EA000176B1

EA000176B1 - Хелатообразователь железа в качестве ингибитора процесса окисления, опосредованного железом

Info

Publication number: EA000176B1
Application number: EA199600078A
Authority: EA
Inventors: Лоренс Хорвиц; Маркус А. Хорвиц; Бредфорд В. Гибсон; Джозеф Рив
Original assignee: Дзе Риджент Оф Дзе Юниверсити Оф Калифорния
Priority date: 1995-02-03
Filing date: 1996-01-26
Publication date: 1998-12-24
Also published as: EA199600078A1; HUP9603036A3; HU9603036D0; MX9604499A; PL316612A1; PL182414B1; EP0754044A1; AU699916B2; KR100325970B1; HUP9603036A2; US5721209A; CZ288996A3; CN1145588A; AU4674496A; DE69636267T2; ATE330610T1; EP0754044B1; WO1996023502A1; DE69636267D1; JP3511139B2

Description

Изобретение относится к химической структуре, принадлежащей к ранее неидентифицируемому ряду соединений, связывающих железо и обладающих высоким сродством к последнему. Эти соединения, названные первыми исследователями экзохелинами, выделяются микобактериями.

Изобретение также относится к модификациям этих вновь идентифицированных соединений, позволяющим изменить их физиологические свойства, а также к применению этих идентифицированных и модифицированных соединений.

При остром инфаркте миокарда сердечная ткань поражается при двух последовательных явлениях, гипоксии в ишемической фазе и окислительном поражении в фазе реперфузии. Поражение миокарда в ишемической фазе может быть предотвращено с помощью переливания крови в ишемическую область. Однако реперфузия может закончиться поражением в результате воспалительного процесса в реперфузной ткани, вызванного миграцией лейкоцитов в ткань и продуцированием активных радикалов кислорода. Одним из наиболее активных радикалов является гидроксильный радикал (-ОН), который генерируется в присутствии железа и приводит к уничтожению клетки. Предотвращение образования (-ОН) позволит предотвратить летальное разрушение клетки. Известно, что образование ( -ОН) зависит от наличия свободного железа и поэтому хелаты железа будут предотвращать реперфузные повреждения. Например, такой хелатообразователь железа, как дефероксамин, в случае если он вводится до реперфузии, предотвращает повреждения и уменьшает размер инфаркта миокарда во время закупорки коронарной артерии и реперфузии. Однако реперфузное разрушение быстро проявляется после восстановления кровотока к ишемическому миокарду.

Образование (-ОН) радикала зависит от наличия свободного железа; его хелатообразующие агенты (хелаторы) могут связывать свободное железо и таким образом не дают железу катализировать образование гидроксильного радикала. Однако, эти известные хелатообразующие соединения для железа либо не предотвращают образование (-ОН)-радикалов по реакции Фентона (например, ЭДТА), либо их проникновение в клетки столь медленно, что даже достаточное количество, например, дефероксамина не способно действовать достаточно быстро для того, чтобы связать нужное количество железа в хелат и предотвратить образование (ОН) и соответственно разрушение клетки. Дефероксамин был продемонстрирован как эффективное средство в том случае, если его вводить во время или после начала реперфузии.

Подобное разрушение сердечной ткани может появиться при использовании искусственного кровообращения во время хирургической операции на открытом сердце или на других органах, когда они лишены снабжения насыщенной кислородом кровью из-за операции или травмы.

Экзохелины и их общее действие в процессе роста микобактерий описаны: авторы Мэхэм, Рэтлидж и Барклей - Университет Холла (Hull) в Англии (см. Lionel P. Macham, Colin Ratledge и Jennifer С. Nocton, «Extracellular Iron Acquisition by Micobacteria : Role of the Exochelins and Evidence Against the Participation of Mycobactin», Infection and Immunity, т. 12, N 6, pp. 1242-1251, Dec. 1975; Raymond Barclay и Colin Ratlege, «Mycobactins и Exochelins of Mycobacterium tuberculosis, M. bovis, M. africanum и Other Related Species», Journal of General Microbiology. 134, 771-776, (1988); L.P. Macham и С. Ratledge, «A New Group of Water-soluble Ironbinding Compounds from Mycobacteria: The Exochelins», Journal of General Microbiology. 89, 379282, 1975). Мэхэм (Macham) идентифицировал наличие вещества, найденного во внеклеточной жидкости, которое он определил, как экзохелин. Он описал экзохелин как растворимое в воде и хлороформе соединение, которое обладает способностью хелатировать свободное железо. Согласно данным Мэхэма, это соединение имеет сходство с микобактином (micobactin), который локализуется в стенке клетки и обладает функцией переноса железа к внутренней стороне клетки.

