PL177585B1 - Peptyd chemotaktyczny wykrywalnie znaczony oraz środek farmaceutyczny do wykrywania miejsca infekcji lub zapalenia zawierający peptyd chemotaktyczny - Google Patents

Abstract

1 1. Peptyd chemotaktyczny wykrywalnie znaczony o wzorze X -Y - Leu - Phe - [Z]n - K - M1 w którym: X oznacza grupe zabezpieczajaca grupe aminowa, Y oznacza aminokwas, Z oznacza sekwencje rozpórki dobrana sposród grup obejmujacych alifatyczne diaminy o 1-6 ato- mach wegla, R6 , i ich mieszaniny, przy czym R6 oznacza jedna lub wiecej jednakowych lub róznych reszt aminokwasowych, n jest równe 0 lub 1, a K - M1 oznacza podstawnik znakujacy lub przylaczajacy, w którym K oznacza posrednia funkcyjna grupe hydrazyno-nikotynoamidowa (HYNIC) a M1 oznacza wykrywalny znacznik. 44. Srodek farmaceutyczny do wykrywania miejsca infekcji lub zapalenia u osobnika, zawierajacy wykrywalnie znaczony chemotaktyczny peptyd, który kumuluje sie w zasadzie tylko w miejscu infekcji lub zapalenia, znamienny tym, ze zawiera chemostatyczny wykrywalnie znaczony peptyd o wzorze X - Y - Leu -Phe -[Z]n - K - M1 w którym: X oznacza grupe zabezpieczajaca grupe aminowa, Y oznacza aminokwas, Z oznacza sekwencje rozpórki dobrana sposród grup obejmujacych alifatyczne diaminy o 1-6 ato- mach wegla, R6 , i ich mieszaniny, przy czym R6 oznacza jedna lub wiecej jednakowych lub róznych reszt aminokwasowych, n jest równe 0 lub 1, a K - M 1 oznacza podstawnik znakujacy lub przylaczajacy, w którym K oznacza posrednia funkcyjna grupe hydrazynonikotynoamidowa (HYNIC) a M1 oznacza wykrywalny znacznik. PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest peptyd chemotaktyczny wykrywalnie znaczony oraz środek farmaceutyczny do wykrywania miejsca infekcji lub zapalenia zawierający wymieniony peptyd chemotaktyczny, który kumuluje się w zasadzie tylko w miejscu infekcji i zapalenia.

Stan zapalny pojawia się jako reakcja na różne formy uszkodzenia tkanki. Uszkodzenia tkanki mogą być wynikiem inwazji bakteryjnej, procesów autoimmunologicznych, odrzucenia aloprzeszczepu tkanki lub organu albo takich zewnętrznych wpływów uszkadzających jak ciepło, zimno, energia promieniowania, bodźce elektryczne lub chemiczne lub urazy mechaniczne. Niezależnie od przyczyny i miejsca w organiźmie, następująca po uszkodzeniu reakcja zapalna jest podobna, stanowiąc złożony zespół regulacji funkcyjnych i komórkowych, obejmujący zmiany mikrocyrkulacji, ruchu płynów, i napływu oraz aktywacji komórek zapalnych (leukocyty). Ten schemat reakcji tworzy ważną część wrodzonych mechanizmów obronnych gospodarza przeciw infekcji, i chociaż „kosztuje” dodatkowe uszkodzenia tkanki wynikające z samego procesu zapalnego, ostatecznie sprzyja następującemu po tym procesowi zdrowienia.

Po infekcji bakteryjnej, lub po niektórych formach uszkodzenia tkanki, powstają rozpuszczalne substancje chemiczne inicjujące kaskadę reakcji zapalnych, składających się na złożony szereg zdarzeń. Przepływ krwi w miejscu zapalnym wzrasta, a w odpowiedzi na zwiększoną przenikalność kapilarną, następuje odpływ płynu z krwi. Zlokalizowane w miejscu urazu wypływanie płynu obejmuje proteiny osocza, które normalnie opuszczają kapilary ze stosunkowo małą szybkością. Leukocyty także wnikają do miejsc zapalnych przez kapilary, zarówno wskutek procesów pasywnych jak i aktywnych. Zapalny wysięk komórkowy początkowo składa się w pierwszym rzędzie z leukocytów cechujących się różnokształtnością jąder komórkowych (PMN) (zwanych także neurofilami lub granulocytami). Następnie, monocyty, limfocyty i komórki osocza można znaleźć w infiltracie zapalnym.

