PL182414B1 - Kompozycja do zabezpieczania zywej tkanki ssaka przed uszkodzeniem PL - Google Patents

Abstract

1. Kompozycja do zabezpieczania zywej tkanki ssaka przed uszkodzeniem na skutek wystawienia na dzialanie powstajacego wolnego rodnika hydroksylowego powstajacego po przywróceniu przeplywu plynu do organu ciala po ograniczeniu doplywu krwi do tego organu, znamienna tym, ze zawiera skuteczna ilosc przynajmniej jednej desferriegzocheliny o wzorze: gdzie R1 jest wybrany z grupy zlozonej z (CH2)nCOOCH3 i (CH2)xCH=CH(CH2)yCOOCH3, przy czym N jest od 1 do 7, a x+y jest od 1 do 5, zas R3 jest wybrane z grupy zlozonej z H i CH3, przy czym wymienione desferriegzocheliny maja ciezar czasteczkowy od okolo 716 do okolo 826 daltonów. 5. Kompozycja do chronienia przed uszkodzeniem zywej tkanki ssaka przy powstawaniu, za posrednictwem jonów, rodników karboksylowych, znamienna tym, ze zwiera skuteczna ilosc przynajmniej jednej desferriegzocheliny o wzorze: (jak wyzej) gdzieR1 jest wybrany z grupy zlozonej z(CH2)NCOOCH3 i (CH2)xCH=CH(CH2)yCOOCH3,przy czym N jest od 1 do 7 ,a x+y jest od 1 do 5, zas R3 jest wybrane z grupy zlozonej z H i CH3, przy czym wymienione desferriegzocheliny maja ciezar czasteczkowy od okolo 716 do okolo 826 daltonów. 6 Kompozycja do dostarczania ssakowi skutecznych ilosci aktywnego zwiazku w celu traktowania stanu medycznego, zna- mienna tym, ze zawiera zwiazek o wzorze: gdzie R 1 jest czastka chemiczna wybrana z grupy zlozonej z (CH2)nCH3, (CH2)nCOOH, (CH2)nCOOR, a R jest grupa alkilowa i (CH2)n ONH2; R2 jest czastka chemiczna podstawiona w dowolnym z 4 otwartych miejsc na pierscieniu, przy czym ta czastka chemiczna............ PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest kompozycja do zabezpieczania żywej tkanki ssaka, zwłaszcza struktura chemiczna dotychczas nie zidentyfikowanego szeregu wiążących żelazo związków o silnym powinowactwie, nazwanych przez poprzednio badających je egzochelinami, które są wydzielane przez prątki. Wynalazek dotyczy również modyfikacji tych nowo zidentyfikowanych związków w celu zmienienia ich właściwości fizjologicznych i zastosowań tych nowo zidentyfikowanych i zmodyfikowanych związków.

W ostrym zawale mięśnia sercowego tkanka serca jest uszkadzana przez dwa kolejne zdarzenia, niedotlenienie w fazie niedokrwienia i uszkodzenie oksydacyjne w fazie reperfuzji. Mięsień serca uszkodzony w fazie niedokrwienia może być ratowany przez ponowne doprowadzenie krwi do obszaru niedokrwionego. Jednakże reperfuzja może spowodować uraz w wyniku reakcji zapalnej w reperfundowanej tkance na skutek migracji leukocytów w tę tkankę i wytwarzania reaktywnych postaci tlenu. Jedną z najbardziej reaktywnych postaci jest postać hydroksylowa (·ΟΗ), która jest wytwarzana w obecności żelaza i która powoduje śmierć komórki. Zapobieganie powstawaniu (·ΟΗ) będzie chronić przed śmiertelnym uszkodzeniem komórki z tego powodu. Wiadomo, że powstawanie (»OH) zależy od obecności wolnego żelaza i że chelatory żelaza będą chronić przed uszkodzeniem reperfuzyjnym. Przykładowo, chelator żelaza w postaci deferoksaminy, kiedy jest podany przed reperfuzją chroni przed urazem i zmniejsza rozległość zawału mięśnia sercowego podczas zamknięcia tętnicy wieńcowej i reperfuzji. Jednakże uraz reperfuzyjny następuje szybko po wznowieniu przepływu krwi do niedokrwionego mięśnia sercowego.

Powstawanie rodnika (·ΟΗ) zależy od obecności wolnego żelaza; chelatory żelaza mogą usuwać wolne żelazo i czynić je niedostępnym dla katalizowania powstawania rodnika hydroksylowego. Jednakże te znane dotychczas materiały chelatujące żelazo albo nie chronią przed wytwarzaniem (·ΟΗ) przez reakcję Fentona (tj. EDTA), albo wchodzą zbyt wolno w komórki (tj. deferoksamina), tak że nie są dostępne ilości wystarczające do dostatecznie szybkiego działania w celu chelatowania wystarczaj ącej ilości żelaza, by uniemożliwić powstawanie (·ΟΗ) i w rezultacie uszkodzenie komórek. Deferoksamina okazała się skuteczna, jeżeli podaje się ją przed wystąpieniem zawału mięśnia sercowego, ale jest nieskuteczną jeśli poda się ją przy lub po rozpoczęciu reperfuzji.

Podobne uszkodzenie tkanki serca może nastąpić w wyniku zastosowania przepływu omijającego, takiego jak podczas zabiegu chirurgicznego na otwartym sercu, lub w innych organach ciała, kiedy zostająone pozbawione natlenowanej krwi w wyniku zabiegu chirurgicznego lub urazu.

