JP2000503625A

JP2000503625A - 鉄−媒介酸化反応の抑制剤としての新規な鉄キレート剤

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Publication number: JP2000503625A
Application number: JP8-523389A
Authority: JP
Inventors: ホロウィッツ，ローレンス; エイホロウィッツ，マーカス; ダブリューギブソン，ブラッドフォード; リーヴ，ジョセフ
Original assignee: ザリージェンツオブザユニバシティオブカリフォルニア
Priority date: 1995-02-03
Filing date: 1996-01-26
Publication date: 2000-03-28
Anticipated expiration: 2016-01-26

Abstract

(57)【要約】生体組織が（・ＯＨ）ラジカルの形成或いは存在により損傷しないように、防護するためにエキソケリンを使用できる。特に、本発明は、鉄媒介の遊離ラジカルの形成から、心筋層の損傷を防護するため、再潅流の前に或いは同時に、梗塞された心筋層にエキソケリンを投与することに関する。また、エキソケリンと変成エキソケリンの化学的構造並びに哺乳動物の病気の治療と診断において、この物質を適用することに関する。

Description

【発明の詳細な説明】鉄−媒介酸化反応の抑制剤としての新規な鉄キレート剤本発明は、ＮＩＨグラントＡ１−３３７９０とＮＩＨグラントＨＬ−４８１７７からの政府支持で一部成されたものである。本発明は、従来の研究者により、ミコバクテリアから放出される、エキソケリンとされる高い親和力の鉄−結合の一連の従来同定されていない化合物の化学構造に関する。また、本発明は、その生理的特性を変えるこれらの新しく同定された化合物の変更例及びそれらの新しく同定されそして変成された化合物の応用にも関する。急性の心筋梗塞において、心臓組織は、２つの連続したできごとにより、損傷され、即ち、虚血相での低酸素症と再潅流相での酸化損傷により、損傷される。虚血相での損傷された心筋層は、虚血領域に血を再導入することにより、救うことができる。然し乍ら、再潅流は、白血球を組織中に移動させ、反応性酸素種が生成することにより生じる再潅流組織中の炎症反応の結果として損傷が生じる。最も反応性のある種の１つは、ヒドロキシ種（・ＯＨ）で、鉄の存在下で生成され、細胞死に至る。（・ＯＨ）の形成防止は、この原因から受ける致死細胞損傷を防止するものである。（・ＯＨ）の形成は、遊離鉄の存在に依存しており、そして、鉄キレート剤は再潅流損傷を防止することが知られている。例えば、鉄キレート剤デフェロキサミンは、再潅流の前に投与されると、損傷を防止し、そして、冠状動脈の咬合と再潅流の間の心筋梗塞の大きさを低減する。然し乍ら、再潅流損傷は、血流が虚血心筋層中に再生した後には、急速に生じる。（・ＯＨ）ラジカルの形成は、遊離鉄の存在に依存してい；鉄キレート剤は、遊離鉄を清掃でき、それにより、ヒドロキシラジカル形成を触媒促進するに鉄を利用できなくする。然し乍ら、これらの先行技術の鉄キレート剤物質は、フェントン(Fenton)反応(即ちEDTA)による（・ＯＨ）の生成を防止しなく、或いは、細胞中に入る速度が遅く（即ちデスフェロキサミン）、そのために、十分な量を供給しなく、（・ＯＨ）の形成を防止し、その後の細胞破壊を防止する程度の十分な鉄キレート物を形成する程に迅速に反応できない。デスフェロキサミンは、心筋梗塞の発生する前に投与すると効果があることが示されるが、再潅流の生じたとき或いはその後に投与すると、効果がないことが明らかである。同様な心臓組織損傷が、開心臓外科手術の間のような、心臓バイパス処理の結果として生じ得、また、外科手術或いは損傷の結果として、酸素化血から誘導される場合に、他の器官にも生じ得る。エキソケリンは、簡単に説明され、そして、ミコバクテリアの成長の中でのその一般的な機能については、マカム、ラトリッジ及びバークレイ（Macham,Ratle dge及びBarclay)は、University of Hull in Englandで検討し；（Lionel P．Ma cham，Colin Ratledge and Jennifer C．Noctonが"Extracellular Iron Acquisi tion by Mycobacteria: Role of the Exochelins and Evidence Against the Pa rticipation of Mycobactin"，Infection and Immunity，Vol．