Однако микобактин является липофильной, нерастворимой в воде молекулой, которая является неспособной к диффузии внутрь клетки и ассимилировать свободное железо из внеклеточного пространства. Мэхэм и др. определили, что экзохелин действует при физиологическом значении рН и способен отделить железо от других железосодержащих соединений в сыворотке крови, таких как трансферрин (fransferrin) или ферритин (ferritin), и перевести железо в ту форму, которая может быть перенесена к микобактину. Они не выделяли и не очищали экзохелины, но идентифицировали их как пентаили гексапептиды, имеющие молекулярный вес от 750 до 800, содержащие 3 мол eN-оксилизина или eN-ацетил- eN-оксилизин и eNоксиорнитина и 1 мол треонина. Кроме того, он обнаружил, что в зависимости от бактериального источника для экзохелинов, их молекула может содержать остатки β-аланина или салициловой кислот.

Барклэй (Barclay) и др. описали получение экзохелинов из двадцати двух различных штаммов М. tuberculosis и родственных видов. Однако эти исследователи не определили специфическую структуру экзохелинов и не определили возможность других применений экзохелинов, кроме как транспортной среды для железа к микобактину, локализованному в стенке клетки.

Таким образом, в настоящее время существует потребность в веществе, которое можно будет легко вводить во время реперфузии и которое будет быстро хелатировать свободное железо по мере его образования, т.е. будет предотвращать образование (-ОН) радикала. Кроме того, существует необходимость в идентификации специфической структуры экзохелина для того, чтобы можно было наиболее полно понять его действие и назначение в качестве диагностического, лечебного и профилактического средства.

Поставленные задачи решены в настоящем изобретении, которое включает применение экзохелинов для предотвращения поражения живой ткани в результате образования или присутствия (-ОН)-радикала. В частности, изобретение предусматривает доставку экзохелинов к миокарду, пораженному инфарктом до или одновременно с реперфузией с целью предотвращения поражения миокарда в результате опосредованного железом образования свободного радикала. Кроме того, представлена химическая структура экзохелинов и модифицированных экзохелинов, а также раскрыты другие применения этих соединений в лечении и диагностике заболеваний млекопитающих.

Эти и другие особенности, цели и преимущества настоящего изобретения будут раскрыты в описании, формуле изобретения и прилагаемых графических материалах.

Фиг. 1А - 1С иллюстрируют химическую структуру хелата железа экзохелина (ферриэкзохелина) и молекулы дезферриэкзохелина (при отсутствии железа);

фиг. 2А и 2В - профиль элюирования фильтрата культуры М. tuberculosis, анализируемого при длинах волн 220 нм и 450 нм;

фиг. 3 - профиль элюирования того же самого фильтрата, определяемого при 450 нм с указанием молекулярного веса соединения, соответствующего каждому пику (далее в тексте называемые просто пиками);

фиг. 4А и 4В - масс-спектр главного серинсодержащего экзохелина при m/е = 720.3 вместе со структурой;

фиг. 5 - график, отражающий ингибирование разрушения клетки сердечной мышцы в результате использования смеси экзохелинов;

фиг. 6 - график, отражающий ингибирование разрушения клетки сердечной мышцы в результате использования экзохелина 758С;

фиг. 7 - 9 - график, отражающий ингибирование разрушения клетки сердечной мышцы в результате использования экзохелина 758С, 772А и 772С;

фиг. 1 0А и 1 0В - химическую структуру хелата железа экзохелина (ферриэкзохелина) и молекулы дезферриэкзохелина (при отсутствии железа) с отметками для идентифицированных модификаций.

Установлено, что экзохелины могут блокировать или значительно уменьшать окислительное разрушение ткани, являющееся результатом опосредованных железом каталитических реакций между тканью и свободными радикалами, такими как гидроксильные, в частности гидроксильными радикалами, генерируемыми по реакции Фентона. Это явление обычно называют реперфузным разрушением.