Egzocheliny zostały w skrócie opisane, a ich ogólne działanie w rozwoju prątków omówione przez: Macham, Ratledge i Barclay z Uniwersytetu w Hull w Anglii (Lionel P. Macham, Colin Ratledge i Jennifer C. Nocton, „Extracellular Iron Acąuisition by Mycobacteria: Role of the Exochelins and Evidence Against the Partipitation of Mycobactin”, Infection and Immunity, Vol. 12, nr 6, s. 1242-1251, grudzień 1975; Raymond Barclay i Colin Ratledge, „Mycobactins and Exochelins of Mycobacterium tuberculosis, M. bovis, M. africanum and Other Related Species”, Journal of General Microbiology, 134, 771-776, (1988); L.P. Macham i C. Ratledge, „A New Group of Water-soluble Iron-binding Compounds from Mycobacteria: The Exochelins”, Journal of General Microbiology, 89, 379-282, (1975)). Machem zidentyfikował istnienie substancji znajdowanej w płynie pozakomórkowym, którą nazwał egzocheliną. Opisał egzochelinę jako rozpuszczalny w wodzie i chloroformie związek, który ma zdolność chelatowania wolnego

182 414 żelaza. Według Machama materiał ten ma podobieństwa do mikobaktyny, która jest zlokalizowana w ściance komórkowej i służy do przenoszenia żelaza do wnętrza komórki. Jednakże, w odróżnieniu od niego, mikobaktyna jest lipofilową, nierozpuszczalną w wodzie molekułą, która nie ma możliwości dyfundowania w środowisko pozakomórkowe i asymilowania z niego wolnego żelaza. Macham i inni rozpoznali, że egzochelinaprzy fizjologicznym pH powoduje oddzielanie żelaza od innych przenoszących żelazo związków w surowicy, takichjak transferyna lub ferrytyna, i daje żelazo w postaci nadającej się do przenoszenia do mikobaktyny. Macham i inni nie wyizolowali ani nie oczyścili egzochelin, ale zidentyfikowali je jako pięcio- lub sześciopeptydy o ciężarze cząsteczkowym 750-800, zawierające 3 moleε-Ν-hydroksylizyny, εΝ-acetylo-eN-hydroksylizyny lub εΝ-hydroksyomityny i 1 mol treotoniny. Ponadto, w zależności od bakteryjnego źródła egzocheliny odkrył on, że molekuły mogą również zawierać β-alaninę lub kwas salicylowy.

Barclay (ibid.) opisał wytwarzanie egzochelin z dwudziestu dwóch różnych szczepów M. tuberculosis i pokrewnych gatunków. Jednakże badacze ci nie określili specyficznej struktury egzochelin ani nie zidentyfikowali żadnych zastosowań egzochelin innych niż ich działanie w charakterze medium przenoszącego żelazo do mikobaktyny usytuowanej w ściance komórki.

Istnieje zatem zapotrzebowanie na substancję, która może być łatwo podawana w czasie reperfuzji i która będzie szybko chelatowała wolne żelazo, gdy jest ono wytwarzane lub udostępniane, aby zapobiegać tworzeniu się rodnika (·ΟΗ). Istnieje ponadto potrzeba oznaczenia specyficznej struktury egzocheliny, tak żeby można było pełniej zrozumieć jej działanie i wyjaśnić jej użyteczność w sensie modalności diagnostycznej, terapeutycznej i prewencyjnej.

Zapotrzebowania te zostały spełnione przez przedmiotowy wynalazek, który obejmuje stosowanie egzochelin do zapobiegania uszkodzeniom żywej tkanki na skutek powstawania lub obecności rodnika (·ΟΗ).

W szczególności zapotrzebowania te zostały spełnione dzięki temu, że została opracowana kompozycja do zabezpieczania żywej tkanki ssaka przed uszkodzeniem spowodowanym wystawieniem na działanie powstającego wolnego rodnika hydroksylowego powstającego po przywróceniu przepływu płynu do organu ciała po ograniczeniu dopływu krwi do tego organu. Kompozycja według wynalazku została określona związkiem chemicznym, w którym to związku Rj jest wybrany z grupy złożonej z (CH₂)_NCOOCH3 i (CH₂)_xCH=(CH₂)j,COOCH₃, przy czym N jest od 1 do 7, a x+y jest od 1 do 5, zaś R₃ jest wybrane z grupy złożonej z H i CH₃, przy czym wymienione desferriegzocheliny mają ciężar cząsteczkowy od około 716 do około 826 daltonów.

Korzystnie, kompozycja zawiera mieszaninę desferriegzochelin o ciężarze cząsteczkowym 722 i 784 daltonów.

W dalszym rozwinięciu wynalazku kompozycja zawiera mieszaninę względnie niepolarnych desferriegzochelin, charakteryzujących się tym, że N jest liczbą całkowitą od 5 do 7.

Zgodnie z wynalazkiem, kompozycja zawiera mieszaninę stosunkowo niepolamych desferriegzochelin, charakteryzujących się tym, że x+y jest 4 lub 5.

Zgodnie z innym przykładem wykonania wynalazku kompozycja do chronienia przed uszkodzeniem żywej tkanki ssaka przy powstawaniu, za pośrednictwem jonów rodników karboksylowych, zawierająca skuteczną ilość przynajmniej jednej desferriegzocheliny jest określona związkiem, w którym Rj jest wybrany z grupy złożonej z (CH₂)_NCOOCH₃ i (CH₂)_xCH=(CH₂)_yCOOCH₃, przy czym N jest od 1 do 7, ax+yjest od 1 do 5, zaś R₃ jest wybrane z grupy złożonej z H i CH₃, przy czym wymienione desferriegzocheliny mają ciężar cząsteczkowy od około 716 do około 826 daltonów.

W jeszcze innym przykładzie wykonania wynalazku, kompozycja do dostarczania ssakowi skutecznych ilości aktywnego związku w celu traktowania stanu medycznego jest określona związkiem chemicznym, w którym Rj jest cząstką chemiczną wybraną z grupy złożonej z (CH₂)_nCOOH₃, (CH₂)_nCOOR, a R jest grupą alkilową i (CH₂)_n CONH₂.

R₂ jest cząstką chemiczną podstawioną w dowolnym z 4 otwartych miejsc na pierścieniu, przy czym ta cząstka chemiczna jest wybrana z grupy złożonej z grup alkilowych, sulfonamidów.