12.No.6，p.1242 〜1251で,1975年12月に検討し；Raymond Barclay and Colin Ratlegeが、"Mycob actins and Exochelins of Mycobacterium tuberculosis，M.bovis，M．african umand Other Related Species"，Journal of General Microbiology，134，771 〜776,(1988)で；L.P.Macham and C.Ratledgeが"A New Group of Water-soluble lron-binding Compounds from Mycobacteria;The Exochelins"，Journal of Ge neral Microbiology ，89，379〜282，(1975)で検討した。）マカムは、細胞外の流体中に見られる物質の存在を同定し、エキソケリンとした。彼は、エキソケリンを、遊離鉄をキレート化する能力を有する、水溶性でクロロフォルム溶性の化合物として説明した。マカムによると、この物質は、ミコバクチン(mycobactin) と類似性があり、細胞壁中に存在し、鉄を細胞の内部に移転する機能を有するとされる。然し乍ら、これに対して、ミコバクチンは、細胞外の環境に拡散出来なく、細胞外の環境からの遊離鉄を同化することが出来ない親脂性で水不溶性の分子である。マカム等は、トランスフェリンやフェリチンのような血清中の化合物を運ぶ鉄を他の鉄から分離させ、そして、ミコバクチンに移される形で鉄を示す生理的ｐＨでエキソケリンの機能を認識した。マカム等は、エキソケリンを単離或いは精製しないが、それらを、７５０〜８００の分子量を有し、３モルのε−Ｎ−ヒドロキシリシン、εＮ−アセチル−εＮ−ヒドロキシリシン、或いはεＮ−ヒドロキシオルニチン及び１モルのトレオニンを含有しているペンター或いはヘキサペプチドとして同定した。また、エキソケリンのバクテリア源に依存して、その分子が、β−アラニン或いはサルチル酸を含むことを記載している。バークレイ（上記）は、２２の異なる株のＭ．ツベルキュロシス(tuberculosi s)及び関連種からエキソケリンを製造することを説明している。然し乍ら、これらの従来の発明者は、エキソケリンの特定の構造を決定しなかった、或いは、細胞壁内に配置されたミコバクチンに、鉄を移送する媒体としての機能以外には、エキソケリンの適用を見出していなかった。従って、物質は、再潅流の時に容易に投与され、そして、（・ＯＨ）ラジカルの形成を防止できるように、形成され、或いは、供給できるように、遊離鉄を迅速にキレート化することの要求がある。更に、エキソケリンの特定構造を同定し、その機能が、より完全に理解でき、そして、診断法、治療法及び予防様式として、その利用を明らかにする必要性がある。概要本発明により、必要性を満足させたものは、生体組織の損傷を、（・ＯＨ）ラジカルの形成或いは存在から防止するためにエキソケリン類を使用することである。特に、本発明は、再潅流の前或いはそれと同時に、梗塞された心筋層に、エキソケリンを投与し、鉄−媒介の遊離ラジカル形成からの心筋層の損傷を防止することに関する。また、エキソケリン及び変成エキソケリンの化学構造及び、哺乳動物の病気の治療及び診断に、これらの物質を適用することが、提供される。図面本発明の特徴、特性及び長所は、更に、以下の説明、請求項の記載及び添付図面から、よりよく理解されるものである。図１は、エキソケリン（フェリエキソケリン）及びデスフェリエキソケリン（鉄なしの）分子の鉄キレート剤の化学的構造を示す。図２は、２２０ｎｍと４５０ｎｍでモニターした、Ｍ．ツベルキュロシス（結図３は、示された各ピークの分子量で、４５０ｎｍでモニターされた同一沢液の溶出プロフィルを示す。図４は、決定された構造による、ｍ／ｚ＝７２０．３での主なセリン−含有のエキソケリンの質量スペクトロメータのスペクトルを示す。図５は、エキソケリン混合物の、心臓筋細胞への使用の結果としての、細胞損傷の抑制性を示すグラフである。図６は、エキソケリン７５８Ｃの、心臓筋細胞への使用の結果としての、細胞損傷の抑制性を示すグラフである。図７、８及び９は、エキソケリン７５８Ｃ、７７２Ａ及び７７２Ｃの、心臓筋細胞への使用の結果としての、細胞損傷の抑制性を比較するグラフである。図１０は、同定された変成のための位置を有するエキソケリン（フェリエキソケリン）及びデスフェリエキソケリン（鉄なし）分子の鉄キレート物の化学構造を示す。発明の詳細な説明エキソケリンは、ヒドロキシラジカル（・ＯＨ）のような、特に、フェントン反応で生成するヒドロキシラジカルのような、組織／遊離のラジカル反応の鉄− 媒介触媒から生じる、組織に対する酸化性損傷（通常は、再潅流損傷とされるもの）を遮断或いは著しく低減できることが見出された。エキソケリンは、再潅流損傷の開始に、或いは同時に、投与されると、再潅流損傷を遅延或いは防止するに効果があることが見出された。