Было найдено, что экзохелины эффективны для торможения или предотвращения реперфузного разрушения, когда их вводят до или одновременно с реперфузией. Дополнительно было найдено, что экзохелины охватывают намного более широкий класс соединений и имеют различную химическую структуру. Также было найдено, что эти соединения способны хелатировать широкий ряд металлов с получением ранее неизвестных структур. Кроме предотвращения реперфузных разрушений, экзохелины, модифицированные определенным образом, могут быть использованы для лечения некоторых болезней, благодаря атаке на некоторые клетки, такие как раковые, а также для осуществления контроля за эффективностью лекарственного лечения и обнаружения некоторых болезненных состояний. В частности, известно, что рост клеток нейробластомы может подавляться путем удаления железа с использованием его хелатообразователя дефероксамина без аналогичного влияния на рост нормальных клеток. Другое применение экзохелинов включает обработку избыточного железа, возникшего в результате переливания крови или химиотерапии, особенно при лейкемии.

В результате выделения и очистки экзохелинов было найдено, что экзохелины представляют собой семейство молекул с различными молекулярными весами, имеющих разнообразные, отличные друг от друга боковые цепи. Кроме того, впервые были получены очищенные экзохелины и показано их использование в качестве акцепторов свободного железа, что определяет их эффективность для предотвращения поражения ткани гидроксильными радикалами. В частности, очищенные экзохелины были выделены из М. tuberculosis, a также была продемонстрирована их эффективность для удаления железа из трансферрина, лактоферрина и ферритина при физиологическом рН, без передачи каких-либо инфекционных свойств бактерии, из которой они получены. Также было продемонстрировано впервые, что эти экзохелины блокируют образование гидроксильных радикалов по реакции Фентона, и на основании реакции клеток миокарда они могут быть эффективными для предотвращения реперфузных поражений после инфаркта миокарда или сосудистого инсульта других тканей, когда они вводятся либо сразу после проявления болезни, либо через несколько часов.

Хотя микобактины былы тщательно изучены, индивидуальные экзохелины до сих пор не были выделены или очищены и их структура и состав не были определены. Экзохелины не могут быть определены как пептиды. Вместо этого они содержат остатки трех аминокислот и другие структурные остатки (салициловой кислоты), дикарбоновых кислот и их моноэфиров и оксикарбоновых кислот), образованные с помощью амидной (-NH - СО -), гидроксиамидной ( - NH - (ОН) - СО -) и эфирной ( - СО - О -) конденсации. Ферри - и дезферриформы экзохелинов изображены на фиг. 1.

Получение экзохелинов

Экзохелины были выделены и очищены из вирулентного (Erdman) и авирулентного (H37Ra) штамма М1иЪегси1о818. Для увеличения производства экзохелинов из М.tuЪercu1osis, бактерии культивировали в среде с дефицитом железа. В частности, штамм Эрдмана М.tuЪercu1osis ( Американский аналог культуры 35801) и H37Ra (АТСС 25177), были выращены в Мидлбруковских 7Н11 (Middlebrook) чашках с агаровой средой при 37°С в 5% ί'.Ό₂. Через 14 дней бактерии были собраны, суспендированы в 1 50 мл модифицированной Саутоновской среды (Sauton's) в колбах с культурой и инкубированы от 3-х до 8-ми недель. Модифицированная Саутоновская среда содержала 0,12 мг/л железоаммонийного цитрата без добавления поверхностно-активного вещества.

Богатые железом экзохелины (ферриэкзохелины) затем выделяют путем фильтрования, насыщения железом и экстракции хлороформом с последующей очисткой методом жидкостной хроматографии высокого давления (ЖХВД). В частности, надосадочную жидкость из упомянутой выше суспензии фильтруют последовательно через связывающие низкобелковые фильтры размером 0,8 и 0,2 мкм. После этого экзохелины нагружают железом путем насыщения профильтрованной надосадочной жидкости обработкой хлоридом железа (150 мг на литр фильтрата культуры). Ферриэкзохелины смешивают с хлороформом (1 объем фильтрата культуры на 1,5 объема хлороформа) и после разделения слоев слой хлороформа, богатый экзохелином, отделяют и оставляют под безводным сульфатом магния (2 г/л). Хлороформный экстракт пропускают через фильтр, заполненный оплавленным стеклом, а затем выпаривают на роторном испарителе до образования коричневого остатка.