182 414 hydroksylu, chlorowca, acetylenu, karbamylu, amin i NO₂ oraz ich kombinacji; R₃ jest cząstką chemiczną wybraną z grupy utworzonej przez boczne łańcuchy znajdujące się na β-hydroksyaminokwasach, które są zdolne do tworzenia cyklicznych struktur oksazolinowych;

R4a> ^4b> ^5a’ ^51» ^są chemicznymi cząstkami wybranymi z grupy złożonej z H, grup alkilowych i podstawionych grup alkilowych; * reprezentuje centra chiralności, które mogą być R lub S.

W dalszym rozwinięciu wynalazku, kompozycja odznacza się tym, że aktywny związek jest wybrany z grupy złożonej ze związków nasyconych i nienasyconych, przy czym związki nasycone mająmasy 716,730,744,758,772,786,800,814 i 828 daltonów, a związki nienasycone mają masy 742, 756, 770, 784, 798, 812 i 826.

Zgodna z wynalazkiem kompozycja, która wystawiona na działanie jonu metalu w roztworze tworzy chelat metalu o określonym wzorze, w którym M jest wybrany z grupy złożonej z żelaza, ołowiu, glinu, kadmu, niklu, srebra, złota, arsenu, magnezu, manganu, cynku, miedzi, rubidu, niobu, cyrkonu, tantalu, wanadu, galu, platyny, chromu, skandu, itru, kobaltu, tytanu, sodu i potasu.

Kompozycja według wynalazku odznacza się tym, że M jest żelem.

Przedmiot wynalazku jest bliżej objaśniony w przykładach wykonania na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia strukturę chemiczną chelatu żelaza molekuły egzocheliny (ferriegzochelina) i desferriegzocheliny (bez żelaza), fig. 2 - profil elucji filtratu kultury M. tuberculosis monitorowanego przy 220 nm i 450 nm, fig. 3 - profil elucji tego samego filtratu monitorowanego przy 450 nm z ciężarem cząsteczkowym każdego pokazanego piku, fig. 4 - widma spektrometrii masowej egzocheliny zawierającej głównie serynę przy m/z=720,3 wraz z określoną na tej podstawie strukturą, fig. 5 - wykres przedstawiający powstrzymywanie uszkodzenia komórek w wyniku zastosowania mieszaniny egzocheliny na włóknach mięśniowych serca, fig. 6 - wykres przedstawiający powstrzymywanie uszkodzenia komórek w wyniku zastosowania egzocheliny 758C na włóknach mięśniowych serca, fig. 7, 8 i 9 - wykresy porównujące powstrzymywanie uszkodzenia w wyniku stosowania egzocheliny 758C, 772A i 772C na włóknach mięśniowych serca, fig. 10 - strukturę chemiczną chelatu żelaza molekuły egzocheliny (ferriegzochelina) i desferriegzocheliny (bez żelaza) z oznaczeniem miejsc do modyfikacji.

Stwierdzono, że egzocheliny mogąblokować lub znacznie zmniejszać oksadacyjne uszkodzenie tkanki powodowane przez katalizę z pośrednictwem żelaza reakcji tkanko wy ch/wolnych rodników, takich jak grupa hydroksylowa (·ΟΗ), szczególnie grup hydroksylowych wytwarzanych w reakcji Fentona, zwanej zwykle urazem reperfuzyjnym. Ponadto stwierdzono, że egzocheliny skutecznie hamują lub zapobiegają urazowi reperfuzyjnemu, kiedy są podawane na początku reperfuzji lub równocześnie z nią. Dodatkowo stwierdzono, że egzocheliny obejmują znacznie szerszą klasę materiałów i mają inną strukturę chemiczną niż według pierwotnej teorii Machama i innych oraz Barclaya i innych.

Stwierdzono również, że materiały te mogąchelatować szeroki zakres metali, by uzyskać dotychczas nieznane materiały. Oprócz zapobiegania urazowi reperfuzyjnemu odpowiednio zmodyfikowane egzocheliny mogą być używane w leczeniu pewnych schorzeń, do atakowania pewnych komórek, takich jak komórki nowotworowe, oraz do monitorowania skuteczności stosowania leków i wykrywania istnienia pewnych stanów chorobowych. W szczególności wiadomo, że na wzrost komórek neuroblastowych może mieć negatywny wpływ usuwanie żelaza przez stosowanie związku chelatującego żelazo, deferoksaminy, bez podobnego oddziaływania na wzrost normalnych komórek. Inne zastosowania egzochelin obejmują leczenie przeciążenia żelem przy transfuzjach lub chemioterapii nowotworowej, zwłaszcza w przypadku leukemii.

W wyniku wyizolowania i oczyszczenia egzochelin stwierdzone zostało, że egzocheliny są rodziną cząsteczek mających pewien zakres ciężarów cząsteczkowych i różne łańcuchy boczne. Ponadto przygotowano oczyszczone egzocheliny i po raz pierwszy wykazano ich użyteczność w charakterze środka usuwającego wolne żelazo, tak że są one aktywne w zapobieganiu powstawaniu uszkodzających tkanki grup hydroksylowych (·ΟΗ). W szczególności wyizolowano oczyszczone egzocheliny M. tuberculosis i wykazano, że skutecznie usuwają one żelazo z trans

182 414 ferryny, laktoferryny i ferrytyny przy fizjologicznym pH bez przenoszenia żadnych infekcyjnych właściwości bakterii, z których zostały one uzyskane. Zademonstrowano również po raz pierwszy, że te egzocheliny blokują powstawanie grup hydroksylowych przy reakcji Fentona i ze względu na reakcję włókien mięśniowych serca mogą skutecznie zapobiegać urazowi reperfuzyjnemu po zawale mięśnia sercowego lub po urazach naczyniowych innych tkanek, kiedy podawane są po wystąpieniu ataku jak również w kilka godzin po zdarzeniu.

