CZ288996A3

CZ288996A3 - Novel iron chelating agent as inhibitor of iron mediated oxidation

Info

Publication number: CZ288996A3
Application number: CZ962889A
Authority: CZ
Inventors: Lawrence Horwitz; Marcus A Horwitz; Bradford W Gibson; Loseph Reeve
Original assignee: Univ California
Priority date: 1995-02-03
Filing date: 1996-01-26
Publication date: 1997-04-16
Also published as: EA199600078A1; HUP9603036A3; HU9603036D0; MX9604499A; PL316612A1; PL182414B1; EP0754044A1; AU699916B2; KR100325970B1; HUP9603036A2; US5721209A; CN1145588A; EA000176B1; AU4674496A; DE69636267T2; ATE330610T1; EP0754044B1; WO1996023502A1; DE69636267D1; JP3511139B2

Description

Předložený vynález se týká chemické struktury dříve j neidentifikované skupiny železo vázajících sloučenin s vysokou- · ~~ afinitou, předchozími výzkumníky nazvaných exocheliny, které jsou uvolňovaný mykobakteriem1. Vynález se rovněž týká modifikací těchto nově identifikovaných sloučenin, které mají změnit fyziologické vlastnosti a používání těchto nově identifikovaných a modifikovaných sloučenin.

Dosavadní stav techniky

Při akutním infarktu myokardu je srdeční tkáň poškozena dvěma po sobě následujími příhodami, hypoxií v ischemické fázi a oxidačním poškozením ve fázi reperfuze. Poškození myokardu v ischemické fázi může být odvráceno obnovením oběhu krve do ischemické oblasti. Avšak reperfuze může mít za následek poškození jako výsledek zánětlivé odezvy ve tkáni s obnoveným oběhem, způsobené migrací leukocitů do této tkáně a vznikem reaktivních kyslíkatých skupin. Jednou z nejreaktivnějších skupin je hydroxylová skupina (-0H), která vzniká v přítomnosti železa a která způsobuje odumírání buněk. Zabránění tvorbě (-0H) zabrání smrtelnému poškození buněk, vznikajícímu s uvedených příčin. Je známo, že tvorba (-0H) je závislá na přítomnosti volného železa a že sloučeniny, tvořící cheláty železa, zabrání reperfuznímu poškození- Například chelatotvorná sloučenina desferrioxamin, když je podána před reperfuzí, zabraňuje poškození a omezuje rozsah infarktu myokardu během okluze věnčité tepny a reperfuze. Reperfuzní poškození však nastává rychle po obnovení oběhu krve do ischemickém myokardu.

Tvorba radikálů (-0H) je závislá na přítomnosti volného železa; sloučeniny chelatující železo mohou odstranit volné železo a tak vázat železo, aby nebylo dostupné pro katalýzu tvorby hydroxylových radikálů, Avšak tyto dříve známé železochelatační materiály buď nezabránují tvorbě (-0H) Fentonovou reakcí (t.j. EDTA) nebo pronikají do buněk příliš pomalu (t.j. desferrioxamin), takže nejsou k dispozici v dostatečném množství pro dostatečně rychlé chelatování dostatku železa, aby se zabránilo tvorbě (-0H) a následnému zničení buněk. Desferrioxamin byl prokázán jako účinný, když byl podán před vznikem infarktu myokardu, ale jako neúčinný, jestliže byl podán při nebo po náběhu reperfuze.

Obdobné poškození srdeční tkáně může nastat jako následek bypasových procedur, například během otevřené operace srdce nebo jiných tělesných orgánů, jestliže tyto orgány jsou zbaveny oxidované krve následkem chirurgického zákroku nebo zranění.

Exocheliny byly stručně popsány a jejich obecná funkce při růstu mykobakterií byly diskutovány Machamem, Ratlegem a Barclayem na univerzitě v Hulí v Anglii (Lionel P. Máchám, Colin Ratledge a Jennifer C. říocton, Získávání extracelulárního železa mykobakteriemi= úloha exochelinů a důkaz proti účasti mycobactinu, Infection and Immunity, sv. 12, č. 6, s. 1242-1251, prosinec 1975; Raymond Barclay a Colin Ratledge, Mycobactiny a exocheliny z Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium africanun a jiných příbuzných druhů“ Journal of General Microbiology, 134,

771-776, (1988); L.P. Máchám a C- Ratledge, Nová skupina ve vodě rozpustných, železo vázajících sloučenin z mykobakterií^:exocheliny, Journal of General Mikrobiology, 89, 379-282, (1975))- Máchám identifikoval existenci substance nalezené v extraculární tekutině, kterou uvádí jako exochelin. Popsal exochelin jako ve vodě a v chloroformu rozpustnou sloučeninu, mající schopnost chelatovat volné železo. Podle Machama má tento materiál podobnost s mycobactinem, který se nachází v buněčné stěně a jehož funkcí je přenos železa do nitra buňky.