Коричневый остаток очищают суспендированием в 5 мл первого буферного раствора (0,1 % трифторуксусная кислота), который был нанесен на жидкостную хроматографическую колонку (С-18 Sep-Pak наполнитель). Коричневую полосу, образующуюся около верха колонки, элюируют с помощью второго буферного раствора (0,1 % трифторуксусной кислоты, 50 % ацетонитрила). Частично очищенный материал разбавляют в 3 раза в 0,1 % трифторуксусной кислоте и затем подвергают жидкостной хроматографии высокого давления с обращенной фазой со скоростью 1 мл/мин, начиная с момента загрузки колонки. Присутствие обогащенных железом экзохелинов в элюате обнаруживают путем одновременного мониторинга УФпоглощения, где пик при 450 нм соответствует соединениям железа, а пик 220 нм указывает на наличие амидной и ароматической групп. Приблизительно 5 главных и 1 0 незначительных пиков, изображенных на фиг. 2, соответствующих соединениям, элюированным в конце колонки С-18, демонстрируют высокую степень поглощения, составляющую 450/220 нм. То, что эти продукты представляют собой экзохелины, было подтверждено дополнительно с помощью масс-спктрометрии. Главные пики были далее „очищены с помощью второй обращенной фазы на алкилфенильной колонке. Экзохелины, выделенные из штамма Ердмана М. tuberculosis, оказались идентичными экзохелинам, выделенным из штамма H37Ra.

Характеристика экзохелинов На основании LSI- и ESI- масс-спектрального анализа многочисленных пиков, элюированных из колонки в их ферри- (Fe³⁺) форме (фиг. 3) следует, что железоэкзохелины не ограничиваются двумя специфическими молекулами, подробно описанными выше, но включают семейство молекул, располагающихся в интервале масс от 716 до 828 дальтонов. Каждый член семейства отличается от соседнего на 1 4 дальтон, что отражает число СН₂ групп в Ri алкильной боковой цепи и/или на 2 дальтона, что отражает присутствие двойной связи в R₁ алкильной боковой цепи. Соответственно, экзохелины образуют два ряда с последующими членами каждого ряда, отличающимися друг от друга по массе в 1 4 дальтон, а именно насыщенный ряд, имеющий массы приблизительно 716, 730, 744, 758, 772, 786, 800, 814 и 828 дальтонов и ненасыщенный ряд, имеющий массы 742, 756, 770, 784, 798, 812, 826. Кроме того, присутствие или отсутствие метальной группы при R3 (например, Н или СН₃) также определяет дополнительные два ряда молекул, названных как сериновый (R₃= Н) и треониновый ряды (R₃ = СН₃), как это следует из аминокислотного анализа. Наиболее полярные соединения находятся в левой части (элюируются раньше) и наименее полярные (более растворимые в липидах) находятся в правой части фиг. 3. Однако, все пики растворимы в воде. Там, где более одного пика имеет один и тот же молекулярный вес, каждый из них был обозначен А, В или С (например, 758А, В и С) , чтобы указать уровень полярности с определением более полярного соединения А и менее полярного С. Полагают, что более полярные соединения получают в результате различного расположения метильных групп в молекуле.

Структура экзохелинов Фиг. 4 показывает результаты анализа последовательно снятого масс-спектра при индуцированном распаде (Не флотируется при 2 кэВ для энергии столкновения 6 кэВ) главного на7 сыщенного серинсодержащего деферриэкзохелина с (М+Н)+ при т/е=720.3. Ионные фрагменты были отнесены к одной из шести структур AF, полученных из продуктов распада, образующихся по амидной или эфирной связи с переходом водорода относительно нейтральной молекулы, которой соответствует каждый из пиков спектра, показанного на фиг. 4. Кислотный гидролиз и метилирование экзохелинов приводит к образованию салициловой и пимелиновой кислот. Масс-спектрометрический анализ показывает, что пимелиновая кислота присутствует в экзохелине в виде метилового эфира.