Chociaż szerokimi badaniami objęto mikobaktyny, indywidualnych egzochelin nie wydzielono lub nie oczyszczono, a ich struktura i skład nie zostały poprzednio określone. Ponadto stwierdziliśmy, że dotychczasowe publikacje mylnie charakteryzowały egzocheliny, a zatem nie zidentyfikowały struktury tych związków. W szczególności Macham (ibid.) identyfikuje je jako pięcio- lub sześciopeptydy, posiadające masą cząsteczkową 750-800, zawierające 3 mole ε-Ν-hydroksylizyny, eN-acetylo-eN-hydroksylizyny lub εΝ-hydroksyomityny i 1 mol treoniny. Stwierdziliśmy, że egzocheliny mają znacznie szerszy zakres masy cząsteczkowej, tworzą kilka szeregów związków o możliwej do określenia różnicy mas cząsteczkowych, zawierają tylko 2 mole ε-Ν-hydroksylizyny i nie są peptydami. Peptyd jest to polimer aminokwasu (NH₂.CHR-COOH) utworzony przez kondensację grupy karboksylowej pierwszej molekuły z grupą aminową innej molekuły w celu utworzenia wiązania amidowego (-CO-NH-). Egzochelin nie można uważać za peptydy. Zawierają one natomiast trzy aminokwasy i inne człony (kwas salicylowy, kwasy dwukarboksylowe lub analogi monoestrowe i kwasy hydroksykarboksylowe) utworzone przez kondensację amidową (-NH-CO-), hydroksymatową (-NH(OH)-CO-) i estrową (-CO-O-). Postacie ferri i desferii przedstawiono na fig. 1.

Przygotowanie - egzocheliny wytworzono i oczyszczono ze szczepu wirulentnego (Erdman) i niewirulentnego (H37Ra) M. tuberculosis. W celu zwiększenia wytwarzania egzochelin M. tuberculosis bakterie hodowano w medium ubogim w żelazo. W szczególności szczep Erdman M. tuberculosis (numer kultury w rejestrze amerykańskim ATCC 35801) i H37Ra (ATCC 25177) hodowano na płytkach agarowych Middlebrook 7H11 przy 37°C w 5% CO₂ Po 14 dniach bakterie zebrano, utworzono z nich zawiesinę w 150 ml zmodyfikowanej pożywki Sautona w kolbie hodowlanej i inkubowano przez 3-8 tygodni. Zmodyfikowana pożywka Sautona zawierała 0,12 mg/1 cytrynianu ferriamonowego bez dodanego środka powierzchniowo czynnego.

Następnie przez filtrowanie, nasycanie żelem i ekstrahowanie chloroformem oraz oczyszczanie metodą chromatografii cieczowej przy wysokim ciśnieniu (HPLC) otrzymuje się egzocheliny bogate w żelazo (ferriegzocheliny). W szczególności płyn nadsączowy z powyższej zawiesiny filtrowano przez kolejne filtraty wiążące niskobiałkowe 0,8 pm i 0,2 pm. Egzocheliny te ładowano następnie żelazem przez nasycanie przefiltrowanego płynu nadsączowego przez wystawienie na działanie chlorku żelazowego (150 mg na litr filtratu kultury). Egzocheliny te zmieszano z chloroformem (1 objętość filtratu kultury na 1,5 objętości chloroformu) i po rozdzieleniu warstw usuwano warstwę chloroformu bogatego w egzochelinąi przechowywano pod bezwodnym siarczanem magnezu (2 g/1). Chloroformowy ekstrakt przepuszczano następnie przez filtr z topionego szkła i odparowywano przez parowanie obrotowe pozostawiające brązowe resztki.

Te brązowe resztki oczyszczano następnie przez utworzenie z nich zawiesiny w 5 ml pierwszego roztworu buforowego (0,1 % kwas trójfluorooctowy), który był wprowadzany do kolumny chromatografii cieczowej (wkład C-18 Sep-Pak). Brązowy pasek, który powstał w pobliżu wierzchołka kolumny, eluowano drugim roztworem buforowym (0,1% TFA, 50% nitryl octowy). Częściowo oczyszczony materiał był następnie rozcieńczony trzykrotnie w 0,1% kwasie trójfluorooctowym i poddawany przeciwfazowej chromatografii cieczowej przy wysokim ciśnieniu z prędkością 1 ml/min, po czym wystawiono go na działanie w kolumnie C-18. Objętość egzochelin bogatych w żelazo w eluacie HPLC wykrywano przez równoczesne monitorowanie absorbancji ultrafioletu dla piku 450 nm (związki żelaza) i dla piku 220 nm, który oznacza grupy amidowe i aromatyczne. W przybliżeniu 5 większych i 10 mniejszych pików, pokazanych na fig. 2, eluowanych z końcowej kolumny C-18 wykazywało duży stosunek absorbancji 450/220 nm.

182 414

Spektrometria masowa potwierdziła, że były to egzocheliny. Większe piki były następnie oczyszczane przez drugą przeciwfazą HPLC na kolumnie alkilofenylowej. Egzocheliny uzyskane ze szczepu Erdmana M. tuberculosis były identyczne z egzochelinami uzyskanymi ze szczepu H37Ra.