Avšak na rozdíl od tohoto Je mycobactin lipofiiní. ve vodě nerozpustná molekula, která není schopna difundovat do extracelulárního prostředí a asimilovat z něho volné železo. Máchám a spolupracovníci poznali, že exochelin působí při fyziologickém pH jako sběrač železa z jiných, v seru obsažených, železo vážících sloučenin, jako jsou transferrin nebo ferritin a poskytuje železo ve formě, která může být transportována do mycobactinu. Máchám a spol. neizolovali ani nevyčistili exocheliny, ale identifikovali je jako penta- nebo hexapeptidy, mající molekulovou hmotnost 750 až 800, obsahující 3 moly E-N-hydroxylysinu, EN-acetyl-EN-hydroxylysinu nebo EN-hydroxyornithinu a 1 mol threoninu. Rovněž v závislosti na bakteriologickém zdroji exochelinu odhalili, že molekuly mohou rovněž obsahovat β-alanin nebo kyselinu salicylovou.

Barclay (tamtéž) popsal výrobu exochelinů zedvaadvaceti různých kmenů Mycobacterium tuberculosis a příbuzných druhů. Avšak tito předchozí výzkumníci nestanovili specifickou strukturu exochelinů, ani neidentifikovali použití exochelinů jinak než v jejich funkci transportního media železa k mycobactinu, nacházejícímu se v buněčných stěnách.

Je tudíž potřebná substance, která může být snadno podávána v okamžiku reperfuze a která bude rychle chelatovat volné železo při jeho vytváření nebo bude k dispozici, aby se zabránilo tvorbě radikálů (-0H). Dále je třeba identifikovat specifickou strukturu exochelinů, tak aby jeho funkce mohla být dokonaleji pochopena a aby mohla být objasněna jeho použitelnost jako diagnostického, léčebného a preventivního prostredeku.

Podstata vynálezu

Těmto potřebám vyhovuje tento vynález, který zahrnuje použití exochelinů pro zabránění poškození živých tkání následkem tvorby nebo přítomnosti radikálů (-0H). Zejména je tento vynález zaměřen na podávání exochelinů infarktem postiženému myokardu před nebo souběžně s reperfuzí, aby se zabránilo poškození myokardu tvorbou volných radikálů, kterážto tvorba je zprostředkovávána železem- Rovněž je zde prezentována chemická struktura exochelinů a modikovaných exochelinů a rovněž jiné aplikace těchto materiálů při léčení a diagnostice chorob savcůTyto a jiné charakteristické rysy, aspekty a přednosti tohoto vynálezu budou lépe pochopitelné v odkazech na následující popis, připojené nároky a doprovodné nákresyPodrobný popis vynálezu

Bylo zjištěno, že exocheliny mohou blokovat nebo významně omezovat oxidační poškození tkáně, obecně uváděné jako reperfúzní poškození, které je způsobováno železem zprostředkovanou katalytickou reakcí tkáňových/volných radikálů, jako jsou hydroxylové radikály C-OH), zejména hydroxylové radikály vzniklé při Fentonově reakci- Dále bylo zjištěno, že exocheliny jsou účinné pro retardaci nebo prevenci reperfúzního poškození, jestliže jsou podány na začátku nebo souběžně s reperfuzíNavíc bylo zjištěno, že exocheliny zahrnují značně širší skupinu materiálů a mají jinou chemickou strukturu něž původně teoreticky vyvozovaly Máchám a spolupracovníci a Barclay a sp.

Bylo rovněž zjištěno, že tyto materiály mohou chelatovat širokou řadu kovů za vzniku materiálů, které dříve nebyly známé- Kromě zabránění reperfuznímu poškození mohou být správně modifikované exocheliny použity pro léčení určitých chorob, pro atakování určitých buněk, jako jsou rakovinové buňky a mohou být použity pro monitorování účinnosti léčby léky a detekovat přítomnost určitých chorobných stavů- Zejména je známo, že růst neuroblastomových buněk může být negativně ovlivněn odstraněním železa použitím Fe chelatační sloučeniny desferrioxaminu, aniž by byl podobně ovlivněn růstu normálních buněk. Jiné aplikace exochelinfl zahrnují léčení přebytku železa z transfuzí nebo z rakovinové chemotherapie, zejména při leukémii.

