CZ278499A3 - Použití deferriexochelinu pro výrobu léčiva schopného bránit proliferací buněk vaskulárního hladkého svalstva - Google Patents

Abstract

Použití exochelinů, zvláště pak exochelinů mikroorganizmu Mycobacteriumtuberculosis, při prevenci proliferace buněk vaskulárního hladkého svalstva Zavedení účinného množství deferriexocheelinů živého organizmu,jakoje zvíře nebo člověk, orální, intravenózní nebo přímou cestou do místa, kde se požaduje jeho účinek, bude chránit cévy živého rganizmu před restenózou po angioplastice nebo vaskulámímchirurgickémzásahu abude působit preventivně nebo zpomalovat postup aterosklerózy, systémové hypertenze, poškození cév zářením, stenosy nebo ucpáníštěpů bypassu koronárních arterií nebojiných cévpo chirurgickémzákroku a různých forempulmonální hypertenze.

Description

Použití deferriexochelinu pro výrobu léčiva schopného bránit proliferaci buněk vaskulárního hladkého svalstva

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu léčby aterosklerózy a poškození cév použitím exochelinů, zvláště exochelinů mikroorganizmu Mycobacterium tuberculosis, za účelem předejít proliferaci buněk vaskulárního hladkého svalstva.

Dosavadní stav techniky

Nepřiměřená proliferace vaskulárního hladkého svalstva je integrální komponentou patofyziologie několika klinicky důležitých forem vaskulárního onemocnění. Proliferace a migrace buněk vaskulárního hladkého svalstva jsou důležité mechanizmy geneze aterosklerotických plaků, které mrtvici nebo onemocnění periferních cév (N 488-500, 1986). Běžným nepříznivým aterosklerotických vaskulárních lézí transluminální angioplastiky je proliferační odezva vaskulárního poškození (J. Am. Coli. Cardiol.; 6:

Předpokládá se, že proliferace vaskulárního hladkého svalstva je významnou komponentou geneze jiných forem poškození cév nebo ucpání, která zahrnující uzavření chirurgických traktů bypassu Research; 29: 405-409, 1992), poškození cév

Am. Coli. Cardiol.; 19: 1106-1113, 1992), způsobují infarkt, Eng. J. Med. ; 314: výsledkem léčby pomocí perkutánní restenóza. Restenóza je hladkého svalstva v místě 369-375, 1985).

(J. Vascular ozářením (J.

systémovou hypertenzi (J. Hyper-tension; 12: 163-172, 1994) neonatální nebo primární pulmonální hypertenzi (J. Clin. Invest.; 96: 273-281, 1996 a Circulation; 42: 1163-1184, 1970). Ke studiu proliferace buněk vaskulárního hladkého svalstva se často používají buněčné kultury připravené in vitro. Proliferace buněk v kultuře, které jsou vystaveny působení

séra, jež obsahuje růstové faktory, nebo jednotlivých růstových faktorů se může kvantifikovat měřením radioaktivity thymidinu, který buňky pohltí (Circulation; 90: 1908-1918, *1994). Sloučeniny, které brání růstu kultivovaných buněk hladkého svalstva, mají také potenciál zabránit abnormální proliferaci vaskulárního hladkého svalstva při onemocnění u lidí (Am. J. Physiol.; 296: H1641-H1647, 1995).

Existuje důkaz, že při vývoji aterosklerózy je důležitá přítomnost železa. Nadměrný přísun železa ve formě injekcí železo-dextran zvyšuje tvorbu arteriálních aterosklerotických lézí u králíků, kteří mají v krvi vysoký obsah cholesterolu (Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol.; 15: 1172-1180, 1995). Oxidace cholesterolu vázaného na lipoproteiny s nízkou hustotou je důležitý krok při časných stádiích vývoje aterosklerózy a je závislá na přísunu železa (J. Clin. Invest.; 95: 2104-2110, 1995). Tato skutečnost může odrážet schopnost volného železa katalyzovat tvorbu vysoce reaktivních kyslíkových volných radikálů (BioChem. J. ; 184: 469-472, 1979). Chelatace železa však v jiných modelech zahrnujících lymfocyty a neuroblastomy, kde se může vyskytnout mechanizmus, který se nevztahuje k oxidaci cholesterolu vázaného na lipoproteiny s nízkou hustotou, inhibuje růst buněk a průběh buněčného cyklu (Blood; 86: 2268-2280, 1995). Chelatační činidlo železa deferoxamin brání proliferaci buněk vaskulárního hladkého svalstva in vitro a brání tloustnutí vnitřních vrstev stěn cév in vivo u králíků (Arterioscler. Thromb.; 14: 299-304, 1994). Deferoxamin také redukuje proliferaci hladkého svalstva vnitřních stěn cév u experimentálních štěpů cév (J. Vascular Research.; 29: 405-409, 1992) .

Deferoxamin je sloučenina, kterou nelze extrahovat do chloroformu a vzhledem k tomu, že není rozpustná v lipidech, má podstatné omezení při léčbě aterosklerózy, restenózy nebo jiných forem poškození cév. Když se aplikují in vivo vyšší dávky, deferoxamin vykazuje podstatné vedlejší účinky. Obecně ·

se nepoužívá koncentrace vyšší než 10 pmol/1 (Br. j. Haematol.; 42: 547-555,. 1979), což není dostatečné množství, aby se dosáhlo anti-proliferačního účinku u lidí. Deferoxamin je možné aplikovat pouze intravenózně. Vstupuje do buněk nebo tkání pouze velmi pomalu pinocytózou a vyžaduje nepřerušovanou aplikaci, protože se rychle vylučuje (Biochem. Pharmacol.; 41: 1361-1363, 1991) .

Aby se předešlo ateroskleróze, je nutné připravit činidlo, které je schopné chelace železa a tak je schopné zabránit produkci volných radikálů zprostředkovaných železem a na rozdíl od deferoxaminu bude rozpustné v lipidech. Je pravděpodobné, že v lipidech rozpustné chelatační činidlo železa, které má uvedené vlastnosti, je schopné aplikace orální nebo transkutánní cestou a vykazuje podstatnou účinnost při prevenci proliferace buněk vaskulárního hladkého svalstva a oxidace lipidů, což jsou hlavní mechanizmy vývoje aterosklerózy. Dlouhodobá aplikace v lipidech rozpustného chelatačního činidla železa je ideální prostředek, jak předcházet nebo zpomalit postup aterosklerózy.

Navíc je nutné, aby se předešlo vzniku restenózy po angioplastíce nebo jiných postupech, které uvolňují ucpání cév. Dále je nutné vytvořit činidlo, které jako deferoxamin je schopné provést chelaci železa a předejít produkci volných radikálů zprostředkovanou železem, ale na rozdíl od deferoxaminu je ve vodě rozpustné. V podstatě je nutné vytvořit v lipidech rozpustné činidlo, které zabrání peroxidaci lipidů a je možné ho aplikovat orálně.

Dále, aby se dosáhlo prevence restenózy, je nutné vytvořit činidlo, které je účinné v prvních několika hodinách po provedení angioplastiky (J. Clin. Invest.; 90: 2044-2049, 1992 a J. Vasc. Surg. 1994; 19: _ 1084-1091, 1992). V ideálním případě by se mělo toto činidlo aplikovat přímo do cév, které se ošetřují angioplastikou, nebo několik minut po provedení angioplastiky. Aby léčba byla účinná, činidlo se musí rychle dostat do buněk oblasti, která se ošetřuje. Činidla rozpustná v lipidech jsou . schopny rychle prostupovat 1-ipidbvé části buněčných membrán a působit uvnitř buněk, zatímco činidla, která nejsou v lipidech rozpustná, vstupují do buněk daleko pomaleji. Deferoxamin, protože není rozpustný v lipidech, není možno aplikovat intravenózní cestou. Očekává se však, že chelatační činidlo železa rozpustné v lipidech bude schopné rychlé intravaskulární aplikace, protože je pravděpodobné, že bude rychle pohlcováno buňkami hladkého svalstva v cévách.