更に、エキソケリンは、非常に広いクラスの物質であり、異なる化学構造を有することを見出した、それは、マカム等及びバークレイ等により理論的に得られたものである。これらの物質は、広い範囲の金属をキレート化でき、未知の物質が得られることを見出した。再潅流損傷を防止する他に、適切に変成されたエキソケリンは、ある種の病気を治療するのに用いられ、ガン細胞のようなある種の細胞を攻撃するために用いられ、そして、薬剤処理の効果をモニターするために用いられ、そして、ある種の病気状態の存在を検知するために用いられる。特に、神経芽細胞腫細胞の成長は、鉄キレート化化合物デスフェリオキサミンを用いて、正常細胞の成長に悪影響なく、鉄を除去することにより、害することができることは知られている。エキソケリンの他の適用例は、輸注或いはガン化学療法から、特に、白血病のため、鉄−過荷重の処置を含むものである。エキソケリンを単離し、そして、精製した結果として、エキソケリンは、特定範囲の分子量を有し、種々の異なる側鎖を有する分子群であることが見出された。更に、精製されたエキソケリンが製造され、そして、その利用法は、遊離鉄の清掃物としてであり、組織損傷のヒドロキシラジカル（・ＯＨ）の形成を防止するに効果的であり、それは、最初にここで証明されたものである。特に、Ｍ．ツベルキュロシスの精製されたエキソケリンが単離され、そして、生理的ｐＨで、誘導されるバクテリアの感染特性を移転することなく、トランスフェリン、ラクトフェリン及びフェリチンから鉄を効果的に除去することが証明された。これらのエキソケリンは、フェントン反応により、ヒドロキシラジカル形成を遮断し、そして、心臓筋細胞の反応に基づいて、攻撃が生じた後に投与された場合、また、発生の数時間後、投与された場合、心筋梗塞或いは血管傷害の後の、他の組織に対する再潅流損傷を防止するに効果があることが、最初に証明されたものである。ミコバクチンは、良く研究されてきたが、個々のエキソケリンは、単離或いは精製できていなく、その構造及び組成物は、従来決められていない。更に、発明者は、従来の文献がエキソケリンの特性を誤り、従って、それらの化合物の構造は同定できていないことを見出した。特に、マカム（上記）は、それらを、７５０〜８００の分子量を有し、３モルのε−Ｎ−ヒドロキシリシン、εＮ−アセチル−εＮ−ヒドロキシリシン或いはεＮ−ヒドロキシオルニチン及び１モルのトレオニンを含有している、ペンタ−或いはヘキサペプチドとして同定した。発明者は、エキソケリンは、非常に広い分子量範囲を有し、分子量の同定され、差のある数種の系列の化合物を構成し、２モルのみのε−Ｎ−ヒドロキシリシンを含有するが、ペプチドでないことを見出した。ペプチドは、第１の分子のカルボキシル基と他の分子のアミノ基が縮合し、アミド結合(-CO-NH-)を形成することにより形成されたアミノ酸(NH₂-CHR-COOH)のポリマーである。エキソケリンは、ペプチドであると考えることができない。その代わりに、それらは、３つのアミノ酸と他の構造部分（サリチル酸、ジカルボン酸或いはモノエステル類、及びヒドロキシカルボン酸）を含有し、それは、アミド(-NH-CO-)、ヒドロキシメート（- NH(OH)-CO-)及びエステル縮合(-CO-O-)により形成されるものである。フェリー形及びデスフェリー形が、図１に示される。製造法−エキソケリンは、Ｍ．ツベルキュロシスの毒性株（エルドマン;Erdma n)及び無毒性(H37Ra)株から生成され、精製された。Ｍ．ツベルキュロシスエキソケリンの製造性を高めるために、バクテリアは、鉄欠乏媒体中で、培養された。特に、Ｍ．ツベルキュロシス（ＡＴＣＣ３５８０１）及びＨ３７Ｒａ（ＡＴＣＣ２５１７７）のエルドマン株を、ミドルブルック(Middlebrook)7H11アガー皿上で、３７℃で、５％ＣＯ₂中で生長せしめた。１４日後、バクテリアを収穫し、培養フラスコ中の１５０ｍｌの変成ソートン(Sauton's)の媒体中に懸濁し、３〜８週間、培養した。変成ソートン媒体は、０．１２ｍｇ／１のアンモニウムクエン酸第２鉄を含有し、表面活性剤の添加はない。、クロロフォルムで抽出せしめ、そして、高圧液体クロマトグラフィ(HPLC)により精製された。特に、上記の懸濁液からの上澄み液を、順次、０．８μｍと０．を飽和させることにより、鉄を荷重（含有）せしめた。フェリエキソケリンを、、層分離した後に、エキソケリン富有クロロフォルム層を除去し、無水硫酸マグネシウム（２ｇ／ｌ）下に貯蔵した。クロロフォルム抽出物は、フリット化ガラスフィルターを通過せしめ、回転式蒸発により、蒸発せしめると、褐色残査が残った。褐色残査を更に５ｍｌの第１緩衝溶液（０．１％トリフルオロ酢酸）中の懸濁液により精製し、それを、液体クロマトグラフィカラム（Ｃ−１８Sep-Pakカートリッヂ）中に導入した。カラムの項部付近に形成された褐色帯を、第２のバッファー（０．１％ＴＦＡ、５０％アセトニトリル）で溶離した。