На основании проведенного анализа, была предложена следующая общая структурная формула ферриэкзохелинов и дезферриэкзохелинов (фиг. 1). Метильные группы, показанные в положении R₄ (как определено на фиг. 10), могут находиться в положении R₅ . Центр молекулы железо-экзохелина представляет собой окружность с атомом железа в центре. Он содержит 3 кислотных остатка (два остатка Nоксилизина и 1 остаток серина или треонина, в зависимости от значения R₃ как водорода или метильной группы). Главное различие между экзохелинами и микобактинами из М. tuberculosis состоит в том, что R₁ в экзохелинах является либо насыщенным алкилметильным эфиром ((СН₂ )_N СООСН₃ ), либо ненасыщенным алкилметильным эфиром с одной двойной связью (СН2 )X СН = СН(СН2 )Y СООСН3, и экзохелины имеют значительно более короткие боковые цепи, чем микобактины. Эти более короткие боковые цепи имеют на конце остатки метиловых эфиров. Отмеченные различия обеспечивают экзохелинам растворимость в воде и способность функционировать во внеклеточном пространстве.

Клиническое применение

Клиническое применение при введении экзохелинов для предотвращения разрушения от реперфузии было продемонстрировано на мышечных клетках взрослой крысы.

В приведенных ниже примерах идентифицированы различные экзохелины, находящиеся в обеих формах: дезферри- и ферри- формах. Идентификация проведена с учетом их молекулярного веса, как это показано на кривой элюирования (фиг. 3).

Пример 1. Сердце мужской особи крысы иссекают после анестезирования животного, а затем производят торакотомию и сердце охлаждают in situ. Иссеченное сердце помещают в аппарат Лангендорфа и перфузируют коллагеном и гиалуронидазой в 50 мкМ кальция в модифицированном буферном растворе КребсаРингера. Ткань тонко измельчают и помещают в коллаген/трипсиновый раствор, а затем фильтруют в охлажденный трипсиновый ингибиторный раствор и подвергают обработке для повышения концентрации кальция. После удаления поврежденных клеток оставшуюся клеточную суспензию помещают в несколько ламинированных снаружи пластмассовых чашек наряду со средой культуры, содержащей 5 % эмбриональной бычьей сыворотки.

После того, как культуры простоят 48 ч, в каждую чашку добавляют перекись водорода и измеряют активность лактат дегидрогеназы (ЛДГ) в различные промежутки времени, которая является показателем клеточного повреждения. Индекс поражения клетки (ИПК) для сравнения получают, как путем измерения ЛДГ в необработанной клетке культуры для определения условия (0-ой индекс), так и после обработки детергентом, что приводит к 1 00 % распаду мышечных клеток (1 % Тритон Х-100), соответствующему величине ИПК = 1 00. Далее определяют показатель ЛДГ после обработки в определенных условиях в различные периоды времени, получая соответствующую величину ИПК, а затем из индивидуальных результатов строят график зависимости ИПК от времени, приведенный на фиг. 5.

Используя описанный выше метод, смесь экзохелинов в дезферри-форме 772С и 784 (смесь 50 : 50 пика 772С и пика 784), которая является относительно неполярным веществом, выделяют и используют для обработки клеток культур. Экзохелины были переведены в форму дезферриэкзохелинов путем инкубации в течение нескольких дней в присутствии 50 миллимолей ЕДТА при рН 6. Дезферриформу затем повторно очищают с помощью экстракции хлороформом.

Три образца клеток обрабатывают либо а) Н₂О₂; б) смесью НЮ₂ и 50 мкМ дезферриэкзохелина (экзохелин, не содержащий железа) добавляемых одновременно; либо с) НЦ₂, которую добавляют спустя 2 ч после добавления 1 00 мкМ дезферриэкзохелина к клетке культуры (прединкубация). Необработанные клетки культуры показывают почти 62% поражения клетки в течение 4 ч, в то время как добавление экзохелина одновременно с перекисью или на 2 ч раньше нее, в основном, предотвращает или существенно снижает повреждение клетки, которое составляет приблизительно от 2 до 9%.

Пример 2. Методику описанную в примере 1 , повторяют с использованием дезферриэкзохелина 758С, который является относительно более полярным, чем экзохелины 772С и 784. Не наблюдалось никакого различия между вариантами, когда дезферриэкзохелин 758С вводят одновременно с НЦ₂ или спустя 15 мин после введения H₂O₂. В обоих случаях спустя 2 ч разрушение клетки было практически таким же, как и в контрольном опыте. Однако введение дезферриэкзохелина 758С за два часа до введения НЦ₂ сокращает разрушение клетки до величины ИПК около 20. Результаты показаны на фиг. 6.

