-3P-fluormethyl-5a-pregnan-20-on, 3βbrommethyl-3a-hydroxy-5a-pregnan-20-on, 3a-hydroxy-3pjodmethyl-5a-pregnan-2Ó-on, 3a-hydroxy-3p-trifluormethyl-5apregnan-20-on, 3a-hydroxy-3p-trifluormethyl-5p-pregnan-20-on, 3a, 21-dihydroxy-3p-trifluorraethyl-5p-pregnan-20-on-21-acetát,

3a,2l-dihydroxy-3p-trifluormethyl-5P~pregnan-20-on, 3a-hydroxy3p-trifluormethyl-5p-pregnan-ll,20-dion, sodná sůl 3a,21dihydroxy-3p-trifluormethyl-5p-pregnan-20-on-21-heinisukcinátu, 3a-hydroxy-3p-trifluormethyl-5p-pregnan-17(20)-en, 3a,20adihydroxy-21-ethyl-5a-pregnan, 3a,20a-dihydroxy-21-methyl-5apregnan, 3a,20a-dihydroxy-2P~isopropoxy-5a-pregnan, 3a,20adihydroxy-2p-ethoxy-5a-pregnan, 3a,20a-dihydroxy-2p-n-propoxy5a-pregnan, 3a,20a-dihydroxy-3p-methyl-5a-pregnan, 3a,20adihydroxy-3P~ethinyl-5a-pregnan, 3a,20p-dihydroxy-3p-methyl5p-pregnan, 3a,20-dihydroxy-3p,20-dimethyl-5p-pregnan, 3a,20adihydroxy-3P,21-dimethyl-5a-pregnan, 3a,20a-dihydroxy-3P~ ethinyl-5p-pregnan, 3a,20p-dihydroxy-3P~ethinyl-5p-pregnan,

3a,20p-dihydroxy-3p-methyl-5a-pregnan, 3a,20p-dihydroxy-3P~ ethinyl-5a-pregnan, 3a-hydroxy-3p-methoxymethyl-5a-pregnan-20on, 3β-(ethoxymethyl)-3a-hydroxy-5a-pregnan-20-on, 3β-(1'hexinyl)-3a-hydroxy-5P~pregnan-20-on, 3p-azidomethyl-3ahydroxy-5a-pregnan-20-on, 3a-hydroxy-3p-(2' ,2' , 2' trifluorethoxymethyl)-5a-pregnan-20-on, 3a-hydroxy-3ppropoxymethyl-5a-pregnan-20-on, 3p-kyanmethyl-3a-hydroxy-5apregnan-2-on, 3β-(3-methylbut-2-en-l-inyl)-3a-hydroxy-5P~ pregnan-20-on, 3β-(1'-heptinyl)-3a-hydroxy-5p-pregnan-20-on, 3P-cyklopropylethinyl-3a-hydroxy-53-pregnan-20-on, 3β-(1'oktinyl) -3a-hydroxy-^-pregnan-20-on, 3β-σγ^ορΓοργ1θίΗίηγ1-3αhydroxy-^-pregnan-20-on a 3β-σγ^ορΓοργ1β^ίηγ1-3α--1^Γθχν-5αpregnan-20-on.

Příklady substituentů, které je možno použít ve sloučeninách vzorce 3, jsou:

R je vodík nebo' nižší alkyl, nižší alkenyl nebo nižší alkinyl,

Ri je β-acetylová skupina, ketal β-hydroxyacetylové skupiny, β-trifluoracetylová skupina, β-(hydroxyacetyl)skupina, β-1τ^κ1τοχγ3θβ1γ1-17α-1ιγάηοχγ3]<χιρίη3, β-methoxyethylacetylová skupina, β-(ethoxy)-methyl-2'-methylenacetylová skupina, β-(1'hydroxyethyl)skupina, β-(1'-hydroxypropyl)skupina, β-(2'hydroxyisopropyl)skupina, β-sukcinyloxyacetylová skupina, βhydroxyacetylnatriumsukcinátová skupina, β-acetoxyacetylová skupina, β-sulfoxyacetylová skupina, β-methylacetylová skupina, β-chloracetylová skupina, β-ethinylová skupina nebo β-ethylová skupina, která spolu se 17-uhlíkovým atomem, ne nějž je vázána, a s atomem kyslíku tvoří 17(20)epoxyskupinu a jejich fyziologicky přijatelné 3-estery, 20-estery, 21estery, 3,20-diestery a 3,21-diestery, s podmínkou, že uvedenou sloučeninou není 3a-hydroxy-5a-preg9 (11)-en-20-on, 3a, 21-dihydroxy-5a-preg-9 (11) -en-20-on nebo 21acetoxy-3a-hydroxy-5a-preg-9(11)-en-20-on nebo jejich esterové deriváty.

Výhodnou skupinou jsou sloučeniny vzorce 3, kde R je vodík nebo alkinyl. Ještě výhodnější jsou sloučeniny, kde R je vodík.

Další výhodnou skupinou jsou sloučeniny vzorce 3, kde R_x je acetyl, hydroxyalkyl, hydroxyacetyl, nebo jejich estery s fyziologicky přijatelnými kyselinami. Ještě výhodnější jsou sloučeniny, kde R_x je acetyl nebo β-sukcinyloxyacetyl. Zvlášť výhodné jsou sloučeniny, kde Ri je acetyl.

Příklady výhodných sloučenin zahrnují, aniž by se na ně omezovaly: 3a-hydroxy-3p-trifluormethyl-53-pregn-9 (11) -en-20-on a 3a-hydroxy-3p-methyl-5a-pregn-9-en-20-on.

Příklady substituentů, které mohou být použity ve sloučeninách vzorce 4, jsou:

R je vodík, nižší alkyl, nižší alkenyl nebo nižší alkinyl,

Ri má stejný význam jako ve vzorci 3 a jejich fyziologicky přijatelné 3-estery, 20-estery, 21estery, 3,20-diestery a 3,21-diestery, s podmínkou, že uvedenou sloučeninou není 3a-hydroxy-53-pregnll-en-20-on nebo jeho 3-esterové deriváty.

Výhodnou skupinou jsou sloučeniny vzorce 4, kde R je vodík, trifluormethyl nebo nižší alkinyl. Ještě výhodnější jsou sloučeniny, kde R je vodík.

Další výhodnou skupinou jsou sloučeniny vzorce 4, kde R_x je acetyl, hydroxyalkyl, hydroxyacetyl, nebo jejich estery s fyziologicky přijatelnými kyselinami. Ještě výhodnější jsou sloučeniny, kde Ri je acetyl nebo β-sukcinyloxyacetyl. Zvlášť výhodné jsou sloučeniny, kde Ri je acetyl.

Příklady výhodných sloučenin zahrnují, aniž by se na ně omezovaly: 3a-hydroxy-3p-trifluormethyl-5p-pregn-ll-en-20-on,

3α,20p-dihydroxy-53-pregn-ll-en, 3α-hydroxy-3β-methyl-5α-pregnll-en-20-on, 3a,20β-dihydroxy-5β-pregn-ll-en a 3β-ethinyl-3ahydroxy-5p-pregn-ll-en-20-on.

Příklady substituentů, které mohou být použity ve sloučeninách vzorce 5, jsou:

R je vodík nebo nižší alkyl, nižší alkenyl nebo nižší alkinyl,

Ri je β-formyl, methylen, β-hydroxymethyl, methoxymethylen nebo β-kyan a jejich fyziologicky přijatelné 3-estery, 20-estery a 3,20diestery.

Příklady výhodných sloučenin zahrnují, aniž by se na ně omezovaly: 3α-]Ίγάηοχγ-17β-ίοΏηγ1-5α-19-ηοΓ3ηάΓθ3ί&η a 3ahydroxy-17(20)(Z)-methoxymethylen-5a-19-norandrostan.

9	Příklady substituentů, sloučeninách vzorce 6, jsou:	které	mohou být použity ve
	R je vodík nebo nižší alkinyl,	alkyl,	nižší alkenyl nebo nižší
	Ri má význam uvedený pro	vzorec	3
	a jejich fyziologicky přijatelné	3-estery, 20-estery, 21-

estery, 3, 20-diestery a 3,21-diestery.

Výhodnou skupinou jsou sloučeniny vzorce 6, kde R je nižší alkenyl, nižší alkinyl nebo trifluormethyl. Ještě výhodnější jsou sloučeniny, kde R je nižší alkinyl a trifluormethyl.

Jinou výhodnou skupinou jsou sloučeniny vzorce 6, kde Ri je acetyl, hydroxyalkyl, hydroxyacetyl, nebo jejich estery s fyziologicky přijatelnými kyselinami. Ještě výhodnější jsou sloučeniny, kde Ri je acetyl nebo β-sukcinyloxyacetyl. Zvlášť výhodné jsou sloučeniny, kde Ri je acetyl.

Další výhodné sloučeniny jsou sloučeniny vzorců 1 až 6, které jsou estery hydroxylových skupin v polohách 3 a/nebo 20. Výhodné estery jsou estery vytvořené z odpovídajících kyselin: kyseliny octové, propionové, maleinové, fumarové, askorbové, pimelové, jantarové, glutarové, bismethylensalicylové, methansulfonové, ethandisulfonové, šťavelové, vinné, salicylové, citrónové, glukonové, itakonové, glykolové, paminobenzoové, asparagové, glutamové, γ-aminomáselné, a-(2hydroxyethylamino)-propionové, glycinu a dalších a17 aminokyselin, kyseliny fosforečné, sírové, glukuronové a 1methyl-1,4-dihydronikotinové.

Další ještě výhodnější skupina sloučenin zahrnuje sloučeniny vzorců 1 až 6, kde 3β substituentem je ethinyl nebo trifluormethyl a v poloze 17 steroidů je navázána jedna ze skupin β-acetyl, β-(1'-hydroxyethyl) nebo 17(20)(Z)-en.

Příklady výhodných sloučenin zahrnují, aniž by se na ně omezovaly: 3α-hydroxy-3β-methyl-5β-19-norpregn-17(20)(Z)-en, 3a-hydroxy-19-nor-5a-pregnan-cis-17(20)(Z)-en, 3α-hydroxy-5β19-norpregn-17(20)(Z)en, 3a-hydroxy-3β-methyl-5a-19-norpregn17(20)(Z)-en, 3β-ethinyl-3a-hydroxy-5β-19-norpregn-17(20)(Z)-en a 3a-hydroxy-3β-trifluormethyl“5β-19-norpregn-17(20)(Z)-en.

3a-hydroxy-3β3α-ίιγάηοχγ-3β3α-1ιγάηοχγ-3βVýhodné jsou dále tyto sloučeniny: ίηίί1ηοππθί1ίγ1-19-ηοη-5β-ρηοςηηη-20-οη, trifluormethyl-19-nor-5a-pregnan-20-on, trifluormethyl-5β-19-norpregn-17 (20) (Z)-en, 3a, 21-άί1ογάηοχγ-3βtrifluormethyl-19-nor-5β-pregnan-20-on a 3α,21-dihydroxy-3βtrifluormethyl-19-nor-5β-pregnan-20-on-21-hemisukcinát a sodná sůl.

j eho

Výhodné jsou také tyto sloučeniny: 3a,20a-dihydroxy-19nor-5a-pregnan, 3a-hydroxy-3β-trifluormethyl-19-nor-5β-pregnan20-on, 3a-hydroxy-3β-methyl-5a-19-norpregnan-20-on, 3β-βί1ιίηγ13a-hydroxy-19-nor-5β-pregnan-20-on, 3β-βί1ιίηγ1-3α-1ιγάΓοχγ-5β19-norpregn-17(20)(Z)-en, 3a-hydroxy-3β-methyl·-5β-19-norpregn17(20)(Z)-en, 3a-hydroxy-3β-methyl-5β-19-norpregn-17(20)(z)-en, 3a,21-dihydroxy-3β-trifluormethyl-19-nor-5β-pregnan-20-on-21hemisukcinát a jeho sodná sůl.

Nejvýhodnější sloučeniny podle vynálezu jsou:

3α-1ιγάΓοχγ-3β- (3' -methylbut-3' -en-1' -inyl) -5β-ρηβρηηη-20-οη,

3α-1ιγάΓοχγ-3β- (3' -methylbut-3' -en-1' inyl) -5a-pregnan-20-on,

3α-ήγ<ΐΓοχγ-3β-ίΓί£1υοηηθίΗγ1-5α-ρΓ6ςη&η-20-οη,

3a-hydroxy-33-trifluormethyl-^-pregn-ll-en-20-on,

3α,21-dihydroxy-3p-trifluormethyl-19-nor-53-pregnan-20-on,

3β-(cyklopropyl)θίΗίηγ1-3α-ΗγάΓοχγ-5β-ρΓθρηβη-20-οη,

3α, 20a-dihydroxy-33-ethinyl-5a-pregnan,

3α, 21-dihydroxy-3p-ethenyl-5a-pregnan-20-on a

3α, 21-dihydroxy-3β-fluorItιethyl-5α-pregnan-20-on nebo jejich fyziologicky přijatelné 3-estery, 20-estery, 21estery, 3,20-diestery nebo 3,21-diestery.

Zvlášť výhodné jsou také tyto estery spadající do rozsahu vynálezu:

sodná sůl 3a, 21-dihydroxy-3β-trifluorIαethyl-19-nor-5β-pregnan20- on-21-hemisukcinátu,

3a,20a-dihydroxy-21-methyl-5a-pregnanbishemisukcinát,

3a,21-dihydroxy-3p-ethenyl-5a-pregnan-20-on-21-hemisukcinát,

3a,21-dihydroxy-3p-methyl-5a-pregnan-20-on-21-acetát, sodná sůl 3a,21-dihydroxy-3β-trifluormethyl-5β-pregnan-20-on21- herní fumarátu,

3a, 21-dihydroxy-3β-trifluormethyl-5β-pregnan-20-on-methyl-21sukcinát,

3a, 21-dihydroxy-3β-trifluormethyl-5β-pregnan-20-on-21propionát, bis(3a,21-dihydroxy-3β-trifluormethyl-5β-pregnan-20-on)-21hemisukcinát, bis(3a, 21-dihydroxy-3β-ethinyl-5β-pregnan-20-on)-21hemisukcinát a

N- (3α-hydroxy-3β-methyl·-5α-pregnan-20-yl·idin) ethanolamin.

Příklady provedeni vynálezu

Následující syntetické metody a příklady jsou zaměřeny na přípravu sloučenin, tvořících součást vynálezu.

Syntetické metody

Sloučeniny podle vynálezu je možno připravovat jakoukoli vhodnou metodou, například pomocí běžných metod, jaké jsou popsány v „Steroid Reactions, Djerassi, publikováno 1963 Holden-Day, lne., San Francisco, nebo „Organic Reactions in Steroid Chemistry, Fried and Edwards, publikováno 1972 Van Nostrand-Reinhold Co., New York.

Sloučeniny podle vynálezu mohou být připravovány jakoukoli vhodnou známou nebo v budoucnu vyvinutou metodou.

Obecné metody

20- Hydroxypregnany byly připravovány redukcí 20ketopregnanů běžnými redukčními činidly.

21- Hemisukcináty byly připravovány z pregnan-20-onových derivátů, které byly nejprve brómovány molekulárním bromem na odpovídající 21-brompregnany. Brómované sloučeniny pak byly podrobovány reakci s různými diovými kyselinami, jako je kyselina jantarová, v přítomnosti aminu za vzniku 21hydroxyesterů. Vzniklé estery diových kyselin pak byly převáděny na sodné soli běžnými metodami.

Estery je možno vytvářet reakcemi, v oborou známými, mezi hydroxylovou skupinou na výše pospaných sloučeninách a organickou kyselinou, halogenidem kyseliny, anhydridem nebo esterem, kde organickou kyselinou je například kyselina octová, propionová, maleinová, fumarová, askorbová, pimelová, jantarová, glutarová, bismethylensalicylová, methansulfonová, ethandisulfonová, šťavelová, vinná, salicylová, citrónová, glukonová, itakonová, glykolová, p-aminobenzoová, asparagová, glutamová, γ-aminomáselná, α-(2-hydroxyethylamino)-propionová, glycin a další α-aminokyseliny, kyselina fosforečná, sírová, glukuronová a 1-methyl-l, 4-dih.ydronikotinová.

3P~Substituenty

Halomethyl

3p-Monohalomethylsloučeniny podle vynálezu je možno připravovat reakcí 3-spiro-2'-oxiranového steroidu se zdrojem halogenidových iontů v inertním rozpouštědle, například s tetramethylamoniumhalogenidem v toluenu, a přednostně v přítomnosti zdroje protonů, jako je kyselina octová.

Nasycený nebo nenasycený alkyl

Další 3-substituované steroidy je možno připravovat přídavkem organokovového činidla k 3-ketosteroidu, v němž mohou být ostatní reaktivní funkční skupiny podle potřeby chráněny. 3-alkinylsloučeniny je tedy možno připravovat s použitím acetylidu lithného v inertních rozpouštědlech nebo s přípravou tohoto činidla in šitu z 1,2-dibromethylenu a butyllithia jako organokovové sloučeniny. Podobně sloučeniny vzorce 1, kde R je alkenylová skupina, je možno připravovat reakcí 3-ketosteroidu s vinylorganokovovou sloučeninou, jako je vinylmagnesiumbromid. Pro přípravu sloučenin obsahujících 3-alkenylovou skupinu je možno rovněž používat sloučeniny, v nichž je z místa reakce odstraněno nenasycení, jako je allylmagnesiumbromid. Podobně použití alkylovaného Grignardova činidla, jako je methylmagnesiumjodid, vede k 3-alkylsloučeninám.

Trifluormethyl

Trifluormethylová skupina může být připravena reakcí 3ketosteroidu s trimethyltrifluormethylsilanem, katalyzovanou fluoridovými ionty.

21-Oxidované sloučeniny

Oxidace 21-methylu tetraacetátem olova

Různé sloučeniny tohoto typu je možno připravovat sledem reakcí, při nichž se pregnan-20-on oxiduje tetraacetátem olova na 21-acetoxyderivát, acetát se hydrolyzuje na 21-alkohol a ten se acyluje vhodným derivátem karboxylové kyseliny, jako je anhydrid nebo chlorid, nebo jiným činidlem schopným nahradit vodík v hydroxylové skupině, jako je methansulfonylchlorid.

Pregnan-17-eny

Mohou být vytvořeny reakcí 17-ketosteroidu s Wittigovým činidlem, jako je ylid vzniklý reakcí npropyltrifenylfosfoniumbromidu se silnou bází, jako je terc.butoxid draselný.

3,20-Dioly

Pregnan-3,20-diol může být vytvořen adicí hydridu boru, jako je diboran, na dvojnou vazbu pregnan-17-enu s následnou oxidací takto vzniklého organoboranu například alkalickým peroxidem vodíku na 20-ol. Alternativně je možno pregnan-3,20dioly vytvářet redukcí 20-onové skupiny na 20-olovou skupinu. Vhodnými činidly jsou hydridové sloučeniny, jako je borohydrid sodný, nebo rozpouštění kovů, jako je sodík, v n-propanolu apod.