Identyfikacja i charakterystyka miejsc infekcji i zapalenia są ważne dla klinicznej diagnozy w medycynie i weterynarii. W przypadku wcześnie zlokalizowanych infekcji, często jest niezbędne szukanie „ukrytych miejsc zapalnych” u osobników, którzy nie posiadają bardziej specyficznych objawów klinicznych i wykazują tylko gorączkę i utratę masy ciała. Podobnie, u chorych z chorobami autoimmunologicznymi, takimi jak reumatoidalne zapalenie stawów, lub u biorców odrzucających aloprzeszczepy tkanki lub organu, zdolność identyfika177 585 cji miejsc zapalnych, określenia ich stopnia, monitorowanie zmian po rozpoczęciu terapii, jest ważna dla skutecznej opieki klinicznej.

Nie jest zatem zaskoczeniem, że włożono wiele wysiłku i opracowano szereg technik w celu identyfikacji miejsc(a) i oceny stopnia procesu zapalnego. Techniki te obejmują techniki rentgenowskie, skaning CAT, i rozmaite skaningi radionuklidowe. (Sutton, A Textbook of Radiology Imaging, trzecie wydanie, Churchill Livingston (1980); Maysey i wsp., Clinical Nuclear Medicine, Wydawca, W. B. Sanders (1983). Przykłady wykorzystywanych technik skaningów radionuklidowych obejmują:

1.⁶⁷Ga, który po iniekcji wiąże się z proteiną osocza, transferyną, i wykazuje tendencję do sytuowania się w miejscach przewlekłych zapaleń;

2. granulocyty znaczone ^fIn, które po powtórnej iniekcji do gospodarza, będą się nagromadzać w miejscu zapalnym;

3. radioznaczone chelaty, które przechodzą do płynu pozakomórkowego i mogą się następnie kumulować w miejscach nagromadzenia płynu; i

4. skaningi talowe łub tzw. angiogramy radionuklidowe pierwszego przejścia, dla oceny obszarów zwiększonego przepływu krwi.

Tradycyjne techniki medycyny nuklearnej wykorzystują następujące radiofarmaceutyki dla obrazowania zapalenia infekcyjnego: cytrynian 6^?Ga, leukocyty znaczone ¹¹¹ In, leukocyty znaczone ^99mTc oraz ludzkie poliklonalne IgG znaczone ^IHIn. Chociaż każdy z tych środków może dać pozytywne wyniki w określonych sytuacjach, pozostaje znaczące pole dla ulepszeń.

Cytrynian 6^?Ga może być mechanicznie przydzielony do kategorii z 1ln-IgG (M. cz.: 150kD) jako znaczoną proteiną, ponieważ, po dożylnej iniekcji, cytrynian 6^?Ga łatwo transchelatuje do krążącej w osoczu transferyny (M. cz.: 100 kD) i laktoferyny (M. Cz.: - 100 kD). Obrazowanie zapalenia przy użyciu znaczonych protein jest wynikiem różnic szybkości nagromadzenia w miejscu zapalenia i uwalniania z normalnych tkanek (Juweid, M., i wsp., Eur. J. Nuci. Med. 19:159-165 (1992)). Przy użyciu tych reagentów, optymalne wykrywanie uszkodzenia w typowym przypadku następuje co najmniej po 24 godzinach po iniekcji wskutek preferencyjnego wymywania z normalnych tkanek i uwalniania z krwi.

Thakur i wsp. przeprowadzili rozległe analizy i dyskusję metod opartych na znakowaniu neutrofilu in vitro (Sem. Mud. Med. 14:107-117(1984)). W tym podejściu, neutrofile osobnika są znaczone radionuklidami emitującymi promienie gamma, przy czym ^mIn jest wybranym nuklidem. Taki znaczony neutrofil może być użyty w badaniach kinetycznych in vivo do obrazowania ognisk zapalnych. Niekorzystną cechą tej techniki jest konieczność usuwania i wyodrębniania neutrofilu przed znakowaniem in vitro.