Charakterystyka - na podstawie analizy LSIMS i ESI-MS licznych pików w ich postaci ferri- (Fe³⁺), eluowanych z kolumny (patrz fig. 3) żelazoegzocheliny nie są ograniczone do dwóch specyficznych molekuł opisanych szczegółowo powyżej, ale stanowią rodzinę materiałów o masie w zakresie 716-828 daltonów. Każdy członek tej rodziny wydaje się różnić od swego sąsiada o 14 daltonów, co odzwierciedla liczbę grup CH₂ w alkilowym łańcuchu bocznym R_b i/lub 2 daltony, co odzwierciedla obecność podwójnego wiązania w alkilowym łańcuchu bocznym Rp Wydaje się zatem, że egzocheliny tworzą dwa szeregi, gdzie kolejne elementy każdego szeregu różnią się pod względem masy o 14 daltonów, przy czym szereg nasycony ma masy w przybliżeniu 716, 730, 744, 758, 772, 786, 800, 814 i 828 daltonów, a szereg nienasycony ma masy 742, 756,770, 784, 798, 812 i 826. Ponadto obecność lub brak grupy metylowej wpozycji R₃ (tzn. H lub CH₃) określa dodatkowe dwa szeregi cząsteczek, nazywane szeregiem serynowym (R₃=H) oraz szeregiem treoniowym (R₃=CH₃), co potwierdziła analiza na aminokwasy. Najbardziej polarne związki są usytuowane po lewej stronie rysunku (wcześniejsze eluowanie), a najmniej polarne (najłatwiej rozpuszczalne w lipidzie) po prawej stronie. Jednakże wszystkie piki są rozpuszczalne w wodzie. Tam, gdzie stwierdzono, że więcej niż jeden pik ma taki sam ciężar cząsteczkowy, każdy pik oznaczano ponadto przez A, B lub C (tzn. 758A, B i C), aby oznaczyć poziom biegunowości, przy czym A odnosi się do związku bardziej polarnego, a C do związku najsłabiej polarnego. Uważa się, że bardziej polarne postacie wynikają z grup metylowych dołączonych w różnych miejscach w cząsteczce.

Struktura egzocheliny - fig. 4 przedstawia wyniki analizy metodą tandemowej spektrometrii masowej przy wywołanej dysocjacji (He pobudzany przy 2 keV do energii zderzenia 6 keV) głównie nasyconej desferriegzocheliny zawierającej serynę z (M+H)⁺ przy m/z 720,3. Jony fragmentowe przypisane zostały jednemu z sześciu strukturalnych członów A-F otrzymanych z produktów rozpadu wytworzonych wokół wiązań amidowych lub estrowych z przeniesieniem wodoru względem neutralnej molekuły związanej z każdym pikiem wskazanym na widmie przedstawionym na fig. 4. Hydroliza kwasu i metylacja egzochelin spowodowały powstanie kwasu salicylowego i kwasu pimelinowego. Analiza metodą spektrografii masowej wykazuje, że kwas pimelinowy występuje w egzochelinie jako ester metylowy.

Na podstawie tej analizy ogólna struktura ferriegzochelin i desferriegzochelin pokazana jestnafig. 1. Grupametylowa pokazana wpozycji R₄ (jak określono na fig. 10) może być wpozycji R₅. Żelazo-egzochelinowa molekuła rdzeniowa jest kołowa z żelazem w środku. Zawiera ona 3 człony aminokwasowe (dwie N-hydroksylizyny i 1 serynę lub treoninę, zależnie od tego, czy R₃ jest wodorem, czy grupą metylową). Główna różnica pomiędzy egzochelinami a mikobaktynami M. tuberculosis polega na tym, że R] w egzochelinach występuje albo jako nasycony alkilowy ester metylowy((CH₂)_NCOOCH₃), albo jako pojedynczo nienasycony alkilowy ester metylowy (CH₂)_xCH=CH(CH₂)_yCOOCH₃ i egzocheliny mają znacznie krótszy alkilowy łańcuch boczny niż mikobaktyny, przy czym te krótsze łańcuchy boczne kończą się członami z estru metylowego. Różnice te odpowiadająza rozpuszczalność egzochelin w wodzie i za ich zdolność do funkcjonowania w środowisku pozakomórkowym.

Użyteczność kliniczna - użyteczność kliniczna podawania egzochelin w celu zapobiegania urazowi reperfuzyjnemu została zademonstrowana przez wprowadzenie we włókna mięśniowe dorosłych szczurów.

W poniższych przykładach różne egzocheliny, zarówno w postaci desferri-jak i w postaci ferri-, identyfikowane będąprzez ciężar cząsteczkowy, jak pokazano na krzywej elucji na fig. 3.

Przykład 1

Serce samca szczura wycięto po znieczuleniu, wykonaniu torakotomii i serce schłodzono in situ. Wycięte serce umieszczono następnie w aparacie Langendorffa i perfundowano kolagenaząi hialuronidazą w 50 μΜ wapnia w zmodyfikowanym roztworze buforowym Krebs-Ringera.

182 414

Następnie tkankę dokładnie rozdrobniono i zdyspergowano w roztworze kolagenazy/trypsyny, prze filtrowano do zimnego roztworu inhibitora trypsyny i wystawiono na działanie coraz większych stężeń wapnia. Po usunięciu uszkodzonych komórek pozostałą zawiesinę komórek umieszczono w kilku powleczonych lamininąplastikowych płytkach wraz z pożywką zawierającą5% płodowej surowicy bydlęcej.

Po pozostawieniu kultur w spokoju na 48 godzin do każdej płytki dodano nadtlenek wodoru i w różnych odstępach czasu mierzono aktywność dehydrogenazy mleczanowej (LDH), która jest oznaką uszkodzenia komórek. Wskaźnik uszkodzenia komórek (CII) dla celów porównawczych otrzymywano przez pomiar LDH w nienarażonej kulturze komórek zarówno w stanie zastanym (wskaźnik 0) jak i po wystawieniu na działanie detergentu, który powoduje rozpad 100% członów molekuł (1 % Triton X-100) reprezentujący CII równy 100. Następnie w różnych okresach czasu oznaczano LDH w podanych warunkach traktowania, określano odpowiednią wartość CII i poszczególne wyniki naniesiono na wykres w funkcji czasu (fig. 5).

Stosując opisaną powyżej procedurę wyizolowano mieszaninę postaci desferri- egzochelin 772C i 784 (mieszanina 50:50 piku 772C i piku 784), będącą substancjąniepolamą, i użyto ją do potraktowania kultur komórkowych. Egzochelina była przetwarzana do postaci desferriegzocheliny przez inkubacje przez kilka dni z 50 mM EDTA przy pH 6. Tę postać desferri- oczyszczono następnie ponownie przez ekstrakcję chloroformem.