部分的に精製された物質は、０．１％トリフルオロ酢酸により３倍に希釈処理され、１ｍｌ／分の逆相高圧液体クロマトグラフィにかけ、Ｃ−１８カラムに接せしめた。HPLC溶離液の中の鉄−富有のエキソケリンは、HPLC溶離液中の鉄−富有のエキソケリンは、４５０ｎｍピーク（鉄化合物）及びアミドと芳香族基を示す２２０ｎｍピークのＵＶ吸収線の同時モニターにより検知された。図２に示すように、約５つの主ピークと１０の小ピークが、最終Ｃ−１８カラムの溶離液で見られ、高４５０／２２０ｎｍの吸収度の比率を示した。質量スペクトルによりエキソケリンと確認された。主ピークは、更に、アルキル−フェニルカラム上に第２の逆相HPLC により精製された。Ｍ．ツベルキュロシスのエルドマン株から回収されたエキソケリンは、Ｈ３７Ｒａ株から回収されたエキソケリンと同一であった。特徴−カラムからの溶離されたフェリー(Fe³⁺)形中での、多数のピークのLSIM S及びESI-MS分析（図３参照）に基づいて、鉄−エキソケリンは、上記に詳細した２つの特定分子に限定されないが、質量７１６〜８２８ダルトンの範囲の種の群を含む。群の各部員は、近傍と１４ダルトン、異なり、それは、R₁、アルキル側鎖中のCH₂基の数に依存し、及び／或いは、R₁アルキル側鎖中及び／或いは２ダルトン中の二重結合の数に依存する。従って、エキソケリンは、各々、１４ダルトンの質量の差がある連続する部員内で２つの系列を形成しており、その飽和系列は、およそ７１６、７３０、７４４、７５８、７７２、７８６、８００、８１４及び８２８ダルトンの質量数を有し、その不飽和系列は、７４２、７５６、７７０、７８４、７９８、８１２及び８２６ダルトンの質量数を有する。更に、 R₃（即ち、Ｈ或いはCH₃）でのメチル基の存在或いは不存在が、アミノ酸分析により確認されたセリン（R₃＝Ｈ）と、トレオニン系列(R₃＝CH₃)とされる分子の更なる２つの系列を決めるものである。最も極性のある化合物は、図の左側（溶離が速い）にあり、最も極性の少ないもの（脂質に最も溶け易い）が、右側にある。然し乍ら、すべてのピークは、水溶性である。１以上のピークが、同じ分子量を有すると見られる場合、各ピークを更にＡ、Ｂ或いはＣ（例えば、７５８Ａ、Ｂ及びＣ）と示し、極性レベルが、Ａは、より極性のある化合物であり、Ｃは、より極性が少ない形であることを示す。より極性がある形態は、分子中の異なる位置にあるメチル基から得られるものと思われる。エキソケリンの構造−図４は、m/z720.3での(M＋H)⁺を有する、主な飽和のセリン含有デスフェリエキソケリンの誘導分離（Ｈｅが６ｋｅＶの衝突エネルギーに対して２ｋｅＶで浮遊している）の下での、タンデム質量スペクトル分析の結果を示す。フラグメント・イオンは、図４に示されるスペクトル上に示される各ピークに伴う中性分子に関して移転する水素とのアミド或いはエステル結合の周りに生成される分解産物から得られる６つの構造部分Ａ〜Ｆの１つに係るものである。エキソケリンの酸加水分解とメチル化により、サルチル酸とピメリン酸の形成になる。質量スペクトル分析により、ピメリン酸は、メチルエステルとして、エキソケリン中に存在することが分かる。この分析に基づいて、フェリエキソケリン及びデスフエリエキソケリンの一般的構造式は、図１に示される。R₄位置に示されるメチル基（図１０に示されるように）は、R₅位置にある。鉄−エキソケリンコア分子は、中心の鉄により環状にある。それは、３アミノ酸部分（２つのＮ−ヒドロキシリシン及び１つのセリン或いはトレオニンで、それは、R₃が水素或いはメチル基のどちらかであるかに依存する）を含有する。Ｍ．ツベルキュロシス(M.tuberculosis)のエキソケリンとミコバクチンとの間の主な差異は、エキソケリン中のR₁は、飽和アルキルメチルエステル((CH₂)_NCOOCH₃)或いは単独で不飽和のアルキルメチルエステル(CH₂)_X CH=CH(CH₂)_YCOOCH₃のどちらかとして存在し、エキソケリンは、メチルエステル部分の末端を有する短い側鎖を持つミコバクチンより、はるかに短いアルキル側鎖を有するものである。これらの差異は、エキソケリンの水溶性と細胞外の環境中での機能性能を供するものである。治療の用途−再潅流損傷を防止するエキソケリンの投与の治療の用途は、大人のラット筋細胞に適用することにより、証明された。以下の実施例において、デスフェリー及びフェリー形の両方で、異なるエキソケリン類は、図３の溶出曲線に示すようなモル重量で同定されるものである。実施例１雄ラットの心臓を、ラットを麻酔した後に、切除し、開胸術を行ない、心臓をその位置で、冷却した。切除した心臓は、ランゲンドルフ処置上に置かれ、変成クレブスリンゲル緩衝溶液中の５０μＭカルシウム中のコラゲナーゼ（膠原酵素）とヒアルロン酸分解酵素で潅流された。次に、組織を細砕し、コラゲナーゼ濃度を高めた。