Leukocyty wytwarzają różnorodne mediatory, kontrolujące zakres i czas trwania reakcji zapalnej, i mają na swojej powierzchni rozmaite receptory, które mogą wiązać i reagować na mediatory chemiczne i inne proteiny obecne w płynie zapalnym. Takie oddziaływania receptor-mediator są ważne dla funkcji kontrolowania leukocytu w miejscu zapalnym. Wśród mediatorów zapalnych są czynniki chemotaktyczne, zwane także chemoatraktantami, o zdolności do indukowania ukierunkowanej migracji i aktywacji PMN i makrofagów (ogólny przegląd i omówienie podaje Roitt i wsp., Immunology, Gower Medical Pub., London (1985)).

Leukocyty znaczone n'In okazały się bardzo dobrym środkiem obrazującym, lecz wymagany jest znaczny czas przygotowania oraz manipulowanie krwią. Czasy badania dalej są przedłużone, ponieważ radioznaczone komórki wymagają szeregu godzin dla zlokalizowania po iniekcji, gdyż muszą wykryć sygnał chemoatraktanta, a następnie migrować do miejsca zapalenia. Także względy dozymetryczne ograniczają ilość radioaktywności, którą można podać, co często daje obrazy o słabej jakości. Chociaż można zastosować znacznie wyższe dawki leukocytów znaczonych 99^|nTc, ogólna stosowalność jest ograniczona przez nagromadzanie się radioaktywności w organach niedocelowych.

Czas między iniekcją i wykryciem uszkodzenia można by znacząco zmniejszyć przez opracowanie radiofarmaceutyków o niskim ciężarze cząsteczkowym, które przyłączają się do cyrkulacji komórek zapalnych jak również do komórek już obecnych w miejscu zapalnym. Cząsteczkami będącymi kandydatami o tych cechach są: IL-8 (Baggiolini, M. i wsp., J. Clin. Invest. 84(4): 1045-1049(1989)), czynnik płytkowy-4 (Deuel, T. F. i wsp., Proc. Natl. Acad.

177 585

Sei. USA 78(l):4584-4587 (1981)) i peptyd, N-formylo-mdtionylo-lducylofdnyloalanina (ForMLF) (M.cz. 437) (Showeil, H. J. i wsp., J. Exper. Med. 143:1154-1169 (1976); Schiffmann, E. i wsp., Poe. Natl. Acad. Sci. USA 72:1059-1062 (1975); Williams, L. T. i wsp., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74:1204-1208 (1977)).

For-MLF jest bakteryjnym produktem inicjującym chemotaksję leukocytu przez wiązanie do receptorów o wysokim powinowactwie na błonach białych ciałek krwi (Williams, L. T. i wsp., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74:1204-1208 (1977); ShowcK H. J. i wsp.. J. Exper. Med. 143:1154-1169 (1976); Schiffmann, E. i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:1059-1062 (1975)). Te receptory są obecne na PMN i fagocytach jednojądrowych. Chociaż liczne badania in vhro struktura-aktywność wykazały, że wiele syntetycznych analogów tych małych, Nformylo-metionylowych peptydów wiąże się do neutrofilów i makrofagów z równym lub większym powinowactwem w porównaniu do rodzimego peptydu (Niedel, J. i wsp., J. Biol. Chem. 255:7063-7066 (1980); OTlaherty, J. T. i wsp., J. Immunol. 120:1326-1332(1978); Rot, A. i wsp., Proc. Nati. Acad. Sd. USA 84:7967-7971(1987); Iqbal, M. i wsp., FEBSI6S:171-174 (1984)), badania in vivo biodystrybucji i aktywności biologicznej były stosunkowo ograniczone. Ponieważ granulocyty reagują na gradient chemoatraktanta, powinowactwo receptorów obniża się w miarę jak dodatkowe receptory ulegają ekspresji, dopóki komórka osiągnie miejsce zapalne, gdzie stężenie chemoarraktanta jest największe (Snyderman, R. i wsp., Rev. Infect. Dis. 9:5562-5569 (1987); Fletcher, M. P., J. Immunot. 128:941948 (1988); Niedel, J. i wsp., J. Biot. Chem. 10:700-710 (1979)). Na skutek bardzo małej wielkości For-MLF (M. cz. 437) można łatwo manipulować jego strukturą cząsteczkową w celu zaprojektowania optymalnego środka obrazującego.