Trzy próbki komórek poddano działaniu a) H₂O₂, b) H₂O₂ i 50 μΜ desferriegzocheliny (egzochelina pozbawiona żelaza) dodanej równocześnie, albo c) H₂O₂ dodanemu 2 godziny po dodaniu 100 μΜ desferriegzocheliny do kultury komórkowej (preinkubacja). Nienarażona kultura komórkowa wykazała prawie 62% uszkodzenia komórek po 4 h. Natomiast dodanie egzocheliny równocześnie z lub 2 godziny przed dodaniem nadtlenku zasadniczo zapobiegało lub znacznie zmniejszało uszkodzenie komórek, przy czym wskaźnik uszkodzenia komórek wynosił w przybliżeniu 2-9%.

Przykład 2

Powtórzono procedurę z przykładu 1 z desferriegzocheliną758C, która jest stosunkowo bardziej polarna niż egzochelina 772C i 784.

Była niewielka różnica lub nie było żadnej różnicy pomiędzy wynikiem, kiedy desferriegzochelinę 758C podawano równocześnie lub w ciągu 15 minut od podania H₂O₂. W obu przypadkach po 2 godzinach uszkodzenie komórek było zasadniczo takie same jak w przypadku kontrolnym. Jednakże podawanie desferriegzocheliny 758C 2 godziny przed wprowadzeniem H₂O₂ zmniejszyło uszkodzenie komórek do CII około 20. Wyniki pokazano na fig. 6.

Przykład 3

Powtórzono procedurę opisaną powyżej stosując desferriegzochelinę 772A, 772C i 758C. Na fig. 7-9 przedstawiono na wykresach wyniki dla podania z wyprzedzeniem 2 godzin, dla podania równoczesnego i dla opóźnionego o 20 minut podania egzochelin. Tylko egzochelina 772C wykazuje hamowanie uszkodzeń przy wszystkich warunkach, natomiast egzochelina 772A nie jest skuteczna w żadnych warunkach. Z drugiej strony egzochelina 758C wykazuje ochronę tylko wtedy, jeśli jest podawana 2 godziny przed wprowadzeniem nadtlenku. Należy zatem wysnuć wniosek, że stosunkowo niepolame, bardziej rozpuszczalne w lipidach egzocheliny są skuteczne, kiedy sąpodawane wraz z powstawaniem lub po powstaniu rodnika (·ΟΗ), to znaczy po wystąpieniu uszkodzeń. Bardziej polarne egzocheliny trzeba podawać 1-2 h przed wytworzeniem swobodnych rodników, aby zmniejszyć uszkodzenia komórek lub zapobiec im.

Przykład 4

Zdolność egzochelin do rywalizowania o żelazo z macierzystymi proteinami wiążącymi żelazo określana była przez inkubowanie desferriegzocheliny z roztworami transferryny, lactoferryny lub ferrytyny przy stosunkach molowych żelaza do egzocheliny 4:1 i 1:1. Przemianę egzocheliny z jej postaci desferri- do postaci ferri- .określono następnie przez HPLC z odwróceniem fazy. W ciągu jednej minuty od wystawienia desferiegzocheliny na działanie transferryny nasyconej w 95% żelem egzochelina zaczęła zabierać żelazo z transferryny i po jednej godzinie egzochelina była całkowicie nasycona żelazem. Żelazo było również łatwo usuwane z transfer

182 414 ryny nasyconej żelazem w 40%, co jest zbliżone do zawartości żelaza w transferrynie istniejącej z surowicy. Podobne wyniki otrzymano, kiedy desferriegzochelina została wystawiona na działanie laktoferryny nasyconej żelem. Podobnie ferrytyna oddawała żelazo do egzocheliny, ale wolnej niż inne proteiny wiążące żelazo.

Odkryto, że egzocheliny bardzo skutecznie usuwają wolne żelazo w systemie fizjologicznym i odbierają żelazo od protein przenoszących żelazo. W szczególności stwierdzono, że egzochelina skutecznie blokuje tworzenie wolnego rodnika hydroksylowego (·ΟΗ) i znacznie zmniejsza przez to lub uniemożliwia uszkodzenia niedokrwionej tkanki, kiedy cyrkulacja krwi do tej tkanki jest wznawiana przy większym ciężarze cząsteczkowym, przy czym mniej polarne egzocheliny skuteczniej zabezpieczają komórki przez uszkodzeniami. Chociaż przedstawiono zalety dla tkanki sercowej, oczywiste są obecnie korzyści ze stosowania egzochelin po przerwaniu dopływu krwi do innych organów ciała, łącznie (ale bez ograniczenia) z mózgiem, nerkami, wątrobą jelitem i mięśniem szkieletowym.

Doświadczenia wykazały, że powinowactwo egzochelin nie ogranicza się do żel a7^ lecz mogąbyć chelatowane inne metale, takie jak Na, K, Mn, Mg, Al i Zn. Egzocheliny mogą być zatem stosowane do doprowadzania do ciała różnych pożądanych metali lub chelatowania różnych niepożądanych metali wewnątrz ciała. Dodatkowo niektóre komórki, obejmujące pewne komórki rakowe, mająjak wiadomo zapotrzebowanie na lub powinowactwo wobec pewnych metali. Można to wykorzystywać do doprowadzania do takiej komórki reaktywnych związków dołączonych do egzochelin w celu zniszczenia tej komórki (chemioterapia) lub w celu wycelowania w chory organ korzystnym lekiem związanym z egzocheliną. Przeciwnie, ponieważ pewne komórki rakowe mają duże zapotrzebowanie na żelazo, desferriegzocheliny mogąbyć używane do wiązania swobodnego żelaza, przez co uniemożliwia się dostarczanie żelaza do komórki rakowej, aby spowodować jej znieszczenie.