Příklad 1

a) 20-Ketal 3a-hydroxy-5p-pregnan-20-onu

Směs 3a-hydroxy-5p-pregnan-20-onu (10,8 g, 34 mmol), ethylenglykolu (45 ml) a triethylorthoformiátu (30 ml) byla míchána 5 min při teplotě místnosti. Pak byla přidána kyselina p-toluensulfonová (200 mg) a v míchání při teplotě místnosti se pokračovalo 1,5 h. Vzniklá hustá pasta byla vlita do nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného (250 ml). Vysrážená pevná látka byla oddělena filtrací, důkladně promyta studenou vodou a vysušena. Polovysušený produkt byl rozpuštěn v dichlormethanu (350 ml) a sušen nad bezvodým uhličitanem draselným. Roztok ketalu pak byl přefiltrován a použit jako takový v příštím stupni.

b) 20-Ketal 53~pregnan-3,20-dionu

Výše uvedený roztok 20-ketalu 3a-hydroxy-5P~pregnan-20-onu v dichlormethanu byl po dobu 15 min míchán pod dusíkem s Nmethylmorfolin-N-oxidem (8,8 g, 75 mmol) a práškovými molekulárními síty 4A (58 g) . Pak byl přidán tetrapropylamoniumperruthenát (400 mg) a v míchání při teplotě místnosti se pokračovalo 2 h. Vzniklá tmavě zelená směs byla podrobena průchodu krátkým sloupcem Florisilu a eluována dichlormethanem. Frakce obsahující produkt (TLC) byly spojeny a odpařeny. Surový produkt pak byl překrystalován ze směsi EtOAc:Hex (1:1) na titulní sloučeninu (10,3 g) ve formě dlouhých tyčinek.

c) Příprava lithného činidla z 1,2-dibromethylenu

Do lOOml tříhrdlé baňky, opatřené probubláváním plynného dusíku, teploměrem a kapací nálevkou, byl předložen 1,2dibromethylen (směs cis/trans, 98 %, Aldrich, 0,164 ml, 2 mmol, mw = 186, d = 2,246). Byl přidán suchý tetrahydrofuran (15 ml) a roztok byl na lázni suchý led-aceton vychlazen na -78 °C. V průběhu 10 min bylo po kapkách přidáváno n-butyllithium (2,5 M v THF, 1,6 ml, 4 mmol). Směs byla míchána při stejné teplotě lha vzniklé činidlo bylo bezprostředně použito pro další stupeň.

d) 33~Ethinyl-3a-hydroxy-5p-pregnan-20-on

K výše uvedenému roztoku činidla v tetrahydrofuranu, který byl udržován na -78 °C, byl po kapkách přidáván roztok 20ketalu 5p-pregnan-3,20-dionu (180 mg, 0,5 mmol) v tetrahydrofuranu (15 ml) . Během přídavku byla teplota udržována pod 70 °C. V míchání při této teplotě se pokračovalo 15 min (100% konverze, detekováno TLC). Chladicí lázeň byla odstraněna a ke vzniklému roztoku byla přidána 2N kyselina chlorovodíková (pH 6). Bylo odstraněno rozpouštědlo a zbytek byl rozpuštěn v acetonu (10 ml). Po přídavku 2N kyseliny chlorovodíkové (4 ml) byl roztok míchán 0,5 h při teplotě místnosti. Směs byla neutralizována zředěným roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Vysrážená pevná látka (158 mg, 93 %) byla získána filtrací, promyta vodou a vysušena. Surový produkt byl pak čištěn krystalizací z ethylacetátu nebo ze směsi aceton-hexan a byla získána titulní sloučenina, t.t. 196197 °C, TLC-Rf 0,45 (hexan:aceton 7:3).

Příklad 2

Dinatriumbis(hemisukcinát) 3a,20p-dihydroxy-5p-pregnanu

K suspenzi 3a, 20p-dihydroxy-53-pregnanu (Steraloids; 250 mg, 0,78 mmol) v 5 mi suchého pyridinu byl přidán sukcinanhydrid (200 mg, 2,0 mmol). Směs byla zahřívána celkem 10 h na 100 °C. Během zahřívání směsi bylo ve třech částech přidáno dalších 6 mmol sukcinanhydridu. Tmavá směs byla zkoncentrována (0,05 mm Hg, 30 °C) k odstranění rozpouštědla a pak zahřívána na 90 °C (0,05 mm Hg) k odstranění přebytku sukcinanhydridu. Zbytek byl překrystalován ze směsi ether/hexan a získaná pevná látka byla tvořena hlavně kyselinou jantarovou. Matečný louh byl zkoncentrován a podroben sloupcové chromatografií (rychlý silikagel, eluce 95/5/0,1

CH₂Cl₂/MeOH/HOAc); získaná bílá pevná látka byla překrystalována ze směsi ether/hexan. Bis(hemisukcinát), t.t. 81-90 °C, byl dále převeden na disodnou sůl.

Bis(hemisukcinát) (100 mg, 0,192 mmol) byl rozpuštěn v minimálním objemu methanolu. Po - kapkách byl přidán roztok hydrogenuhličitanu sodného (2 ekv., 33 mg, 0,393 mmol) v 6 ml vody. Po 3 h byl roztok vakuově zahuštěn a poskytl bílou pevnou látku.

Příklad 3

3a-Hydroxy-3p-trifluormethyl-5a-pregnan-20-on a 33-hydroxy-3atrifluormethyl-5a-pregnan-20-on

K roztoku 5a-pregnan-3,20-dion-20-ethylenketalu (356 mg, 0, 987 mmol) v suchém tetrahydrofuranu (5 ml) byl přidán 0,5M F₃CSi(CH₃)3 (v THF; 2,5 ml, 1,25 mmol). Vzniklý bezbarvý roztok byl ochlazen na 0 °C a byl přidán n-Bu₄NF.xH₂O (několik krystalů). Chladicí lázeň byla odstraněna. Byl pozorován vývin plynu (Me₃SiF) a reakční roztok zežloutl. Směs byla míchána 30 min při teplotě místnosti. TLC (3:1 hexan/aceton) ukázala úplné spotřebování výchozí látky; nové skvrna se pohybovala téměř s čelem rozpouštědla. Pak byla přidána IN kyselina chlorovodíková (cca 3 ml) a vzniklá dvoufázová směs byla míchána přes noc při teplotě místnosti. Nyní TLC (3:1 hexan/aceton) ukázala jedinou skvrnu s R_f cca 0,5. Naproti tomu při použití dičhlormethanu se objevily dvě blízké skvrny, z nichž horní patřila vedlejšímu produktu. Byl přidán ether a voda. Vodná vrstva byla extrahována zpět etherem. Spojený organický podíl byl promyt nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a solankou, vysušen (síran hořečnatý), přefiltrován a odpařením za sníženého tlaku byla získána bílá krystalická (pěnivá) pevná látka, která byla podrobena rychlé chromatografii s elucí dichlormethanem.

Odpařením dřívějších frakcí byl získán 3a-hydroxy-3ptrifluormethyl-5a-pregnan-20-on (10 mg).

Další elucí kolony byl získán 3p-hydroxy-3atrifluormethyl-5a-pregnan-20-on (200 mg), který na základě ^1SF NMR a GC-MS také obsahoval 1,5 % vedlejšího produktu (tj. 3ahydroxy-33-trifluormethyl-5a-pregnan-20-onu). Za účelem odstranění této nečistoty byl učiněn pokus o překrystalování z horké směsi hexan/ethylacetát 60:40; krystaly se nevytvořily. Nakonec bylo možno získat vysoce čistý 3p-hydroxy-3atrifluormethyl-5a-pregnan-20-on (145 mg) opětným podrobením výše uvedené směsi 97,5:1,5 rychlé chromatografií s dichlormethanem, t.t. 181-183 °C.

Příklad 4

3p-Hydroxy-3a-ethenyl-5p~pregnan-20-on a 3a-hydroxy-3p-ethenyl5p-pregnan-20-on

K roztoku 20-ketalu 5p-pregnan-3,20-dionu (1,18 kg, 3,3 mmol) v suchém tetrahydrofuranu (20 ml) byl při -70 °C přidán vinylmagnesiumbromid (IM v THF, 3,7 mmol, 3,7 ml). Po 5 min míchání směsi při této teplotě a 2,5 h při teplotě místnosti byl přidán nasycený roztok chloridu amonného (10 ml). Po odpaření rozpouštědla byl zbytek extrahován ethylacetátem. Organická vrstva byla promyta vodou, zředěným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vodou a solankou. Po vysušení nad bezvodým síranem hořečnatým byl roztok přefiltrován a odpařením byl získán surový produkt (1,2 g). Tento surový produkt pak byl rozpuštěn v acetonu (20 ml). Po přídavku IN kyseliny chlorovodíkové (10 ml) byl roztok míchán 15 h při teplotě místnosti. Po odstranění rozpouštědel byl zbytek extrahován dichlormethanem. Organická vrstva byla promyta vodou, zředěným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vodou a solankou. Po vysušení nad přefiltrován a Tento surový dichlormethanu toluen:aceton pregnan-20-on bezvodým síranem hořečnatým byl roztok odpařením se získal surový produkt (890 mg). produkt byl pak rozpuštěn v malém množství a nalit na sloupec silikagelu. Elucí směsí (94:6) byl získán 3α-βί1ΐθηγ1-3β-1ιγάΓθχγ-5β;i26 mg) jako první frakce. Další elucí stejnou směsí rozpouštědel byl získán 3β-ethenyl-3α-hydroxy-5β-pregnan20-on (189 mg), t.t. 113-116 °C.

Příklad 5

a) 3a-hydroxy-5a-androstan-17-on

K roztoku 3β-hydroxy-5α-androstan-17-onu (6 g) a diethylazodikarboxylátu (5,04 g) v tetrahydrofuranu (50 ml) byla přidána kyselina trifluoroctové (3,3 g) a směs zežloutla. Pak byl přidán trifenylfosfin (7,6 g). Reakčni směs se odbarvila za vývinu tepla. Po 5 min byl přidán benzoát sodný a pak voda (100 ml). Směs byla extrahována methylenchloridem (3 x 80 ml) a organický podíl byl vysušen nad síranem hořečnatým. Po odstranění rozpouštědla ve vakuu byl surový produkt po dobu 1 h hydrolyzován hydroxidem draselným (10%, 10 ml) v methanolu (150 ml). Pak byla většina methanolu odstraněna ve vakuu a zbytek byl rozdělen mezi methylenchlorid a chlorid amonný. Produkt (4,7 g, 78 %) byl přečištěn chromatografií (methylenchlorid:aceton 9:1).

b) 3a-Hydroxy-21-methyl-5a-pregn-17(20)(Z)-en

3a-Hydroxy-5a-androstan-17-on (2 g, 6,9 mmol) byl přidán k Wittigovu činidlu, získanému z propyltrifenylfosfiumbromidu (13,3 g) a terč.butoxidu draselného (3,9 g) v tetrahydrofuranu (20 ml) . Reakčni směs byla 12 h ref luxována a ochlazena na 25 °C. Pak byl přidán roztok chloridu amonného (60 ml) a organická vrstva byla oddělena dělicí nálevkou. Vodná vrstva byla extrahována methylenchloridem (2 x 50 ml). Organický roztok byl sušen nad uhličitanem draselným a rozpouštědlo bylo odpařeno ve vakuu. Surový produkt byl přečištěn chromatografií (aceton:methylenchlorid:hexan 1:2:7) a bylo získáno 0,84 g produktu (39 %). Jednalo se o směs isomerů Z a E (Z:E = 13:1).

c) 3a-Terc.butyldimethylsiloxy-21-methyl-5a-pregn17(20)(Z)-en

Směs 5a-3a-hydroxy-21-methylpregn-17(20)(Z)-enu (0,84 g, 2,66 mmol), TBDMSC1 (1,2 g, 8,0 mmol) a imidazolu (0,91 g, 13,3 mmol) v methylenchloridu (10 ml) a dimethylformamidu (30 ml) byla míchána 12 h a pak byl přidán chlorid amonný. Byla provedena extrakce methylenchloridem (3 x 40 ml) a promytí solankou (50 ml) . Organický roztok byl vysušen nad uhličitanem draselným a po odstranění rozpouštědla bylo zjištěno, že je přítomno ještě určité množství dimethylformamidu. Zbytek byl proto rozpuštěn v etheru a promyt solankou (2 x 50 ml) a sušen nad uhličitanem draselným. Chromatografií s hexanem bylo získáno 1,14 g čistého produktu (100 %) .

d) 3a-Terc.butyldimethylsiloxy-20a-hydroxy-21-methyl-5apregnan

K roztoku 3a-terc.butyldimethylsiloxy-21-methyl-5a-pregn17(20)(Z)-enu (1,14 g, 2,66 mmol) v tetrahydrofuranu (30 ml) byl po kapkách při 0 °C přidán tetrahydrofuranový komplex diboranu (1M roztok v THF, 5,3 ml). Reakční směs byla ponechána ohřát se během 1 h na 25 °C. Pak byl velmi pomalu při 0 °C přidáván roztok hydroxidu sodného (20%, 10 ml) a pak peroxid vodíku (30%, 10 ml). Poté byl přidán vodný chlorid amonný a dělicí nálevkou byla oddělena tetrahydrofuranová vrstva. Vodná vrstva byla extrahována etherem (2 x 40 ml) . Organický roztok byl sušen nad uhličitanem draselným a rozpouštědlo odstraněno ve vakuu. Čistý produkt byl získán sloupcovou chromatografií (0,52 g, 44 %).

e) 3a,20a-Dihydroxy-21-methyl-5a-pregnan

Roztok připravený smísením kyseliny fluorovodíkové (48%, 5 ml) a CH₃CN (30 ml) byl přidán do baňky obsahující 3aterc.butyldimethylsiloxy-20a-hydroxy-21-methyl-5a-pregnan (0,51

g) a vznikla bílá sraženina. Reakční směs byla míchána lha pak zfiltrována. Bílá pevná látka byla promyta třikrát etherem a poskytla uspokojivé analytické výsledky (0,3 g, 79 %), t.t. 227-231 °C.

Příklad 6

3α, 21-Ώί?ιγάι:οχγ-3β-^ίί1ηοΏηθ1Ηγ1-5β-19-ηοΓρΓβςηΒη-20-οη

K roztoku 3a-hydroxy-3β-trifluormethyl-5β-19-norpregnan20-onu (300 mg, 0,87 mmol) v toluenu (15 ml) byl přidán methanol (1 ml) a BF₃'OEt₂ (1,4 ml, 11,3 mmol). Vzniklá směs byla ochlazena na 0 °C a byl přidán Pb(OAc)₄ (0,54 g, 1,21 mmol). Reakční směs byla za míchání po dobu 45 min ohřátá na 25 °C, pak byl přidán roztok hydrogenuhličitanu sodného (nas., 30 ml) a směs byla míchána 1 h. Byla nalita do dělicí nálevky obsahující vodu (50 ml) a extrahována etherem (3 x 4 0 ml) . Etherový roztok byl promyt solankou (50 ml) a pak vysušen nad uhličitanem draselným. Surový produkt, získaný odstraněním rozpouštědla, byl rozpuštěn v methanolu (25 ml) a byl přidán roztok uhličitanu draselného (nas., 8 ml). Reakční směs byla míchána 5 h a pak nalita do dělicí nálevky obsahující 50 ml vody. Pak byla extrahována methylenchloridem (3 x 30 ml) . Spojený extrakt byl vysušen nad uhličitanem draselným a získaná surová látka poskytla po přečištění chromatografií produkt (160 mg) spolu s 21-methoxy vedlejším produktem (40 mg). Produkt byl dále přečištěn překrystalováním z 10% acetonu v hexanu na 88 mg čistého produktu (28 %) jako bílé pevné látky, t.t. 140-142 °C.

Příklad 7

3β-Ε^ΐηγ1-3α,20a-dihydroxy-53-pregnan a 3p-ethinyl-3a,20βdihydroxy-5p-pregnan

K roztoku 3β-ethinyl-3α-hydroxy-5β-pregnan-20-onu (0,31 g, 0,91 mmol) v methanolu (20 ml) byl přidán borohydrid sodný (200 mg, 5,3 mmol) a směs byla míchána 1 h při 25 °C. Pak byl přidán roztok chloridu amonného (50 ml) a směs byla extrahována methylenchloridem (3 x 30 ml) . Chromatografií (EtOAc :Hex 3:7) byl získán 3β-ethinyl-3α,20β-dihydroxy-5β-pregnan (200 mg, 65 %) jako hlavní produkt; t.t. 221-223 °C. Vedlejší produkt 3βethinyl-3a, 20α-άί1ιγά^χγ-5β-ρΓβςη3η byl dále přečištěn další chromatografií (25 až 30% ethylacetát v hexanu, 16 mg, 5 %); t.t. 187-188 °C.

Příklad 8

3α, 21-ϋί1ιγά^χγ-3β-θ11ι1ηγ1-5β-ρχβρηηη-20-οη a 3α-ϊιγε^οχγ-3βethinyl-21-methoxy-5β-pregnan-20-on

K roztoku 3α, 21-άί1ιγά^χγ-3β-β11ι1ηγ1-5β-ρΓβρη3η-20-οη-21acetátu (725 mg, 1,81 mmol) ve 45 ml methanolu o teplotě 0 °C byl přidán 10% vodný roztok uhličitanu draselného (3,75 ml). Po 30 min míchání při teplotě místnosti byla směs ochlazena na 0 °C a byl přidán 2N vodný roztok kyseliny octové (1,8 ml). Reakční směs byla přidána do směsi ethylacetát/voda. Vodná vrstva byla extrahována dvakrát ethylacetátem a spojené organické vrstvy byly extrahovány roztokem solanky, vysušeny (síran sodný) a zkoncentrovány. Přečištěním rychlou chromatografii (20 cm silikagelu v koloně o průměru 4 cm, eluce 2 1 směsi 20% acetonu a hexanu) bylo získáno 582 mg (90 %) diolu jako bílé pevné látky, t.t. 155,5-157 °C.

Při přípravě ve větším měřítku byl izolován 3a,21-diol jako méně polární nečistota, t.t. 176-178,5 °C, a bylo zjištěno, že se jedná o 3a-hydroxy-3p-ethinyl-21-methoxy-5ppregnan-20-on, vzniklý pravděpodobně jako vedlejší produkt při přípravě 21-acetátu.

Příklad 9

3p-Ethenyl-3a-hydroxy-5a-pregnan-20-on a 3a-ethenyl-3P~hydroxy5a-pregnan-2 0-on

K roztoku 5oc-pregnan-3,20-dion-20-ketalu (720 mg, 2 mmol) v suchém tetrahydrofuranu (20 ml) byl při -78 °C přidán vinylmagnesiumbromid (IM v THF, 4 mmol, 4 ml) . Po 5 h míchání směsi při této teplotě byl přidán 2N roztok kyseliny chlorovodíkové (2 ml). Po odstranění rozpouštědla byl zbytek rozpuštěn v acetonu (25 ml). Po přídavku 2N kyseliny chlorovodíkové (10 ml) byl roztok míchán 15 h při teplotě místnosti. Po odstranění rozpouštědel byl zbytek extrahován methylenchloridem. Organická vrstva byla promyta vodou, zředěným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vodou a solankou. Po vysušení nad bezvodým síranem hořečnatým byl roztok zfiltrován a odpařením byl získán surový produkt (1 g) . Tento surový produkt pak byl rozpuštěn v malém množství methylenchloridu a nalit na sloupec silikagelu. Elucí směsí toluen:aceton (95:5) byl jako první frakce získán 33~ethenyl3a-hydroxy-5a-pregnan-20-on (250 mg), t.t. 163-165 °C. Další elucí stejnou směsí rozpouštědel byl získán 3a-ethenyl-3phydroxy-5a-pregnan-20-on (150 mg).