Wiele gatunków bakterii może wytwarzać jeden lub więcej rodzajów cząsteczek chemotaktycznych, małe peptydy, większe proteiny lub lipidy (Klein; J., Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination, Wiley Interscience, New York (1982)). Np. wiadomo, że bakterie E. coli wytwarzają skuteczne cząsteczki chemotaktyczne, których aktywnymi składnikami są małe, heterogenne peptydy o zablokowanych grupach aminowych. Takie peptydy zsyntetyzowano i wiadomo, że są skutecznymi chemoarzaktantami dla PMN. Najbardziej znanymi z tych chemotakrycenych peptydów są For-MLF i pewne pokrewne tdrrapeprydy (Schiffman i wsp., Proc. Natl. Acad. Sd. USA 72:1059-1062 (1975); Schiffman i wsp., opis patentowy US 4.427.660 (1984)). Badania struktura-funkcja tych peptydów zasugerowały obecność stdrdospecyficenych receptorów na powierzchni komórek docelowych (Becker, E. L., Am. J. Pathol. 85:385:394 (1976)); takie receptory były następnie wykryte przy użyciu radioznaczonych formylopeptydów jako ligandów (Williams i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:1204-1208 (1977)). Następnie, zsyntetyzowano chemotaktyczny peptyd o strukturze BFormylo-NId-Leu-Phe-NId-Tyr-Ly_s, który można by znaczyć dla uzyskania wyższej radioaktywności właściwej przy użyciu ^UT na reszcie Tyr, i wykazano, że wiąże się silnie do receptorów na ludzkim neutrofilu (Niedel et at., J. Biol. Chem. 254:10700-10706 (1979)).

Komórki bakteryjne mogą również indukować w komórkach gospodarza wytwarzanie czynników chemotaktycznych, np. przez aktywowanie składników uzupełniającego układu gospodarza, powodując wzrost lokalnego wytwarzania cząsteczek chdmorakrycenych, C5a i C5b67. Gdy reakcja immunologiczna wystąpi u gospodarza, cząsteczki przeciwciała IgG mogą również działać jako czynniki chemorakryczne, tak samo jak cząsteczki wytworzone przez aktywowane limfocyty T. Różne cząsteczki chemotakrycene są selektywne dla różnych PMN (np. neutrofile, bazoble, cozynofile), komórek mast, monocytów/makrofagów lub limfocytów, co jest oparte na obecności odpowiednich receptorów typu komórki zapalnej.

Chdmorakrycene peptydy były obiektem licznych badań struktura-aktywność ukierunkowanych na oznaczenie specyficznych cech cząsteczki, odpowiedzialnych za wiązanie i aktywację receptora (Deuel, T. F. i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78(1 ):4584-4587 (1981); O’Flaherty, J. T. i wsp., J. Immunot. 120:1326-1332(1978); Rot, A. i wsp., Pro. Nart. Acad. Sci. USA 84:7967-7971(1987); Iqbal. M. i wsp., FEDS 165:171-174(1984)). Większość tych badań koncentrowała się na podstawieniach naturalnych aminokwasów w sekwencji For-MLF; jednak, były doniesienia o rozszerzonych peptydach i peptydach wysoce ujemnie naładowanych (Fischman, A. J., I. Nucl. Med. 32:483-491 (1991); Toniolo, C. i wsp., Bio177 585 chem. 23:698-704 (1984)), cechujących się EC₅₀ aktywacji i wiązania receptora, mniejszym lub równym wielkościom rodzimego peptydu. Na ogół, wyniki tych badań strukturaaktywność wykazały że, chociaż modyfikacja na końcu N ma znaczny ujemny wpływ na wiązanie i aktywację receptora, modyfikacje C-końcowe mają wpływ minimalny (Spisani,

S. i wsp. , nnflammaiion 10:363-369 (1986)). Ponadto. wiąmiie receptora i aktywaność biologiczna są silnie skorelowane (Deuel, T. F. i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78(1):45844587 (1981); SchiffmaoLO, E. i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:1059-1062 (1975)). W oparciu o te dane, zaproponowano model konformacji kompleksu receptor-peptyd, w którym jedynie cztery reszty aminokwasowe N-końcowe oddziałują z receptorem (Freer, R. J. i wsp., Biochem. 21:257-263 (1982)).