Po izolaci a vyčistění exochelinfl bylo zjištěno, že exocheliny jsou skupinou molekul, majících molekulové hmotnosti v určitém rozmezí a majících rflzné rozmanité postranní retězce. Dále, byly preparovány vyčištěné exocheliny a poprvé byla demonstrována jejich použitelnost jako zachycovačů volného železa a tím demonstrována jejich účinnost pro zabraňování tvorbě hydroxylových radikálů <-0H), které poškozují tkáň. Zejména byly izolovány vyčištěné exocheliny z Mycobacterium tuberculosis a byla ukázána jejich účinnost pro odstraňování železa z transferrinu, lactoferrinu a ferritinu při fyziologickém pH bez přenosu jakékoliv infekční vlastnosti bakterií, ze kterých byly odvozeny- Rovněž bylo prvně ukázáno, že tyto exocheliny blokují tvorbu hydroxylových radikálů z Fentovy reakce a na základě odezvy kardiomyocytfl mohou být účinné pro zabránění reperfuznímu poškození po infarktu myokardu nebo po vaskulárních poškozeních jiných tkání, jsou-li podány po vzniku ataku, jakož i několik hodin po této příhodě.

Zatímco mycobactiny byly v minulosti široce studovány, jednotlivé exocheliny nebyly izolovány ani čištěny a jejich struktura a složení nebyly dříve definovány. Dále jsme zjistili, že dřívější odkazy na exocheliny je charakterizovaly chybně a tak selhaly při identifikaci struktury těchto sloučenin. Zejména Máchám (tamtéž) je identifikoval jako pentanebo hexapeptidy, mající molekulovou hmotnost 750 až 800, obsahující 3 moly E-N-hydroxylisinu, EN-acetyl-EN-hydroxylisinu nebo EN-hydroxyornithinu a 1 mol threoninu. Zjistili jsme, že exocheliny mají značně širší rozsah molekulových hmotností, tvoří několik skupin sloučenin s identifikovatelnými rozdíly v molekulových hmotnostech, obsahují jenom 2 moly E-N-hydroxylisinu a nejsou to peptidy. Peptid je polymer aminokyseliny (NHa-CHR-COOH), vzniklý kondenzací karboxylové skupiny první molekuly s aminoskupinou jiné molekuly za vzniku amidové vazby (-CO-NH-). Exocheliny nelze považovat za peptidy.

Místo toho obsahují tri aminokyselinové a jiné strukturní skupiny (kyselinu salicylovou, dikarboxylové kyseliny nebo jejích monoesterové obdoby a hydroxykarboxylové kyseliny), vzniklé amidovou (-NH-CO-), hydroxamovou (-NH(OH)-CO-) nebo esterovou (-CO-Q-) kondenzací. Formy ferri- a desferri- jsou vyobrazeny na obr. 1Přehled obrázků na výkresech

Obraz 1 ukazuje chemickou strukturu molekuly Fe chelátu exochelinu (ferriexochelinu) a desferriexochelinu Cexochelinu bez železa).

Obraz 2 ukazuje eluční profil kultury filtrátu z Mycobacterium tuberculosis, monitorovaného na 220 nm a 450 nm.

Obraz 3 ukazuje eluční profil téhož filtrátu na 450 nm se zobrazením molekulární hmotnosti každého píku.

Obraz 4 ukazuje hmotového spektrum hlavního, šeřin obsahujícího exochelinu na m/z = 720,3 společně se strukturou z toho odvozenou.

Obraz 5 je graf ukazující na kardiomyocytech inhibici poškození buňky jako výsledek použití exochelinové směsi.

Obraz 6 je graf zobrazující na kardiomyocytech inhibici poškození buňky jako výsledek použití exochelinu 758CObrazy 7, 8 a 9 jsou grafická porovnání na kardiomyocytech inhibice poškození buňky jako výsledek použití exochelinu 758C, 772A a 772C.

Obraz 10 ukazuje chemickou strukturu molekul Fe chelátu exochelinu (ferriexochelinu) a desferriexochelinu (exochelinu bez železa) s vyznačením poloh pro modifikace.

Příklady provedení vynálezu

Příprava

Exocheliny se vyprodukovaly a vyčistily od virulentního (Erdman) a avirulentního (H37Ra) kmene Mycobacterium tuberculosis- Pro zvýšení produkce exochelinů z Mycobacterium tuberculosis se bakterie kultivovaly v mediu s nedostatkem železa. Zejména Erdmanův kmen Mycobacterium tuberculosis (Americká sbírka typů kultur - ATCC 35801) a H37Ra (ATCC 25177) se pěstoval na Middlebrookových 7H11 agarových deskách při 37°C v 5 * CO2- Po 14 dnech se bakterie sklidily, suspendovaly se do 150 ml modifikovaného Sautonova media v kultivačních baňkách a inkubovaly se 3 až 8 týdnů. Modifikované Sautonovo medium obsahovalo 0,12 mg/1 citrátu železitoamonného bez přídavku povrchově aktivního činidla.