Пример 3. Методику, описанную выше, повторяют с использованием дезферриэкзохе9 лина 772А, 772С, и 758С. На фиг. 7-9 изображены графики результатов введения экзохелинов за два часа, одновременно и через 20 мин после введения Н₂О₂. Только экзохелин 772С демонстрирует замедление разрушения клетки в любых условиях, в то время как экзохелин 772А неэффективен ни при каких условиях. С другой стороны, экзохелин 758С демонстрирует защиту только в случае, если он вводится за 2 ч до введения перекиси. Таким образом, можно заключить, что относительно неполярные, более растворимые в липидах, экзохелины эффективны в том случае, когда они вводятся одновременно или после образования (-ОН) - радикала, т.е. после того как происходит разрушение клетки, более полярные экзохелины должны быть введены за 1 или за 2 ч до начала выделения свободных радикалов для предотвращения или снижения клеточного разрушения.

Пример 4. Способность экзохелинов конкурировать в качестве акцептора железа со связывающими железо протеинами «хозяина» определяют путем инкубации дезферриэкзохелина с раствором трансферрина, лактоферрина или ферритина при молярном соотношении железа к экзохелину от 4:1 до 1:1. Переход экзохелина из его дезферри- в его ферри- форму определяют с помощью ЖХВД в обращенной фазе. При взаимодействии в течении 1 мин дезферриэкзохелина и 95 % -ого насыщенного железом трансферрина, экзохелин начинает забирать железо из последнего, и в течение одного часа экзохелин полностью насыщается железом. Кроме того, оно легко удаляется из 40 % - ного насыщенного железом трансферрина, который по содержанию железа приближается к трансферрину, находящемуся в сыворотке крови. Аналогичные результаты были получены, когда дезферриэкзохелин вводят во взаимодействие с насыщенным железом лактоферрином. Подобным же образом освобождает железо для экзохелина и ферритин, но с меньшей скоростью, чем протеины, связанные с железом.

Было обнаружено, что экзохелины очень эффективны в отношении присоединения свободного железа из физиологических систем и удаления его из железосодержащих протеинов. В частности, было найдено, что экзохелины эффективно блокируют образование гидроксильных свободных радикалов (-ОН) и значительно снижают или предотвращают разрушение ишемической ткани, когда восстанавливается циркуляция крови к этой ткани, при этом менее полярные экзохелины с большим молекулярным весом более эффективны в предотвращении разрушения клетки. Хотя их полезность для ткани сердечной мышцы была уже продемонстрирована, выгода от применения экзохелинов после прерывания кровотока к другим органам, включая мозг, а также почки, печень, кишечник и скелетные мышцы, стала теперь очевидной.

Эксперименты показали, что экзохелины обладают не только сродством к железу, но и к другим металлам, с которыми они могут образовывать хелаты, например к Na, К, Мп, Al и Zn. Следовательно, экзохелины могут быть использованы для доставки в организм необходимых металлов или для хелатирования нежелательных металлов, присутствующих в организме. Кроме того, некоторые клетки, включая некоторые раковые, как известно, обладают сродством к некоторым металлам. Это может быть использовано для введения в эти клетки активных соединений, присоединенных к экзохелинам для разрушения клетки (химиотерапия) или для целенаправленной атаки больного органа с помощью полезного лекарства, связанного с экзохелином.

Наоборот, поскольку некоторые раковые клетки имеют высокую потребность в железе, дезферриэкзохелины могут быть использованы для связывания свободного железа, тем самым препятствуя доставке железа в раковую клетку, что ведет к ее разрушению.

Хотя структура экзохелинов, выделенных из М. tuberculosis приведена на фиг. 1, известно, что и другие микобактерии способны генерировать экзохелины, и что экзохелины могут иметь другие структуры и включать другие аминокислоты в зависимости от микобактерии, из которой они выделены. Однако все экзохелины будут вести себя одинаково и образовывать подобные ряды с последовательным расположением в нем членов, имеющих аналогичную последовательность молекулярных весов. Эффективность различных членов этих рядов будет также зависеть от относительной полярности молекул. Таким образом, изобретение включает экзохелины, выделенные из других микобактерий, которые включают, но не ограничиваются следующими видами:

М. tuberculosis, М. microti, М. bovis, М. africanum, M. kansasii, М. marinum, М. gastri, М. nonchromogenicum, М. terrae, М. trivale, М. malmoense, M. shimoidei, M. gordonae, M. asiaticum, M. szulgai, M. simiae, М. scrofulaceum, M. avium, M. Infracellulare, M. xenopi, M. ulcerans, M. haemophilum, M. farcinogenes, M. lepraemurium, M. paratuberculosis, M. chelonae subsp. Cheionae, M. chelonae subsp. Abscessus, M. fortuitum, M. chitae, M. senegalense, M. agri, M. smegmatis, M. phlei, M. tnermoresistibile. M. aichiense, M. aurum, M. chubuense, M. duvalii, M. flavescens, IVI. gadium, M. givum, M. komassense, M. neoaurum, M. obuense, IVI. parafortuitum, M. rtiodesiae, M. sphagni, M. rokaiense или М. vaccae.

Также было установлено, что экзохелины могут быть модифицированы для воздействия на такие их свойства, как растворимость, способность к образованию хелатов с металлами, а также скорость поглощения клеткой. Кроме того, обнаружение модифицированных экзохелинов или экзохелинов в виде металлических хе11 латов с использованием моноклональных антител или путем химического анализа в качестве диагностического инструмента, анализа крови, анализа мочи или с помощью неинвазивной инструментальной техники, дает возможность контролировать развитие болезненного состояния и эффективность лечения. В частности, структуры металлсодержащих соединений и соединений, свободных от металлов, представленные на фиг. 10, включают следующие заместители:

Ri представляет собой (СН₂)_П СН₃ в виде линейной или разветвленной цепи; (СН₂)_П СООН - жирная кислота; (CT₂)_nCOOR - эфир жирной кислоты, где R представляет собой алкил; (СН₂)_ПСОЫН₂;

R₂ представляет собой замещение по любому из 4 открытых участков кольца алкильными группами; сульфамидными группами; гидроксилом; галогеном, ацетилом; карбамилом; аминогруппой, NO₂ и любыми их комбинациями;

R₃ представляет собой Н (серин) или СН₃(треонин), которые могут быть замещены боковыми цепями β-гидроксиаминокислот, способных образовывать циклические оксазолиновые структуры;

R_4a и R_4b, представляют собой Н, СН₃ или другие алкил или замещенные алкильные группы;

R_5a и R_5b представляют собой Н, СН₃ или другие алкил или замещенные алкильные группы;

Х = О, NH, S, СН;

М представляет собой моно-, ди- или трехвалентный металл, такой как Pb, Al, Cd, Ni, Ag, Au, As, Mg, Mn, Zn, Cu, Ru, Nb, Zr, Та, V, Ga, Pt, Cr, Sc, Y, Co, Ti, Na, K.

* представляет собой обозначение хиральных центров, которые могут быть R или S.

Различные гидроксильные группы (ОН), вовлеченные в реакцию хелатирования металлов, могут быть замещены на различные функциональные группы, такие как Н или галоген, для того, чтобы изменить сродство соединения к хелатированному металлу или для превращения молекулы в металлический антагонист.

Хотя настоящее изобретение было описано со значительными подробностями со ссылкой на некоторые предпочтительные варианты его осуществления и применения, их не следует рассматривать как ограничение изобретения. Например, экзохелины могут быть использованы для атаки на инфекционные бактерии, такие как М. tuberculosis, путем блокирования доступа микобактерии к железу для удаления токсичных металлов из организма или для доставки в организм необходимых металлов. Кроме того, модифицированные металлсодержащие экзохелины могут доставлять назначенные активные лекарства или химические соединения к тем участкам организма, которые предпочтительно поглощают хелатированный металл. В результате такие предпочтительно поглощенные экзохелины с хелатированными металлами могут быть использованы для целенаправленного лечения с помощью других методов, например микроволновой энергии для гипотермической обработки раковых клеток.

Поэтому объем предложенной формулы изобретения не должен быть ограничен только описанием предпочтительных примеров его осуществления.