Wykazano, że syntetyczne analogi For-MLF, modyfikowane na końcu C, wiążą się do neutrofilów i makrofagów z równym lub większym powinowactwem w porównaniu z rodzimym peptydem (Deuel, T. F. i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78(l):4584-4587 (1981); Schiffmaoo, E. i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:1059-1062 (1975); Niedel,) i wsp., J. Biol. Chem 255:7063-7066 (1980)). Zatem włączenie znaczonego ugrupowania na końcu C pozwala na wytworzenie radiozoaczooych analogów o zachowanym wiązaniu do receptora.

To podejście do obrazowania infekcji daje szereg teoretycznych korzyści względem obecnie stosowanych radiofarmaceutyków. Przedział między iniekcją a wykryciem uszkodzenia można by zasadniczo zmniejszyć przez zdolność tych małych cząsteczek do wiązania cyrkulujących granulocytów, jak też leukocytów już obecnych w miejscu zapalnym. Niski ciężar cząsteczkowy peptydu (<1000 daltooów) pozwala na szybszą dyfuzję do obszarów infekcji i zapalenia w porównaniu do znaczonych protein i leukocytów. Ponadto, radiozoakowanie granulocytów in situ eliminuje zmianę funkcji komórkowych, związaną z konwencjonalną procedurą znakowania i eliminuje manipulowanie krwią i nieodłącznie związane z tym niebezpieczeństwo dla personelu i chorych.

Zoghbi i wsp., J. Nuc. Med. 22:32 (1981) For-MLF znaczone Ίο przy użyciu traosferyny proteinowej połączyli z peptydem i zasugerowali, że ten reagent daje nadzieję na selektywnie znaczony ludzki ο^^ίΑΙ. O ile to podejście daje potencjalne rozwiązanie problemu specyficzności znakowania, mie sugeruje ooo rozwiązania komplikacji związanej z usuwaniem komórek z osobnika, manipulowaniem oimi io vitro, a następnie powtórnym ich umieszczeniem w organiźmie.

W jednym z dooiesień opisaoo próbkę zlokalizowania ropienia jałowego io vivo przez bezpośrednią iniekcję N-Formyl-NIr-Lru-Phe-NIr-Tyr-Lys znaczonego · 5 do królików (Jiaog i wsp., Nuct. Med. 21:110-113 (1982)). Chociaż osiągnięto korzystne stosunki znakowania (ropień-mięsień), użycie tego środka spowodowało przejściową oeutropeoię, po której nastąpiła nawrotowa neutrofilia. Autorzy uznali, że potrzebne jest dalsze opracowywanie metody, by uniknąć efektów ubocznych oeutropenii/orutronilii i aby uczynić tę metodę klioiczoie przydatną. Pooadto, '5 oie obrazuje dobrze i odsyłacz teo oie ujawnia ani nie sugeruje lepszych izotopów obrazujących, takich jak ³I, Io lub ^mTc.

Morgan i wsp. w opisie patentowym US 4.986.979 ujawnili sposób zwiększenia ilości znaczników nagromadzających się w tkaoce miejsc zapalnych. Opisaoo, że zwiększenie zoaczoika w miejscach zapalenia tkaoki uzyskuje się przez infuzję znakowanego czyaoika rozpoznającego, zdolnego do współdziałania w miejscu zapaleoia z leukocytami, które zostały zaktywizowane w procesie zapalnym. Zwiększeoie kumulacji znacznika w miejscu docelowej tkaoki możaa przeprowadzić, zgodnie z tym opisem, poprzez strumień krwi i tkankę obwodową. To znaczy, najpierw droga iofuzji wprowadza się nie znakowany czyaoik rozpoznający i przyłącza sic' do miejsc, do których ηοΡςρι··^ .υρι·ο\υ;ιι1ζ;) się xiart^^aOi^. Pozwata to na szyłb sze i pełniejsze kumulowanie podawanego później znakowanego czynnika roypoyoaoia w miejscach zapaleoia. Wykorzystuje się regulację „go góry” powierzchniowych markerów antygenowych oa leukocytach po ich aktywacji. Opisαak sposób obrazowania wykorzystujący chemotaktyczny peptyd zawierający zoaczoik powiaowactwa i zaaczaik radionuklidowy sprzężony z leukocytami. Autorzy ci nie ujawnili żadnych metod syntetycznych syntezy antagonistów lub faktu że tacy antagoniści mogą być przydatni w uoikaoiu reakcji neutropeniczoych.