Proto je nutné vytvořit činidlo, které je možno zavádět jinou cestou než intravenózní a které rychle vstupuje do buněk vaskulárního hladkého svalstva a brání jejich proliferaci. Takové činidlo je potencionálně použitelné při prevenci aterosklerózy, restenózy a jiných nežádoucích účinků poškození cév.

Podstata vynálezu

Deferoxamin nesplňuje uvedená kriteria. Zjistilo se však, že specifické exocheliny, popsané dále v textu, jsou unikátní chelatační činidla, protože jsou rozpustné v lipidech, které jim umožňují vstupovat a rychle prostupovat lipidovou částí buněčných membrán a brání železem zprostředkované produkci hydroxylového radikálu nebo jiných vysoce reaktivních volných radikálů. Ukázalo se, že tato činidla jsou schopny předcházet proliferaci hladkého svalstva. Všechny ostatní chelatační činidla železa, která jsou v současné době dostupná, buď nemohou rychle vstupovat do buněk nebo se neprokázalo, že dokáží předcházet proliferaci buněk vaskulárního hladkého svalstva.

Zjistilo se, že exocheliny jsou činidla rozpustná v lipidech, které mohou tvořit cheláty železa a blokovat reakce zprostředkované železem, jako je produkce hydroxylového radikálu prostřednictvím Fentonovy reakce. Vzhledem k jejich rozpustnosti v lipidech jsou exocheliny schopny vstupovat do • a buněk daleko rychleji než chelatační činidla železa, která nejsou v lipidech rozpustná, jako je deferoxamin. Rozpustnost v lipidech umožňuje také exochelinům na rozdíl od chelatačních činidel železa, která nejsou v lipidech rozpustná, jako je deferoxamin, lokalizovat a tvořit cheláty železa v různých částech buněk. Ukázalo se, že exocheliny jsou schopny omezit kultivovaných buněk vaskulárniho hladkého proliferaci svalstva.

Také podstatně se ukázalo, že exocheliny mohou blokovat nebo redukovat oxidační poškození tkáně, které je výsledkem železem zprostředkované katalýzy reakce tkáně a volného radikálu, jako je produkce hydroxylového radikálu (·0Η) Fentonovou reakcí. Tato reakce je důležitá při repefúzním poškození, ke kterému dochází, když se obnoví průtok krve po dočasném přerušení. Dále se zjistilo, že exocheliny jsou účinné při zpomalování nebo prevenci reperfúzního poškození, když se aplikují během uvedené reperfúze. Dále se zjistilo, že exocheliny zahrnují daleko širší třídu materiálů a mají odlišnou chemickou strukturu než původně uvádí Máchám et al. a Braclay et al..

Dále se zjistilo, že tyto materiály mohou tvořit chelát s širokým rozmezím kovů za vzniku materiálů, které nebyly dříve známy. Vedle toho, že předchází reperfúznímu poškození, správně upravené exocheliny se mohou použít při léčbě jistých onemocnění a mohou napadat určité buňky, jako jsou buňky zhoubného bujení. Zvláště je známo, že růst buněk neuroblastomu lze negativně ovlivnit odstraněním železa za použití chelatační sloučeniny deferoxaminu, aniž dojde k ovlivnění normálních buněk. Exocheliny lze dále využít při nadměrné aplikaci železa transfúzí a při chemoterapii zhoubného bujení.

Při izolaci a čištění exochelinů se zjistilo, že exocheliny jsou rodina molekul, které mají různé molekulově hmotnosti a různé odlišné postraní řetězce. Dále se připravily z mikroorganismu M. fyziologického pH čištěné exocheliny a poprvé se demonstrovala jejich využitelnost při zachycováni volného železa tak, že jsou účinné při prevenci tvorby hydroxylových radikálů (·0Η), poškozujících tkáň. Zvláště se izolovaly čištěné exocheliny pocházející tuberculosis a ukázalo se, že za podmínek účinně odstraňují železo z transferinu, laktoferinu a feritinu, aniž dojde k přenosu jakýchkoli infekčních vlastností bakterií, z nichž jsou odvozeny. Také se poprvé ukázalo, že tyto exocheliny blokují tvorbu hydroxylového radikálu Fentonovou reakcí a na základě odezvy kardiálních myocytů mohou být účinné při prevenci reperfúzního poškození po infarktu myokardu nebo vaskulárním poškození jiných tkání, když se aplikují ihned po objevení ataku nebo několika hodin po epizodě.

Zatímco se intenzivně studovaly mykobaktiny, jednotlivé exocheliny se neizolovaly ani nečistily a jejich struktura ani složení nebylo dříve definováno. Dále se nyní zjistilo, že v předchozích publikacích jsou exocheliny špatně charakterizovány a tak došlo k chybě při identifikaci struktury těchto sloučenin. Konkrétně Máchám je identifikoval jakopentapeptid nebo hexapeptid s molekulovou hmotností 750 až 800, obsahující 3 mol ε-N-hydroxylysinu, εΝ-acetyl-EN-hydroxylysinu nebo εΝ-hydroxyornithinu a 1 mol threoninu. Zjistilo se, že exocheliny mají daleko širší rozpětí molekulárních hmotností, tvoří několik sérií sloučenin s identifikovatelným rozdílem v molekulárních hmotnostech, zahrnují pouze 2 mol ε-Nhydroxylysinu a nejsou to peptidy. Peptid je polymer aminokyseliny (NH2-CHR-COOH) vzniklý kondenzací karboxylové skupiny první molekuly s aminoskupinou další molekuly za vzniku amidové vazby (-CO-NH-). Exocheliny nelze považovat za peptidy. Obsahují spíše tři aminokyseliny a další strukturní jednotky (kyselinu salicylovou, dikarboxylové kyseliny nebo monoesterové analogy a hydroxykarboxylové kyseliny) vzniklé kondenzací amidu (-NH-CO-), hydroxymatu (-NH(OH)-CO-) a

esteru. Železité formy nebo formy bez železa jsou zobrazeny na obrázku-č. 1. . . - Příprava

Exocheliny se generují a izolují z virulentních (Erdman) a nevirulentních (H37Ra) kmenů mikroorganizmu M. tuberculosis. Za účelem zvýšit produkci exochelinů mikroorganizmem M. tuberculosis se bakterie kultivovaly v kultivačním médiu, které je deficitní na železo. Zvláště Erdmanův kmen bakterie M. tuberculosis (American type culture collection 35801) a H37Ra (ATCC 25177) se kultivuje na plotnách s agarem Middlebrook 7H11 při teplotě 37 °C v atmosféře 5 % C0₂. Po 14 dnech se bakterie shromáždily, resuspendovaly se ve 150 ml modifikovaného Sautonova kultivačního média v kultivačních lahvích a inkubovaly se po dobu 3 až 8 týdnů. Modifikované Sautonovo kultivační médium obsahuje 0,12 mg/1 ' citrátu železito-amonného, aniž se přidalo povrchově aktivní činidlo.