Claims

1. Композиция для защиты живой ткани млекопитающего от разрушения, вызванного воздействием свободных гидроксильных радикалов, образовавшихся вслед за восстановлением потока жидкости к органу после ограничения поступления к нему кровотока, включающая дезферриэкзохелин и физиологически приемлемый носитель, отличающаяся тем, что в качестве дезферриэкзохелина она содержит эффективное количество, по меньшей мере, одного дезферриэкзохелина формулы где R₁ выбран из группы, состоящей из (СН2)пСООСН₃ и (СН2χСН=СН(СН2)γСООСН₃при значениях n от 1 до 7 и (х + у) от 1 до 5,

R2 - химический фрагмент, замещенный по любому из 4 открытых участков кольца, причем этот фрагмент выбирают из алкильной группы, сульфамидной группы, гидроксила, галогена, ацетила, карбамила, аминогруппы, NO2 и их комбинаций;

и R₃ выбирают из группы, состоящей из Н и СН₃, причем эти дезферриэкзохелины имеют молекулярный вес примерно от 716 до 826 дальтон.

2. Композиция по п.1, где живая ткань представляет собой ткань сердечной мышцы и жидкость выбрана из группы, состоящей из растворов, используемых при реперфузии и кардиоплегии.

3. Композиция по п.1, включающая смесь дезферриэкзохелинов, имеющих молекулярный вес от 772 до 782 дальтон.

4. Композиция по п.1, включающая смесь из относительно неполярных дезферриэкзохелинов, для которых значение n составляет от 5 до 7.

5. Композиция по п.1, включающая смесь из относительно неполярных дезферриэкзохе13 линов, для которых значение (х +у) составляет 4 или 5.

6. Композиция для предотвращения разрушения живой ткани млекопитающего как результата опосредованного ионами образования гидроксильных радикалов, включающая дезферриэкзохелин и физиологически приемлемый носитель, отличающаяся тем, что в качестве дезферриэкзохелина она содержит эффективное количество, по крайней мере, одного дезферриэкзохелина формулы где Ri выбран из группы, состоящей из (СН2)пСООСНз и (СН2)хСН=СН(СН2)уСООСНз, где п составляет от 1 до

7 и (х + у) от 1 до 5,

R₂ - химический фрагмент, замещенный по любому из 4 открытых участков кольца, причем этот фрагмент выбирают из алкильной группы, сульфамидной группы, гидроксила, галогена, ацетила, карбамила, аминогруппы NO₂ и их комбинаций;

и R₃ выбран из группы, состоящей из Н и СНз, причем эти дезферриэкзохелины имеют молекулярный вес примерно от 716 до 826 дальтон.

где R₁- химический фрагмент, выбираемый из группы, состоящей из (СН2)пСНз, (СН2)п СООН, (С1 EyCOOR, где R представляет собой алкильную группу и группу (СН₂)_пСОЯН₂;

R2 - химический фрагмент, замещенный по любому из 4 открытых участков кольца, причем этот фрагмент выбран из алкильных групп, сульфамидной группы, гидроксила, галогена, ацетила, карбамила, аминогруппы, NO2 и их комбинаций;

R₃ - химический фрагмент, выбираемый из группы, состоящей из остатков β-гидроксиаминокислот с боковыми цепями, которые способны образовывать оксазолиновые структуры;

R_4a, R_4b, R_5a, R_5b - химические фрагменты, выбираемые из группы, состоящей из Н, алкильных групп или замещенных алкильных групп;

* - представляет собой хиральные центры, которые могут быть R или S.

8. Соединение по п.7, обладающее терапевтическим действием, выбираемое из группы, состоящей из насыщенных и ненасыщенных соединений, причем насыщенные соединения имеют массу 660, 674, 688, 702, 716, 730, 744, 758, 772, 800, 814 и 828 дальтон, ненасыщенные соединения имеют массу 686, 700, 714, 728, 742, 756 и 770 дальтон.

9. Способ получения хелата металла формулы отличающийся тем, что включает обработку соединения по п.9 раствором, содержащим ион металла М, где М выбирают из группы, состоящей из железа, свинца, алюминия, кадмия, никеля, серебра, золота, мышьяка, магния, марганца, цинка, меди, рубидия, ниобия, циркония, тантала, ванадия, галлия, платины, хрома, скандия, иттрия, кобальта, титана, натрия и калия.

10. Хелат металла формулы где М выбирают из группы, состоящей из железа, свинца, алюминия, кадмия, никеля, серебра, золота, мышьяка, магния, марганца, цинка, меди, рубидия, ниобия, циркония, тантала, ванадия, галлия, платины, хрома, скандия, иттрия, кобальта, титана, натрия и калия.

11. Хелат металла по п.10, где М представляет собой железо.

Евразийский патент действует на территории всех Договаривающихся государств, кроме AM и MD.