Příklad 10

3a-Hydroxy-33-trifluormethyl-53-19-norpregnan-20-on

K roztoku 3cc-hydroxy-3p-trifluormethyl-5a-19-norpregn17 (20) (Z)-enu (2,6 g, 7,3 mmol) v tetrahydrofuranu (80 ml) byl po kapkách při 25 °C přidán tetrahydrofuranový komplex diboranu (IM roztok v THF, 22 ml). Reakce byla dokončena za 1 h, načež byl velmi pomalu přidáván při 0 °C roztok hydroxidu sodného (20%, 50 ml) a pak peroxid vodíku (30%, 30 ml) . Pak byla přidána voda a tetrahydrofuranová vrstva byla oddělena v dělicí nálevce. Vodná vrstva byla extrahována methylenchloridem (2 x 40 ml). Organický roztok byl sušen nad uhličitanem draselným a rozpouštědlo odstraněno ve vakuu. Použitím rychlé kolony (hex./aceton 1:1) bylo získáno 1,8 g produktu, který byl podroben oxidaci PCC (PCC, 2,1 g, 9,6 mmol; acetát sodný, 0,8 g, 9,6 mmol). Čistý produkt (700 mg, 26 %) byl přečištěn sloupcovou chromatografií s použitím ethylacetátu a hexanu (15:85) jako eluentu; t.t. 151,5-153,0 °C.

Příklad 11

a) 3(R)-Spiro-2'-oxiran-5a-17p-hydroxyandrostan

Směs trimethylsulfoxoniumjodidu (6,82 g, 31 mmol) a terc.butoxidu draselného (3,5 g, 31 mmol) v tetrahydrofuranu (30 ml) byla 1,5 h zahřívána k refluxu a pak ochlazena na 25 °C. Pak byl přidán 17p-hydroxy-5a-androstan-3-on (3 g, 10,3 mmol) a reakční směs byla míchána 2 h při 25 °C. Pak byla přidána voda a směs byla extrahována etherem (3 x 80 ml) . Extrakt byl sušen nad uhličitanem draselným a odstraněním rozpouštědla byly získány 3 g dosti čistého produktu (surový výtěžek 96 %), který byl použit pro další stupeň.

b) 3p-methyl-3a-hydroxy-5a-androstan-17-on

K roztoku 3(R)-spiro-2'-oxiran-5a-17p-hydroxyandrostanu (3 g, 9,9 mmol) v tetrahydrofuranu (50 ml) pod argonem byl přidán lithiumaluminiumhydrid (LAH, IM roztok v THF, 10 ml) a směs byla zahřívána 5 min k refluxu a pak ochlazena na 25 °C. Byl přidán roztok chloridu amonného (vod., nas., 70 ml) a směs pak byla extrahována methylenchloridem (3 x 70 ml). Organický roztok byl vysušen nad uhličitanem draselným a pak byl přidán 4-methylmorfolin-N-oxid (2,9 g, 25 mmol) a mletá molekulární síta (4A, 10 g). Směs pak byla míchána 20 min, načež byl přidán tetrapropylamoniumperruthenát (200 mg) . Reakce byla dokončena za 1,5 h a reakční směs byla přefiltrována přes Florisil, který byl promyt směsí methylenchloridu a etheru (1:2). Vzniklá látka byla přečištěna chromatografií (30% EtOAc v hexanu) a poskytla produkt (2,5 g, 83 %).

c) 3β,21-Dimethyl-3a-hydroxy-5a-pregn-17(20)(Z)-en

K Wittigovu činidlu, připravenému mícháním směsi npropyltrifenylfosfoniumbromidu (2,55 g, 6,6 mmol) a terč.butoxidu draselného (0,75 g, 6,6 mmol) v tetrahydrofuranu (20 ml) po dobu 30 min, byl přidán 3p-methyl-3a-hydroxy-5aandrostan-17-on (0,5 g, 1,65 mmol) a směs byla zahřívána 18 h k refluxu. K reakční směsi pak byl přidán roztok chloridu amonného a byla provedena extrakce methylenchloridem. Čistý produkt (420 mg, 77 %) byl získán chromatografií (20% EtOAc v hexanu).

d) 3α,20α-ϋί1ιγόΓοχγ-3β,21-dimethyl-5a-pregnan

K roztoku 3β, 21-dimethyl-3a-hydroxy-5a-pregn-17(20) (Z)-enu (0,42 g, 1,27 mmol) v tetrahydrofuranu (30 ml) byl po kapkách při 0 °C přidán tetrahydrofuranový komplex diboranu (IM roztok v THF, 2,6 ml). Reakční směs byla ponechána 2 h ohřát se na 25 °C. Pak byl velmi pomalu při 0 °C přidán roztok hydroxidu sodného (2N, 10 ml) a pak peroxid vodíku (30%, 10 ml). Reakční směs byla míchána 1 h při 25 °C. Pak byl přidán vodný chlorid amonný a tetrahydrofuranová vrstva byla oddělena v dělicí nálevce. Vodná vrstva byla extrahována methylenchloridem (2 x 4 0 ml) . Organický roztok byl sušen nad uhličitanem draselným a rozpouštědlo odstraněno ve vakuu. Produkt byl získán sloupcovou chromatografií (0,17 g, 38 %). Dále byl přečištěn rekrystalizací a bylo získáno 110 mg produktu; t.t. 200-203 °C.

Příklad 12

3a, 21-Dihydroxy-3P~trifluormethyl-5p-pregnan-20-on

Roztok 3a,21-dihydroxy-3p-trifluormethyl-5p~pregnan-20-on21-acetátu (1,36 g, 3,06 mmol) v methanolu (75 ml) byl ochlazen na 0 °C. Pak byl po kapkách přidán roztok uhličitanu draselného (10% vodný, 6,45 ml, 4,67 mmol). Po 1,5 h míchání při 0 °C byl po kapkách přidán roztok kyseliny octové (2N vodný, 2,5 ml, 5,0 mmol) a směs byla ponechána ohřát se na teplotu místnosti. Byl přidán ethylacetát, methylenchlorid a voda (vždy 100 ml) a směs byla důkladně promísena. Byla izolována organická fáze, promyta vodnými roztoky hydrogenuhličitanu sodného a chloridu sodného, vysušena nad síranem hořečnatým a odpařena ve vakuu. Zbytek byl přečištěn rychlou sloupcovou chromatografií (hexan/EtOAc 3:1) a poskytl bílou pevnou látku (973 mg, 79 %, t.t. 148-150 °C.

Příklad 13

3a, 2l-Dihydroxy-3p-ethinyl-5p-pregnan-20-on-21-hemisukcinát sodný

K roztoku 3a, 21-dihydroxy-3p-ethinyl-5P~pregnan-20-onu (535 mg, 1,49 mmol) ve 2 ml suchého pyridinu byl při 0 °C přidán pevný sukcinanhydrid (1,2 ekv., 180 mg, 1,80 mmol). Po ohřátí na teplotu místnosti byla reakční směs 48 h míchána. Po odstranění rozpouštědla ve vakuu a triturací zbytku s hexanem (2 x 10 ml) byla získána gumovitá pevná látka, která byla co nejvíce rozpuštěna v methylenchloridu a vnesena na 13 cm rychlého silikagelu v koloně o průměru 2 cm. Eluci gradientem od 5 % acetonu v methylenchloridu do 100 % acetonu bylo získáno 667 mg požadované kyseliny.

Za účelem odstranění pyridiniových solí byla kyselina rozpuštěna v ethylacetátu a extrahována ledem chlazeným Ο,ΟΙΝ vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové (30 ml). Organická vrstva byla vysušena síranem sodným a zkoňcentrována. Zbytek, tj. 633 mg, t.t. 62-68 °C, byl rozpuštěn v methanolu a byl přidán vodný roztok 116 mg (0,253 mmol) hydrogenuhličitanu sodného. Po 3,5 h míchání bylo rozpouštědlo odstraněno za sníženého tlaku a zbytek byl triturován se směsí ether/hexan. Získaná světle žlutá pevná látka, hmotnost 616 mg, byla rozpustná ve vodě v množství > 20 mg/ml.

Příklad 14

3p-Fluormethyl-3a-hydroxy-5a-pregnan-20-on

Směs n-Bu₄NF‘xH₂O (7,873 g) a benzenu (50 ml) byla přes noc refluxována s Dean-Starkovým nástavcem. Směs, která nepředstavovala čirý roztok, pak byla zkoňcentrována (normální tlak) na přibližně 10 ml a ponechána vychladnout na teplotu místnosti. Pomocí jehly se dvěma konci byl k tomuto zkoncentrovanému roztoku přidán roztok ethylenketalu 3(R)-5apregnan-3-spiro-2'-oxiran-20-onu (2,55 g, 6,81 mmol) v suchém benzenu (15 ml + 5 ml pro promytí) . Vzniklý roztok byl pomocí krátkocestného destilačního přístroje zkoncentrován na přibližně 10 ml a po dobu 15 min refluxován. Protože bylo velmi obtížné zachytit koncentrovaný reakční roztok na TLC desce, byl přidán suchý benzen (5 ml). TLC (100:1 methylenchloíid/aceton nebo 3:1 hexan/aceton) ukázala kromě dvou nových méně polárních skvrn určité množství nezreagované výchozí látky. Reakčni směs byla opět zkoncentrována a pak 30 min refluxována; TLC (po zředění směsi benzenem) nyní ukázala téměř úplné spotřebování výchozího epoxidu. Směs byla stejně jako předtím zkoncentrována a krátkou dobu refluxována. Zde je nutno upozornit, že tato reakce probíhá pouze, je-li směs vysoce koncentrovaná. Poté, co směs zaujala teplotu místnosti (za vzniku světle žluté pevné látky), byl přidán ether a voda. Protože se nerozpustil veškerý pevný podíl, byl přidán methylenchlorid. Vodná vrstva byla extrahována methylenchloridem. Spojené organické extrakty byly promyty vodou (x 2), vysušeny (síran sodný), přefiltrovány a odpařeny za sníženého tlaku, čímž byla získána bílá pevná látka (3,33 g) , jejíž NMR ukázala, že se jedná o směs 4:1 ethylenketalu 3p-fluormethyl-3a-hydroxy-5a-pregnan-20-onu a ethylenketalu 3a-fluor-33-hydroxymethyl-5a-pregnan-20-onu.

Za účelem analýzy ketalu byl k výše uvedené pevné látce přidán aceton (100 ml), voda (5 ml) a p-Ts0H‘H₂0 (143 mg, 0,752 mmol). Přídavkem kyseliny chlorovodíkové bylo pH upraveno na mírně kyselou hodnotu. Směs byla po krátkou dobu zahřívána teplometem do vyčeření roztoku, který pak byl zahříván 2 h při teplotě místnosti. Roztok se zakalil, a proto byl pro vyčeření přidán methylenchlorid. TLC ukázala dokončení reakce. Odpařením rozpouštědla za sníženého tlaku byla získána bílá pevná látka, ke které byl přidán methylenchlorid a voda. Vodná vrstva byla extrahována methylenchloridem. Spojený organický podíl byl promyt nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vysušen (síran hořečnatý), zfiltrován a odpařen za sníženého tlaku na bílou krystalickou látku (2,5 g) , jejíž ¹H NMR ukázalo, že se jedná o směs 4:1 3a-fluormethyl-3a-hydroxy-5a-pregnan-20-onu a 3a-fluor-3p-hydroxymethyl-5a-pregnan-20-onu. Rychlou sloupcovou chromatografií této směsi s methylenchloridem jako eluentem byl získán požadovaný 3P-fluormethyl-3a-hydroxy-5a-pregnan-20-on (1,41 g, 59 %), t.t. 201-203 °C.

Příklad 15

3β-ΕίΗίηγ1-3α,20a-dihydroxy-5a-pregnan a 3p-ethinyl-3-,20βdihydroxy-5a-pregnan

K roztoku 3β-ethinyl-3α-hydroxy-5α-pregnan-20-onu (0,32 g, 0,94 mmol) v methanolu (20 ml) byl přidán borohydrid sodný (200 mg, 5,3 mmol) a směs byla 1 h míchána při 25 °C. Poté byl přidán roztok chloridu amonného (50 ml) a směs byla extrahována methylenchloridem (3 x 30 ml). Chromatografií (EtOAc:Hex 3:7) byl získán 3β-ethiΓlyl·-3α, 20β-dihydroxy-5α-pregnan (192 mg, 60 %) jako hlavní produkt, t.t. 195,5-197,5 °C, a 3β-θί1ιίηγ13α,20a-dihydroxy-5a-pregnan jako vedlejší produkt (19 mg, 6 %), t.t. 210-215 °C (rozkl.).

Příklad 16

Bis-hemisukcinát 3a,20a-dihydroxy-21-methyl-5a-pregnanu

Do suché baňky obsahující 3a,20a-dihydroxy-21-methyl-5apregnan (350 mg, 1,05 mmol) byl přidán pyridin (bezvodý, 5 ml) a pak sukcinanhydrid (1 g, 10 mmol) . Směs byla zahřívána 20 h na olejové lázni o teplotě 100 °C a pak ochlazena na 25 °C. Byla smísena s roztokem kyseliny chlorovodíkové (IN, 70 ml) a extrahována ethylacetátem (3 x 40 ml) a extrakty byly sušeny nad síranem sodným. Produkt (0,54 g) byl získán chromatografií (7 % MeOH a 0,3 % HOAc v CH₂C1₂) a dále čištěn překrystalováním z EtOAc na 334 mg produktu (60 %), t.t. 159-162,5 °C.

Příklad 17

a) 3,3-Ethylendioxy-5P~pregn-17(20)(Z)-en

5p-Ethylendioxyandrostan-17-on - (6 g) byl přidán k Wittigovu činidlu, připravenému z ethyltrifenylfosfoniumbromidu (15 g) a terč.butoxidu draselného (4,5 g) v tetrahydrofuranu (15 ml). Reakční směs byla 2 h refluxována a pak ochlazena na 25 °C'. Poté byl přidán methylenchlorid (80 ml) a roztok chloridu amonného (60 ml) a v dělicí nálevce byla oddělena organická vrstva. Vodná vrstva byla extrahována methylenchloridem (2 x 50 ml). Organický roztok byl sušen nad uhličitanem draselným a rozpouštědlo odstraněno ve vakuu. Většina fosforoxychloridu byla odstraněna promytím hexanem. Získaný produkt (6 g) byl rozpuštěn v acetonu (100 ml) a byla přidána kyselina chlorovodíková (2N, 10 ml) . Surový produkt (5,5 g) , získaný alkalickým zpracováním a extrakcí methylenchloridem, byl přečištěn chromatografií na 4,5 g produktu (83 %). Čistý stereoisomer byl získán opakovanou krystalizaci z hexanu.

b) 3a-Hydroxy-3p-trifluormethyl-5p-pregn-17(20)(Z)-en

K roztoku 5p-pregn-17(20)(Z)-en-3-onu (950 mg, 3,17 mmol) v tetrahydrofuranu (15 ml) byl při 0 °C přidán trifluormethyltrimethylsilan (0,5M roztok v THF, 9,5 ml). Roztok postupně hnědl a reakce byla dokončena za 30 min. Poté byla přidána voda (30 ml) a odebrána organická vrstva. Vodná vrstva byla extrahována etherem (3 x 50 ml) a organický roztok byl sušen nad uhličitanem draselným. Čistý produkt (680 mg, 58 %) byl izolován sloupcovou chromatografií s použitím ethylacetátu a hexanu (1:9) jako eluentu.

Příklad 18

a) 3a-Hydroxy-5p-pregn-ll-en-20-on

K roztoku 5p-pregn-ll-en-3,20-dionu (Sigma, 1,5 g, 4,77 mmol) v tetrahydrofuranu (40 ml) byl při -78 °C během 15 mi η pomalu přidán lithiumtriterc.butoxyaluminiumhydrid (IM v THF, 5,7 mmol). Reakční směs byla ponechána ohřát se během 12 h na 25 °C. Směs byla rozdělena mezi chlorid amonný a ether a takto získaná surová látka byla přečištěna sloupcovou chromatografií (10 až 20% aceton v hexanu, 1,3 g produktu, 86 %).

b) 3a-Hydroxy-5p-20,20-ethylendioxypregn-ll-en

Ke směsi 3a-hydroxy-5p-pregn-ll-en-20-onu (1,3 g), ethylenglykolu (8 ml) a trimethylorthoformiátu (20 ml) byla přidána kyselina p-toluensulfonová (0,1 g) a reakční směs byla míchána 1 h. Obvyklým zpracováním (hydrogenuhličitan sodný a ether) s následným odstraněním rozpouštědla byl získán produkt, který byl přečištěn chromatografií (aceton:Hex 1:4, 1,2 g, 81 %) .

c) 5β-20, 20-Ethylendioxy-5P-pregn-ll-en-3-on

Směs 3a-hydroxy-20,20-ethylendioxy-5p-pregn-ll-enu (1,2 g), acetátu sodného (0,53 g) a PCC (1,4 g) byla 1 h míchána při 25 °C a pak přefiltrována přes Florisil s elucí methylenchloridem a etherem (1:2). Čistý produkt byl získán sloupcovou chromatografií (aceton:hexan 1:9, 0,71 g, 60 %).

d) 3a-Hydroxy-3p-trifluormethyl-5p-pregn-ll-en-20-on

K roztoku 5p-20-ethylendioxypregn-ll-en-3-onu (710 mg, 1,98 mmol) v tetrahydrofuranu (15 ml) byl přidán trifluormethyltrimethylsilan (0,5M roztok v THF, 6 ml) a pak při O °C tetrabutylamoniumfluorid (20 mg) . Roztok postupně hnědl a reakce byla dokončena za 1 h. Byla přidána voda (30 ml) a odebrána organická vrstva. Vodná vrstva byla extrahována etherem (3 x 40 ml) a organický roztok byl vysušen nad uhličitanem draselným. Surový produkt, získaný odstraněním rozpouštědla, byl hydrolyzován kyselinou chlorovodíkovou (2N, 5 ml) v acetonu (40 ml) . Čistý produkt (554 mg, 73 %) byl pak izolován sloupcovou chromatografií s použitím ethylacetátu a hexanu (1:5) jako eluentu, t.t. 160-162,5 °C.

Příklad 19

3a, 21-Dihydroxy-3p-ethinyl-5p-pregnan-20-on-21-acetát

K suspenzi 3p-ethinyl-3a-hydroxy-5p-pregnan-20-onu (1,00 g, 2,92 mmol) ve 35 ml toluenu byly přidány 2 ml methanolu. Vzniklý roztok byl chlazen na lázni led/voda a byl přidán bezvodý BF₃-Et₂O (Aldrich; 5,8 ml, 5,02 g, 35,4 mmol). V několika částech byl přidán pevný tetraacetát olova (Aldrich; 1,96 g, 4,42 mmol). Zpočátku se vytvořil světle purpurový roztok, který za stálého míchání při 0 °C měnil barvu na světle hnědou. Směs byla míchána 3 h při teplotě místnosti a pak ochlazena na 0 °C. Chladná reakční směs byla přidána ke směsi 52 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného, vody a drceného ledu. Vzniklá směs byla extrahována ethylacetátem (2 x 75 ml). Spojená organická vrstva byla extrahována nasyceným roztokem chloridu sodného, vysušena (síran sodný) a zkoncentrována. Surový produkt byl přečištěn sloupcovou chromatografií (25 cm rychlého silikagelu v koloně o průměru 5 cm s elucí 3 1 20% aceton/hexan) , která poskytla 749 mg (64 %) acetátu, t.t. 196-198 °C.