Exocheliny bohaté na železo (ferriexocheliny) se pak získaly filtrací , saturací železem a extrakcí chloroformem a čištěním vysokotlakou kapalinovou chromatografii (HPLC). Supernatant ze shora uvedené suspenze se filtroval přes filtr s nízkou vazebnou schopností proteinů o velikosti pórů 0,8 /um a 0,2 /um. Tiby se exocheliny saturovaly železem, vystavily se působení chloridu železitého (150 mg/1 filtrátu kultury). Ferriexocheliny se smísily s chloroformem (1 objem filtrátu kultury na 1,5 objemu chloroformu) a po separaci vrstev se odstranila chloroformová vrstva bohatá na exochelin a skladovala se pod hezVA^ým síranem amonným (v koncentraci 2 g/1) . Chloroformový extrakt pak prošel skleněnou fritou a odpařil se na rotační odparce. Po odpaření tam zůstal hnědý zbytek.

Hnědý zbytek se dále čistil jako suspenze v 5 ml prvního pufrovaného roztoku (0,1 % kyselina trifluorooctová) , která se zavedla na kolonu kapalinové chromatografie (s náplní C-18

Sep-Pak). Hnědý pruh, který se vytvořil blízko vrcholu kolony se eluoval druhým pufrem Částečně čištěný materiál .(0,1 % TFA, 50 % acetonitril-).

se pak třikrát naředil 0,1 % kyselinou trifluorooctovou a proběhla vysokotlaká kapalinová chromatografie s reverzními fázemi (RV HPLC) při rychlosti průtoku 1 ml/min; pak následuje nanesení na kolonu C-18. Přítomnost exochelinů bohatých na železo v eluátu HPLC kolony se detekovala současným sledováním UV absorbance. Píky se objevily při vlnové délce 450 nm (sloučeniny železa) a 220 nm, kdy poslední jmenovaný určuje přítomnost amidových a aromatických skupin. Z kolony C-18 se eluovalo přibližně 5 hlavních a 10 minoritních plků, jak ukazuje obrázek č. 2, které vykazují vysoký poměr absorbance 450/220 nm. Hmotnostní spektrometrií se potvrdilo, že jde o exocheliny. Hlavní píky se dále čistily HPLC se zpětnými fázemi na alkyl-fenylové koloně. Exocheliny získané z Erdmanova kmene bakterie M. tuberculosis byly shodné s exocheliny získanými z kmene H37Ra.

Charakterizace

Na základě LSIMS a ESI-MS analýzy řady sloučenin plků v jejich železité formě eluovaných z kolony (obrázek č. 3), se ukázalo, že exocheliny bohaté na železo nelze omezit na dvě molekuly popsané shora v textu, ale zahrnují rodinu členů, jejichž hmotnost je v rozmezí 716 až 828. Každý člen rodiny se odlišuje od svého sousedícího člena hodnotou molekulové hmotnosti 14, což odráží počet skupin CH₂ v R_x alkylovém postraním řetězci a/nebo v hodnotě molekulové hmotnosti 2, což odráží přítomnost dvojných vazeb v Ri alkylovém postraním řetězci.

Je zřejmé, že exocheliny tvoří dvě série, kdy po sobě každé série se liší v hodnotě molekulové Saturované série mají molekulovou hmotnost přibližně 716, 730, 744, 758, 772, 786, 800, 814 a 828 a nesaturované série mají molekulovou hmotnost 742, 756, 770, jdoucí členové hmotnosti o 14.

• 4 4 4 4 · · · 4 4 * 4 • · · 4 · · 4 4 4 4 · · 4 44 44 444444 _η ·44 «44 44

444 444 44 44 44

784, 798, 812 a 826. Přítomnost nebo nepřítomnost methylové skupiny v R₃ (to je H nebo- CH₃) - dále definuje další dvě série molekul, které se označují jako serinová série (R₃=H) a threoninová série (R3=CH₃), což se potvrdilo analýzou aminokyselin. Nejvíce polární sloučeniny jsou na levé straně obrázku (eluují se dříve) a nejméně polární sloučeniny (nejvíce rozpustné v lipidech) jsou na pravé straně obrázku.

Všechny frakce, které odpovídají plkům, jsou ve vodě rozpustné. Když se zjistilo, že více plků má stejnou molekulovou hmotnost, každý z plků se označil písmeny A, B nebo C (to znamená například 758A, B a C) , aby se označil stupeň polarity. Písmeno A znamená sloučeninu s nejvyšší polaritou a písmeno C označuje její nejméně polární formu. Je zřejmé, že více polární formy vděčí za svou polaritu methylové skupině, která je na molekule navázána v různých místech.

Struktura exochelinu

Obrázek č. 4 ukazuje výsledky tandemové hmotnostní spektrometrické analýzy při kolizí indukované disociaci (He unášené pří 2keV za vzniku kolizní energie 6 keV) hlavního saturovaného deferriexocholinu, který obsahuje serin (M+H)⁺ při poměru m/z 720,3. Fragmentové ionty se zařadily do jedné ze šesti strukturních částí A až F, které vznikají z produktů štěpení generovaných amidovými nebo esterovými vazbami s relativním přenosem vodíku vzhledem k neutrální molekule, která odpovídá určitému píku na spektru, jak ukazuje obrázek č. 4. Kyselá hydrolýza a metylace exochelinu vede ke tvorbě kyseliny salicylové a pimelové. Hmotnostní spektrografická analýza ukazuje, že kyselina pimelová je v exochelinu přítomna ve formě methylesteru.

Na základě této analýzy .se zjistila obecná struktura ferriexochelinů a deferriexochelinů, která je zobrazena na obrázku č. 1. Methylová skupina uvedená na obrázku č. 1 v poloze R4, jak se definuje na obrázku č. 6, může být v poloze

R₅, což ukazuje obrázek č. 6. Molekula ferriexochelinu tvoří kruh s železem uprostřed. Obsahuje 3 aminokyselinové jednotky (dva N-hydroxylysiny a 1 serin nebo threonin, podle toho, zda R3 je vodík nebo methylová skupina). Hlavní rozdíl mezi exocheliny a mykobaktiny mikroorganismu M. tuberculosis je, že Ri v exochelinech existuje typicky buď jako nasycený alkylmethylester ( (CH2) NCOOCH3) , jednou nenasycený alkylmethylester (CH₂) _XCH=CH (CH₂) _yCOOCH3 nebo karboxylová kyselina a exocheliny mají ve srovnání s mykobaktiny mnohem kratší postranní alkylový řetězec, který končí methylesterovými skupinami. Tyto rozdíly způsobují rozpustnost exochelinů ve vodě a jejich schopnost fungovat v extracelulárním prostředí.

Na obrázku č. 5 je srovnání prevence poškození buněk, když se do buněčné kultury krysích kardiálních myocytů ošetřených peroxidem vodíku přidá deferoxamin nebo daleko menší množství exochelinů. Tento graf ukazuje, že exochelin může rychle vstupovat do buněk a redukovat nebo preventivně působit proti poškození, zatímco použití deferoxaminu nevede k žádnému pozitivnímu výsledku.

V příkladech dále v textu se deferriexocheliny a ferriexocheliny uvádějí ve vztah na základě hmotností ferriexochelinu, jak ukazuje obrázek č. 3. Písmeno, které následuje po hodnotě molekulové hmotnosti (A, B, C atd.) značí, že existuje sloučenina se stejnou molekulovou hmotností, ale odlišnými elučními charakteristikami, což ukazuje na odlišné pozice postranních řetězců nebo odlišnou optickou orientaci, která ovlivňuje polaritu sloučenin (rozpustnost). Píky sloučenin se stejnou molekulovou hmotností se označily písmenem (A, B, C) v pořadí, ve kterém se eluují z kolony, kdy A je jako první, pak je B a pak C. Číslo, po němž následuje SM, označuje, že sloučenina je členem serinově (S) řady a jedná se o methylester (Μ), zatímco TM označuje člena threoninové (T) řady a zároveň methylester (M) .