損傷細胞を除去した後、残留細胞懸濁液を、５％の胎牛の血清を含有する培養媒体を有するラミニン−被覆の数個のプラスチック皿中に置いた。培養物を４８時間放置した後に、過酸化水素を各皿に添加し、細胞損傷を指示する乳酸塩デヒドロゲナーゼ活性(LDH)を種々の間隔で測定した。細胞損傷インデックス(CII)は、比較目的のために、現状のままで（０インデックス）及び100 のCIIを示す筋細胞(1％トリトン(Triton)X-100)の１００％を溶解する洗浄剤に晒すことの両方の場合に、接触していない細胞培養物中のLDHを測定することにより得られた。特殊な処理条件下で、種々の時間で、LDHを測定したが、相当するCII値が測定され、各々の結果は、時間に対してプロットされた（図５）。上記の処理法を用いて、エキソケリン７７２Ｃと７８４のデスフェリー形態の混合物（７７２Ｃピークと７８４ピークの５０：５０の混合物）、比較非極性物質が単離され、細胞培養物の処理に用いられた。エキソケリンは、５０ミリモル EDTAでｐＨ６で数日間培養することにより、デスフェリエキソケリン形に変換された。次に、デスフェリ−形は、クロロフォルム抽出液で再精製された。細胞の３つの試料は、ａ）H₂O₂、ｂ）H₂O₂と、５０μＭの、同時に添加されたデスフェリエキソケリン（鉄なしのエキソケリン）、或いは、ｃ）細胞培養物（予め培養されたもの）に、１００μＭのデスフェリエキソケリンを添加した後２時間で添加するH₂O₂のいずれかにより、処理された。非処理の細胞培養物は、４時間にわたり、約６２％の細胞損傷を示した。これに対して、過酸化物添加と同時に、或いは２時間前に、エキソケリンを添加すると、細胞損傷を防止し、或いは、細胞損傷を著しく低減し、細胞損傷は、約２〜９％であった。実施例２実施例１の処理法を、エキソケリン７７２Ｃ及び７８４よりも、比較的により極性のある、デスフェリエキソケリン７５８Ｃについて、行なった。デスフェリエキソケリン７５８Ｃを、H₂O₂を１５分間或いは１５分以内の間に与えた場合の効果には差異は、わずかであるか或いはないものであった。両方の場合、２時間後、細胞破壊は、参照のものと基本的に同じであった。然し乍ら、H₂O₂導入の２時間前に、デスフェリエキソケリン７５８Ｃを投与すると、約２０のCIIに細胞破壊が低減された。その結果は、図６に示される。実施例３上記に示した処理法を、デスフェリエキソケリン７７２Ａ、７７２Ｃ及び７５８Ｃを用いて、行なった。図７〜９に示されたものは、エキソケリンを、２時間前に投与したもの、同時に投与したもの及び２０分遅れて投与したものの結果である。エキソケリン７７２Ｃのみが、すべての条件下で損傷が遅滞することを示すが、エキソケリン７７２Ａは、いずれの条件下でも効果的でない。一方、エキソケリン７５８Ｃは、過酸化物導入の２時間前に投与する場合のみ、保護作用を示す。従って、比較的に非極性の、脂質溶解性の高いエキソケリンが、（・ＯＨ）ラジカルの形成と同時に、或いはその後に、即ち、損傷が生じた後に投与されても、効果的であるが、より極性があるエキソケリンでは、細胞破壊を防止するか或いは低減するためには、遊離ラジカル生成の１〜２時間前に、投与されなければならない。実施例４鉄のために、ホスト鉄−結合プロテインと匹敵するエキソケリンの能力は、デスフェリエキソケリンを、トランスフェリン、ラクトフェリン或いはフェリチンのそして、鉄：エキソケリンのモル比が４：１〜１：１である溶液で培養することにより、測定された。そのデスフェリ−からフェリ−形態にエキソケリンを変換することは、反転相HPLCにより決定される。１分間以内で、デスフェリエキソケリンを、９５％鉄−飽和トランスフェリンに接触せしめると、エキソケリンは、トランスフェリンから鉄を取り出すことを始め、そして、１時間以内に、エキソケリンが、鉄で完全に飽和された。鉄を、４０％鉄−飽和トランスフェリンから容易に除去することができ、血清中に存在しているように、トランスフェリン中の鉄レベルと同じにする。デスフェリエキソケリンを鉄−飽和ラクトフェリンに接触させるときに、同様な結果が得られる。同様に、フェリチンは、エキソケリンに対して鉄を放出したが、他の鉄結合プロテインよりも、遅い速度で放出した。エキソケリンは、生理的システム中の遊離鉄を清掃するに、また、鉄添加プロテインから鉄を取るのに、非常に効果的であることを見出した。特に、エキソケリンは、ヒドロキシ遊離ラジカル（・ＯＨ）の形成を効果的に遮断すること、そして、そのために、より高い分子量で、細胞破壊の防止に、より効果的である、より極性が小さいエキソケリンが、虚血組織中に血液を再度、循環させた場合に、虚血組織に対する損傷を著しく低減し、或いは、防止することが見出された。心臓組織に対する利点は明らかであるが、一方、血流が、頭脳、腎臓、肝臓、腸、骨格筋肉を含むが、それらに限定されるものでない、他の身体器官に流れることを阻止した後に、エキソケリンを使用する利点は、明らかである。