177 585

O ile powyższe techniki mogą dostarczyć przydatną informację, mogą one również spowodować niedopuszczalnie wysoką częstotliwość zarówno błędnych dodatnich jak i błędnych ujemnych wyników. Wymagają nieakceptowanie dużego manipulowania i przetwarzania, lub towarzyszą im niedopuszczalne efekty uboczne. Zatem istnieje w stanie techniki uznana ciągła potrzeba bardziej bezpośrednich, czulszych i bardziej specyficznych metod wykrywania i lokalizacji miejsc infekcji lub zapalenia, w szczególności techniki, którą można by wykonywać seryjnie, tak żżyy moana Iw©) cennie w zassi e reacej ę aa tenżpję.

Wynalazek rozwiązuje ten problem poprzez opracowanie środka farmaceutycznego do wykrywania miejsca infekcji lub zapalenia u osobnika, na bazie wykrywalnie znaczonego peptydu chemotnatypzaeeo.

Peptyd chemntnktzcznz wykrywalnie znaczony według wynalazku przedstawiony jest wzorem

X - Y - Leu -Phe- [Z],, - K - M1 w którym:

X oznacza grupę zabezpieczającą grupę aminową,

Y oznacza aminokwas,

Z oznacza sekwencję rozporki dobraną spośród grup obejmujących alifatyczne dinmiaz o 1-6 atomach węgla, R⁶, i ich mieszaniny, przy czym R’ oznacza jedną lub więcej jednakowych lub różnych reszt aminokwasowych n jest równe 0 lub 1, a

K - M1 oznacza podstawnik znakujący lub przyłączający, w którym K oznacza pośrednią funkcyjną grupę hydraryao-nikotznonmidową (HYNIC) a M1 oznacza wykrywalny znacznik.

Korzystny jest peptyd, w którym Y oznacza grupę o wzorze

- NH - CH(R') - (C=O) w którym R1 oznacza benzyl, alkil lub grupę -CH2 - CH2 - R2 - CH3, w której R2 oznacza -S-, -SO2-, -SO- lub -O-.

W peptydzie tym korzystna grupa X zabezpieczająca grupę aminową dobrana jest spośród grup N-formylowej, t-Boc, karbaminianów, karbokszamidów, tiokarżoksyamidów, moczników, tiomoczników i odpowiadających im pochodnych pzeannguanidzaowyph, sulfoamidów i Cosfonoamidów.

X oznacza również grupę o wzorze

R³ - C = R⁴, w którym Ri dobrane jest z grupy obejmującej wodór, alkil, alkenyl, alkinyl, alkoksyl, aryloalknkszl i amino a R4 oznacza tlenowiec.

Korzystny pepetyd przedstawiony jest wzorem

X - Met - Leu - Phe - [Z]_n - K - M1

W peptydzie tym reszta metioninowa może być zastąpiona kwasem 4-nmiaotetrahzCrotiopirnao-4-knrbokszlowzm. Reszta leucynowa może być zastąpiona dipropzloglicyną lub kwasem 1-aminopykloheksaaokarbokszlowzm. Reszta fenzloalaninowa może być zastąpiona z-dehydrofeayloalnainą kwasem 2-nminoiadnaono-2-karbokszlnwzm lub anilinogb^ą

W korzystnym peptydzie n wynosi 1, a Z oznacza R6. Aminokwas w R6 niezależnie dobrany jest z grupy obejmującej norleucynę, tyrozynę, kwas asparaginowy, lizynę, leucynę

177 585 i fenyloalaninę. Również w przypadku, gdy występują dwie lub więcej reszt w R6 są one niezależnie dobrane z grupy obejmującej norleucynę, tyrozynę, kwas asparaginowy, lizynę, leucynę i fenyloalaninę.

Szczególnie korzystny chemotaktyczny wykrywalnie znaczony peptyd zawiera człon wybrany z grupy obejmującej:

izopropylomocznik-Met-Leu-Phd-Lys-SHNH-BOC, iozpzopylomocznik-M.er-I.eu-fhc-n-propγlodiamino-Λsp-SHNH HBr, izopropylomocznik-Mer-Leu-ehd-Lys-Asp-SHNH HBr, izopropylomocenik-Mer-Ldu-ehd-Lys-SHNH HBr i izopropylomocemk-Mdr-Ldu-ehd-propanodiamino-SHNH HBr.