Molekulová hmotnost formy bez železa je o 53 menší než železitá forma, protože železitá forma ztrácí jeden atom železa (molekulová hmotnost 56) , ale získává 3 atomy vodíku (molekulová hmotnost 1).

Přehled obrázků na výkrese

Na obrázku č. 1 je chemická struktura molekuly chelátu železa exochelinu (ferriexocholin) a deferriexocholinu (neobsahuje železo).

Obrázek č. 2 znázorňuje eluční profil filtrátu kultury mikroorganizmu M. tuberculosis, který se sleduje při vlnové délce 220 nm a 450 nm.

Na obrázku č. 3 je eluční profil stejného filtrátu , který se sleduje při vlnové délce 450 nm a je zde uvedena molekulová hmotnost sloučeniny každého píku.

Na	obrázku č.	4a	je struktura	hlavního	exochelinu
obsahujícího serin při	poměru m/z 720,3.
Na	obrázku č.	4b	jsou uvedena	spektra	hmotnostní

spektrometrie exochelinu obsahujícího serin, který zobrazuje obrázek č. 4a.

Na obrázku č. 5 je zobrazen graf porovnávající inhibici poškození buněk jako výsledek použití deferrinexochelinu 772C nebo deferoxaminu v případě aplikace na kardiální myocyty.

Na obrázku č. 6 je chemická struktura molekul chelátu železa exochelinu (ferriexochelin) a deferriexochelinu (bez železa) s místy modifikace.

Na obrázku č. 7 je graf srovnávající několik vzorků kultivovaných buněk vaskulárního hladkého svalstva ošetřených různými koncentracemi deferriexochelinu.

Na obrázku č. 8 je graf srovnávající účinek ošetření buněčných kultur vaskulárního hladkého svalstva deferriexocholinem a deferoxaminem.

Na obrázku č. 9 je graf znázorňující účinků na levou ven.trikúlá-rní (LV). systolickou funkci během léčby ischemie při různých dávkách deferriexochelinu.

Obrázek č. 10 je graf znázorňující měření koronárního průtoku před a po ischemii při různých dávkách deferriexochelinu.

Na obrázku č. 11 je graf znázorňující měření 2,3 DHBA a 2,5 DHBA v případě kardiální tkáně po 30 minutách reperfúze při různých dávkách deferriexochelinu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1:

Lidské buňky vaskulárního hladkého svalstva se získaly ze segmentů véna saphena odebraných v průběhu elektivní chirurgie. Vnitřní svalová vrstva segmentů cév se získala ze zbytku segmentů cév rozdrcených a štěpených směsí kolagenázy a elastázy při pH 7,4. Dále postupně proběhla čtyři následná štěpení v kultivačním médiu, které obsahuje bovinní trypsin, alfa-chymotrypsin a elastázu. Výsledkem je oddělení životaschopných buněk hladkého svalstva, od zbývajících komponent cév. Po centrifugaci za účelem odstranění odpadu se buňky resuspendovaly v lahvích o objemu 25 cm² v kultivačním médiu, které obsahuje 10 % séra (50 % bovinního telecího séra a 50 % séra krve z pupeční šňůry novorozenců, které se deaktivovalo zahřátim) , po dobu dvou týdnů. Buňky se pak nanesly na kultivační plotny s 24 prohlubněmi (20 000 buněk/prohlubeň) po dobu 2 dní při koncentraci séra 10 %. Buňky se pak nechaly v klidu v kultivačním médiu s 0,1 % bovinním sérem po dobu tří dní. Buňky se pak pre-inkubovaly po dobu 30 minut v kultivačním médiu s 0,1 % sérem. Do testovacích prohlubní, které obsahují buď 0,1 %, 1 % nebo 2 % bovinního séra, se přidal deferriexochel-in 772SM (dříve označován jako 772C, uvádí se na obrázku č. 3) v koncentraci 2, 10 nebo 20 mikromol. Vše se inkuboval.o po dobu 24 hodin. Do kontrolních • 9 · • 9 · <9* 9·· · · 9 ·»·»♦·· • 99 999 · ·

..............

prohlubní se vnesly stejné koncentrace séra., ale zůstaly bez 772SM. -V případě každých podmínek se' studovaly .tři vzorky. Čtyři hodiny před koncem 24 hodinové expozice se přidalo do každé prohlubně 0,5 μ(3ί/ιη1 thymidinu značeného tritiem. Po 24 hodinách inkubace se buňky lyžovaly a obsah radioaktivity v každé prohlubni se měřil na kapalném scintilačním počítači. Výsledky jsou uvedeny na obrázku č. 7, což je graf počtu impulzů pro každou skupinu obsahující tři prohlubně pro každé podmínky ze studovaných 12 podmínek (celkem 36 prohlubní). Sloupce reprezentují průměrné hodnoty pro každou skupinu tří prohlubní a vertikální čáry nad každým sloupcem značí standardní chybu průměru. Každá skupina vzorků ze tří prohlubní je označena jako % zastoupení přítomného séra (0,1 %, 1,0 % nebo 2,0 %) a molární koncentrací deferriexochelinu 772SM (0,2, 10 nebo 20 μΜ), v případě, že je do prohlubně přidán. Při každé ze tří koncentrací séra buď 10 nebo 20 mikromolární deferriexochelin 772SM značně redukuje příjem thymidinu ve srovnání s prohlubněmi, které obsahují stejnou koncentraci séra, ale žádné nebo nízké (2 μΜ) množství deferriexochelinu. Protože proliferace buněk se měří pohlcením thymidinu, může se shrnout, že deferriexochelin 772SM v koncentracích vyšších než 10 mikromolů, zvláště v rozmezí 10 až 20 mikromolů, působí preventivně při růstu buněk lidského vaskulárního hladkého svalstva stimulovaného sérem.

Příklad 2:

Lidské buňky vaskulárního hladkého svalstva se získaly a zpracovaly stejným způsobem, jako v příkladu 1. Buňky se vnesly na kultivační plotny se 24 prohlubněmi (přibližně 12 800 buněk/prohlubeň) po dobu 2 dní, koncentrace séra je 10 %. Pak se nechaly v klidu stát v kultivačním médiu s 0,1 % bovinním sérem po dobu 4 dní. Experimenty proběhly v prohlubních, které obsahovaly 0,1 % nebo 2 % bovinního séra, po dobu 24 hodin. Během 24 hodin testovací doby prohlubně obsahují ΙΟρΜ deferriexochelin 798(TM) (Des-Exo 798TM), 10 pM ferriexochelin798(TM) (Ferri-Exo 798TM) nebo 25 pM deferoxamin (Deferox.) a některé zůstaly