実験により、エキソケリンの親和力が、鉄に限定されないが、他の金属、Ｎａ、Ｋ、Ｍｎ、Ｍｇ、Ａｌ及びＺｎがキレート化できることが分かった。従って、エキソケリンは、身体に、種々の望ましい金属を分配し、或いは、種々の望ましくない金属を、身体内で、キレート化するために、用いることができる。更に、ある種のガン細胞を含むある種の細胞は、ある種の金属に対して、必要性或いは親和力を有することが知られている。これは、細胞の破壊のために、エキソケリンへ付着された反応性化合物を、その細胞に分配すること（化学療法）に用いられ、或いは、エキソケリンに結合した効果的な薬剤で、病気器官を標的にすることに用いられる。逆に、ある種のガン細胞は、鉄に対して高い要求性を有するので、デスフェリエキソケリンは、遊離鉄を結合するに用いられ、ガン細胞への鉄分配を防止し、そのため、ガン細胞を破壊する結果が得られる。Ｍ．ツベルキュロシスから回収したエキソケリンの構造は、図１に示されるが、他のミコバクテリアは、エキソケリンを生成でき、そして、エキソケリンは、異なる構造を有することができ、誘導されるものからミコバクテリアに依存して異なるアミノ酸を含有するものであることは知られている。然し乍ら、すべてのエキソケリンは、同様に挙動し、同様な分子量数列を有する継続的な部員で同様な系列で存在している。系列の異なる部員の効果性は、分子の比較極性に依存している。従って、本発明は、以下の他のミコバクテリア（但し、それらに限定されるものではない）から、生成されるエキソケリンを意図しているものである。即ち、Ｍ.（ミコバクチン）ツベルキュロシス(tuberculosis)、Ｍ．ミクロチ(mi croti)、Ｍ．ボビス(bovis)、Ｍ．アフリカヌム(africanum)、Ｍ．カンサシイ（ kansasii)、Ｍ．マリナム(marinum)、Ｍ．ガストリ(gastri)、Ｍ．ノンクロモゲニカム(nonchromogenicum)、Ｍ．テラエ(terrae)、Ｍ．トリバレ(trivale)、Ｍ．マルモエンス(malmoense)、Ｍ．シモイデイ(shimoidei)、Ｍ．ゴルドナエ(gor donae)、Ｍ．アシアチカム(asiaticum)、Ｍ．スズルガイ(szulgai)、Ｍ．シミアエ(simiae)、Ｍ．スクロフラセウム(scrofulaceum)、Ｍ．アビウム(avium)、Ｍ．イントラセルラレ(intracellulare)、Ｍ．ゼノピ(xenopi)、Ｍ．ウルセランス (ulcerans)、Ｍ．ハエモフィラム(haemophilum)、Ｍ．フェルキノゲネス(farcin ogenes)、Ｍ．レプラエムリウム(lepraemurium)、Ｍ．パラツベルキュロシス(pa ratuberculosis)、Ｍ．キロナエサブスペシキロアエ(chelonae subsp．chel onae)、Ｍ.キロナエサブスペシアブスセサス(chelonae subsp．abscessus) 、Ｍ．フォルツイツム(fortuitum)、Ｍ．シタエ(chitae)、Ｍ．セネガレンス(se negalense)、Ｍ．アグリ(agri)、Ｍ．スメグマチス(smegmatis)、Ｍ．フレイ（p hlei)、Ｍ．ツエルモレシスチビル(thermoresistibile)、Ｍ．アイチエンス(aic hiense)、Ｍ．アウラム(aurum)、Ｍ．ツブエンス(chubuense)、Ｍ．ヂュバリエ( duvalii)、Ｍ．フラベセンス(flavescens)、Ｍ．ガジウム(gadium)、Ｍ．ギバム (givum)、Ｍ.コモセンス(komossense)、Ｍ.ネオアウラム(neoaurum)、Ｍ.オブエンス(obuense)、Ｍ．パラフォルツイトム(parafortuitum)、Ｍ．ロデシアエ(rho desiae)、Ｍ．スファグニ(sphagni)、Ｍ．トカイエンス(tokaiense)或いは、Ｍ．バキャエ(vaccae)から生産されるエキソケリンを意図する。エキソケリンが、その溶解度特性、金属キレート化能力或いは細胞吸収度を効果的に変えることができることをも目的とする。更に、変成エキソケリン或いはその金属キレート化状態のエキソケリンを、診断器具として、モノクロナール抗体或いは化学分析法を用いて、検知し、病気状態の進展度或いは処置の効果をモニターするために、血液分析、尿分析或いは侵入性でない処置技術により、検査する。特に、図１０に示される金属含有及び金属なしの化合物の構造を目的とするものである。但し、 R₁＝(CH₂)_nCH₃、線形或いは分枝鎖として；(CH₂)_nCOOH、脂肪酸として、 (CH₂)_nCOOR、脂肪酸エステル（但し、Ｒはアルキル基）として；(CH₂)_nCONH₂ ； R₂＝アルキル基、スルフォンアミド、ヒドロキシル、ハロゲン、アセチル、カルバモイル、アミン、NO₂或いはそれらの組合せの４の開環位置にある置換部である。 