Na železo bohaté exocheliny (ferriexocheliny) se potom izolovaly filtrací, saturovaly se železem a extrahovaly chloroformem a čistily vysokotlakou kapalnou chromatografií (HPLC). Kapalina nad sedlinou ze shora uvedené suspenze se filtrovala po sobě následujícími 0,8 pm a 0,2 jjm filtry pro zachycování nižších proteinů. Exocheliny se potom nasytily železem saturací nadsedlinového filtrátu chloridem železitým (150 mg na litr filtrátu kultury). Ferriexocheliny se smísily s chloroformem (1 objem filtrátu kutury na 1,5 objemu chloroformu) a, po separaci vrstev, se na exochelin bohatá chloroformová vrstva oddělila a uložila se pod bezvodý sírane hořečnatý (2 g/l). Chloroformový extrakt se přefiltroval pres skleněný filtr a rotačně se odpařil, přičemž zanechal hnědé reziduum.

Hnědé reziduum se dále čistilo suspendováním v 5 ml prvního pufrovaného roztoku (0.1 % kyseliny trifiuoroctové), který se zavedl do kolony pro kapalinovou chromatografií (patrona C-18 Sep-Pak). Hnědý proužek, který se vytvořil blízko vrchu kolony, se eluoval druhým pufrem (0,1 % TFA, 50 % aceto8 nitrilu). Částečně vyčištěný materiál se potom rozpustil v trojnásobku 0.1 % trifluoroctové kyseliny a podrobil se reverzní fázi vysokotlaké kapalinové chromatografie při objemové rychlosti 1 ml/min, následovanou chromatografováním na koloně s náplní C-18. Přítomnost na železo bohatých exochelinfl v HPLC eluátu se detekovala simultánním monitorováním UV absorbance 450 nm píku (sloučeniny železa) a 220 nm píku, který indikuje přítomnost amidové a aromatické skupiny- Přibližně 5 hlavních a 10 menších píkfl, zobrazených na obr. 2, eluovaných z finálního kolony s náplní C-18, vykazovalo vysoký absorbanční poměr 450/220 nm. Hmotová spektrometrie potvrdila, že se jedná o exocheliny- Hlavní píky byly dále čištěny druhou reverzní fází HPLC na alkylfenylové koloně- Exocheliny, získané z Erdmanova kmene Mycobacterium tuberculosis, byly identické s exocheliny které byly získány z kmene H37Ra.

Charakter i s t i ka

Na základě LSIMS a ESI-MS analýz četných píkfl, v jejich formě ferri- (Fe³⁺), eluovaných z kolony (viz- obr. 3), se exocheliny železa neomezují na dvě specifické molekuly popsané shora, ale obsahují skupinu sloučenin s hmotnostmi od 716 do 828 daltonfl. Každý člen této skupiny se jeví jako odlišující se od svého souseda o 14 daltonfl, odrážejíce tak počet CHa skupin v a1kýlovém postranním řetězci Ri a/nebo o 2 daltony, odrážejíce tak přítomnost dvojné vazby v alkylovem postranním řetězci Ri. Podle toho se exocheliny jeví jako tvořící dvě rady s následnými členy v každé radě lišícími se v hmotnosti o 14 daltonfl, nasycená řada mající hmotnosti přibližně 716, 730,

744, 758, 772, 786, 800, 814 a 828 daltonfl a nenasycená řada mající hmotnosti 742, 756, 770, 784. 798, 812 a 826- Kromě toho, jak potvrdila aminokyselinová analýza, přítomnost nebo absence methylové skupiny v R3 (t.j H nebo CH3) dále definuje další dvě řady molekul, uváděných jako serinová (R3 = H) a threoninová (R3 - CH3> řada. Nejpolárnější sloučeniny jsou na grafu vlevo (eluované dříve) a nejméně polární (nejvíce rozpustné v lipidu) jsou vpravo. Všechny tyto píky jsou však rozpustné ve vodě. Kde byl nalezen více než jeden pík se stejnou molekulovou hmotností, tak je každý pík dále označen A,

B nebo C (t.j. 758A, B a C), aby se označila úroveň polarity, kde A představuje nejpolárnější sloučeninu a C představuje formu nejméně polární. Předpokládá se, že nejpolárnějí formy dávají methylové skupiny, připojené na různých místech molekuly.