Deferriexochelin 798(TM) bez exochelinů (kontrola). (Des-Exo 798TM) a ferriexochelin798(TM) (Ferri-Exo 798TM) jsou sloučeniny, které mají molekulovou hmotnost 745 respektive 798 (uvedeno na obrázku č. 3). Pro každé podmínky se studovala trojice vzorků. Během posledních 4 hodin 24 hodinové expozice se do každé prohlubně přidalo 0,5 pCi/ml tritiovaného thymidinu. Po 24 hodinách inkubace se buňky lyžovaly a obsah radioaktivity každé prohlubně se měřil na kapalném scintilačním počítači. Výsledky jsou uvedeny na obrázku č. 8, kde je uveden počet pulzů pro každou skupinu obsahující tři prohlubně pro každou ze studovaných 8 podmínek (celkem 24 prohlubní). Sloupce reprezentují průměrné hodnoty pro každou skupinu tří prohlubní a vertikální čáry nad každým sloupcem značí standardní chybu průměru. Každá skupina vzorků ze tři prohlubní je označena jako % zastoupení přítomného séra a molární koncentrací činidla, v případě, že je do prohlubně přidán. Experimenty vykazují, že v prohlubních obsahujících 0,1 % séra dochází k pohlcování pouze malého množství thymidinu, což je indikováno malým počtem pulzů za minutu, protože při této koncentraci séra se prolíferuje pouze malé množství buněk. V kontrolních prohlubních (které nejsou ošetřeny) dochází po 24 hodinách kultivace v 2,0% séru k vysokému pohlcování thymidinu. Naopak v prohlubních s deferriexochelinem 798TM nedošlo během expozice v 2,0 % séru k podstatnému vzrůstu pohlcení thymidinu nad hodnoty naměřené u neošetřených buněk v 0,1 % séru. V buňkách ošetřených ferriexochelinem 798TM, kterým je zcela železem saturovaný exochelin 798TM, a vystaveným působení 2,0 % séra, dochází k podstatnému pohlcení thymidinu, ale je menší než se pozorovalo v kontrolních buňkách kultivovaných ve 2 % séru. V buňkách ošetřených deferoxaminem a vystavených působení 2,0 % séra dochází ke stejnému pohlcení thymidinu

• 4 4	• 4«	44 44
•	•	•	4 4	4	4 4 4 4
•	•	4 4	4 4	4 4	444 444
•	•	4	4 4	4	4 4
··		4 4 4	444 44		4 4 44

jako u kontrolních buněk, které se kultivují s 2,0 % sérem. Protože proliferace buněk še měří pohlcením thymidinu, může se shrnout, že deferriexochelin 798TM v koncentraci 10 mikromolů působí preventivně při růstu buněk lidského vaskulárního hladkého svalstva, který je stimulován sérem. Ferriexochelin 798TM vykazuje malý inhibiční účinek při růstu buněk lidského vaskulárního hladkého svalstva stimulovaném sérem a 25 mikromolární deferoxamin (2,5 násobek koncentrace deferriexochelinu) nemá žádný účinek na růst buněk lidského vaskulárního hladkého svalstva stimulovaný sérem. Tyto skutečnosti ukazují, že testovaný exochelin má inhibiční účinek, který nezávisí na jejich schopnosti chelace železa.

Příklad 3:

Na izolovaných králičích srdcích se provedly studie za účelem zjištění, zda kardiální tkáň během injekce je schopna rychle pohlcovat v lipidech rozpustné deferriexocheliny. Po injekci deferriexochelinu do kořene aorty se stanovily ochranné účinky proti reperfúznímu poškození a akumulaci metabolitů hydroxylového radikálu. Také se měřil obsah exochelinů v odtoku z cévy. Tento systém, který není cirkulačním systémem, vyžaduje rychlé počáteční pohlcení kardiální tkání.

Příprava izolovaného, perfúzního srdce

15-ti dospělým novozélandským bílým králíkům obou pohlaví o hmotnosti v rozmezí 2,3 až 3,5 kg se aplikoval heparin (1 000 jednotek/kg) a provedla se anesteze pentobarbitalem sodíku (60 mg/kg aplikováno intravenozně). Srdce se rychle vyřízla a perfundovala se modifikovaným pufrem Krebs-Henseleit za použití postupu podle Langendorffa bez recirkulace. Za účelem zachycení hydroxylových radikálových izomerů se k pufru přidala 1 mM kyselina salicylová. Pufrovaný perfuzát se zavedl do srdce aortovou kanylou při tlaku 73 mm • · · · φφφ · · · · φ φφφ φφφ φφφφ • · · · φ φ · φ φφφ ΦΦ· • φφ φφφ φφ φφ φφφ φφφ φφ φφ φφ rtuťového sloupce. Za účelem měření tlaku se do levé komory zavedl latexový - balon . naplněný kapalinou.. Před měřením se objem balonu nastavil tak, aby se dosáhlo základního diastolického tlaku 5 mm rtuťového sloupce. Objem balonu zůstal během experimentu konstantní. Získaný tlak se definoval jako píkový systolický tlak mínus konečný diastolický tlak. První derivace tlaku levé komory (dP/dt) se získala derivačním obvodem. Všechny srdce vykazovala tep 240 úderů za minutu. Koronární výtok se získal pomocí jehly zavedené do dutiny levé komory.

Salicylátová metoda detekce ·0Η

Salicylátové metabolity se kvantifikovaly tandemovou kapilární plynovou chromatografií (GC) a hmotnostní spektrometrií (MS). Vzorky a standardy ošetřily 2,6hydroxybenzoovou kyselinou (vnitřní standard), extrahovaly se ethylacetátem (97 % účinnost) a derivatizovaly se za vzniku trimethylsilyletherů s bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamidem. Separací kapilární plynovou chromatografií vznikly odlišné píky salicylátu, vnitřního standardu (2,6-dihydroxybenzoová kyselina) a salicylátových metabolitů ·ΟΗ, což jsou jmenovitě 2,3- a 2,5-dihydrobenzoová kyselina. Kvantitativní analýza proběhla za použití standardních křivek, kde do grafu vynesly poměry iontů každého analytu ku vnitřnímu standardu proti koncentraci.

Použily se autentické standardy 2,3- 2,4- 2,5- 3,4- a 2,6dihydroxybenzoové kyseliny a kyseliny salicylové. Připravily se standardní křivky kyseliny 2,3- 2,4- 2,5- a 3,4dihydrobenzoové v metanolu v sériích koncentrací v rozsahu od 1 do 1 000 pmol. Přidal se vnitřní standard (2,6dihydroxybenzoová kyselina) v koncentraci 100 pmol. Standardy a biologické extrakty se analyzovaly ve trojicích GCMS za použití plynové chromatografie Hewlett Packard 5890 spojené s hmotnostním selekčním detektorem 5970. Podmínky GC

ΦΦ φ » ·· ΦΦ ΦΦ • » · · φ · φ φ · φ φ φ φ φ φ · φ φ φφφφ φ φ · φ · φ ΦΦ φ φ φ φ φ φ Φ·· · · · φ φ

ΦΦ φφφ φφφ ΦΦ ΦΦ ΦΦ odpovídají počáteční teplotě kolony 100 °C po dobu 5 minut, která se zvyšovala o 10 °C za minutu na konečnou teplotu 300 °C. V případě dihydrobenzoové kyseliny se ionty sledovaly při hodnotě poměru m/z 355, 356 a 357. U všech iontů byl čas zdržení 25 milisekund. Minimální detekovatelné množství je v případě 2,3- a 2,5-dihydrobenzoové kyseliny v koncentračním rozmezí 200 femtomolů. Hodnoty měření v homogenizovaném myokardu se vyjadřují jako pmol/g myokardu. Měření v koronárním toku se vyjadřuje jako pmol/g/min myokardu.