Příklad 20

3α,21“Dihydroxy-3p-trifluormethyl-5p-pregnan-20-on-21-acetát

V atmosféře bezvodého argonu byl 3a-hydroxy-3ptrifluormethyl-5p-pregnan-20-on (1,94 g, 5,02 mmol) rozpuštěn v toluenu (86 ml) a methanolu (5,2 ml). Pomocí injekční stříkačky byl přidán bortrifluoridetherát (10,4 ml, 84,3 mmol). Poté byl přidán tetraacetát olova (2,89 g, 6,51 mmol). Směs byla míchána po dobu 70 min, nalita do vody a extrahována třikrát methylenchloridem. Organické fáze byly spojeny, promyty vodnými roztoky hydrogenuhličitanu sodného a chloridu sodného, vysušeny nad síranem hořečnatým a odpařeny ve vakuu na světle žlutou pevnou látku (2,18 g) . Tato pevná látka byla přečištěna rychlou sloupcovou chromatografií (CH₂Cl₂/EtOAc 150:1 a hexan/EtOAc 4:1) na bílou pevnou látku (1,54 g, 69 %), t.t. 167-168,5 °C.

Příklad 21

3a-Hydroxy-3p-trifluormethyl-5p-pregnan-20-on

Odkaz: Krishnamurti, R., Bellew, D.R., Surya Prakash,

G.K., J. Org. Chem. 1991, 56, 984.

K roztoku 53~pregnan-3,20-dion-20-ethylenketalu (60 mg, 0,166 mmol) v suchém tetráhydrofuranu (3 ml) byl přidán 0,5M F₃CSi(CH₃)3 (v THF; 0,5 ml, 0,25 mmol). Vzniklý bezbarvý roztok byl ochlazen na 0 °C a byl přidán n-Bu₄NF'xH₂O (několik krystalů). Chladicí lázeň byla odstraněna a směs byla ponechána ohřát se na teplotu místnosti. Na rozdíl od stejné reakce s použitím 5a-pregnan-3,20-dion-20-ethylenketalu výše uvedená reakční směs nezežloutla a rovněž nedošlo k vývinu plynu. TLC (3:1 hexan/aceton) neukázala vznik produktu. Poté byl přidán 0,5M F₃CSi(CH₃)₃ (v THF; 0,5 ml, 0,25 mmol). Vzniklá směs byla míchána několik minut při teplotě místnosti. TLC ukázala novou skvrnu, která měla hodnotu R_f blízkou 1, ale bylo ještě přítomno určité množství nezreagované výchozí látky. Proto byl přidán ještě 0,5M F₃CSi(CH₃)₃ (v THF; 0,5 ml, 0,25 mmol). Směs byla ještě krátkou dobu míchána při teplotě místnosti. Nevyskytoval se nezreagovaný výchozí keton. Byla přidána IN kyselina chlorovodíková (cca 3 ml) a vzniklá dvoufázová směs byla míchána přes noc při teplotě místnosti. Skvrna, která se vytvořila v důsledku trifluormethylace, nyní úplně zmizela a objevily se dvě nové méně polární skvrny, z nichž spodní patří hlavnímu produktu. Směs pak byla zředěna etherem a vodou. Vodná vrstva byla oddělena a extrahována etherem. Spojená organická vrstva byla promyta nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a solankou, vysušena (síran hořečnatý), zfiltrována a odpařena za sníženého tlaku na bílou krystalickou (pěnivou) látku. ¹H a ¹⁹F NMR této látky ukazují přítomnost dvou epimerů v poměru 85:15. Rozdělení těchto dvou epimerů bylo provedeno rychlou chromatografií směsí 15:1 hexan/aceton.

Odpařením dřívějších frakcí byl získán vedlejší isomer, který nebyl charakterizována a bylo předpokládáno, že se jedná o 3β-1ιγάηοχγ-3α~ίηϊίluormethyl-3p-pregnan-20-on.

Další elucí kolony byl získán 3α-1ιγάΓοχγ-3βtrifluormethyl-^-pregnan-20-on (50 mg) .

Příklad 22

3α-Hydroxy-3β-trifluormethyl-5β-19-norpregn-17(20)(z)-en

K roztoku 5β-19-ηοτρ^ςη-17 (20) (Z)-en-3-onu (823 mg, 2,88 mmol) v tetrahydrofuranu (30 ml) byl při 0 °C přidán trifluormethyltrimethylsilan (0,5M roztok v THF, 8,6 ml). Roztok postupně hnědl a reakce byla dokončena za 30 min. Byla přidána voda (30 ml) a odebrána organická vrstva. Vodná vrstva byla extrahována etherem (3 x 50 ml) a organický roztok byl vysušen nad uhličitanem draselným. Čistý produkt (800 mg, 78 %) byl izolován sloupcovou chromatografii s použitím ethylacetátu a hexanu (1:9) jako eluentu.

Příklad 23

3a,21-Hydroxy-3p-methyl-5a-pregnan-20-on-21-acetát

Roztok 3a-hydroxy-33-methyl-5a-pregnan-20-onu (3,00 g, 9,02 mmol) v suchém toluenu (110 ml) a methanolu (6 ml) byl vychlazen na lázni suchý led/aceton na -75 °C. Pomocí injekční stříkačky byl přidán bezvodý BF₃-Et₂O (Aldrich; 18 ml, 146 mmol) a pak byl po částech přidán pevný tetraacetát olova (4,39 g, 9,90 mmol). Při -75 °C nebyla zjevná žádná reakce a reakční směs byla ponechána ohřát se během 4 h na -10 °C. Během dalších 90 min byla reakční směs ponechána ohřát se na 0 °C. Podle HPLC je hlavní přítomnou látkou výchozí látka. Po 1 h při 0 °C byla reakční směs ochlazena na -15 °C a bylo přidáno dalších 1,94 g tetraacetátu olova a reakční směs byla ponechána ohřát se na 0 °C. Po 30 min poskytla HPLC (difrakční detektor) nekorigovaný poměr produktu a výchozí látky 10:1 a po dalších 45 min byla reakční směs ochlazena na -10 °C a přidána k ledem chlazené směsi 100 ml ethylacetátu, 165 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a drceného ledu. Vodná vrstva byla oddělena a promyta ethylacetátem (2 x 150 ml). Spojená organická vrstva pak byla promyta pokaždé dvakrát vodou a nasyceným roztokem chloridu sodného. Po vysušení nad síranem sodným bylo rozpouštědlo odstraněno a zbytek byl překrystalován z ethylacetátu a poskytl 1 g acetátu, kontaminovaného výchozí látkou. Matečný louh byl zkoncentrován ve vakuu a triturován se dvěma 100 ml podíly hexanu. Zbytek z promývání hexanem byl spojen s překrystalovanou látkou a podruhé překrystalován. Vzniklá pevná látka byla kontaminována 2,8 % výchozí látky (podle HPLC). Třetí rekrystalizací bylo získáno 1,087 g (výtěžek 31 %) acetátu, který obsahoval < 2 % výchozí látky.

Příklad 24

3α,21-Dihydroxy-5p-pregnan-20-on-21-dinatriumfosfát

K roztoku 21-brom-3a-hydroxy-53~pregnan-20-onu (1,0 g, 2,5 mmol) v 10 ml tetrahydrofuranu byl při teplotě místnosti za míchání přidán dibenzylhydrogenfosfát (2,1 g, 7,55 mmol) a triethylamin (1,085 ml, 7,8 mmol). Reakční směs pak byla 2,5 h zahřívána k refluxu a pak ochlazena na teplotu místnosti. Pak byl přidán dichlormethan (25 ml) a roztok byl přenesen do dělicí nálevky, promyt IN kyselinou chlorovodíkovou, nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vysušen síranem hořečnatým a zkoncentrován ve vakuu na dibenzylfosfát jako surový olej (943 mg) . Olej byl rozpuštěn v ethanolu (50 ml) a bylo přidáno několik kapek kyseliny sírové. Do baňky pak bylo vloženo 400 mg 5% Pd/C a míchaný roztok byl vystaven tlaku 1 atm. plynného vodíku při teplotě místnosti do dokončení reakce. Katalyzátor byl odfiltrován a roztok zkoncentrován na zbytek. Tento zbytek byl rozpuštěn ve směsi 4:1 methanol:voda (20 ml) a titrován 2N hydroxidem sodným do pH 11. Bylo přidáno dalších 50 ml methanolu a po stání po dobu 1 h při 0 °C byl odfiltrován pevný anorganický fosfát. Roztok byl zkoncentrován ve vakuu a zbytek byl promyt horkým toluenem (cca 50 ml) a pak rozpuštěn v minimálním objemu methanolu. K tomuto roztoku byl pomalu přidáván aceton do vysrážení pevné látky. Směs byla odstředěna, rozpouštědlo dekantováno a vlhká pevná látka byla přenesena do lékovky a sušena ve vakuu na titulní sloučeninu ve formě hygroskopické pevné látky.

Příklad 25

3α,21-Dihydroxy-33-methyl-5a-pregnan-20-on-21-dinatriumfosfát

K roztoku 21-brom-3a-hydroxy^3p-methyl-5a-pregnan-20-onu (1,0 g, 2,43 mmol) v 10 ml tetrahydrofuranu byl při teplotě místnosti za míchání přidán dibenzylhydrogenfosfát (2,1 g, 7,3 mmol) a triethylamin (1, 085 ml, 7,53 mmol). Reakční směs pak byla 4,5 h zahřívána' k ref luxu a pak ochlazena na teplotu místnosti. Poté byl přidán dichlormethan (25 ml) a roztok byl přenesen do dělicí nálevky, promyt IN kyselinou chlorovodíkovou, nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vysušen síranem hořečnatým a zkoncentrován ve vakuu na dibenzylfosfát jako surový olej (1,025 g) . Dibenzylfosfát (790 mg, 1,3 mmol) byl rozpuštěn ve směsi 2:1 EtOH:THF (30 ml) s několika kapkami kyseliny sírové, bylo přidáno 5% Pd/C (180 mg, 20% hmotn.) a při teplotě místnosti byl aplikován vodík o tlaku 345 kPa (50 psi) do dokončení reakce, detekováno TLC. Katalyzátor byl odfiltrován a filtrát byl zkoncentrován. Zbytek byl rozpuštěn ve směsi 4:1 MeOH:voda (10 ml) a titrován IM hydroxidem sodným do pH 11. K roztoku byl přidáván aceton do vysrážení snadno filtrovatelné látky, načež byla směs ochlazena na 0 °C a zfiltrována za účelem izolace 260 mg surové látky. Tato látka byla rozpuštěna ve 20 ml vody za vzniku zakaleného roztoku, který byl zfiltrován a pak zkoncentrován a poskytl 220 mg titulní sloučeniny jako bílé pevné látky.

Příklad 26

a) 20,20-Ethylendioxy-5a-pregnan-3-on

Titulní sloučenina byla připravena s celkovým výtěžkem asi 90 % z 3p-hydroxy-5a-pregnan-20-onu jako výchozí látky s použitím metody popsané pro 53-sloučeninu.

b) 3p-Ethinyl-3a-hydroxy-5a-pregnan-20-on-20-ketal a 3aethinyl-3p-hydroxy-5a-pregnan-20-on-20-ketal

Do 250ml tříhrdlé baňky, vybavené přívodem plynu, teploměrem a chladičem, byl předložen komplex lithiumacetylidEDA (2,75 g, 90%, 27,5 mmol). Byl přidán suchý benzen (60 ml) a směsí byl mírnou rychlostí probubláván plynný acetylen. Směs pak byla zahřívána na olejové lázni na 50 až 55 °C a po částech byl přidáván 5a-pregnan-3,20-dion-20-ketal (9 g, 25 mmol). Směs se míchala při této teplotě ještě 5 h a pak dalších 17 h při teplotě místnosti. Vzniklá suspenze byla ochlazena na 10 °C a byl přidán nasycený roztok chloridu sodného (5 ml) . Rozpouštědlo bylo odstraněno a zbytek byl vyjmut do vody. Ve vodě nerozpustný produkt byl získán filtrací, promyt vodou a sušen ve vakuu. Tento surový produkt pak byl překrystalován z ethylacetátu a poskytl 3a-ethinyl-3p-hydroxy-5a-pregnan-20on-20-ketal (3,55 g). Matečný louh byl odpařen do sucha a zbytek byl přečištěn sloupcovou chromatografii na silikagelu. Elucí směsí toluen:aceton (92:8) byl získán nezreagovaný výchozí keton (1,3 g) a pak 3p-ethinyl-3a-hydroxy-5a-pregnan20-on-20-ketal (1,3 g) jako druhá frakce. Další elucí stejnou směsí rozpouštědel byl získán polárnější 3a-ethinyl-3p-hydroxy5a-pregnan-20-on-20-ketal (270 mg).

c) 3p-Ethinyl-3a-hydroxy-5a-pregnan-20-on

3p-Ethinyl-3a-hydroxy-5a-pregnan-20-on-20-ketal (550 mg) byl rozpuštěn ve směsi acetonu (20 ml) a 2N kyseliny chlorovodíkové (10 ml) a směs byla míchána 15 h při teplotě místnosti. Rozpouštědla byla odpařena a zbytek byl extrahován methylenchloridem. Organická vrstva byla promyta vodou, zředěným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vodou a solankou. Po vysušení nad bezvodým síranem hořečnatým byl roztok zfiltrován a odpařením byl získán surový produkt (414 mg) .

Tento surový produkt pak byl rozpuštěn v malém množství methylenchloridu a nalit na sloupec silikagelu. Elucí směsí toluen:aceton (92:8) byla získána titulní sloučenina (280 mg), t.t. 175-177 °C.

d) 3a-Ethinyl-33_nitrooxy-5a-pregnan-20-on

Roztok 3cc-ethinyl-3p-hydroxy-5a-pregnan-20-on-20-ketalu (2,15 g) v trichlormethanu (45 ml) byl ochlazen na -20 °C a byl přidán acetanhydrid (20 ml) . Poté byla přidána dýmavá kyselina dusičná (4 ml) a směs byla při této teplotě míchána 45 min. Po ohřátí na -5 °c byl žlutý roztok nalit do směsi 2N hydroxidu sodného (70 ml) a vody (150 ml) a vznikl roztok o pH 3 až 4. Ten byl pak extrahován trichlormethanem, promyt vodou, nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, solankou, vysušen (síran hořečnatý) a odpařením byla získána titulní látka jako viskózní materiál (3 g), který byl použit jako takový pro další stupeň.

e) 3p-Ethinyl-3a-hydroxy-5a-pregnan-20-on a 3a-ethinyl-3P~ hydroxy-5a-pregnan-20-on

Surový produkt (3 g) z výše uvedeného stupně byl vyjmut do směsi tetrahydrofuranu a vody (30 ml, 1:1) a byl přidán dusičnan stříbrný (516 mg). Po 15 h míchání při teplotě místnosti byla odstraněna rozpouštědla a zbytek byl extrahován methylenchloridem. Organická vrstva byla promyta vodou, zředěným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vodou a solankou, po vysušení nad bezvodým síranem hořečnatým byl roztok zfiltrován a odpařením byl získán surový produkt (2 g) . Tento surový produkt pak byl rozpuštěn v malém množství methylenchloridu a nalit na sloupec silikagelu. Elucí směsí toluen:aceton (93:7) byl získán 3p-ethinyl-3a-hydroxy-5apregnan-20-on (550 mg) jako první frakce. Další elucí stejnou směsí rozpouštědel byl získán polárnější 3a-ethinyl-3p-hydroxy5a-pregnan-20-on (460 mg).

Příklad 27

3a,21-Dihydroxy-3P~trifluormethyl-5p-pregnan-20-on-21hemisukcinát

V atmosféře bezvodého argonu byl rozpuštěn 3a,21dihydroxy-33-trifluormethyl-5p-pregnan-20-on (920 mg, 2,29 mmol), sukcinanhydrid (457 mg, 4,57 mmol) a dimethylaminopyridin (14 mg) v bezvodém pyridinu. Po 16 h míchání byl přidán další dimethylaminopyridin (7 mg) . Po dalších 3 h míchání bylo rozpouštědlo odstraněno ve vakuu. Zbylý pyridin byl odstraněn odpařením z toluenového roztoku. Zbytek byl přečištěn rychlou sloupcovou chromatografií (CH2C12/MeOH; gradient 100:1 až 50:1) a byl získán bílý polopevný zbytek (1,1 g) . Tato mírně znečištěná látka byla rozpuštěna v methylenchloridu, promyta vodou (3 x 50 ml) a vysušena nad síranem hořečnatým. Rozpouštědlo bylo odpařeno ve vakuu a byla získána bílá pevná látka (883 g, 77 %) .

Sodná sůl 3a,21-dihydroxy-3p-trfluormethyl-5p-pregnan-20-on-21hemisukcinátu

3a, 21-Dihydroxy-3p-trifluormethyl-5p-pregnan-20-on-21hemisukcinát (859 mg, 1,71 mmol) byl rozpuštěn v methanolu (35 ml). Po kapkách byl přidán hydrogenuhličitan sodný (143 mg, 1,70 mmol) ve vodě (10 ml). Byl přidán další methanol (10 ml). Po 2,5 h míchání bylo odpařeno rozpouštědlo. Zbytek byl rozetřen se směsí ether/hexan a pak s hexanem a byla získána bílá pevná látka. Byl přidán a odstraněn methanol. Byl přidán heptan a odstraněn ve vakuu. Zbytek byl rozetřen s hexanem a vysušením ve vakuu byla získána bílá pevná látka (878 mg, 98 %) ·

Příklad 28

33-Ethinyl-3a-hydroxy-5p-pregn-ll-en-20-on

K roztoku cis/trans-dibromethylenu (236 mg, 1,27 mmol) v 5 ml suchého tetrahydrofuranu bylo při -78 °C po kapkách přidáno 1,6M butyllithium v hexanech (1,6 ml, 2,54 mmol) a směs byla míchána po dobu 30 min. Pak byla teplota snížena na -90 °C a pomocí kanyly byl v průběhu 10 min přidán roztok 5p-pregn-llen-3,20-onu v 10 ml tetrahydrofuranu a reakční směs byla míchána dalších 30 min při -90 °C, načež byly přidány 3 ml nasyceného vodného roztoku chloridu amonného a směs míchána do teploty místnosti. Obsah rozpouštědla byl ve vakuu snížen na přibližně 5 ml a pak byla směs rozdělena mezi ethylacetát a vodu (po 25 ml) a organická vrstva byla promyta nasyceným vodným roztokem chloridu sodného, vysušena síranem hořečnatým a zkoncentrováním ve vakuu byla získána surová pevná látka. Rychlou chromatografií na 15,2 cm (6 in) silikagelu v koloně 2 cm se sbíráním frakcí po 10 ml a elucí směsí 95:5 toluen:aceton bylo získáno 142 mg (65,6 %) titulní sloučeniny, t.t. 147-150 °C.

Příklad 29

3P-Trifluormethyl-3a-hydroxy-5a-19-norpregnan-20-on

Tato sloučenina byla získána jako vedlejší produkt při přípravě 3a-hydroxy-3p-trifluormethyl-5p-19-norpregnan-20-onu (viz příklad 10). Je izolována z příslušných chromatografických frakcí; t.t. 178-179 °C.