Struktura exochelinu

Obraz 4 ukazuje výsledek tandemové hmotnostní spektrometrické analýzy při vyvolané disociaci (He na hladině 2 keV pro kolizní energii 6 keV) hlavního nasyceného, serin obsahujícího, desferriexochelinu s (Μ + Η)^-·· při m/z 720,3. Fragmentové ionty byly přiřazeny k jedné ze šesti strukturních skupin A-F, vzniklých ze štěpných produktů, generovaných poblíž amidových nebo esterových vazeb vodíkovým transferem, odpovídajících neutrální molekule, asociovaných s každým z píků, indikovaných na spektru vyobrazeném na obr. 4. Kyselá hydrolýza a methylace exochelinů má za následek tvorbu kyseliny salicylové a kyseliny pimelové. Hmotnostní spektrografická analýza naznačuje, že kyselina pimelová je v exochelinu přítomná jako metylester.

Na základě těchto analýz je obecná struktura ferriexochel i nů a desferriexochelinů ukázána na obraze 1. Methylová skupina, která je zobrazena v pozici R-4 (viz obr. 10), může být v poloze Rs - Fe-exochelinové jádro molekuly je kruhovité s železem ve svém středu. Obsahuje 3 aminokyselinové skupiny (dvě N-hydroxylysinové a 1 serinovou nebo threoninovou, podle toho, zda R3 je vodík nebo methylová skupina). Hlavní rozdíl mezi exocheliny a mycobactiny z Mycobacterium tuberculosis spočívá v tom, že Ri v exochelinech existuje buď jako nasycený a1kymethy1ový ester ((CH2)nC00CH3) nebo jako alkyImethylester s jednou nenasycenou vazbou ((CHa)x“CH(CH2)yC00CH3 a exocheliny mají značně kratší alkylový postranní řetězec než mycobactiny s těmito kratšími postranními řetězci končícími v methylestero10 vých skupinách. Tyto rozdíly jsou příčinou rozpustnosti exochelinů ve vodě a jejich funkčnosti v extracelulárním prostředí.

V dole uvedených příkladech jsou různé exocheliny. jak ve formě desferri-, tak ve formě ferri-, identifikovány molekulovou hmotností, jak je vidět na eluční křivce na obr. 3.

Příklad 1

Srdce samce krysy bylo po anestezi krysy excidováno, byla provedena thorakotomie a srdce bylo ochlazenu in šitu. Excidované srdce bylo potom umístěno do Langendorffova přístroje a promýváno kolagenazou a hyaluronidazou v 50 μΜ vápníku v modifikovaném Krebs-Ringerově pufrovem roztoku. Tkáň byla potom jemně rozmělněna a dispergována v kolagenazo/tripsinovém roztoku, přefiltrována do studeného tripsinového inhibitorového roztoku a vystavena zvýšené koncentraci vápníku. Po odstranění poškozených buněk byla zbývající buněčná suspenze umístěna do několika tence povlečených plastikových misek společně s kulturním mediem, obsahujícím 5 % fetalníního hovězího sera.

Po 48 hodinách ponechání kultury v klidu byl do každé misky přidán peroxid vodíku a v různých časových intervalech byla měřena aktivita dehydrogenazolaktatu (LDH), která je indikativní. pro poškození buněk- Index poškození buněk (Cil) po porovnávací účely byl získán měřením LDH v neexponované buněčné kultuře za podmínky původního stavu (index 0) a po vystavení vlivu detergentu. který štěpí 100 % myocytů (1 % Triton X-100), představující Cil 100. Potom bylo stanovováno LDH za specifických pracovních podmínek pro různé časové intervaly, byla stanovována odpovídající hodnota Cil a jednotlivé výsledky byly do grafu vynášeny proti času (obraz 5>.

S použitím shora popsaného způsobu byla izolována a použita pro ošetření buněčných kultur relativně nepolární substance, směs desferri-formy exochelinů 772C a 784 (směs 50= píku 772C a píku 784). Exochelin byl konvertován na desf err iexochel inovou formu inkubací po dobu několika dnů s 50 mllimolárním EDTA při pH 6. Desferri-forma potom byla vyčištěna chloroformovou extrakcí.

Tri vzorky buněk byly vystaveny buď a) H2O2. b) H2O2 a 50 juM desf err iexochel inu (exochelin bez železa) přidaným souběžně nebo c) H2O2 přidaným 2 hodiny po přidání 100 uM desferriexochelinu k buněčné kultuře (preinkubace). Neošetřená buněčná kultura vykazovala po 4 hodinách téměř 62 % poškození buněk. V kontrastu s tímto přídavek exochelinu společně nebo 2 hodiny před přídavkem peroxidu vodíku zabránil podstatně poškození buněk nebo poškození významně omezil, poškozeno bylo přibližně 2 až 9 % buněk.