Jako wykrywalny znacznik M¹ peptyd zawiera izotop radioaktywny taki jak ^mTc, ^l23I, 31t 97t)„ 89-7^ 72 a „ 90_v 67r-v ΖΟΙπρτ 2l7rj· 211 a ₊ 212t)U 47c„ 111t„ 1,,U 109t)4 Γ?.„1 ^l25I, Ί'Ι, ⁹⁷Ru, 6⁸Ga,⁸⁹Zr, ⁷²As, ⁹⁰Y, ^wCu, 2^UUI, 2^r/Bi, ²¹ 'At, H, ^Sc, 'In lub ^1ϋ9Μ. Ewentualnie M1 obejmuje izotop paramagnetyczny lub związek, który może być obrazowany za pomocą PET (positron emission tomography).

Ponadto K - M1 może dodatkowo zawierać L oznaczając ligand pomocniczy przyłączony do M1 taki jak np..glukoheptonian, trycyna lub dodatkowa jednostka peptydu.

Korzystny jest peptyd chemotaktyczny o podanym powyżej wzorze, w którym X oznacza grupę zabezpieczającą grupę aminową o wzorze

R³ - C = R⁴ w którym R³ dobrane jest z grupy obejmującej atom wodoru, alkil, alkenyl, alkinyl, alkoksy, aryloalkoksy i grupę aminową, a R4 oznacza tlen lub siarkę.

Y oznacza Met, Phe lub Nle,

Z oznacza sekwencję rozporki dobraną z grupy obejmującej diaminy alifatyczne o 1-6 atomach węgla, R6 i ich mieszaniny, przy czym R^s oznacza jedną lub więcej takich samych lub różnych reszt aminokwasowych, n jest równe 0 lub 1, a

K - M1 oznacza podstawnik znakujący lub przyłączający, w którym K oznacza pośrednią funkcyjną grupę hydzaeynonikotynoamidową (HYNIC) a M oznacza wykrywalny znacznik.

Szczególnie korzystny jest peptyd, w którym Y oznacza Met. Reszta metioninowa może również być zastąpiona przez kwas 4-aminotetrahydrotiopirano-4-karboksylowy. Reszta leucynowa może być zastąpiona przez dipropyloglicynę lub kwas 1-aminocykloheksanokarboksylowy, zaś reszta fenyloalaninowa może być zastąpiona przez zdehydrofenyloalaninę, kwas 2-aminoindanono-2-karboksylowy lub anilinoglicynę.

W tym korzystnym pdprydzid n jest równe 1, a Z oznacza R6, przy czym reszta aminokwasowa, lub dwie lub więcej reszt aminokwasowych, w R6 niezależnie dobrane są z grupy obejmującej norleucynę, tyrozynę, kwas asparaginowy, lizynę, leucynę i fenyloalaninę.

W peptydzie tym K - M1 może dodatkowo zawierać L oznaczające ligand pomocniczy przyłączony do M1 przy czym ligand pomocniczy obejmuje glukoheptonian, trycynę lub dodatkowąjednostkę peptydu.

Dalszą korzystną grupą peptydów o podanym powyżej wzorze sąpeptydy, w których:

X oznacza grupę zabezpieczającą grupę aminową o wzorze R ³ - C = R⁴ w którym R³ dobrane jest z grupy obejmującej atom wodoru, alkil, alkenyl, alkinyl, alkoksy, aryloalkoksy i grupę aminową, a R4 oznacza atom tlenu lub siarki,

Y oznacza resztę aminokwasową,

177 585

Z oznacza sekwencję rozporki wybraną z grupy obejmującej diaminy alifatyczne o 1-6 atomach węgla, R6, i ich mieszaniny, przy czym R, oznacza jedną lub więcej takich samych lub różnych reszt aminokwasowych, n jest równe 0 lub 1 a

K oznacza pośrednią funkcyjną grupę hydrazynonikotynoamidową (HYNIC), a

M oznacza wykrywalny znacznik.

W peptydzie tym, gdy Y oznacza Met, Phe lub Nle, K dodatkowo zawiera L oznaczające ligand pomocniczy przyłączony do K, przy czym ligand pomocniczy obejmuje glukoheptonian, trycynę lub dodatkowąjednostkę peptydową.