Protokol minut po uvedení do rovnováhy, kdy se dosáhlo základních dat, se uzavřela aortová kanyla a vypnul se kardiostimulátor. Po 30 minutách ischemické periody se iniciovala reperfúze a znovu se vyvolal tep. Během 30· minutového období reperfúze se zaznamenával tlak a každých pět minut se odebral koronární tok. Srdce se ihned zmrazila a uzavřela hliníkovými svorkami ochlazenými v kapalném dusíku a skladovala se při teplotě -70 °C do okamžiku dalšího použití·. V případě kontrol se aplikoval normální fyziologický roztok a u ošetřených srdcí se aplikovala během prvních tří minut reperfúze infúze deferriexochelinu v normálním fyziologickém roztoku v dávce 0,1 nebo 0,2 nebo 0,4 mikromolů do kořene aorty

Výsledky

Studovalo se šest kontrolních (neošetřených) srdcí, tři srdce ošetřená 0,1 mikromol deferriexochelinu, tři srdce ošetřená 0,2 mikromol deferriexochelinu a tři srdce ošetřená 0,4 mikromol deferriexocholinu. Účinky na systolickou funkci levé komory (LV) během zotavení z ischemie jsou uvedeny na obrázku č. 9. Kontrolní srdce vykazují pouze malé zlepšení tlaku levé komory, což reprezentuje první pozitivní derivace (LV dp/dt MAX) a získaný tlak během 30 minut doby regenerace, • 9 99 jak ukazuje celá křivka tlaku po dobu 30 minut. Na konci 30 minutového období regenerace LV. dp/dt MAX a vyvolaný tlak^v LV vzrostly v porovnání s kontrolou více jak dvakrát při všech dávkách odezvy, deferriexochelinu. přičemž nejvyšší přímý vztah koncentrace dávky a vykazuj e

Existuje testovaná alespoň třínásobný vzrůst. Ukázalo se, že srdce ošetřená deferriexochelinem v koncentraci 0,1, 0,2 a 0,4 j?;ik»omolů aplikovanÝřrt do kořene aorty v periodě tří minut demonstrují podstatné zlepšení systolické funkce LV ve srovnání s kontrolami. Ukazuje se, že zde existuje přímý vztah dávka a odezva.

Obrázek č. 10 znázorňuje měření koronárního toku před a po ischemii. Koronární průtok během reperfúze byl nižší v případě kontrolních srdcí ve srovnání se srdcí ošetřenými Vyšší koronární průtok u srdcí ošetřených reperfúze odráží snížení koronárního deferriexochelinem . exochelinem během poškození cév.

Obrázek č. 11 ukazuje měření 2,3 DHBA a 2,5 DHBA v kardiální tkáni po 30 minutách reperfúze. 2,3 DHBA a 2,5 DHBA jsou salicylátové izomery hydroxylového radikálu. Studovalo se šest neošetřených srdcí a 3 srdce ošetřená deferriexochelinem (každý v koncentraci 0,1, 0,2 a 0,4 mikromolů). U ošetřených srdcí se snížily obě hodnoty 2,3- a 2,5-DHBA způsobem vztahujícím se k dávce, což ukazuje, že v případě srdcí ošetřených deferriexocheliny existuje s dávkou spojená redukce metabolitů hydroxylového radikálu. To způsobuje snížení produkce hydroxylového radikálu, jako výsledek chelace železa deferriexocheliny.

V případě jednoho srdce do kterého se infuzí zavedl*? Q_t2 mikromol; v lipidu rozpustného deferriexochelinu, se každých pět minut během reperfúze odebral výtok z cévy a měřilo se množství přítomného exochelinu. Do tohoto srdce se infúzí zavedly relativně nepolární (v lipidech vysoce rozpustné) exocheliny v podstatě bez železa. Jsou to 770SM (jiné označení • 4 • ·4 44 *4

4 4 9 9 9 9

4 9 9 · 4 4

44 444 44*

4 4 4 4 • 44 44 44 *4 je 770, uvádí se na obrázku č. 3) v koncentraci 0,042 μπιοί, 784SM (jiné označení je 784B, uvádí se .'na obrázku č. 3) v koncentraci 0,110 μπιοί a 798TM (jiné označení je 798, uvádí se na obrázku č. 3) v koncentraci 0,047 μπιοί. Saturace exochelinů, které se zavedly infuzí do kořene aorty, železem je menší než 5% (obsahují více jak 95 % formy bez železa) . Během reperfúze se ve výtoku aorty stanovilo množství deferriexochelinů a celkové množství exochelinů (obě formy exochelinů). Množství ferriexochelinu se stanovilo ve vzorcích výtoku extrakcí chloroformem, čímž se odstraní exocheliny, odpařením chloroformového extraktu do sucha, suspendováním exochelinů v pufru a dále se extrakt nanesl na vysokotlakou kapalinovou chromatografii s reverzními fázemi. Oblast pod pikem absorbance při vlnové délce 450 nm odpovídá každému exochelinů a tyto oblasti se převedou na jednotky hmotnosti za použití standardní křivky. Celkové množství exochelinů ve výtoku se stanovilo saturací alikvotu výtoku železem, přičemž se všechny exocheliny přeměnily na ferriexochelinovou formu a pak se exocheliny testovaly stejným shora v textu popsaným způsobem. Výtok shromážděný během prvních pěti minut reperfúze obsahuje 0,048 μπιοί exochelinů. Pozdější vzorky obsahovaly neměřitelné množství exochelinů. Protože do aorty se infuzí zavedlo celkem 0,2 mikromol exochelinů, podíl získaný ve výtoku je 0, 048 mikromol/0,2 mikromol x 100 = 23, 8 %. To ukazuje, že podstatné množství (76,2%) injekcí zavedeného exochelinů zůstalo v srdci. Dále exocheliny měřené ve výtoku z aorty byly z 25,9 % saturované železem. Dokonce během jediného průchodu srdcem deferriexocheliny jsou schopny získat podstatné množství železa.

Kombinovaný účinek deferriexochelinů na systolickou funkci levé komory a na produkci metabolitů hydroxylových radikálů, redukované množství exochelinů. v koronárním toku a důkaz, že podstatné množství deferriexochelinů zavedené infúzí do srdce získalo železo během průchodu srdcem potvrzuje, že srdce • ·

pohlcuje fyziologicky účinné množství deferriexochelinů během jedné injekce, která- se. aplikuje blízko místa původu koronárních arterií.

V příkladu 1 (uvádí se na obrázku č. 7) shora v textu se ukázalo, že deferriexocheliny jsou schopny preventivně působit na proliferaci vaskulárniho hladkého svalstva. Toto zjištění v kombinaci s výsledky jiných příkladů ukazuje, že tyto sloučeniny lze použít při prevenci onemocnění, které jsou spojeny s proliferaci buněk vaskulárniho hladkého svalstva, jako je ateroskleróza, vaskulární restenóza, která vzniká po angioplastice nebo vytvoření koronárních bypassů, nebo jiných forem poškození cév nebo onemocnění, která zahrnují systémovou hypertenzi a různé formy pulmonární hypertenze. Jak se popisuje v příkladu 8 bez^ železitá forma exochelinů preventivně působí proti proliferaci vaskulárniho hladkého svalstva, zatímco železitá forma uvedeného exochelinů vykazuje pouze slabou inhibici a v množství 2,5 krát vyšším než je množství v lipidech nerozpustného chelatačního činidla železa deferoxaminu nevykazuje žádný účinek na proliferaci lidského hladkého vaskulárniho svalstva. Jak se popisuje v příkladu 9, deferriexocheliny, když se aplikují jedinou injekcí, jsou schopny vstupovat do srdce dostatečně rychle, aby proběhla chelace železa a aby působily preventivně proti škodlivým oxidačním účinkům. Tato vlastnost deferriexochelinů indikuje, že jediná dávka exochelinů, když se zavede do ošetřované cévy po nebo během angioplastiky nebo při vaskulárním chirurgickému zákroku, působí preventivně proti poškození cév. Deferoxamin, který je jediným dalším uvažovaným chelatačním činidlem železa, také vykazuje potenciál pro prevenci proliferace buněk vaskulárniho hladkého svalstva, ale vyžaduje nepřerušovanou intravenózní aplikaci, protože^ ňen/rychle pohlcován do buněk. Dokonce i když se aplikuje intravenózně, není zřejmé, zda se dosáhne dostatečně vysoké, netoxické dávky uvedeného polárního, v lipidech nerozpustného chelatačního činidla (deferoxaminu), aby se cévy ochránily proti poškozeni. Naopak při lokální aplikací deferriexochelinů do poškozených a nemocných cév se dosahuje účinné fyziologické odezvy. Navíc demonstrace mírné inhibice proliferace vaskulárního hladkého je důkaz výhod jeho chelatačních relativní polaritě svalstva železitou formou exochelinů exochelinů, které jsou odděleny od vlastností.