Příklad 2

Způsob z příkladu 1 byl opakován s desferriexochelinem 758C. který je relativně polárnější než exocheliny 772C a 784. Existovaly malé nebo žádné rozdíly v účinnosti, když byl desferriexochelin 758C dávkován společně nebo v intervalu 15 minut od dávkování H2O2- V obou případech po 2 hodinách bylo poškození buněk v podstatě stejné jako kontrolní. Avšak dávkování desferriexochelinu 758C 2 hodiny před zavedením H2O2 způsobí snížení poškození buněk na hodnotu Cil rovnou 20. Výsledky jsou zobrazeny na obr. 6.

Příklad 3

Způsob shora uvedený byl opakován s použitím desferriexochelinu 772A. 772C a 758C. V obrazech 7-9 jsou zakresleny výsledky pro dávkování 2 hodiny předem, pro simultánní dávkování a pro dávkování exochelinů s 20 minutovým opožděním. Jenom exochelin 772C vykazuje retardaci poškození za všech podmínek, zatímco exochelin 772A je neúčinný za kaýchkoliv podmínek. Exochelin 758C naopak vykazuje ochranu lenom tehdy, je-li dávkován 2 hodiny před zavedením peroxidu.

Z toho se tedy vyvozuje, že relativně nepolární, více v lipidech rozpustné exocheliny jsou účinné, jsou-li podány s nebo po vytvoření radikálů C-OH). t.zn. po vzniku poškození; polárnější exocheliny musí být podány, aby se zabránilo poškození buněk. 1 až 2 hodiny před tím, než nastane příhoda tvorby volných radikálů

Příklad 4

Kapacita exochelinů v soutěži o železo s hostitelskými železo vázajícími proteiny byla stanovována inkubací desferriexochelinu roztoky transferrinu, laktoferrinu nebo ferrinu při molárních poměrech železa k exochelinu 4^;1 a 1=1. Konverze exochelinu z jeho desferri- na jeho ferri- form^, byly potom stanovována reverzní fází HPLC. Během jedné minuty po vystavení desferriexochelinu vlivu 95 % železen nasyceného transferrinu začal exochelin přijímat železo od transferrinu a během jedné hodiny byl exochelin zcela saturován železem. Železo bylo rovněž pohotově odstraňováno z 40 % železem nasyceného transferrinu, což aproximuje hladinu železa v transferrinu na hodnotu jaká je v seru. Podobné výsledky byly získány, když desferriexochelin byl vystaven vlivu železem nasycenému laktoferrinu. Podobně i ferritin uvolňoval železo do exochelinu, ale pomaleji než ostatní železo vázající proteinyRovněž bylo objeveno, že exocheliny jsou velmi účinné ve sbírání volného železa ve fyziologických systémech a v odnímání železa z železo vázajících proteinů- Zejména bylo zjištěno, že exochelin účinně blokuje tvorbu hydroxylových volných radikálů C-OH) a tak významně omezuje nebo zabraňuje poškození ischemické tkáně po obnovení oběhu krve v tkáni, přičemž exocheliny s vyšší molekulovou hmotností, méně polární, jsou účinnější pro zabránění poškození buněk. Zatímco užitek pro srdeční tkáň již byl ukázán, užitek pro použití exochelinů po přerušení krevního oběhu k jiným tělesným orgánům, včetně mozku, ledvin, láteř, střev a kosterního svalstva, ale nikoliv omezený len na tyto, le nyní zřelmý.

Pokusy ukázaly, že afinita exochelinů není omezena na železo, ale že mohou být chelatovány i line kovy, lako Na, K, Mn, Mg, Al a Zn. Proto mohou bý exocheliny použity pro dodávání do těla různých žádoucích kovů nebo pro chelatování různých kovů, v těle nežádoucích- Dále le známo, že určité buňky, včetně určitých rakovinových buněk, potřebu!í kovy nebo že malí afinitu k různým kovům. Toto může být využito pro dodávání reaktivních sloučenin, vázaných na exocheliny, do těchto buněk, aby se buňky zničily (chemotherapie) nebo pro nasměrování výhodného léku, vázaného na exochelin, na nemocný orgán.

Opačně, lelikož určité rakovinové buňky malí vysokou spotřebu železa, tak aby se tak zabránilo dodávání železa rakovinovým buňkám, může být desferriexochelin použit pro vázání volného železa, což bude mít za následek destrukci rakovinových buňek.