Chociaż na fig. 1 przedstawiono strukturę egzochelin otrzymanych z M. tuberculosis, wiadomo, że inne prątki mogą wytwarzać egzocheliny i że te egzocheliny mogąmieć inną strukturę i mogą zawierać inne aminokwasy w zależności od prątków, z których pochodzą. Jednakże wszystkie egzocheliny będą zachowywały się w podobny sposób i istnieją w podobnych szeregach, których kolejne człony mają podobny wzrost ciężarów cząsteczkowych. Skuteczność różnych członów takiego szeregu będzie również zależeć od względnej polamości cząsteczek. Wynalazek rozważa zatem egzocheliny wytworzone z innych prątków, obejmujących, ale bez ograniczenia tylko do nich, M. Luberculosis, M. microli, M. bovis, M. africanum, M. kansasii, M. marinum, M. gastri, M. nonchromogenicum, M. terrae, M. trivale, M. malmonese, M. shimoidei, M. gordonae, M. asiaticum, M. szulgai, M. simiae, M. scrofulaceum, M. avium, M. intracellulare, M. xenopi, M. ulcerans, M. haemophilium, M. farcinogenes, M. lepraemurium, M. paratuberculosis, M. chelonae subsp. chelonae, M. chelonae subsp. abscessus, M. fortuitum, M. chitae, M. senegałense, M. agri, M. smegmatis, M. phlei, M. thermoresistibile, M. aichiense, M. aurum, M. chubuense, M. duvalii, M. flavesces, M. gadium, M. givum, M. komossense, M. neoaurum, M. obuense, M. parafortuitum, M. rhodesiae, M. sphagni, M. tokaiense lub M. vaccae.

Rozważa się również, że egzocheliny mogą być modyfikowane w celu oddziaływania na ich właściwości rozpuszczalności, na zdolność do chelatowania metali lub na stopień absorbcji komórkowej. Dodatkowo wykrywa się modyfikowane egzocheliny lub egzochelinę w swym stanie chelatowanym metalem przy użyciu monoklonalnych przeciwciał lub przeprowadza się analizę chemicznąjako narzędzie diagnostyczne przy analizie krwi, moczu lub przy nieinwazyjnych technikach instrumentalnych, aby monitorować stan w przebiegu choroby lub skuteczność leczenia. W szczególności, jeśli chodzi o struktury związków zawierających metale i pozbawionych metali, pokazane na fig. 10, rozważane są następujące podstawienia:

Rj = (CH₂)_nCH₃jako łańcuch liniowy lub rozgałęziony; (CH₂)_nCOOH, kwas tłuszczowy; (CH^COOR, ester kwasu tłuszczowego, gdzie R jest grupą alkilową; (CH₂)_nCONH₂;

R₂ = podstawienie w dowolnym z 4 otwartych miejsc pierścienia grup alkilowych, sulfonamidów, hydroksylu, chlorowca, acetylenu, karbamylu, amin, NO₂ lub dowolnej ich kombinacji;

182 414

R₃ - H (seryna) lub CH₃ (treonina) mogą być zastąpione przez boczne łańcuchy znajdujące się na β-hydroksyaminokwasach, które są zdolne do tworzenia cyklicznych struktur oksazolinowych;

R_4ai R_4b~ H, CH₃ lub inne grupy alkilowe lub podstawione grupy alkilowe;

R_5a i R_5b = H, CH₃ lub inne grupy alkilowe lub podstawione grupy alkilowe;

X = O, NH, S, CH₂;

M = jedno- dwu- lub trójwartościowe metale, takie jak Pb, Al, Cd, Ni, Ag, Au, As, Mg, Mn, Zn, Cu, Ru, Nb, Zr, Ta, V, Ga, Pt, Cr, Sc, Y, Co, Ti, Na, K;

* reprezentuje centra chiralności, które mogą być R lub S;

Różne grupy hydroksylowe (OH) biorące udział w chelatowaniu metalu mogą być zastąpione różnymi grupami funkcjonalnymi, takimi jak H lub chlorowiec, aby zmienić powinowactwo związku wobec chelatowanego metalu

Chociaż przedmiotowy wynalazek opisano dość szczegółowo w odniesieniu do pewnych korzystnych wersji i zastosowań, możliwe sąinne wersje i zastosowania. Przykładowo, egzocheliny można stosować do atakowania zaraźliwych bakterii, takich jak M. tuberculosis, przez blokowanie dostępu prątków do żelaza, do usuwania toksycznych poziomów metali z ciała lub do dostarczania ciału potrzebnych metali. Ponadto modyfikowane egzocheliny zawierające metal mogądostarczać dołączone do nich aktywne leki lub chemikalia do tych miejsc w ciele, które korzystnie pochłaniająchelatowany metal, i korzystnie absorbowane egzocheliny z chelatowanymi metalami można wykorzystać jako cele do traktowania przez inne modalności, na przykład energia mikrofalowa do hipotermicznego traktowania komórek rakowych. Duch i zakres załączonych zastrzeżeń patentowych nie powinny być zatem ograniczone do zawartego tu opisu korzystnych wersji.

182 414

Fig. 2A

Czas elucji (min)

182 414

0.07 η ^450 nm

Fig. 3

O

r 100 —|——------1———————J I —————J

70 80 90 100

Fig. 4A

182 414

Ο² Η- ο

HO^CH9- ® ^CH9OO9’33ΟΟ8Υ ^CH9OO9^U(^ZH9) -33038Υ

Η -300

03’30 ο

HO-*O9-9

HZ* 0-3303 ο

HC* 0-303 ν>

Η *09 '3300 ο

ΗΖ*ΗΝ*30 ο

ο

CO 3 (Mł-H) 720.3

ΗΖ-3ΟΟβΥ =>«° m u>

HZ-33SY« m

3303 5

HZ * HN * 3008 o -łΗ -3008 ~

Η* ΗΟΝ- '00’303 ιο~βν

Fig. 4B

182 414

Γ

Wskaźnik .

uszkodzenia komórek o Ιο

Czas (h) —o— tylko H2O2 μΜ D-egzo (mieszanina 772c i 784) —b— równocześnie —°— preinkubacja

Fig. 5 r

Wskaźnik .

uszkodzenia ₄₀ _ komórek .