Příklad 30

3β-(1-Heptinyl)-3a-hydroxy-5p-pregnan-20-on

K roztoku 1-heptinu (0,327 ml, 2,5 mmol) v suchém tetrahydrofuranu (15 ml) bylo při -78 °C přidáno n-butyllithium (2,5M v THF, 2,5 mmol, 1 ml). Po 1 h míchání při této teplotě byl přidán roztok cyklického 20-(1,2-ethandiylacetalu) 5βpregnan-3,20-dionu (360 mg, 1 mmol) v suchém tetrahydrofuranu (15 ml) a směs byla 1 h míchána při -78 °C. Byl přidán 2N roztok kyseliny chlorovodíkové (1 ml). Bylo odstraněno rozpouštědlo a zbytek byl pak rozpuštěn v acetonu (10 ml) . Po přídavku 2N kyseliny chlorovodíkové (10 ml) byl roztok 1 h míchán při teplotě místnosti. K neutralizaci kyseliny pak byl přidán nasycený roztok hydrogenuhličitanu sodného. Byla odstraněna rozpouštědla a zbytek byl extrahován ethylacetátem. Organická vrstva byla promyta vodou, zředěným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vodou a solankou. Po vysušení nad bezvodým síranem hořečnatým byl roztok zfíltrován a odpařením byl získán surový produkt (400 mg) . Tento surový produkt byl pak rozpuštěn v malém množství methylenchloridu a nalit na sloupec silikagelu. Elucí směsí toluen:aceton (93:7) byl získán 3β-(1-heptinyl)-3α-hydroxy-3β-pregnan-20-on (260 mg) jako bezbarvá pevná látka; t.t. 121-123 °C.

Analogický postup byl použit k přípravě 3β-(l-hexinyl-3ahydroxy-5β-pregnan-20-onu, 3β-(1-oktinyl)-3α-hydroxy-5βpregnan-20-onu, 3β-cyklopropylethinyl-3a-hydroxy-5β-pregnan-20onu, 3β-(3-methylbut-2-en-l-inyl)-3α-hydroxy-5β-pregnan-20-onu a 3β-(3,3-dimethylbutinyl)-3α-hydroxy-5β-pregnan-20-onu.

Příklad 31

3p-Cyklopropylethinyl-3a-hydroxy-53-pregnan-20-on

a) Cyklický 20-(1,2-ethandiylacetal) 3p-(chlor-lpentinyl)-3a-hydroxy-5p-pregnan-20-onu

K roztoku 5-chlorpentinu (0,5 ml, 4,8 mmol) v suchém tetrahydrofuranu (15 ml) bylo při -60 °C přidáno n-butyllithium (2,4M v THF, 4,8 mmol, 2 ml). Po 0,5 h míchání směsi při -78 °C byl přidán roztok cyklického 20-(1,2-ethandiylacetalu) 5βpregnan-3,20-dionu (560 mg, 1,56 mmol) v tetrahydrofuranu (15 ml) a směs byla míchána 1 h při -78 °C. Chladicí lázeň byla odstraněna a ke směsi byl přidán roztok chloridu amonného (3 ml). Rozpouštědlo bylo odstraněno a zbytek byl extrahován ethylacetátem. Organická vrstva byla promyta vodou, zředěným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vodou a solankou. Po vysušení nad bezvodým síranem hořečnatým byl roztok zfiltrován a odpařením byl získán surový produkt (660 mg). Tento surový produkt byl použit jako takový v příštím stupni.

b) 3p-Cyklopropylethinyl-3ahydroxy-5p-pregnan-20-on

K roztoku diisopropylaminu (0,4 ml, 3 mmol) v suchém tetrahydrofuranu (15 ml) bylo při -60 °C přidáno n-butyllithium (2,5M v THF, 3 mmol, 1,2 ml). Po 0,5 h míchání směsi při -78 °C byl přidán roztok cyklického 20-(1,2-ethandiylacetalu) 3β—(5— chlor-l-pentinyl)-3a-hydroxy-5P~pregnan-20-onu (100 mg, 0,22 mmol) v tetrahydrofuranu (15 ml) . Chladicí lázeň byla odstraněna a směs byla míchána 0,5 h při teplotě místnosti. Byl přidán roztok chloridu amonného (3 ml) . Rozpouštědlo bylo odstraněno a zbytek pak byl rozpuštěn v acetonu (40 ml). Po přídavku IN kyseliny chlorovodíkové (4 ml) byl roztok míchán 15 min při teplotě místnosti. Byl přidán nasycený roztok hydrogenuhličitanu sodného k neutralizaci kyseliny.

Rozpouštědla byla odstraněna a zbytek byl extrahován ethylacetátem. Organická vrstva byla promyta vodou, zředěným roztokem hydrogenuhličitanu sodného, vodou a solankou. Po vysušení nad bezvodým síranem horečnatým byl roztok zfiltrován a odpařením byl získán surový produkt (120 mg) . Tento surový produkt pak byl rozpuštěn v malém množství methylenchloridu a nalit na sloupec silikagelu. Eluci směsí toluen:aceton (95:5) byl získán 3β-(cyklopropylethinyl)-3a-hydroxy-5p-pregnan-20-on (55 mg) jako bezbarvá pevná látka; t.t. 123-138 °C; TLC R_f (hexan:aceton 7:3) 0,29.

Odborníkovi je zřejmé, že výše uvedené sloučeniny se mohou vyskytovat jako směsi diastereomerů, které je možno rozdělit na jednotlivé diastereomery. Štěpení diastereomerů je možno výhodně provádět plynovou nebo kapalinovou chromatografií nebo izolací z přírodních zdrojů. Není-li zde uvedeno jinak, zahrnují odkazy na sloučeniny podle vynálezu všechny isomery, ať jsou rozdělené nebo jako směsi.

Pokud se isomery dělí, převládá požadovaná farmakologické aktivita často u jednoho z diastereomerů. Jak výše uvedeno, tyto sloučeniny vykazují vysoký stupeň stereospecifity. Největší afinitu vůči komplexu receptoru GABA mají zejména sloučeniny s 33-substituovaným-3a-pregnanovým steroidním skeletem.

Sloučeniny podle vynálezu, což jsou netoxické, farmaceuticky přijatelné, přírodní a syntetické, přímo působící a prekursorové formy metabolitů progesteronu, deoxykortikosteronu a androstanu, mají dosud neznámou aktivitu v mozku na komplexu receptorů GABA_a. Vynález těží z objevu tohoto dosud neznámého mechanismu a účinnosti.

Farmaceutické přípravky podle vynálezu se připravují v běžných lékových formách zabudováním účinné sloučeniny podle vynálezu nebo směsi takových sloučenin uznávanými postupy do netoxického farmaceutického nosiče v netoxickém množství postačujícím k dosažení požadovaného farmakodynamického účinku u zvířecího nebo lidského subjektu. Přednostně přípravek obsahuje účinnou složku v účinném, avšak netoxickém množství, zvoleném mezi asi 1 mg až asi 500 mg účinné složky na jednotku dávky. Toto množství závisí na konkrétní požadované biologické účinnosti a na stavu pacienta. Požadované cíle přípravků a způsobů podle vynálezu jsou léčba stresu, úzkosti, PMS, PND a záchvatů, například epileptických, za účelem zlepšení nebo zamezení návalů úzkosti, svalového napětí a depresí, běžných u pacientů, trpících těmito abnormalitami centrální nerovové soustavy. Dalším žádoucím cílem přípravků a způsobů podle vynálezu je léčba nespavosti a vyvolávání hypnotické aktivity. Dalším žádoucím cílem těchto přípravků a způsobů je vyvolávání anestesie, zejména intravenózní aplikací.

Použitý farmaceutický nosič může být například pevný, kapalný nebo s časovaným uvolňováním (viz například Remington's Pharmaceutical Sciences, 14. vyd., 1970). Příklady pevných nosičů jsou laktóza, bílá hlinka, sacharóza, talek, želatina, agar, pektin, arabská guma, stearát hořečnatý, kyselina stearová, mikrokrystalická celulóza, polymerní hydrogely apod. Typické kapalné nosiče jsou propylenglykol, glykofurol, vodné roztoky cyklodextrinů, sirup, arašídový olej a olivový olej a podobné emulze. Podobně může nosič nebo ředidlo zahrnovat jakoukoli známou časově zpožďující látku, jako je glycerolmonostearát nebo glyceroldistearát samotný nebo s voskem, mikrokapslemi, mikrosférami, liposomy a/nebo hydrogely.

Mohou být používány rozmanité farmaceutické formy. Používá-li se pevný nosič, může být přípravek jednoduše mletý, mikronizovaný, v oleji, tabletovaný, uložený v kapsli z tvrdé želatiny nebo s enterosolventním povlakem ve formě mikronizovaného prášku nebo pelet nebo ve formě pastilek nebo pilulek. Sloučeniny podle vynálezu mohou být rovněž podávány ve formě čípků pro rektální aplikaci. Sloučeniny mohou být zamíchány v materiálu, jako je kakaové máslo a polyethylenglykoly nebo jiný vhodný nedráždivý materiál, který je pevný za teploty místnosti, ale kapalný při teplotě rekta. Používá-li se kapalný nosič, může být preparát ve formě kapaliny, například v ampuli, nebo ve vodné nebo v nevodné suspenzi. Kapalné lékové formy vyžadují rovněž farmaceuticky přijatelné konzervační prostředky apod. Z důvodu nízkých dávek, požadovaných na základě zde uváděných údajů, je vhodnou farmaceutickou formou pro topickou aplikaci také parenterální aplikace, nosní sprej, sublingvální a bukální aplikace a transdermální náplasti s časovaným uvolňováním.

Způsob vyvolání anxiolytické, antikonvulsivní, náladu měnící (například antidepresivní) nebo hypnotické aktivity podle vynálezu spočívá v tom, že se subjektu, vyžadujícímu tuto aktivitu, podává sloučenina podle vynálezu, obvykle ve formě výše uvedeného přípravku s farmaceutickým nosičem, v netoxickém množství dostatečném k vyvolání uvedené aktivity.

Během menses se hladina vylučovaných metabolitů mění přibližně čtyřnásobně (Rosciszewska a d., 1986). Terapie, vedoucí k potlačení příznaků, tedy znamená udržovat pacientku na vyšší hladině metabolitů progesteronu než je normální v premenstruálním stadiu pacientek s PMS. Během premenstruálního a postmenstruálního stadia pacientky se monitoruje hladina aktivních a hlavních metabolitů v plasmě. Množství sloučenin podle vynálezu, podávaných buď samostatně nebo ve směsích, se pak vypočte tak, aby dosahovalo úrovně, která vykazuje aktivitu receptoru GABA rovnou nebo vyšší než hladina metabolitů progesteronu u normálního subjektu během premenstruálního stadia.

Aplikace může být prováděna jakoukoli cestou, účinně transportující účinnou sloučeninu k receptorům GABA_a, které mají být stimulovány. Aplikace může být prováděna parenterálně, enterálně, rektálně, intravaginálně, intradermálně, intramuskulárně, sublingválně nebo nasálně; preferována je orální, intramuskulární a dermální cesta. Například jedna dávka v transdermální náplasti může pacientce dodávat účinnou složku po dobu až jednoho týdne. Pro epileptický stav je však preferována parenterální cesta.

Účinnost v místě GR

Experimentální data in vitro i in vivo ukazují, že přirozeně se vyskytující metabolity progesteronu a deoxykortikosteronu a jejich deriváty interagují s vysokou afinitou na novém a specifickém rozpoznávacím místě na komplexu GR a usnadňují konduktanci chloridových iontů neuronálními membránami citlivými na GABA (Gee a d., 1987, Harrison a d., 1987).

Odborníkům je známo, že modulace [³⁵S] terč.butylbicyklofosforothionátové ([³⁵S]TBPS) vazby je mírou účinnosti léčiv působících na komplex GR, která mohou mít potenciální terapeutickou hodnotu při léčbě stresu, úzkosti a záchvatových poruch (Squires, R.F., a d., „[³⁵S]t-Butylbicyclophosphorothionate binds with high affinity to brain-specific sites coupled to gamma aminobutyric acid-A and ion recognition site, Mol. Pharmacol., 23:326, 1983; Lawrence, L.J. a d., „Benzodiazepine anticonvulsant action: Gamma-aminobutyric aciddependent modulation of the chloride ionophore, Biochem. Biophys. Res. Comm., 123:1130-1137; Wood a d., „In vitro characterization of benzodiazepine receptor agonists, antagonists, inverse agonists and agonist/antagonists, Pharmacol. Exp. Ther., 231:572-576 (1984)). Zjistili jsme, že tyto sloučeniny interagují s novým místem na komplexu GR, které se nepřekrývá s barbiturátovým, benzodiazepinovým nebo jiným dříve známým místem. Tyto sloučeniny mají navíc za přísných strukturních požadavků vysokou účinnost na komplexu GR.

Postupy k provádění tohoto testu jsou podrobně popsány v: (1) Gee a d., 1987, (2) Gee, K.W., L.J. Lawrence a H.I. Yamamura, Molecular Pharmacology, 30:218 (1986). Tyto postupy byly prováděny následujícím způsobem:

Ze samců krys Sprague-Dawley byly bezprostředně po usmrcení odebrány mozky a mozková kůra byla vyříznuta nad ledem. Byl připraven P₂ homogenizát dříve popsaným způsobem (Gee a d., 1986). Stručně řečeno byla kůra opatrně homogenizována v 0,32M sacharóze a pak odstřeďována 10 min při 1000 x g. Byl odebrán supernatant a odstřeďován 20 min při 9000 x g. Získaná peleta P₂ byla suspendována jako 10% (pův. hmotnost za mokra/objem) suspenze v 50 mM Na/K fosfátového pufru (pH 7,4), 200 mM NaCl za vzniku homogenizátu.

Alikvoty homogenizátu P₂ (0,5 mg proteinu) po 100 μΐ byly inkubovány s 2nM [³⁵S]TBPS (70 až 110 Ci/mmol; New England Nuclear, Boston, ΜΆ) v přítomnosti nebo nepřítomnosti testovaných přirozeně se vyskytujících steroidů nebo jejich syntetických derivátů. Testované sloučeniny byly rozpuštěny v dimethylsulfoxidu (Baker Chem. Co., Phillipsbury, NJ) a přidány v alikvotech po 5 μΐ k inkubační směsi. Inkubační směs byla doplněna pufrem na konečný objem 1 ml. Nespecifická vazba byla definována jako vazba v přítomnosti 2mM TBPS. Účinek a specifita GABA (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO) byla hodnocena tak, že všechny testy byly prováděny v přítomnosti GABA plus (+)bikukulinu (Sigma Chem. Co.). Inkubace, udržované 90 min na 25 °C (podmínky ustáleného stavu), byly ukončeny rychlou filtrací přes filtr ze skleněných vláken (č. 32, Schleicher a Schuell, Keene, NH). Radioaktivita navázaná na filtr byla kvantifikována kapalnou scintilační spektrofotometru. Kinetická data a křivky závislosti sloučenina/dávka [³⁵S]TBPS odpověď byly analyzovány nelineární regresí s použitím komputerizovaných iterativních postupů pro získání hodnot rychlostních konstant a IC₅o (koncentrace sloučeniny, při níž dochází k polovině maximální inhibice bazální vazby [³⁵S]TBPS).

Experimentální data, získaná v tomto testu, jsou rovněž publikována v Gee a d., 1987. Data, uvedená v této práci, jsou popsána a osvětlena ve zveřejněné přihlášce PCT č. WO 93/03732, zveřejněné 4.3.1993. Vazebné místo steroidů, identifikované v této práci, je však odlišné od místa GABA/bikukulin. Posun křivek závislosti dávka-odpověď, vyvolaný bikukulinem, je-li inhibice vazby [³⁵S]TBPS způsobena alfaxalonem, není paralelní. To dokazuje, že místo GABA a místa steroidů se nepřekrývají.

Druhá sada experimentů byla provedena za účelem demonstrace, že steroidy, barbituráty a benzodiazepiny nesdílejí společné vazebné místo na receptoru GABA. Test byl proveden v souladu s výše zmíněnými postupy. Výsledná kinetická data ukazují, že disociace vazby [³⁵S]TBPS, iniciovaná saturační koncentrací 3a-hydroxy-5a-pregnan-20-onu, je potencována ΙΟΟμΜ pentobarbitalem sodným. Tento efekt naznačuje, že 3α-ΟΗ-5αpregnan-20-on (steroid) a pentobarbital (barbiturát) se vážou na nezávislá místa.

Třetí sada experimentů zkoumala interakce mezi 3a-hydroxy5a-pregnan-20-onem a pentobarbitalem sodným při potenciaci vazby (³H) flunitrazepamu (FLU). Tyto experimenty dále podporují tvrzení, že steroidy nesdílejí společné místo působení s benzodiazepiny a barbituráty. V této sérii experimentů byl zkoumán vliv měnících se koncentrací 3ahydroxy-5a-pregnan-20-onu na vazbu (³H) FLU v přítomnosti nebo nepřítomnosti maximálně stimulující koncentrace pentobarbitalu sodného. Protože pentobarbital sodný má větší maximální účinnost při potenciaci vazby (³H) FLU než 3a-hydroxy-5apregnan-20-on, měl by 3a-hydroxy-5a-pregnan-20-on nakonec antagonizovat účinek pentobarbitalu sodného, kdyby oba kompetitivně interagovaly na stejném místě. To však pozorováno nebylo. Data tedy dále podporují náš závěr, že určité steroidy včetně sloučenin podle vynálezu interagují s novým místem na GR komplexu, odlišným od barbiturátového nebo BZ regulačního místa. V důsledku tohoto nezávislého místa působení se předpokládá, že tyto steroidní sloučeniny budou mít terapeutické profily odlišné od barbiturátů a BZ.

stanovení jejich vitro. Tyto testy

Byly zkoumány různé sloučeniny pro potenciálu jako modulátorů vazby [³⁵S]TBPS in byly prováděny v souladu s výše uvedenými postupy. Na základě těchto testů jsme stanovili požadavky na strukturu a aktivitu pro jejich specifickou interakci na komplexu GR a pořadí jejich účinnosti. V tabulce 1 jsou uvedeny hodnoty IC₅₀ a maximální inhibice několika sloučenin včetně příkladů nárokovaných v přihlášce. IC₅o je definována jako koncentrace sloučenin, která inhibuje 50 % kontrolní vazby [³⁵S]TBPS. Je ukazatelem účinnosti sloučeniny in vitro. Maximální inhibice je ukazatelem působivosti sloučeniny in vitro.