R₃−H（セリン）或いはCH₃（トレオニン）は、環状オキサゾリン構造を形成できる、β−ヒドロキシアミノ酸上に見られる側鎖により、置換できる。 R_4a及びR_5b＝H、CH₃或いは他のアルキル或いは置換アルキル基： R_5a及びR_5b＝H、CH₃或いは他のアルキル或いは置換アルキル基： X＝0、NH、S、CH₂： M＝Pb、Al、Cd、Ni、Ag、Au、As、Mg、Mn、Ｚn、Ｃu、Ru、Nb、Zr、Ta、V、Ga 、pt、Cr、Sc、Y、Co、Ti、Na、Kのような一価、二価或いは三価金属； ^*は、Ｒ或いはＳのキラール中心を示す。金属をキレート化するに含有される種々のヒドロキシ基（ＯＨ）は、Ｈ或いはハロゲンのような種々の機能基により置換され、キレート化された金属のための化合物の親和性を変え、或いは、分子を金属拮抗質に変換するものである。本発明は、特定の好適なもの及びその用途について、詳細に説明したが、他の種々のもの及び用途も可能である。例えば、エキソケリンは、ミコバクテリアの受容位置を鉄でブロックし、身体から金属の毒性レベルを除去し、或いは、所望の金属を、身体に分配することにより、Ｍ．ツベルキュロシスのような感染バクテリアを攻撃することに用いることができる。更に、エキソケリン含有の変成金属は、付属の活性薬剤或いは化学剤を、好適にキレート化金属を吸収する、身体の部位に分配でき、そして、キレート化された金属を好適に吸収したエキソケリンは、ガン細胞の低温熱処理のためのマイクロ波エネルギーのような他の様式により処理されるターゲットとして用いることができる。従って、請求項に記載の精神及び範囲は、ここで記載した好適なものの説明に限定されるものではない。

【手続補正書】特許法第１８４条の４第４項【提出日】１９９６年８月２９日（１９９６．８．２９）【補正内容】請求の範囲１．効果的な量のデスフェリンエキソケリンを含有し、その効果的な量は、その身体組織への流体の流れが再構築されるに伴い、生体組織に投与されるべきものであり、その身体器官への血流が制限された後に、身体器官への流体の流れが再構築された後に、形成されるヒドロキシ遊離ラジカルとの接触により生成する損傷から哺乳動物中の生体組織を防御するため組成物。２．デスフェリエキソケリン類を、該流体の投与の前に投与することを特徴とする請求項１に記載の組成物。３．デスフェリエキソケリン類を、少なくとも、該流体の投与が始まる時間に、投与することを特徴とする請求項１に記載の組成物。４．デスフェリエキソケリン類を、該流体の投与の開始から約１５分以内に投与することを特徴とする請求項１に記載の組成物。５．生体組織は、心筋層であり、該流体は、再潅流溶液及び心臓組織再生溶液よりなる群から選択されたことを特徴とする請求項１に記載の組成物。６．該組成物は、式（但し、R₁は(CH₂)_NCOOCH₃及び(CH₂)_XCH=CH(CH₂)_yCOOCH₃(但し、Nは１〜７であり、x+yは１〜５であり、R₃はH及びCH₃よりなる群から選択される)H及びCH₃よりなる群から選択される）を有する少なくとも１つのデスフェリエキソケリンの効果的量を含有し、そのデスフェリエキソケリンは、約７１６〜約８２６ダルトンの分子量を有することを特徴とする請求項１に記載の組成物。７．７７２〜７８４ダルトンの分子量を有するデスフェリエキソケリンの混合物を含有することを特徴とする請求項６に記載の組成物。８．該組成物は、Ｎが５〜７の全数であることを特徴とする比較的に極性のないデスフェリエキソケリンの混合物を含有することを特徴とする請求項６に記載の組成物。９．該組成物は、ｘ＋ｙが４或いは５であることを特徴とする比較的に極性のないデスフェリエキソケリンの混合物を含有することを特徴とする請求項６に記載の組成物。１０．式（但し、R₁は(CH₂)_NCOOCH₃及び(CH₂)_XCH=CH(CH₂)_yCOOCH₃(但し、Nは１〜７であり、x+yは１〜５であり、R₃は、H及びCH₃よりなる群から選択され、そのデスフェリエキソケリンは、約７１６〜約８２６のダルトンの分子量を有する）を有する少なくとも１つのデスフェリエキソケリンの効果量を含有することを特徴とする鉄媒介のヒドロキシラジカル形成の存在から哺乳動物中の生体組織の損傷することを防護するための組成物。１１．式（但し、R₁は(CH₂)_nCH₃、(CH₂)_nCOOH及び(CH₂)_nCOOR(但し、Rはアルキル基及び( CH₂)_nCONH₂である)からなる群から選択された化学部分であり： R₂は、環の４つの開環位置のいずれかで置換された化学部分であり、化学部分は、アルキル基、スルフォンアミド、ヒドロキシ、ハロゲン、アセチル、カルバミル、アミン及びNO₂及びそれらの組合せからなる群から選択され、 R₃は、環状オキサゾリン構造を形成することのできる、β−ヒドロキシアミノ酸上に形成された側鎖よりなる群から選択された化学部分であり、 R_4a、R_4b、R_5a、R_5bは、Ｈ、アルキル基及び置換アルキル基よりなる群から選択される化学部分であり、そして、^* は、Ｒ或いはＳになるキラール中心を示す）を含有し、医療条件を処置するため、哺乳動物への活性化合物の効果量を与えるための組成物。