O 0

Fig. 6 tylko H2O2

H2O2 następnie

D-egzo po 15 min

Równocześnie D-egzo i H2O2

2h D-egzo potem H2O2

182 414

100 ao 60 Wskaźnik ⁴⁰ ; uszkodzenia 20 komórek o -20 O

--.—tylko H2O2 —⁰—D-egzo 772A —·— D-egzo 758A —o— D-egzo 772C

-J-----------<----------1----------1-----------1__________1____1

3 4

Czas (h)

Fig. 7

Wskaźnik uszkodzenia komórek _r 80 70 60 ⁵⁰ ?

30 20 ¹⁰ 7

-10 t0

.tylko H2O2

-D-egzo 772A

-D-egzo 758C

D-egzo 772C

Czas (h) . 8

100 r

Wskaźnik eo uszkodzenia _An 40 komórek 20 -

-—o— tylko H2O2

--·— Deferoks —⁰— D-egzo 772C o ----------------------¹----------·-----------1---------------------1-----------------------0 12 3 4

Czas (h)

Fig. 9

182 414

Fig. 10B

Fig. 10A

182 414

Fig. 1B

Fig. 1A

Ferriegzochelina

Desferriegzochelina

Fig. 1C

Rj

Rj Mr (CHjJhCOOCHj N=l-7 H.CHj 716-828 (aiJ^^CHCCH^COOCHj x+y=l-5 H.CHj 742-826

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 60 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims (9)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Kompozycja do zabezpieczania żywej tkanki ssaka przed uszkodzeniem na skutek wystawienia na działanie powstającego wolnego rodnika hydroksylowego powstającego po przywróceniu przepływu płynu do organu ciała po ograniczeniu dopływu krwi do tego organu, znamienna tym, że zawiera skuteczną ilość przynajmniej jednej desferriegzocheliny o wzorze:

   gdzie R, jest wybrany z grupy złożonej z (CH₂)_NCOOCH₃ i (CH₂)_xCH=CH(CH₂)_yCOOCH₃, przy czym N jest od 1 do 7, a x+y jest od 1 do 5, zaś R₃ jest wybrane z grupy złożonej z H i CH₃, przy czym wymienione desferriegzocheliny mają ciężar cząsteczkowy od około 716 do około 826 daltonów.
2. 2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zwiera mieszaninę desferriegzochelin o ciężarze cząsteczkowym 772 782 daltony.
3. 3. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że mieszaninę stosunkowo niepolarnych desferriegzochelin, charakteryzujących się tym, że N jest liczbą całkowitą od 5 do 7.
4. 4. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zwiera mieszaninę stosunkowo niepolamych desferriegzochelin, charakteryzujących się tym, że x+y jest 4 lub 5.
5. 5. Kompozycja do chronienia przed uszkodzeniem żywej tkanki ssaka przy powstawaniu, za pośrednictwem jonów, rodników karboksylowych, znamienna tym, że zwiera skuteczną ilość przynajmniej jednej desferriegzocheliny o wzorze:

   182 414 gdzie R₁ jest wybrany z grupy złożonej z (CłtytyCOOCR, i (CH₂)_xCH=CH(CH₂)_yCOOCH₃, przy czym N jest od 1 do 7, a x+y jest od 1 do 5, zaś R₃ jest wybrane z grupy złożonej z H i CH₃, przy czym wymienione desferriegzocheliny mają ciężar cząsteczkowy od około 716 do około 826 daltonów.
6. 6. Kompozycja do dostarczania ssakowi skutecznych ilości aktywnego związku w celu traktowania stanu medycznego, znamienna tym, że zawiera związek o wzorze:

   o gdzie

   Rj jest cząstką chemiczną wybraną z grupy złożonej z (CH₂)_nCH₃, (CH₂)_nCOOH, (CH₂)_nCOOR, a R jest grupą alkilową i (CH₂)_nCONH₂;

   R₂ jest cząstką chemiczną podstawioną w dowolnym z 4 otwartych miejsc na pierścieniu, przy czym ta cząstka chemiczna jest wybrana z grupy złożonej z grup alkilowych, sulfonamidów, hydroksylu, chlorowca, acetylenu, karbamylu, amin i NO₂ oraz ich kombinacji.

   R₃ jest cząstką chemiczną wybraną z grupy utworzonej przez boczne łańcuchy znajdujące się na β-hydroksyaminokwasach, które są zdolne do tworzenia cyklicznych struktur oksazolinowych;

   R_4a, R_4b, R_5a, R_5b, są chemicznymi cząstkami wybranymi z grupy złożonej z H, grup alkilowych i podstawionych grup alkilowych;

   * reprezentuje centra chiralności, które mogą być R lub S.
7. 7. Kompozycja według zastrz. 6, znamienna tym, że aktywny związek jest wybrany z grupy złożonej ze związków nasyconych i nienasyconych, przy czym związki nasycone mająmasy 716, 730, 744, 758, 772, 786, 800, 814 i 828 daltonów, a związki nienasycone mająmasy 742, 756, 770, 784, 798,8121 826.
8. 8. Kompozycja według zastrz. 6, znamienna tym, że wystawiona na działanie jonu metalu w roztworze tworzy chelat metalu o wzorze:

   182 414 gdzie M jest wybrany z grupy złożonej z żelaza, ołowiu, glinu, kadmu, niklu, srebra, złota, arsenu, magnezu, manganu, cynku, miedzi, rubidu, niobu, cyrkonu, tantalu, wanadu, galu, platyny, chromu, skandu, itru, kobaltu, tytanu, sodu i potasu,
9. 9. Kompozycja według zastrz. 8, znamienna tym, że M jest żelazem.

   * * *