Zatímco struktura exochelinů, které byly získány z Mycobacterium tuberculosisi le vyobrazena na obr. 1, tak le známo, že i liné mycobacterie mohou produkovat exocheliny a že tyto exocheliny mohou mít linou strukturu a obsahovat liné aminokyseliny, v závislosti na mykobakteriích, ze kterých vznikly. Avšak všechny exocheliny se budou chovat podobně a budou existovat v podobných řadách s následnými členy s podobně stoupalícími molekulovými hmotnostmi- Účinnost lednotlivých členů těchto řad bude rovněž závislá na relativní polaritě molekul. Proto vynález počítá s exocheliny generovanými linými mykobakteriemi, včetně Mycobacterium tuberculosis, M. microti, M. bovis, M. africanum, M- kansaii, M. marinum, M. gastri, M. nonchromogenicum, M. terrae, M. trivale, M. malmoense, M. shimodei, M. gordonae, M. asiaticum, M. szulgai, M. simiae, M. scrofulaceum. M. avium, M. intracellulare, M. xenopi, M. ulcerans, M. haemophi 1um, M. farcinogenes. M. lepraemurium, M. paratuberculosis, M. chelonae subsp. chelonae, M. chelonae subsp. abscessus, M. fortuitum, M. chitae, M. senegalense, M. agri, M. smegmatis, M. phlei, M. thermoresistibile, M- aichi14 ense, M. aurun, M. chubuense, M- duvalii, M- flavescens, Μ. gadium, M- givum, M- komossense, M. neoarum, M. obuense, M. parafortuitum, M. rhodesiae, M. sphagni, M. tokáiense nebo M. vaccae, ale nikoliv s omezením jenom na tyto.

Počítá se rovněž s tím, že exocheliny mohou být modifikovány tak, aby se ovlivnila jejich rozpouštěcí vlastnosti, schopnost chelatace kovů nebo míra buněčné absorpce. Kromě toho detekce modifikovaných exochelinů nebo exochelinů v jejich kovochelatovém stavu, použití monoklonálních protilátek nebo chemická analýza jako diagnostický nástroj, při analýze krve, analýze moči nebo nedestruktivních nástrojových technikách, pro monitorování progrese chorobného stavu nebo účinnosti léčby. Zejména, s odkazem na strukturu kov obsahujících sloučenin a sloučenin bez kovu, vyobrazených na obr. 10, se počítá s následujícími substitucemi:

Rl = (CH2>nCH3 jako lineární nebo rozvětvený řetězec; CCH2>nC00H, mastná kyselina; (ClfejnCOOR, ester mastné kyseliny, kde R je alkylová skupina; (CH2>nC0NHa:

R2 = substituce některého ze 4 míst otevřeného kruhu alkylovými skupinami, sulfonamidy, hydroxylem, halogenem, acetylem, karbamylem, aminy, NO2 nebo nějakými jejich kombinacemi:

R3 = H (šeřin) nebo CH3 (threonin) může být nahrazen postranními řetězci nacházejícími se na β-hydroxyaminokyse1inách, které jsou schopné vytvářet cyklické oxazolinové strukturyR^a a R-ib = H, CH3 nebo jiná alkylová nebo substituovaná alkylová skupina;

Rsa a Rsb = H, CH3 nebo jiná alkylová nebo substituovaná alkylová skupina;

X - O, NH. S. CH2 ;

M = mono-, di- nebo trivalentní kov, jako Pb. Al. Cd, Ni, Ag, Au, As, Mg, Mn, Zn, Cu, Ru, Nb, Zr, Ta, V, Ga. Pt, Cr, Sc, Y, Co, Ti, Na, K;

* představuje středy chirality, které mohou být R nebo S;

Rflzné hydroxylové skupiny (OH), které se podílejí na chelataci kovu mohou být nahrazeny různými funkčními skupinami, jako je H nebo halogen, aby se měnila afinita sloučeniny k chelatovanému kovu nebo aby se konvertovala molekula na kovový protějšek.

Ačkoliv tento vynález byl popsán do značných podrobností s odkazy na určité výhodné obměny a jejich použití, tak jsou možné i jiné obměny a jiná použití. Například, exocheliny mohou být použity k atakování infekčních bakterií, jako jsou Mycobacterium tuberculosis, blokováním přístupu bakterií k železu, pro odstraňování toxické hladiny kovu z těla nebo pro dodání žádoucích kovů tělu. Dále, modifikované, kov obsahující exocheliny mohou dodávat připojená léčiva nebo chemikálie do míst v těle, která přednostně absorbují chelatovaný kov a přednostně absorbované exocheliny s chalatovanými kovy mohou být použity jako cílová místa pro léčení jinými modalitami, jako je mikrovlnná energie pro hypothermní léčení rakovinových buněk. Proto duch a rozsah připojených nároků by neměl být omezen na popis výhodných obměn zde obsažených.

Klinická využitelnost

Klinická využitelnost podávání exochelinů pro zabránění reperfuznímu poškození byla demonstrována aplikací na myocytech dospělých krys.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY ' ý* -J ·Ί 3 · w ’ rj -'n 3

1 ‘ vyznačující se tím, že obsahuje účinné ;· _; c, n - ‘ · ’ ' i množství desferriexochelinu a tím, že řečené účinné $ množství se podává živé tkáni v souvislosti s obnovením -__toku tekutiny do tkáně.