１２．該化合物は、飽和及び不飽和の化合物からなる群から選択され、飽和化合物は、７１６、７３０、７４４、７５８、７７２、７８６、８００、８１４及び８２８ダルトンの質量を有し、不飽和化合物は、７４２、７５６、７７０、７８４、７９８、８１２及び８２６ダルトンの質量を有することを特徴とする請求項１１に記載の組成物。１３．溶液中の金属に接触させたときに、式（但し、Ｍは、鉄、鉛、アルミニウム、カドミウム、ニッケル、銀、金、砒素、マグネシウム、マンガン、亜鉛、銅、ルビジウム、ニオビウム、ジルコニウム、タンタル、バナジウム、ガリウム、白金、クロム、スカンジウム、イットリウム、コバルト、チタニウム、ナトリウム及びカリウムからなる群から選択される）を有する金属キレート物を形成することを特徴とする請求項１１に記載の組成物。１４．Ｍが鉄である請求項１３に記載の金属キレート物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ )，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ホロウィッツ，マーカスエイアメリカ合衆国カリフォルニア州 90077 ロスアンジェルスストラデラロード 1275 (72)発明者ギブソン，ブラッドフォードダブリューアメリカ合衆国カリフォルニア州 94702 バークレイペラルタアベニュー 1324 (72)発明者リーヴ，ジョセフアメリカ合衆国カリフォルニア州 93644 オークハーストロード 423 52419

Claims

【特許請求の範囲】１．生体組織への流体の流れを、再構築すると共に、効果的な量のデスフェリエキソケリンを含有する組成物を、哺乳動物に投与することを特徴とする、その身体器官への血流が制限された後に、身体器官への流体の流れを再構築するときに、形成されるヒドロキシ遊離ラジカルと接触することにより、生成する損傷から哺乳動物中の生体組織を防御する方法。２．デスフェリエキソケリン類を、該流体の投与の前に投与することを特徴とする請求項１に記載の方法。３．デスフェリエキソケリン類を、少なくとも、該流体の投与が始まる時間に、投与することを特徴とする請求項１に記載の方法。４．デスフェリエキソケリン類を、該流体の投与の開始から約１５分以内に投与することを特徴とする請求項１に記載の方法。５．生体組織は、心筋層であり、該流体は、再潅流溶液及び心臓組織再生溶液よりなる群から選択されたことを特徴とする請求項１に記載の方法。６．該組成物は、式（但し、R₁は(CH₂)_NCOOCH₃及び(CH₂)_xCH=CH(CH₂)_yCOOCH₃(但し、Nは１〜７であり、x+yは１〜５であり、R₃はH及びCH₃よりなる群から選択される)H及びCH₃よりなる群から選択される）を有する少なくとも１つのデスフェリエキソケリンの効果的量を含有し、そのデスフェリエキソケリンは、約７１６〜約８２６のダルトンの分子量を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。７．該組成物は、７７２〜７８４ダルトンの分子量を有するデスフェリエキソケリン混合物を含有することを特徴とする請求項６に記載の方法。８．該組成物は、Ｎが５〜７の全数であることを特徴とする比較的に極性のないデスフェリエキソケリンの混合物を含有することを特徴とする請求項６に記載の方法。９．該組成物は、ｘ＋ｙが４或いは５であることを特徴とする比較的に極性のないデスフェリエキソケリンの混合物を含有することを特徴とする請求項６に記載の方法。１０．式（但し、R₁は(CH₂)_NCOOCH₃及び(CH₂)_xCH=CH(CH₂)_yCOOCH₃(但し、Nは１〜７であり、x+yは１〜５であり、R₃はH及びCH₃よりなる群から選択され、そのデスフェリエキソケリンは、約７１６〜約８２６のダルトンの分子量を有する）を有する少なくとも１つのデスフェリエキソケリンの効果量を含有することを特徴とする鉄媒介ヒドロキシラジカル形成の存在から哺乳動物中の生体組織が損傷することを防御するための組成物。１１．式（但し、R₁は(CH₂)_nCH₃、(CH₂)_nCOOH及び(CH₂)_nCOOR(但し、Rはアルキル基及び( CH₂)_nCONH₂である)からなる群から選択された化学部分であり： R₂は、環の４つの開環位置のいずれかで置換された化学部分であり、化学部分は、アルキル基、スルフォンアミド、ヒドロキシ、ハロゲン、アセチル、カルバミル、アミン及びN0₂及びそれらの組合せからなる群から選択される）を有する組成物であり、医療条件を処置するため哺乳動物への活性化合物の効果量を与えるための組成物。