Tab» 1

	IC»	Imax
3 β-cyjílopropyleth ínyl-3 a-hydroxy-5 P-pregnan-20-on	22	94
3 a-hydroxy-3 β-(3 '-meíhyl-but-3 '-en-1'-ίηγ!)-5βpregnan-20-on	24	91
3a-hydroxy-3p-methyl-5P-19-nor-pregnan-20-on	26	94
3 a,20a-dihydroxy-21 -ethyl-5a-pregnant	27	13
3 P-(cytíopropyl)eth! nyl-3 a-hydroxy-5 P-pregnan-20-on·	32	97
3 a,20a-dihydroxy-2 l-methyl-5a-pregnan	35	28
3 a-hydroxy-5a-pregnan-20-on	37	95
3a-hydroxy-3p-methyl-5P-pregnan-20-on	37	98
3 β-ethi nyl-3 a-hydroxy-5 P-pregnan-20-on	39	101
3 β-eth l nyl-3 α-hydroxy-19-nor-5 P-pregnan-20-on	44	93
3 β-(5 '-chlor pentťη-1 '-yl)-3 a-hydroxy-5 P-pregnan-20on	44	98
3 P-ethenyl-3 a-hydroxy-5 β-pΓegnan-20-on f	46	100
3 a-hydroxy-3 β-ethj nyl-5 a-pregnan-20-on	53	91
3 a-hydroxy-3 β-methyl-5a-pregnan-20-onf	62	97
bis (3a,21-dihydroxy-3P-ethynyl-5P-pregnan-20-on ) 21hemisulxinátt	68	56
3 a,21 -dihydroxy-5 a-pregnan-20-ont- 21 -acetat.	75	9ř-
3a,21 -dihydroxy-5a-pregnan-20-οπ' (5a-THDOC)	76	100
3a-Hydroxy-3P-trifluor. methyl-19-nor-5P-pregnan-20-onf	76	100
3 a-hydroxy-21 -methyl-5 P-pregnan-20-on	78	100
3 a-hydroxy-3 β-(3 '-methyl-but-3 '-en-1'-! nyl)-5apregnan-20-on'	88	95
3 a-hydroxy-3 β,21 -dimethyl-5 a-pregnan-20-on	89	85
3 a-hydroxy-3 P-methyl-5a-19-nor-pregnan-20-on.	91	80
3a,20a(S)-dihydroxy-5a-pregnan	99	46
N-(3 a-hydroxy-3 P-methyl-5a-pregnan-20ylidin )ethanolamin	101	93
3P-ethenyl-3a-hydroxy-5a-pregnan-20-on	113	88

se

	icJ0	Imax
3 α,21 -dihydroxy-5a-pregnan-20-on-21 -hem isukcinal	117	91
3 a,21 -d ihydroxy-5 P-pregnan-20-on - 21 -acetat	119	49
3a,20a-dihydroxy-3p-methyl-5a-pregnaiT	166	52
3a,20-dihydroxy-20-methyl-5a-pregnanc	176	40
3 a,21 -d ihydroxy-3 β-eth i ny 1-5 P-pregnan-20-on - 21 hemisukcinatt	179	82
Bis (3a,21-dihydroxy-3P-trifluortmethyl-5P-pregnan-20on ý-21 -hemisukcinát'	189	23
3 a-hydroxy-3 β-fluor methyl-5a-pregnan-20-on	200	77
3 a,20a-dihydroxy-3 β-eth i oyl-5 a-pregnan	202	56
3a-hydroxy-3 P-trifluoromethyI-5p-pregn-1 l-en-20-oni	203	99
3 a,21 -dihydroxy-3p-methyl-5a-pregnan-20-on- 21 hemisukcinaí , sod W sví	211	104
3a-hydroxy-3β-trifluop methy!-5p-pregnan-20-on	211	98
3 a,21 -dihydroxy-3 β-eth pnyl-5 P-pregnan-20-on	216	104
3 a,21 -d ihydroxy-3 β-methy 1-5 a-pregnan-20-on -21hemisukcinát	241	92
3a-hydroxy-3P-methyl-5a-pregn-l l-en-20-on	242	76
3 a-hydroxy-3 β-trifluor. methyl-5a-pregnan-20-on·	244	44
3 a,21 -dihydroxy-3 P-trifluor>methyl-19-nor-5p-pregnan20-on	246	100
3 a,21-dihydroxy-5a-pregnan-20-on-21-hemisukcinat,, sodha' sjl.	251	92
3 a-hydroxy-3 β-trifluor methyl-19-nor-5 a-pregnan-20-on-	251	40
3 a,21 -dihydroxy-3β-ethfnyl-5P-pregnan-20-on ,21acetát.	251	101
3a,21-dihydroxy-3P-methyl-5a-pregnan-20-on;	258	96
3a,21-dihydroxy-3P-methyl-5a-pregnan-20-on-21- acetát	284	93
3 a,21 -dihydroxy-3 p-ethenyl-5a-pregnan-20-on	288	101
3a,21 -dihydroxy-3P-trifluor methyl-5P-pregnan-20-on·	354	102
3 a,21-dihydroxy-3 β-trifluor. methyl-5P-pregnan-20-on2 1-acetat.	370	88

ίο

	ic50	Imax
3 a,21 -dihydroxy-3 Q-ethenyl-5a-pregnan-20-on -21hemisukcinát	377	89
3 a,20P-dihydroxy-3 β-m ethy 1-5 β-pregnan	455	105
3a,20a-dihydroxy-3P,21-aimethyl-5a-pregnan	507	48
3 a,21 -dihydroxy-3 β-trifluor methyl-19-nor-5 β-pregnan20-on - 21-hemisukcinátsodýjz/ stll	530	101
3 a,21 -dihydroxy-3 β-eth řnyI-5 P-pregnan-20-on+ 21 hemisukcinát sodW* st?h	540	102
3 a,21 -dihydroxy-3 β-trifluor :methyl-5P-pregnan-20-on-21-hemifumarát/: so&ia1 sul	546	102
3 a,20a-dihydroxy-3 β-eth vny 1-5 β-pregnan	557	98
3a,21 -dihydroxy-3β-fluor methy 1-5 a-pregnan-20-om	592	101
3 a,21 -dihydroxy-3 β-trifluor. methyl-5P-pregnan-20-on 21-hemisukcinát	648	101
3 a,20P-dihydroxy-3 β-eth fnyl-5 β-pregnan	688	77
3 a,21 -dihydroxy-3β-trifluor methyl-5β-pregnan-20-on«21-hemisukcinát ·, sodha* sul'	712	99
3a,20P-dihydroxy-3P-etbínyl-5a-pregnam	774	107
3 a,21-dihydroxy-3 β-trifluor 'methyl-5P-pregnan-20-on methyl 21-sukcinát	480	86
3a-hydroxy-3 P-methyl-21,21,21 - frífluor methy 1-5apregnan-20-on	915	101
3a,20P-dihydroxy-3p-methyI-5a-pregnan	924	99
3 a-hydroxy-3 β-methyl-5a-pregn-16-en-20-on	955	100
3 a-hydroxy-3 β-methyl-S a-pregnan.. -11,20-dion	958	100
21-brom -3 a-hydroxy-3 β-trifluor methyl-5[}-pregnan-20on;	1530	102
estradiol	> 1000	1*
progesteroru	> 1000	I*
kortifosteron-	> 1000	I*
cholesterol	> 1000	I*

* = ínaktivrX

Jak je patrné z tabulky 1, sloučeniny podle vynálezu mají nízké hodnoty IC₅o/ což je koncentrace potřebná k dosažení 50 % maximální inhibice vazby [³⁵S]TBPS, zatímco sloučeniny, jako jsou pohlavní steroidy (estradiol a progesteron), glukokortikoidy (kortikosteron) a cholesterol, s vysokými hodnotami IC₅₀, jsou v podstatě neúčinné. Předpokládá se tedy, že hormonální steroidy a cholesterol jako takové nebudou mít žádnou terapeutickou hodnotu pro indikace podle vynálezu. Pro rozlišení od hormonálních steroidů byla tato samostatná skupina steroidů nazvána neuroaktivní steroidy. Pohlavní steroidy, jako je progesteron, však mohou být v organismu metabolizovány na steroidy podobné 3a-hydroxy-5a-pregnan-20-onu. Progesteron je tedy možno považovat za prekursor. Data pro TBPS dobře korelují s údaji pro příjem ³⁶C1 iontů, potencovaný různými 3ahydroxylovanými steroidy, popsanými v Purdy R.H. ad., J. Med. Chem. 33:1572-1581 (1990), a rovněž s elektrofyziologickými daty získanými měřením aktivity steroidu při potenciaci GABAindukovaného proudu v oocytu, do něhož byly vpraveny lidské receptory GABA. To naznačuje, že test TBPS představuje přibližné měření schopnosti steroidů allostericky modulovat aktivitu Cl” kanálků.

Sloučeniny s částečnou aktivitou

Z hlediska dostupnosti požadované terapeutické účinnosti pro pacienta s co nejméně nežádoucími vedlejšími účinky je podstatným aspektem vynálezu objev agonistů s částečnou aktivitou ve sloučeninách s 5a-pregnan-3a,20a-hydroxylovou, 5βpregnan-3a,20p-hydroxylovou skupinou nebo derivátech a prekursorech těchto sloučenin. Navíc vykazuje částečnou účinnost v testu TBPS také podmnožina neuroaktivních steroidů jiných než jsou tyto dvě skupiny (tabulka 1) . Pro pacienty, kteří si přejí zlepšení úzkosti nebo křečí, je nežádoucí hypnóza. Pro pacienty, kteří si přejí zlepšení nespavosti, je nežádoucí anestesie. Sloučeniny popsané jako agonisté s částečnou aktivitou by mohly poskytovat požadovaný účinek s minimem nežádoucího účinku.

Kromě toho byla schopnost těchto sloučenin potencovat GABA-zprostředkované zesílení proudu Cl v oocytu Xenopus se vstfiknutými geny lidského receptoru GAGAa omezená ve srovnání s 3a-hydroxy-5a-pregnan-20-onem.

Při použití expresního systému oocytu Xenopus pro testování hranice účinnosti některých neuroaktivních steroidů bylo postupováno následovně. Do oocytu Xenopus laevis (stadium VI), které byly „defolikulovány s použitím metody štěpení kolagenasou [3 h při 18 až 23 °C, 2 mgml^-1 kolagenasy „A v Barthově salinickém roztoku s vynechanými solemi Ca²⁺], byly vstříknuty transkripty cRNA podjednotkových komplexů lidského receptoru GABAa al, βΐ a γΐ. Hlavní komplex receptoru GABAa je tvořen podjednotkami αβγ. Takto ošetřené oocyty byly jednotlivě uchovávány až 9 dní při 19 až 20 °C na 96jamkových plotnách (200 μΐ na jamku normálního Barthova roztoku doplněného 50 IU ml^-1 penicilinu, 50 mg ml^-1 streptomycinu a 100 mg ml'¹ gentomycinu). Agonistou indukovaný proud byl zaznamenáván z napětí oocytu Xenopus, odečítaného pomocí zesilovače Axoclamp 2A (Axon Instruments) v systému dvojitých elektrod při udržovacím potenciálu -60 mV. Mikroelektrody snímající napětí a průchod proudu byly vyplněny 3M KC1 a měly odpor 1 až 3 ΜΩ, měřeno ve standardním extracelulárním salinickém roztoku. Oocyty byly při teplotě místnosti (17 až 21 °C) kontinuálně promývány žabím Ringerem (120 mM NaCl, 2 mM KC1, 1,0 mM CaCl2, 5 mM HEPES pH 7,4) v množství 5 až 7 ml min^-1.

Všechna léčiva byla aplikována pomocí tohoto perfuzního systému. Steroidy (ΙΟ^-2 M) byly připraveny jako koncentrované zásobní roztoky buď v DMSO nebo ethanolu a pak byly ředěny Ringerovým roztokem na příslušnou koncentraci. Konečná koncentrace DMSO a ethanolu byla 0,2 % v/v, což je hodnota, která neměla žádný vliv na odpověď vyvolanou GABA. Zásobní roztoky všech ostatních léčiv byly připraveny v Ringerově roztoku. Membránové proudové reakce byly podrobeny filtraci nízkého průchodu při 100 Hz a zaznamenány pomocí přístroje FM (Racal Store 4DS) na magnetický pásek pro následnou analýzu.

Přínosy oproti progesteronu

Korelace mezi sníženými hladinami progesteronu a příznaky souvisejícími s PMS, PND a katameniální epilepsií (Backstrom a d., 1983; Dalton, K., 1984) vedly k používání progesteronu při jejich léčbě (Mattson a d., 1984, a Dalton, 1984). Progesteron však není při léčbě výše uvedených syndromů konzistentně účinný. Například pro progesteron neexistuje vztah dávkaodpověď při léčbě PMS (Maddocks a d., 1987). Tyto výsledky jsou předvídatelné, vezmou-li se v úvahu výsledky našich- studií in vitro, které demonstrují, že progesteron má velmi nízkou účinnost na komplex GR, jak je patrné z tabulky 1, v porovnání s určitými metabolity progesteronu.

Příznivý účinek progesteronu pravděpodobně souvisí s proměnnou konverzí progesteronu na aktivní metabolity progesteronu. Použití specifických metabolitů progesteronu při léčbě výše uvedených syndromů je jasně výhodnější než použití progesteronu vzhledem k vyšší účinnosti metabolitů a jejich derivátů (viz Gee a d., 1987, a tabulka 1).

Žádné hormonální vedlejší účinky

Bylo rovněž demonstrováno, že neuroaktivní steroidy nemají hormonální vedlejší účinky v důsledku nízké afinity pro progesteronové a jiné hormonální steroidní receptory. Data byla získána při testech prováděných postupy dříve popsanými v Gee a d., 1988 za účelem stanovení účinku metabolitů progesteronu a jejich derivátů a progestinu R5020 na vazbu [³H]R5020 na progesteronový receptor v krysí děloze (Gee a d., 1988).

³H-progesteron (0,15 nM) byl inkubován s cytosolem krysí dělohy v přítomnosti testovaných sloučenin. Po inkubaci byla stanovena specifická vazba a porovnána s kontrolní inkubací bez těchto sloučenin. Výsledky jsou vyjádřeny jako procento inhibice vazby. Váže-li se sloučenina na progesteronový receptor s vysokou afinitou, je možno při testované koncentraci očekávat 100% inhibici vazby. Neuroaktivní steroidy vykazují menší než 10% inhibici, což ukazuje, že jsou neaktivní jako progestenické prostředky.

Dále byly studovány různé hormonální aktivity reprezentativních neuroaktivních steroidů na základě testování jejich potenciálních estrogenních, mineralokortikoidových a glukokortikoidových aktivit. Tyto aktivity byly analyzovány monitorováním schopnosti sloučenin inhibovat vazbu steroidních hormonů na odpovídající hormonové receptory. Výsledky těchto experimentů jsou uvedeny ve zveřejněné přihlášce PCT, zveřejněné 4.3.1993 pod číslem WO 93/03732.

Výsledky těchto experimentů jasně ukazují, že neuroaktivní steroidy nemají silnou afinitu vůči žádnému z výše uvedených steroidních receptorů. Nelze u nich tedy předpokládat hormonální vedlejší účinky, které by z takovéto vazby na steroidní receptory vyplývaly.

Antikonvulsivní účinnost

Byly rovněž prováděny experimenty za účelem zjištění fyziologické relevance interakcí neuroaktivního steroidů a GABA receptoru hodnocením schopnosti sloučenin podle vynálezu zabraňovat metrazolem vyvolaným křečím u myší. Myším byly 10 min před injekcí metrazolu injekčně vstříknuty různé dávky testovaných sloučenin podle vynálezu. Pozorováním každé myši po dobu 30 min byla stanovena doba do nástupu myoklonie (přítomnost klonické aktivity předních končetin), vyvolané metrazolem. U kontrolních myší vyvolává metrazol (85 mg/kg) křeče u 95 % zvířat. Schopnost několika sloučenin podle vynálezu chránit myši před křečemi je uvedena v tabulce 2.

Tabo 2. AntimetrazolcvQ ákti/iia i heuroaktívollísteroidu u: PyFi

ho/ž-Á 1/	óexfe?	vehUsvá)	mg/kg	%
3 β-Cyclopropy leth i ny 1-3 a-hydroxy-5 fúpregnan-20onv	IP	50% hpbcd	10	87,5
3 a-Hydroxy-3 β-(3 '-methy l-buf-3-en-1 ~ rny 1>— 5 βpregnan-20-on	IP	50% hpbcd	10	100
3a-Hydroxy-5a-pregnan-20-on	IP	50% hpbcd	10	100
3 a-Hydroxy-3 β-methy 1-5 β-ρΓβ^3η-20-οηι	IP	rnikro rozt.	10	70
3 β-Etht ny 1-3 a-hydroxy-5 β-ρΓ6^Ηη-20-οη.	IP	50% hpbcd	10	100
3 β-Eth ínyl-3 a-hydroxy-19-nor^-pregnan-20-on	IP	50% hpbcd	10	87,5
3 β-( 1 -Hex fn y 1 )-3 a-hydroxy^-pregnan-20-on	IP	50% hpbcd	10	37,5
3 P-Ethenyl-3 a-hydroxy-5 P-pregnan-20-on	IP	50% hpbcd	10	87,5
3 a-Hydroxy-3 β-etb rny 1-5 a-pregnan-20-on	IP	50% hpbcd	10	87,5
3 a-Hydroxy-3 P-methyl-5 a-pregnan-20-on:	IP	50% hpbcd	10	100
Bis (3a,21-dihydroxy-3P-ethímyl-5P-pregnan-20-on ) 21-hemisujypinát	IP	50% hpbcd	10	37,5
3 a,21 -Dihydroxy-5a-pregnan-20-on-21 -acetát	IP	50% hpbcd	10	50
3a,21 -Dihydroxy-5a-pregnan-20-on (5a-THDOC)	IP	50% hpbcd	10	87,5
3a-Hydroxy-3P-trifluor methyl-19-nor-5P-pregnan-20on.	IP	50% hpbcd	10	100
3P-Eth6nyl-3a-hydroxy-5p-pregn-l l-en-20-on	IP	50% hpbcd	10	75
3a-Hydroxy-3P-(3'-methyl-but-3‘-en-r-/'nyl)-5a- pregnan-20-on	IP	50% hpbcd	10	87,5
3 a-Hydroxy-3 P-methyl-5a-I9-nor-pregnan-20-on	IP	mi&ro rozt.	10	37,5
3a,20a(S)-Dihydroxy-5a-pregnan;	IP	miAro rpzi,	10	30
3 P-Ethenyl-3 a-hydroxy-5a-pregnan-20-on-	IP	50% hpbcd	10	100
3a,21-Dihydroxy-5P-pregnan-20-on-21 -acetat·	IP	50% hpbcd	10	25

3a,20a-Dihydroxy-3P-methyl-5a-pregnan	IP	mifcro roií.	100	60
3α,21 -Dihydroxy-3 β-etM nyl-5(3-pregnan-20-oní- 21 hemisukeinat	IP	vodo	10	50
Bis (3 a,21-dihydroxy-3 β-trifluor mcthyl-5(Lpregnan20-one) 21-hemisu.kcinát	IP	50% hpbcd	10	25
3 a-Hydroxy-3 β-fluor methyl-5a-pregnan-20-om	IP	50% hpbcd	10	14,3
3a,21 -Dihydroxy-3p-methyl-5a-pregnan-20-on~21 kemisukcinat,, sodMÍ sdl	IP	miiro rozt >	10	11,11
3 a-Hydroxy-3 β-trifluor ?tnethyl-5p-prcgnan-20-oní	IP	50% hpbcd	10	62,5
3 a,21 -Dihydroxy-3 β-ethí nyl-5P-pregnan-20-on·	IP	50% hpbcd	10	18,8
3 a,21 -Dihydroxy-3 β-methy l-5a-pregnan-20-on* 21 kemisuUcinat:	IP	voda	10	37,5
3 a-Hydroxy-3 β-trifluormethy 1-5 a-pregnan-20-on	IP	50% hpbcd	10	62,5
3 aj1 -ϋϋ^<ΐΓθχγ-3β-β·ίfluor methyl-19-ηοΓ-5βpregnan-20-OR	IP	50% hpbcd	10	118,8
3 aj 1 -Dihydroxy-5a-pregnan-20-on~21 hemisukeinít;, sodn^Z sůl	IP	vodq	60	100
3 a-Hydroxy-3 β-trifluor 'methyl-19-nor-5 a-pregnan20-on	IP	50% hpbcd	10	25
3 a,21 -Dihydroxy-3 β-eth; nyl-5fl-pregnan-20-on - 21acetát	IP	50% hpbcd	10	62,5
3a,2I-Dihydroxy-3P-methyl-5a-pregnan-20-on	IP	50% hpbcd	10_	87,5
3a,21-Dihydroxy-3P-methyl-5a-pregnan-20-on- 21acetaí	IP	mikro roťt	10	10
3a,21-Dihydroxy-3{V-trifluor!, methyl-5P-pregnan-20on’	IP	50% hpbcd	10	50
3 a,21 -Dihydroxy-3 p-trifluoromethyl-5P-pregnan-20on - 21-acetát.	IP	50% hpbcd	10	62,5
3 a-Hydroxy-3 β-trifluor methyI-5 β-19-nor-pregn17(Z)-en:	IP	50% hpbcd	10	25
3a,20-Dihydroxy-3p,20-dimethyl-5p-pregnan	IP	mikro rO2,t.	10	22,2
3a,20a-Dihydroxy-3P,21-dimethyl-5a-pregnan	IP	dmso	10	0
3a,21-Dihydroxy-3P-trifluor methyl-19-ηοΓ-5βpregnan-20-om- 21-hemisukifinát>,. sodř^-Seí	IP	VWč?	10	50
3 a,21-Dihydroxy-3 β-eth řnyl-5P-pregnan-20-on,~21 hemisukcinat, sod^sák	IP	Vodí!	10	50
3a,21 -Dihydroxy-3P-trifluor, methy!-5p-pregnan-20one-21 hemifumarátj sodnři' syl	IP	vooL·}	10	50