1. Prostředek pro ochranu živé tkáně savce před poškozením způsobeným vystavením vlivu hydroxy1ového volného - ^{z :} ~ j radikálu, vytvořeného po obnovení toku tekutiny do ϊ 1 *4 7ϊ * 1 tělesného orgánu po omezení průtoku krve do tohoto brgánu, 1

2. Prostředek podle nároku, 1 vyznačující se tím, že desferriexocheliny jsou podávány před podáním tekut i ny.

3. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že desferriexocheliny nejpozději před začátkem podávání tekutiny.

4. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že desferriexocheliny jsou podávány během patnácti mihnut po začátku podávání tekutiny.

5. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že živá tkáň je myokard a tekutina je vybrána ze skupiny skládající se z reperfúzního roztoku a kardioplezního roztoku

6. Prostředek podle nároku 1, vyznačující se tím, že prostředek obsahuje účinné množství nejméně jednoho desferriexochelinu, který má obecný vzorec I;

kde Ri je vybrán ze skupiny skládající ze z <CH2>nC00CH3 a CCH2)xCH=CH(CH2)yC00CH3 s n od 1 do 7 a x + y od 1 do 5 a R3 je vybraný ze skupiny skládající se z H a CH3 a tím, že řečené desferriexocheliny mají molekulovou hmotnost 716 až 826 daltonů7. Prostředek podle nároku 6, vyznačující s e tím, že obsahuje směs desferriexochelinů majících molekulové hmotnosti 772 a 782 dáitonů.

7.

8. Prostředek podle nároku 6, vyz na čující se tím, že obsahuje směs relativně nepolárních desferriexochellnů a tím, že n je celé číslo od 5 do

9. Prostředek podle nároku 6. vyz na čující se tím, že obsahuje směs relativně nepolárních desferriexochelinů a tím, že x + y je 4 nebo 5.

10. Prostředek pro zabránění poškození živé tkáně savce následkem přítomnosti železem zprostředkované tvorby hydroxylových radikálů, vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství nejméně jednoho desferriexochelinu, který má obecný vzorec I.

kde Ri je vybrán ze skupiny skládající ze z CCHa>nC00CH3 a (CH2)xCH=CHCCH2>yC00CH3 s n od 1 do 7 a x + y od 1 do 5 a Rj je vybraný ze skupiny skládající se z H a CH3 a tím, že řečené desferriexocheliny mají molekulovou hmotnost 716 až 826 daltonů.

11. Prostředek pro dodávání účinného množství aktivní sloučeniny savci pro medicinální ošetření, vyznačující se tím, řečený prostředek má obecný vzorec II=

X kde Ri je chemická skupina vybraná ze skupiny skládající se z <CH2>nCH3, (CHzínCOOH, <CH2>_nC00R, kde R je alkylová skupina a (CH2)nC0NH2:

R2 je chemická skupina substituovaná na některém ze 4 otevřených míst na kruhu, řečená chemická skupina je vybrána ze skupiny skládající se z alkylových skupin, sulfonamidů, hydroxylu, halogenu, acetylu, carbamylu, aminů a NO2 a z jejich kombinací:

R3 je chemická skupina vybraná ze skupiny skládající se z postranních řetězců nalezených na β-hydroxyaminokyselinách, které jsou schopné vytvářet cyklické oxazolinové struktury:

R4a, R4b. Rsa, Rsb jsou chemické skupiny vybrané ze skupiny skládající se z H, alkylových skupin a substituovaných alkylových skupin a kde * představuje středy chirality, které mohou být R nebo S.

12. Prostředek podle nároku 11, vyznačující se tím, že řečená sloučenina je vybrána ze skupiny skládající se z nasycených a nenasycených sloučenin a tím, že nasycené sloučeniny mají hmotnosti 716, 730, 744, 758, 772, 786, 800, 814 a 828 daltonů a nenysycené sloučeniny mají hmotnosti 742, 756, 770, 784, 798, 812 a 826.

13. Prostředek podle nároku 11, vyznačující se tím, že jestliže je vystavena kovovému iontu v roztoku, tak tvoří chelat kovu s obecným vzorcem III^: kde M je vybráno ze skupiny skládající se z železa, olova hliníku, kadmia, niklu, stříbra, zlata, arzenu, hořčíku, manganu, zinku, mědi, rubidia, niobu, zirkonu, tantalu, vanadia, galia, platiny, chrómu, skandia, ytria, kobaltu, titanu, sodíku a draslíku.

14. Prostředek podle nároku 13,vyznačuj ící se tím, že M je železo.