Zatímco struktura exochelinů získaných z mikroorganizmu M. tuberculosis je zobrazena na obrázku č. 1, je známo, že jiné mykobakterie mohou generovat exocheliny, které se liší strukturou a mohou zahrnovat různé aminokyseliny, které závisí na mykobakterii, kde vznikly. Všechny exocheliny se však budou chovat stejným způsobem a budou tvořit ^ífaéné série se svými následujícími členy, které vykazují podobný růst molekulových hmotností. Účinnost různých členů sérií také závisí na molekul. Vynález zahrnuje exocheliny generované jinými mykobakteriemi, které zahrnují, ale nejsou omezeny na M. africanum, M.

bovis, M.

M.

tuberculosis, M. microtí, M. kansasii, M. marinum, M. gastri, nonchromogenicum, M. terrae, M. triviale, M. malmoense, M. shimoidei, M. gordonac, M. asiaticum, M. szulgai, M. simiae, M. scrofulaceum, M. avium, M. intracellulare, M. xenopi, M. uleerans, M. haemophilum, M. farcinogenes, M. lepraemurium, M. paratuberculosis, M. chelonae, subspecie chelonae, M. chelonae subspecie abscessus, M. fortuitum, M. chitae, M. senegalense, M. agri, M. smegmatis, M. phlei, M. thermoresistibÍLe, M. aíchiense, M. aurum, M. chubuense, M. duvalii, M. flavescens , M. gadium, M. givum, M. komossense, M. neoaurum, M. obuense, M. parafortuitum, M. rhodesiae, M. sphagni, M. tokaiense nebo M. vaccae.

Je také nutno poznamenat, že exocheliny je možné modifikovat tak, aby se pozitivně ovlivnila jejich rozpustnost, schopnost chelace kovů nebo rychlost buněčné absorpce. Zvláště s odvoláním na struktury sloučenin

..... ..... ....

obsahující kov nebo bez kovu, které jsou zobrazeny na obrázku

č. 6A nebo'6B, připadají v úvahu následující substituce:

Ri = (CH₂)_nCH₃ jako lineární nebo větvený řetězec; (CH₂)_nCOOH mastná kyselina; (CH₂)_nCOOR ester mastné kyseliny, kde symbol R je alkylová skupina; (CH₂)_nCONH₂;

R₂ - substituce alkylových skupin, sulfonamidů, hydroxylu, halogenu, acetylu, karbamylu, aminu, N0₂ nebo jejich libovolné kombinace v libovolném ze čtyř volných míst na kruhu;

R₃ - H (serin) nebo CH₃ (threonin) se může nahradit postranními řetězci, které se nachází na βhydroxyaminokyselinách, které jsou schopny tvořit cyklické oxazolinové struktury.

R_4a, a R_4b = H, CH₃ nebo jiné alkylové nebo substituované alkylové skupiny;

Rsa a R_5b = H, CH₃ nebo jiné alkylové nebo substituované alkylové skupiny;

X = 0, NH, S, CH_2;

	M= mono-, di- nebo	trivalentní kovy, jako	je	Pb, Al, Cd,
Ni,	Ag, Au, As, Mg, Mn,	Zn, Cu, Ru, Nb, Zr, Ta,	v,	Ga, Pt, Cr,
Sc,	Y, Co, Ti, Na, K.
	* označuje chirální	centra, která mohou být	R	nebo S;
	Různé hydroxylové	skupiny (OH), které se	podílejí na

chelaci kovu, se mohou nahradit různými funkčními skupinami, jako je H nebo halogen, přičemž se mění afinita sloučeniny ♦

se molekula mění na antagonistu e «· ·: : ί • 9 · • · · • · · « · k chelaťovanému kovu nebo kovu.

Na základě těchto výsledků je zřejmé, že zavedení účinného množství deferriexochelinu do živého organizmu, jako je zvíře nebo člověk, orální, intravenózní nebo přímou cestou, do místa, kde je účinek žádaný, a) chrání krevní cévy u živých organizmů před restenózou, která je způsobena proliferaci buněk vaskulárního hladkého svalstva, která následuje po angioplastice nebo chirurgickém zákroku, b) u pacienta preventivně působí nebo zpomaluje postup aterosklerózy, c) u pacienta preventivně působí nebo zpomaluje postup systémové hypertenze, d) u pacienta preventivně působí nebo zpomaluje postup poškození cév zářením, e) u pacienta preventivně působí nebo zpomaluje postup stenózy nebo ucpání štěpů bypassu koronárních arterií nebo jiných krevních cév po chirurgickém zásahu, f) u pacienta preventivně působí nebo zpomaluje postup různých forem pulmonární hypertenze, jako je hypoxická, neonatální a primárně pulmonární hypertenze a g) u pacienta preventivně působí nebo zpomaluje postup angiogeneze (tvoření nových cév). K těmto závěrům se dospělo, protože každý z těchto vyjmenovaných jevů je výsledkem nekontrolovatelného nebo nežádoucího růstu a/nebo proliferace tkáně indukované buď poraněním nebo onemocněním. Všechny druhy onemocnění lze řídit aplikací deferriexochelinů.

U všech shora uvedených onemocnění se jako kritický mechanizmus uvádí proliferace vaskulárního hladkého svalstva. Restenóza, ke které dochází po dilataci nebo jiných postupech vhodných pro odstranění ucpání arterií, jako je angioplastika nebo aterektomie, zahrnuje proliferaci vaskulárního hladkého svalstva v místě, kde došlo k uvedenému postupu; výsledkem je, že se cévy znovu ucpou. Tento . se iniciuje prvních několik hodin po angioplastice nebo aterektomii. Shora popsané příklady indikují, že intrakoronární injekce deferriexochelinu, která se aplikuje bezprostředně po angioplastice nebo aterektomii, - inhibuje během uvedeného kritického období, kdy dochází procesu restenózy, a preventivně působí proti proliferaci vaskulárního hladkého svalstva a tím zabrání vzniku restenózy. Vzhledem k tomu, že se restenóza objevuje u vysokého procenta případů po provedení angioplastiky a je jednoduché ihned po provedení angioplastiky nebo aterektomie aplikovat intrakoronární injekci, protože angioplastika i aterektomie vyžadují použití intrakoronárních katétrů, zavedení deferriexochelinů nabízí novou formu léčby těchto velmi běžných a vážných onemocnění. Není známo žádné další činidlo, které je možné aplikovat jako intravaskulární bolus a které je tak rychle pohlcováno vaskulární tkání a preventivně působí proti růstu vaskulárního hladkého svalstva. Vzhledem k tomu, že intrakoronární katétr je možné zanechat v místě aplikace pouze po krátkou dobu, rychlé pohlcení libovolného činidla, které se používá při léčbě, je podstatný využitelný rys.