3a,21-Dihydroxy-3p-fluormethyl-5a-pregnan-20-on	IP	50% hpbcd	10	25
3a, 21-Dihydroxy-3p~trif luormethyl-sp-pregnan^Oon^ 1-hemisukcinát	IP	voda	10	50
3a,20p-Dihydroxy-3p-ethinyl-5p-pregnan	IP	50% hpbcd	10	25
3a, 21-Dihydroxy-3p-trifluormethyl-5p-pregn.án-20on-21-hemisukcinát, sodná sůl	IP	voda	10	62,5
3a,20p-Dihydroxy-3p-ethinyl-5a-pregnan	IP	50% hpbcd	10	37,5

Schopnost neuroaktivních steroidů chránit zvířata proti jiným chemickým konvulsivům byla dále demonstrována pro 3ahydroxy-5a-pregnan-20-on, 3a,21-dihydroxy-5a-pregnan-20-on a 3a-hydroxy-3p-methyl-5p-pregnan-20-on. Antikonvulsivní testy jsou podobné, jak uvedeno výše. Další chemická konvulsiva jsou: metrazol (85 mg/kg), (+)bikukulin (2,7 mg/kg), pikrotoxin (3,15 mg/kg), strychnin (1,25 mg/kg) nebo vehikulum (0,9 % salinického roztoku). Bezprostředně po injekci konvulsiva nebo vehikula byly myši pozorovány po dobu 30 až 45 min. Byl zaznamenáván počet zvířat s tonickými a/nebo klonickými křečemi. V testu maximálního elektrošoku byl k vyvolání tonické křeče po dobu 200 ms zaváděn korneálními elektrodami proud 50 mA při 60 Hz. Schopnost sloučenin zrušit tonickou komponentu byla definována jako konečný bod. Celkový depresní potenciál CNS byl stanoven 10 min po injekci sloučenin pomocí testu s rotující tyčí, kdy byl stanoven počet myší zůstávajících po dobu 1 min v jednom ze tří pokusů na rotující (6 min^-1) tyči. Pro každý pokus byla stanovena hodnota ED₅₀ (dávka, při níž se projevuje poloviční účinek vzhledem k maximu) a je uvedena v tabulce 3. Výsledky demonstrují, že neuroaktivní steroidy jsou ve srovnání s jinými klinicky použitelnými antikonvulsivy vysoce účinné a mají profil podobný jako BZ klonazepam. Z těchto pozorování vyplývá terapeutická použitelnost těchto sloučenin jako modulátorů mozkové excitability, která je v souladu s jejich vysokou afinitou při interakci s komplexem GR in vitro.

Tabulka 3. Antikonvulsivní aktivita neuroaktivních steroidů podle vynálezu a vybraných známých antikonvulsiv u myší

EDso (mg/kg)

sloučenina	RR	MES	MTZ	BIC	PICRO	STR
3a5a(a)-P	30	28, 6	4,9	12,3	10, 2	> 300
5a-THDOC(a)	22,9	26,7	8,1	17,8	5, 6	> 300
3a-hydroxy-3p- methyl-5a-pregnan- 20-on(b)	2.4 6,2	> 100	6,3	61, 9	35, 4	> 100
klonazepam*	0,184	93	0,009	0,0086	0, 043	NP
fenobarbital*	69	22	13	38	28	95
fenytoin*	65	10	NP	NP	NP	**
progabid***	—	75	30	30	105	75
valproát*	426	272	149	360	387	293

Význam zkratek: RR (rotující tyč), MES (maximální elektrošok), MTZ (metrazol), BIC (bikukulin), PICRO (pikrotoxin), STR (strychnin), NP (žádná ochrana) ^<a) Rozpuštěno ve 20% hydroxypropyl-p-cyklodextrinu ve vodě. Steroidy byly podávány i.p. a konvulsiva s.c.

* Data o antikonvulsivech jsou z Swinyard & Woodhead, General principles: experimental detection, quantification and evaluation of anticonvulsants, in: Antiepileptic Drugs, D.M.

C.E. Pippenger (ed.), str. 111 (Raven

Woodbury, J.K. Penry a Press, New York), 1982.

^(b> Vehikulum obsahovalo % TWEEN 80 v salinickém ** Maximální ochrana 50

0,32 % hydroxypropylmethylcelulózy a 4 roztoku.

% při 55 až 100 mg/kg.

*** Chemická konvulsiva v progabidové studii byla podávána i.v., všechna data z Worms a d., Gamma-aminobutyric acid (GABA) receptor stimulation. I. Neuropharmacological profiles of progabide (SL 7 6002) and SL 75102, with emphasis on their anticonvulsant spectra, Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 220:660-671 (1982).

Anxiolytické účinky

Dále uvedené experimenty demonstrují, že metabolity progesteronu 3a-0H-5a-pregnan-20-on a 3a-OH-53-pregnan-20-on jsou účinnými anxiolytiky ve čtyřech zvířecích modelech lidské úzkosti, které měří behaviorální účinky anxiolytických sloučenin. Je však nutno upozornit, že tyto dvě sloučeniny jsou uvedeny pouze pro ilustraci. V tabulkách 4 až 6 jsou rovněž uvedena data o jejich syntetických derivátech. Jako zvířecí modely pro měření ' behaviorálních účinků anxiolytických sloučenin byly použity tyto čtyři testy: 1) test přechodu světlo/tma, 2) zvýšené křížové bludiště, 3) Geller-Seifterův konfliktový test a 4) Vogelův test.

a) Test přechodu světlo/tma

Test přechodu světlo/tma (Crawley a Goodwin, Pharmacol. Biochem. Behav. 13:67-70, 1980) je založen na poznatku, že hlodavci mají přirozený sklon zkoumat nové prostředí, ale mají odpor k otevřeným jasně osvětleným plochám, které jejich explorační chování brzdí (Christmas a Maxwell, Neuropharmacol. 9:17-29, 1980; Filé, J. Neurosci. Meth. 2:219-238, 1980). Bylo zjištěno, že různá klinicky používaná anxiolytika včetně diazepamu, klonazepamu a pentobarbitalu zvyšují počet přechodů mezi světlou a tmavou komorou, zatímco neanxiolytická léčiva tento behaviorální účinek nevykazují (Crawley a d., Neuropharmacol. 23:531-537 (1984)).

Harlan, čtyřech (Harlan, g byli po

Samci myší N.I.H. Swiss-Webster Indianapolis, IN) o hmotnosti 15 až 20 umístěni do polyethylenových klecí s pilinovou podestýlkou. Chovný prostor měl kontrolované prostředí (22 °C) s dvanáctihodinovým cyklem světlo/tma (0600-1800 h) . Potrava a voda byla kromě doby testu k dispozici ad libitum. Experimenty byly prováděny v době 0700-1500 h a skupiny byly vyrovnávány z hlediska vlivu denní doby. Myším bylo léčivo nebo vehikulum podáno jednou.

ΊΟ

Byla použita modifikace dříve popsaných metod (Wieland a d., Br. Res. 565:263-268 (1991)). Zařízení obsahovalo dvě automatizované zkušební komory po 2 odděleních (model RXYZCM16, Omnitech Electronics, Columbus, OH) . Otevřené oddělení bylo s uzavřeným oddělením spojeno průchodem 7,5 x 7,5 cm. Otevřené oddělení bylo jasně osvětleno pomocí 200 W žárovky. Experimentální prostor byl udržován v temnu. V obou odděleních bylo automaticky zaznamenáváno každé přerušení infračervených paprsků připojením na počítač přes zařízení Digiscan Analyzer (Omnitech Electronics) a data byla analyzována s použitím systému Lab Animal Monitoring System (Omnitech Electronics).

Myším N.I.H. Swiss-Webster bylo intraperitoneálně (IP) podáno vehikulum nebo testované léčivo a po 10 min byly umístěny do středu osvětleného oddělení. Během zkušební doby 10 min byl měřen počet přechodů mezi osvětlenou a tmavou komorou, celková aktivita v osvětlené komoře a doba strávená v osvětlené komoře.

Podávání 3a-0H-5a-pregnan-20-onu a 3a-OH-5P~pregnan-20-onu v testu přechodu světlo/tma poskytlo významnou závislost dávkaodpověď ve vztahu k počtu přechodů mezi tmavou a osvětlenou komorou. Post-hoc porovnání ukázalo, že počet přechodů při dávkách 3a-0H-5ct-pregnan-20-onu i 3a-0H-53-pregnan-20-onu byl při testovaných dávkách významně zvýšen oproti kontrole (Dunnettův t-test).

Jak 3a-OH-5a-pregnan-20-on, tak 3a-0H-5p-pregnan-20-on kromě toho vyvolal významné (p < 0,01) zvýšení aktivity při dávce 10 a 20 mg/kg ve srovnání s kontrolou (Dunnettův t-test). Při žádné testované dávce nebyly pozorovány významné rozdíly mezi oběma sloučeninami.

b) Zvýšené křížové bludiště

Teoretický základ testu se zvýšeným křížovým bludištěm je podobný jako u testu přechodu světlo/tma. Jak je popsáno v Pelow ad., J. Neurosci. Meth. 14:149-167 (1985), zvýšené křížové bludiště je konstruováno tak, že využívá přirozené averze myší k otevřeným prostorům. Zařízení je tvořeno dvěma otevřenými a dvěma uzavřenými rameny. Test se zvýšeným křížovým bludištěm umožňuje při dvou měřeních úzkosti zjišťovat počet vstupů do otevřených ramen a dobu strávenou v otevřených ramenech, vyjádřeno v obou případech jako procento celkového počtu vstupů a celkové strávené doby jak v otevřených, tak v uzavřených ramenech.

Samci myší N.I.H. Swiss-Webster (Harlan, Indianapolis, IN) o hmotnosti 15 až 20 g byli po čtyřech umístěni do polyethylenových klecí s pilinovou podestýlkou. Chovný prostor měl kontrolované prostředí (22 °C) s dvanáctihodinovým cyklem světlo/tma (0600-1800 h) . Potrava a voda byla kromě doby testu k dispozici ad libitum. Experimenty byly prováděny v době 07001500 h a skupiny byly vyrovnávány z hlediska vlivu denní doby. Myším bylo léčivo nebo vehikulum podáno jednou.

Byla použita dříve popsaná metoda (Lister, Psychopharmacol. 92:180-185 (1987)). Zařízení obsahovalo dvě otevřená ramena, kolmá ke dvěma uzavřeným ramenům, ve výšce 50 cm nad podlahou. Každé rameno mělo délku 50 cm a stěny uzavřených ramen měly výšku 40 cm. Bludiště bylo celé vyrobeno z černého plexiskla. Nad každým otevřeným ramenem byla umístěna 200 W žárovka k dosažení silného kontrastu mezi otevřenými a uzavřenými rameny.

Po 10 min od injekce byly myši N.I.H. Swiss-Webster umístěny do středu bludiště ve směru otevřeného ramene. Během 5 min zkušební doby byl měřen počet vstupů do otevřených a uzavřených ramen a doba strávená v otevřených a uzavřených ramenech. Aby byla závislá proměnná zaznamenána, musely být v příslušném rameni všechny čtyři tlapky. Proto se nepočítá doba strávená ve středu bludiště, takže celková doba strávená v otevřených a uzavřených ramenech nemusí být rovna 5 min.

V testu se zvýšeným křížovým bludištěm vykazuje jak 3a-0H5a-pregnan-20-on, tak 3α-ΟΗ—5β—pregnan—20—on při různých dávkách zvýšený poměr vstupů do otevřených ramen. 3α-ΟΗ-5αpregnan-20-on vyvolal významně zvýšený počet vstupů při 20 mg/kg (p < 0,05), zatímco 3a-OH-5p-pregnan-20-on vyvolal významné zvýšení počtu vstupů při 5 mg/kg (p < 0,05), 7,5 mg/kg (p < 0,01) a 10 mg/kg (p < 0,01).

3a-OH-5a-pregnan-20-on i 3α-OH-5β-pregnan-20-on dále vyvolávaly zvýšení doby strávené v otevřených ramenech v závislosti na dávce. 3a-0H-5a-pregnan-20-on vyvolal významné zvýšení doby strávené v otevřených ramenech při 10 mg/kg (p < 0,01), zatímco 3α-0H-5β-pregnan-20-on vyvolával významné zvýšení doby strávené v otevřených ramenech při 7,5 mg/kg (p < 0,01) a 10 mg/kg (p < 0,01).

Výsledky těchto experimentů jsou uvedeny v přihlášce PCT, zveřejněné jako WO 93/03732 4.3.1993. V tabulce 4 jsou shrnuty anxiolytické účinnosti sloučeniny podle vynálezu pomocí testu se zvýšeným křížovým bludištěm za výše uvedených podmínek.

Tabulka 4. Anxiolytická účinnost u myší ve zvýšeném křížovém bludišti

název	cesta	vehikulum	dávka mg/kg	% kontroly
3a-Hydroxy-3p-(3' -methylbut-3'-en-lřinyl)-5p-pregnan-20-on	IP	50% hpbcd	10	155
3a-Hydroxy-5a-pregnan-20-on	IP	50% hpbcd	20	143,7
3p-Ethinyl-3a-hydroxy-5p-pregnan-20-on	IP	50% hpbcd	1	186, 6
3p-Ethinyl-3a-hydroxy-19-nor-5p~pregnan20-on	IP	50% hpbcd	10	172
3p-Ethenyl-3a-hydroxy-5p-pregnan-20-on	IP	50% hpbcd	10	151
3(X-Hydroxy-3p-ethinyl-5a-pregnan-20-on	IP	50% hpbcd	10	213

Ts

3a-Hydroxy-3p-methyl-5a-pregnan-20-on·	IP	50% hpbcd	5	165,6
3 ap. 1 -Dihydroxy-5 a-pregnan-20-on+21 -acetati	IP	50% hpbcd	10	133
3 a-Hydroxy-3 β-tri fluor methyl-19-nor-5 p-pregnan-20on;	IP	50% hpbcd	10	173,8
3β-ΕΛ ínyl-3 a-hydroxy-5 β-pregn-11 -en-20-on	IP	50% hpbcd	10	233
3 a-Hydroxy-3 β-(3 ’-m ethy l-but-3'-en-1 '*;» nyl)-5 apregnan-20-ow	IP	50% hpbcd	10	141
3 β-Εΰιβηγ1-3 a-hydroxy-5 a-pregnan-20-on	IP	50% hpbcd	5	154,3
3 a^0a-Dihydroxy-3 β-methyl-S a-pregnan*	IV	mitro	10	174,5
3 a,21 -Dihydroxy-3 β-eth í ny 1-5 β-pregnan-20-on~21 hemisuiqinát	IP	50% hpbcd	10	164,2
Bis (3α,21^ϋ^Γθχγ-3β-Ιηί1ποΓΠΐεΐΙιγ1-5β-ρΓ6^3η20-on.) 21-hemisufecinát.	IP	50% hpbcd	10	92
3 a-Hydroxy-3 β-ί1υοππΐ6±γ1-5α-ρΓε^Ηη-20-οη	IP	50% hpbcd	20	150,7
3a-Hydroxy-3 β-trifluon-methy 1-5 β-ρΓβ^3η-20-οη.	IP	50% hpbcd	20	197,6
3 a,21 -Dihydroxy-3 β-εΛ?'ιηγ1-5β-ρ^ηαη-20-οη	IP	50% hpbcd	10	162
3 a,21 -Dihydroxy-3 β-tri flu or.tn e thy I-19-ηθΓ-5βpregnan-20-on	IP	50% hpbcd	10	140
3a-Hydroxy^-trifluormethyl-19-nor-5a-pregnan-20- on	IP	50% hpbcd	10	161
3 a,21 -Dihydroxy-3 β-ethíny l-5P-pregnan-20-on + 21 acetat-'	IP	50% hpbcd	10	159
3a,21-Dihydroxy-3P-trifluor.Tnethyl-5p-pregnan-20-on	IP	50% hpbcd	10	237
3 β-Eth 1 nyl-3 a-hydroxy-5 β-pregnan-11,20-dion	IP	50% hpbcd	5	235,9
3a,21-Dihydroxy-3P-trifluor rnethyl-5P-pregnan-20on - 21 -acetat	IP	50% hpbcd	5	143,3
3a-Hydroxy-3 β-trifluor methyt-5P-pregnan-11,20-dion	IP	50% hpbcd	10	112
3a,20a-Dihydroxy-3P,21-dimethyI-5a-pregnan	IP	dmso	10	73
3a,21 -Dihydroxy-3β-trifluon .methyl-19-ηοΓ-5βpregrfan-20-on-21-hemisuApinát , sodrttf' spí.	IP		20	161,1
3a,21 -Dihydroxy-3P-eth ínyl-5p>-pregnan-20-on-21 hemisu Aeinatj sodwt'su|.	PO	y/pofa	10	159
3a,21 -Dihydroxy-3P-trifluor methyI-5P-pregnan-20-on 21 hemifumarat, sodn«( sák	IP	W.dpt	50% hpbcd	126

3a,21-Dihydroxy-3p-fluormethyl-5a-pregnan-20-on	IP	50% hpbcd	10	109
3a,20b-Dihydroxy-3p-ethinyl-5P~pregnan	IP	dmso	10	178
3a,21-Dihydroxy-3p-trifluormethyl-5p-pregnan-20on-21-hemisukcinát, sodná sůl	IP	voda	20	172,8

c) Geller-Seifterův konfliktový test

Tento zviřeci model lidské úzkosti používá ke zjištění anxiolytických vlastností léčiv podmíněný stav konfliktu u krys. Krysy se pro pozitivní posílení navykají na stlačování páky dvěma způsoby (Geller a Seifter, Psychopharmacologia 1:482-492 (1960)). První spočívá ve stlačování páky v proměnlivém schématu bez potrestání. Druhou složkou je pevné schéma, kdy po každém stlačení páky následuje pozitivní posílení a potrestání. Trestaná složka vyvolává u zvířete stav konfliktu. Netrestaná složka umožňuje pozorovat u léčiva veškeré účinky potlačující odpověď. Anxiolytická odpověď by měla zvýšit trestanou odpověď bez ovlivnění netrestané odpovědi.

Pro konfliktové experimenty byli použiti albiničtí samci krys Sprague-Dawley (Charles River Labs, Wilmington, MA) o hmotnosti 250 až 300 g, kteří byli udržováni na omezené dietě pelet Purina Lab Chow s kdykoli dostupnou vodou za účelem udržení tělesné hmotnosti na 85 % z hodnoty odpovídající mladému dospělci s volným přístupem k potravě. Krysy byly umístěny jednotlivě ve dvanáctihodinovém cyklu světlo-tma se světlem zapnutým v době 0700-1900.

U krys byly pomocí Geller-Seifterova (1960) konfliktového testu měřeny protiúzkostné (zmenšující potrestání) a odpověď potlačující účinky 3a-0H-5a-pregnan-20-onu a 3a-0H-5a-pregnan20-onu. Během tohoto 63min testu provádějí hladové krysy odpověď spočívající ve stlačení páky, aby získaly odměnou slazené mléko. Posilovači schéma spočívá v trestané a netrestané složce, střídající se přibližně každých 15 min.

Krysy byly navykány ve zkušebních komorách (Coulborn Instruments), opatřených pákou upevněnou na jedné stěně, dávkovačem 0,1 ml mléka (1 díl kondenzovaného mléka Eagle, 2 díly vody) jako odměny a podlahou z kovového roštu, kterou byl udělován šok do nohou jako trest. Pro programování a zápis byl použit minipočítač DEC PDP 11/73 se systémem SKED.

Krysy byly nejprve navykány na odpověď ve schématu trvalého posilování a pak rychle přešly na schéma s proměnnými intervaly (VI) 30 s, 1 min a 2 min. Ve schématu trvalého posilování dostávaly krysy mléko po každém stlačení páky; ve schématech VI bylo mléko k dispozici v řídkých a proměnlivých intervalech, nakonec v průměru jednou za 2 minuty. Pak byly v netrestané základní linii VI zavedeny čtyři 3min „konfliktní doby; první byla zahájena po 3 min průběhu VI a ostatní se střídaly mezi 12min obdobími odpovědí VI. Během konfliktních dob, které byly signalizovány světlem a zvukem, bylo opět platné schéma trvalého posilování a každé stlačení páky vedlo současně k výdeji mléka a ke krátkému (0,25 ms) trestu šokem do nohou. Intenzita šoku byla původně 0,2 mA a denně byla zvyšována o 0,02 mA za účelem postupného potlačení odpovědí tvořených stlačováním páky na 5 nebo méně během konfliktní doby. Toto navykání trvalo 4 až 6 týdnů a po této době byl pozorován stabilní nízký počet odpovědí během konfliktního období a stabilní vysoký počet odpovědí v netrestaném období. Léčivem vyvolané zvýšení počtu trestaných odpovědí bylo vzato jako index anxiolytické účinnosti, zatímco snížení počtu netrestaných odpovědí byla vzato jako index potlačení odpovědi nebo uklidnění.

Dále jsou shrnuty účinky 3cc-0H-5a-pregnan-20-onu a 3a-0H5P~pregnan-20-onu v konfliktovém testu. Obě sloučeniny vyvolaly velké zvýšení počtu trestaných odpovědí, z čehož vyplývá, že obě budou účinné jako protiúzkostné prostředky. Vrchol účinku 3a-OH-5P~pregnan-20-onu byl pozorován při 2 mg/kg a u 3α-0Η-5αpregnan-20-onu při 4,4 mg/kg po subkutánní aplikaci. (Pro statistickou analýzu a z důvodu malého počtu testů při každé dávce byly všechny testy pro každou sloučeninu spojeny pro porovnání oproti kontrolním testům s vehikulem a pro příbuzná měření byl použit t-test: pro 3a-0H-5a-pregnan-20-on p < 0,02, pro 3ot-OH-5p-pregnan-20-on p < 0,008).

V tabulce 5 je uveden souhrn anxiolytických aktivit sloučenin podle vynálezu zjištěných pomocí Geller-Seifterova testu za výše uvedených experimentálních podmínek.

Tabulka 5. Anxiolytická účinnost u krys v Geller/Seifterově testu

sloučenina	cesta	vehikulum	dávka mg/kg	Geller/ Seifter % kontroly
3a-Hydroxy-5p-pregnan-20-on	sc	50% hpbcd	2	860,5
3a-Hydroxy-5a-pregnan-20-on	sc	50% hpbcd	5	471,8
3p-Ethinyl-3a-hydroxy-5p-pregnan-20-on	sc	50% hpbcd	2	751,1
3a-Hydroxy-3p-ethinyl-5a-pregnan-20-on	sc	50% hpbcd	8	830,2
3a-Hydroxy-3p-methyl-5a-pregnan-20-on	sc	50% hpbcd	4	1384,6
3a-Hydroxy-3p-trifluormethyl-19-nor-5p~ pregnan-20-on	SC	50% hpbcd	4	1073,1
3P-Ethenyl-3a-hydroxy-5a-pregnan-2 0-on	po	50% hpbcd	12	1092,3
3a-Hydroxy3p-f luorirLethyl-5a-pregnan-20“ on	sc	50% hpbcd	8	1005
3a-Hydroxy-3p~trif luontiethyl-5p-pregn-llen-20-on	sc	50% hpbcd	4	508,3
3a-Hydroxy-3p-trifluormethyl-5p-pregnan20-on	sc	50% hpbcd	4	663,2
3a,21-Dihydroxy-3p~trifluonaethyl-5ppregnan-20-on	sc	50% hpbcd	16	982,4
3a-Hydroxy-3p-trifluonaethyl-5p-19norpregn-17(20)-en	sc	50% hpbcd	16	1130,3
prekursory	cesta	vehikulum	dávka mg/kg	Geller/ Seifter % kontroly
3a, 21-Dihydroxy-3p-trifluormethyl-5ppregnan-20-on-21-acetát	SC	50% hpbcd	8	882,8
3a,21-Dihydroxy-3p-ethinyl-5p-pregnan-20on-21-hemi suk cinát	Po	voda	16	1350,0
3a,21-Dihydroxy-3p-trifluormethyl-5p~ pregnan-20-on-21-hemisukcinát, sodná sůl	P°	voda	8	840,0
3a,21-Dihydroxy-3p-trifluormethyl-5p-19norpregnan-20-on-21-hemisukcinát, sodná sůl	po	voda	8	2493,4

3a-Hydroxy-3β-methy1-5a-pregnan-2 0-spiro-	SC	50%	16	900,0
2'-(1'3'-thiazolidin-4'-karboxylová kyselina)		hpbcd

d) Vogelův test

Vogelův test je založen na vývoji konfliktu mezi vysoce motivovaným chováním a averzí. Silnou motivací je v tomto testu žízeň. K vyvolání motivace k napití je zvíře na 12 až 16 h zbaveno přístupu k vodě. Během výcvikového období jsou zvířata vystavena zkušebním podmínkám, takže si zvyknou na picí žlábek a minimalizují strach z nového prostředí. Po výcviku se zvířatům umožní na 2 h přístup k vodě. Během této doby zvířata zkonzumují normální množství vody a potravy jako kompenzaci za dobu bez přístupu k vodě. Toto schéma však přesto vyvolává silnou motivaci k pití během doby pokusu.

Zvíře, které bylo zbaveno přístupu k vodě po dobu 12 až 16 h, se umístí do zkušební klece, kde se nechá volně pít po dobu 5 min. Tato doba slouží ke zvyknutí zvířete na prostředí a na picí žlábek. Po výcvikové době mají zvířata přístup k vodě a potravě ve své domovské kleci po dobu 2 h. Potrava je k dispozici stále. Po 24 h se zvířeti intracerebroventrikulárně podá léčivo.

Po uvedené prodlevě počínaje dobou injekce se zvíře opět umístí na 10 min do zkušební klece. Počítač zaznamenává každé olíznutí zvířete a po každém dvacátém olíznutí udělí mírný elektrický stimul na jazyk a/nebo nohy. Elektrický stimul je tvořen proudem 0,6 mA o délce 100 ms. Tento postup vyvolá u zvířete stav konfliktu, který je redukován podáním klinicky používaných anxiolytik (tj . valia). Pro získání křivek dávkaodpověď se různým skupinám zvířat injekčně vpravují zvyšující se dávky testovaného léčiva a ve stanovenou dobu se testují.

Data z těchto měření pro některé sloučeniny jsou shrnuta v tabulce 6.

reprezentativní

Tabulka β. Anxiolytická účinnost u krys ve Vogelově testu

sloučenina	cesta	vehikulum	dávka mg/kg	Vogel % kontroly
3a,20a-Dihydroxy-2p-isopropoxy-5a-pregnan	i.c.v.	g-CD	10 μg	169,0
3a,20-Dihydroxy-20-methyl-5a-pregnan	i.c.v.	g-CD	20 gg	179,0
3a,2 Oa-Dihydroxy-21-methyl-5a-pregnan	i.c.v.	g-CD	10 gg	157,9
3a,20a(S)-Dihydroxy-5a-pregnan	i.c.v.	b-CD	10 gg	193, 0
3a-Hydroxy-5a-pregnan-20-on	i.c.v.	b-CD	10 gg	431,1
3a,20a-Dihydroxy-5p-pregnan	i.c.v.	g-CD	10 gg	283,3
3p-Fluor-3a,20a-dihydroxy-5a-pregnan	i.c.v.	g-CD	20 gg	264,9
3a,20a-Dihydroxy-21-ethyl-5a-pregnan	i.c.v.	g-CD	20 gg	225,8
3a, 20p-Dihydroxy-5p~pregnan	i.c.v.	g-CD	20 gg	267,3

Prekursory

Antikonvulsivní a anxiolytická aktivita prekursorů základních sloučenin 3a-hydroxy-5a-pregnan-20-onu a 3a,21dihydroxy-5a-pregnan-20-onu a jejich derivátů byla hodnocena stejným postupem, jaký je popsán výše. Po podání sloučenin bylo vyneseno procento ochrany několika prekursory 3a-hydroxy-5apregnan-20-onu proti metrazolem vyvolaným křečím proti času (tabulka 7).

Bylo testováno ještě několik dalších prekursorů a výsledky jsou uvedeny v tabulce 8. Modifikace základních sloučenin 3ahydroxy-5a-pregnan-20-onu a 3a,21-dihydroxy-5a-pregnan-20-onu na hydroxylech 3a a 21 různými estery zachovává jejich biologickou aktivitu a v některých případech tato modifikace vedla k prodloužení doby ochrany poskytované sloučeninou. Sloučeniny podle vynálezu tedy mohou být modifikovány, aby poskytovaly po určitou dobu antikonvulsivní a anxiolytickou účinnost s různým stupněm ochrany.

Tabulka 7. Anti-metrazolová účinnost prekursorových esterů 3ahydroxy-5a-pregnan-20-onu (3a- (RCOO)-5a-pregnan-20-onu

R	% ochrany 60 mg/kg 1 h, IP
methyl	25
ethyl	75
propyl	75
butyl	33
2-propyl	75
4-heptyl	16 (4 h)
cyklobutyl	17
fenyl	33
4-chlorfenyl	50
4-methoxyfenyl	17
3-pyridyl	50 (20 h)
3-(1-methyl-l,4-dihydroypridinyl)	63 (20 h)

Na rozdíl od benzodiazepinů mohou neuroaktivní steroidy také vyvolávat anestesii. Má se za to, že jejich schopnost vyvolávat anestesii je důsledkem jejich schopnosti otevřít chloridový kanálek v nepřítomnosti GABA, kteroužto vlastnost benzodiazepiny nemají. Neurosteroidy mohou proto působit přímo v nepřítomnosti GABA na receptorů a také „nepřímo v přítomnosti GABA. Toto „nepřímé působení se nazývá „modulace receptorů; Lambert a d., Trends Pharmacology Science 8:224-227 (1987).

Sloučeniny podle vynálezu mohou být používány rovněž pro anestetické indikace ve vysokých dávkách. Výhodným způsobem zavedení anestesie je však intravenózní aplikace (i.v.). Anestetické vlastnosti léčiva se zjišťují u zvířat na základě schopnosti léčiva vyvolat ztrátu vzpřimovacího reflexu. Ztráta vzpřimovacího reflexu je definována jako neschopnost zvířete vzpřímit se do 30 sekund po položení na záda. Léčivo bylo aplikováno myším i.v. do boční ocasní žíly. Po podání byly myši položeny na záda a sledovány. Ilustrativní výsledky jsou uvedeny v tabulce 8.

Tabulka 8. Anestetická účinnost neuroaktivních steroidů u myší

sloučenina	cesta	vehikulum	dávka mg/kg	ztráta vzpřimo- vacího reflexu
3a, 21-Dihydroxy-3p-ethinyl-5p-pregnan-20on	iv	20% cremophor	10	100
3β-(Chlorethinyl-3a-hydroxy-5p-pregnan20-on	iv	mikronizačni roztok	20	100
3p-Ethinyl-3a-hydroxy-5p-pregnan-20-on	iv	10% hpbcd	30	100
3a-Hydroxy-3p-methyl-5a-pregn-16-en-20-on	iv	mikronizačni roztok	50	100
3a-Hydroxy-5a-pregn-9-en-20-on	iv	mikronizačni roztok	10	100
3a-Hydroxy-17(20)(Z)-methoxymethylen-19nor-5a-androstan	iv	mikronizačni roztok	5	75
3a-Hydroxy-3p-methyl-5p-pregnan-20-on	iv	mikronizačni roztok	2,5	100
2p-Ethoxy-3a-hydroxy-5a-pregnan-20-on	iv	20% cremophor	5	100
2β-Fluor-3a-hydroxy-5a-pregnan-2 0-on	iv	mikronizačni roztok	5	100
3a-Hydroxy-3p-methyl-21-methoxymethyl-5a- pregnan-20-on	iv	mikronizačni roztok	20	100

Výše jsou popsána a osvětlena výhodná provedení, avšak bez překročení rozsahu vynálezu je možno provést jejich různé náhrady a modifikace. Je tedy nutno zdůraznit, že vynález je popsán pouze ilustrativním, a nikoli omezujícím způsobem.

Claims (16)

1. Sloučenina, vybraná ze skupiny zahrnující j

9 R u ς

3a-hydroxy-3p-(3^ř-methylbut-3'-en-1'-inyl)-δβ-pregnan-^O-on,

Γ o

3α-ϊιγάΓθχγ-3β- (3' -methylbut-3' -en-1' -inyl) -5a-pregnan-2.Q^©^;-™3™_,

3α-1ιγάΓοχγ-3β-1ηίί:1ηοηιη.β1]Ίγ1-5α-ρηβρηΒη-20-οη,

3α-1νΛ}ηοχγ-3β-1;ΓΪ:εΐυοπηθ11·ϊγ1-5β-ρηβρη-11-θη-20-οη_ζ

3α, 21-άί1ογάηοχγ-3β-·|;Γυ:1ποπηθί}Ίγ1-19-ηοη-5β-ρηβρηηη-20-οη,

3β- (cyklopropyl) βίΐΊ.ΐηγ1-3α-Ιιγάηοχγ-5β-ρηβρηηη-20-οη,

3α, 20α-ύίύγύΓοχγ-3β-θ1ύίηγ1-5α-ρΓθρη3η_ζ

3α, 21-άί]Ί^ηοχγ-3β-θ11ΐθηγ1-5α-ρηθρηηη-20-οη a

3α, 21-dihydroxy-3β-fluormethyl-5α-pregnan-20-on nebo jejich fyziologicky přijatelné 3-estery, 20-estery, 3,20diestery nebo 3, 21-diestery...

2. Sloučenina, vybraná ze skupiny zahrnující sodnou sůl 3a, 21-dihydroxy-3β-trifluorπιethyl-19-nor-5β-pregnan20- on-21-hemisukcinátu,

3a, 20a-dihydroxy-21-methyl-5a-pregnanbishemisukcinát,

3α, 21^ίύγάηοχγ-3β-βίϊιβηγ1-5α-ρηθρη3η-20-οη-21-1ιβιηΪ3η^ϊηέ1,

3a, 21-dihydroxy-3β-methyl-5a-pregnan-20-on-21-acetát, sodnou sůl 3a, 21-dihydroxy-3β-trifluorItιethyl-5β-pregnan-20-on21- hemifumarátu,

3a, 21-dihydroxy-3β-trifluormethyl-5β-pregnan-20-on-methyl-21sukcinát,

3α, 21^ϊ1ιγάηοχγ-3β-ίηίί1ηοπη.θ1ΐΊγ1-5β-ρΓβρη3η-20-οη-21propionát, bis(3a,21-dihydroxy-3β-trifluormethyl-5β-pregnan-20-on)-21hemisukcinát, bis(3α, 21-dihydroxy-33-ethinyl-5p-pregnan-20-on)-21hemisukcinát a

N-(3a-hydroxy-3p-methyl-5a-pregnan-20-ylidin)ethanolamin.

3. Sloučenina podle nároku 1, kterou je 3a-hydroxy-3p-(3'methylbut-3'-en-1'-inyl)-5p-pregnan-20-on.

4. Sloučenina podle nároku 1, kterou je 3a-hydroxy-33trifluormethyl-5a-pregnan-20-on.

5. Sloučenina podle nároku 1, kterou je 3a-hydroxy-3p~ trifluormethyl-53-pregn-ll-en-20-on.

6. Sloučenina podle nároku 1, kterou je sodná sůl 3a,21dihydroxy-3p-trifluormethyl-19-nor-5p-pregnan-20-on-21hemisukcinátu.

7. Sloučenina podle nároku 1, kterou je 3a,21-dihydroxy3p-trifluormethyl-19-nor-5p-pregnan-20-on.

8. Sloučenina podle nároku 1, kterou je 3β(cyklopropyl)ethinyl-3a-hydroxy-5p~pregnan-20-on.

9. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství sloučeniny podle kteréhokoli z nároků 1 až 8 a farmaceuticky přijatelný nosič nebo ředidlo.

10. Způsob léčení stresu nebo úzkosti u živočišného subjektu, vyznačující se tím, že se subjektu podává účinné množství sloučeniny podle kteréhokoli z nároků 1 až 9.

11. Způsob zmírňování záchvatové aktivity u živočišného subjektu, vyznačující se tím, že se subjektu podává účinné množství sloučeniny podle kteréhokoli z nároků 1 až 8.

12. Způsob snižování nebo zmírňování nespavosti u živočišného subjektu, vyznačující se tím, že se subjektu podává účinné množství sloučeniny podle kteréhokoli z nároků 1 až 8.

13. Způsob léčení poruch nálady u živočišného subjektu, vyznačující se tím, že se subjektu podává účinné množství sloučeniny podle kteréhokoli z nároků 1 až 8.

14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že poruchu nálady představuje deprese.

15. Způsob léčení PMS nebo PND u živočišného subjektu, vyznačující se tím, že se subjektu podává účinné množství sloučeniny podle kteréhokoli z nároků 1 až 8.

16. Způsob vyvolání anestesie u živočišného subjektu, vyznačující se tím, že se subjektu podává účinné množství sloučeniny podle kteréhokoli z nároků 1 až 8.

PV: 1553-97.CZ

Způsoby, přípravky a sou ceniny pro modulaci komplexu GAGA_A receptor- chloridový ionofor ke zmírňování stresu, úzkosti, záchvatů, poruch nálady, PMS a PND a k vyvolávání anestesie.