Použití deferriexochelinů je nový způsob léčby restenózy. Rozpustnost exochelinů bez železa v lipidech jim umožňuje rychlé pohlcení tkání, což je vlastnost, kterou nesdílí činidla, která nejsou v lipidech rozpustná, jako je chelatační činidlo deferoxamin. Tato vlastnost jim také umožňuje preventivně působit proti oxidaci cholesterolu vázaného na lipoproteiny s nízkou hustotou. Existují dva podstatné mechanizmy, které se podílí na tvorbě aterosklerotických plaků, které ucpávají koronární arterie a způsobují koronárních onemocnění. Jsou to pohlcování oxidovaného cholesterolu vázaného na lipoproteiny s nízkou hustotou do stěn cév a proliferace vaskulárního hladkého svalstva. Vzhledem k tomu, že deferriexocheliny jsou v lipidech rozpustné antioxidanty, jsou schopny preventivně působit proti oxidaci cholesterolu vázaného na lipoproteiny s nízkou hustotou a proti proliferaci hladkého svalstva. Žádné jiné činidlo a zvláště ne v lipidech nerozpustné chelatační činidlo • 4» · Φ · ·

železa deferoxamin nevykazuje takovou kombinaci vlastností. Pr.oto deferriexocheliny se používají pro prevenci aterosklerózy. Předpokládá se, že chronická aplikace deferriexochelinů orálním nebo podkožním způsobem působí preventivně proti tvoření aterosklerotických plaků. Podobně chronická aplikace orální, podkožní cestou nebo inhalací může preventivně působit proti proliferaci hladkého svalstva, což je integrální mechanizmus systémové nebo pulmonární hypertenze nebo poškození cév vyvolaného radiací. Není známé žádné další činidlo, které je vhodné pro dlouhodobou aplikaci uvedeným způsobem a dále je schopné působit preventivně proti proliferaci vaskulárního hladkého svalstva. Například deferoxamin, což je v lipidech nerozpustné chelatační činidlo železa, se musí aplikovat intravenózně dlouhodobou infúzí a není tak vhodné ani účinné. Dále neexistují žádné důkazy, že by deferriexocheliny byly v antioxidačně a antiproliferačně účinném množství toxické pro buňky vaskulárního hladkého svalstva, buňky myokardu nebo vaskulární endoteliální buňky.

Vynález se neomezuje pouze na popsané verze. Podobné a další příznivé vlastnosti mohou mít variace popsaných exochelinů, jako jsou například výše popsané optické izomery a modifikované sloučeniny. Dále se předpokládá, že při popsaných postupech se mohou také použít exocheliny generované jinými bakteriemi. Bakterie M. bovis BCG vykazuje stejné exocheliny jako bakterie M. tuberculosis. Bakterie M. avium produkuje velmi podobné exocheliny. Zde popsaná využitelnost exochelinů však není omezena na vyjmenované exocheliny. Dále se předpokládá, že se exocheliny mohou využít také při zpomalení tvorby a růstu nových cév v těle a v orgánech, jako jsou oči.

Claims (5)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   44 4* • 4 4 · • 4 4 4

   4 444 444

   4 4

   1. Použití deferriexochelinu pro výrobu léčiva schopného bránit proliferací buněk vaskulárního hladkého svalstva.
2. 2. Použití podle nároku 1, vyznačující se tím, že léčivo je určeno pro ochranu cév živého organizmu proti restenóze.
3. 3. Použití podle nároku 2, vyznačující se tím, že léčivo je určeno pro aplikaci zaváděním přímo do tepny.
4. 4. Použití podle nároku 2, vyznačující se tím, že léčivo je určeno pro aplikaci systémovým intravenózním zaváděním.
5. 5. Použití podle nároku 1, vyznačující se tím, že léčivo je určeno pro prevenci nebo zpomalení postupu aterosklerózy u živého organizmu.

   6. Použití podle nároku 5, v y z nač u j í c í s e t í m, že léčivo je určeno pro dodávání účinného množství deferriexochelinu orálně. 7. Použití podle nároku 5, v y z nač u j í c í s e t í m, že léčivo je určeno pro dodávání účinného množství deferriexochelinu intravenózně • 8. Použití podle nároku 1, v y z nač u j í c í s e t í m, že léčivo je určeno pro prevenci nebo zpomalení

   postupu systémové hypertenze u živého organizmu.

   0 0

   0 0

   0«·

   000 • 0 00 • · · ·

   0 0 0 • · 0 * • · ·

   00 0000

   0 0

   9. Použití podle nároku 8, v y z n a č u j í c í t 1 se t 1 m, že léčivo je určeno pro dodávání účinného množství deferriexochelinu orálně. 10. Použití podle nároku 8, v y z n a č u j 1 c 1 se t 1 m, že léčivo je určeno pro dodávání účinného množství deferriexochelinu intravenózně.

   11. Použití podle nároku 1, vyznačující se tím, že léčivo je určeno pro prevenci nebo zpomalení postupu poškození cév zářením u živého organizmu.

   12. Použití podle nároku 11, vyznačuj ící se tím, že léčivo je určeno pro dodávání účinného množství deferriexochelinu orálně.

   13. Použití podle nároku 11, vyznačuj ící se tím, že léčivo je určeno pro dodávání účinného množství deferriexochelinu intravenózně.

   14. Použití podle nároku 1, vyznačující se tím, že léčivo je určeno pro prevenci nebo zpomalení postupu stenózy nebo ucpání štěpů bypassu koronárních arterií nebo jiných cév po chirurgickém zákroku u živého organizmu.

   15. Použití podle nároku 14, vyznačuj ící se tím, že léčivo je určeno pro dodávání účinného množství deferriexochelinu orálně.

   16. Použití podle nároku 14, vyznačuj ící se tím, že léčivo je určeno pro dodávání účinného množství deferriexochelinu intravenózně.

   17. Použití podle nároku 1, vyznačující se tím, že léčivo je určeno pro prevenci nebo zpomalení postupu pulmonální hypertenze u živého organizmu.

   • 9 99 • 9 9 9

   9 9 9

   9 9 « 9

   9 9 9

   99 9 99 *

   99 9 ··

   9 9

   9 9

   9 999 β 9

   9 9 9 9

   18. Použití podle nároku 17, vyznačuj ící se tím, že léčivo je určeno pro dodávání účinného množství deferriexochelinu orálně.

   19. Použití podle nároku 17, vyznačuj ící se tím, že léčivo je určeno pro dodávání účinného množství deferriexochelinu intravenózně.

   20. Použití podle nároku 17, vyznačující se tím, že léčivo je určeno pro dodávání účinného množství deferriexochelinu inhalací.

   21. Použití podle nároku 1, vyznačující se tím, že léčivo je určeno pro prevenci nebo zpomalení postupu hypoxické, neonatální a primární pulmonální hypertenze u živého organizmu.

   22. Použití podle nároku 1, vyznačující se tím, že léčivo je určeno pro prevenci nebo zpomalení růstu proliferace buněk vaskulárního hladkého svalstva u živého organizmu a obsahuje účinné množství deferriexochelinu získaného z Mycobacterium tuberculosis.

   23. Použití podle nároku 1, vyznačující se tím, že léčivo je určeno pro prevenci nebo zpomalení tvorby nových cév u živého organizmu.

   24 . Použití podle nároku 23, v y z n a č u j i c i se t í m, že léčivo je určeno pro dodávání deferriexochelinu orálně nebo intravenózně. 25. Použití podle nároku 23, v y z n a č u j i c i se ti m, že léčivo je určeno pro dodávání

   deferriexochelinu intraokulárně pro prevenci proti tvorbě nových cév v oku.