Dodatkowa jednostka peptydową oznacza jednostkę o wzorze

X - Y - Leu - Phe -[Z]_n -W w którym

X i Y mają wyżej podane znaczenie,

Z oznacza sekwencję rozporki dobraną spośród grup obejmujących alifatyczne diaminy o 1-6 atomach węgla, R6, i ich mieszaniny, przy czym IR oznacza jedną lub więcej jednakowych lub różnych reszt aminokwasowych.

W oznacza podstawnik znakujący lub przyłączający o wzorze [K]_v-M1 w którym K-M1 oznacza podstawnik znakujący lub przyłączający i w którym K oznacza pośrednią grupę funkcyjną DTPA, EDTA lub HYNIC, v jest równe 0 lub 1, zaś

M1 oznacza wykrywalny znacznik.

Korzystny peptyd, ewentualnie znaczony, dobrany jest z grupy obejmującej: iBOC-L-Metionylo (sulfotlenek)-L-Leu-Phe-L-lizynamid, iBOC-L-Norleucylo-L-Leu-L-Phe-L-lizynamid, izopropylomocznik-Met-Leu-Phe-Lys-SHNH-BOC, izopropylomocznik-Met-Leu-Phe-n-propylodiamino-Asp-SHNH HBr, izopropylomocznik-Met-Leu-Phe-Lys-Asp-SHNH HBr, izopropylomocznik-Met-Leu-Phe-Lys-SHNH HBr, izopropylomocznik-Met-Leu-Phe-propanodiamino-SHNH HBr, N-n-butylomocznik-Phe-Leu-Phe-Leu-Phe,

N-izopropylomocznik-Phe-Leu-Phe-Leu-Phe-COOH lub

N-cynamoilo-Phe-Leu-Phe-Leu-Phe.

Peptyd ten zawiera wykrywalny znacznik, który korzystnie jest izotopem radioaktywnym, takim iak ^Tc, ^I, 'U, 11, 9^?Ru, 6⁸Ga, 89Zr,⁷2As, 90Y ^Cu, ^, 2^, 2.^ 2^, 4_Sc, ¹1'In lub '“'Pd. Ewentualnie wykrywalny znacznik jest izotopem paramagnetycznym lub związkiem, który może być obrazowany za pomocą PET.

Wynalazek obejmuje również środek farmaceutyczny do wykrywania miejsca infekcji lub zapalenia u osobnika, zawierający wykrywalnie znaczony chemotaktyczny peptyd, który kumuluje się w zasadzie tylko w miejscu infekcji lub zapalenia.

Według wynalazku środek farmaceutyczny zawiera chemostatyczny wykrywalnie znaczony peptyd o wzorze

X - Y - Leu - Phe - [Z]n - K - M1 w którym:

X oznacza grupę zabezpieczającą grupę aminową,

Y oznacza aminokwas,

Z oznacza sekwencję rozporki dobraną spośród grup obejmujących alifatyczne diaminy o 1 -6 atomach węgla, R6, i ich mieszaniny, przy czym lR oznacza jedną lub więcej jednakowych lub różnych reszt aminokwasowych, n jest równe 0 lub 1, a

177 585

K - M1 oznacza podstawnik znakujący lub przyłączający, w którym K oznacza pośrednią funkcyjna grupę hydraży nonikotynoamidową (HYNIC) a M1 oznacza wykrywalny znacznik.

Korzystny środek zawiera peptyd, w którym X oznacza grupę zabezpieczającą grupę aminową o wzorze R³-C=R⁴, w którym R³ dobrane jest z grupy obejmującej atom wodoru, alkil, alkenyl, alkinyl, alkoksyl, aryloalkoksyl i grupę aminową, a R⁴ oznacza atom tlenu lub siarki,

Y oznacza resztę aminokwasową, korzystnie Met, Phe lub Nle,

Z oznacza sekwencję rozporki wybraną z grupy obejmującej diaminy alifatyczne o 1-6 atomach węgla, R6, i ich mieszaniny, przy czym R® oznacza jedną lub więcej takich samych lub różnych reszt aminokwasowych, n jest równe 0 lub 1,

K oznacza pośrednią funkcyjną grupę hydrazynonikotynoamidową (HYNIC), ewentualnie dodatkowo zawierającą przyłączony do niej pomocniczy ligand L, korzystnie taki jak glukoheptonian, trycyna lub dodatkową jednostkę pepty dowąo wzorze

X-Y-Leu-Phe-[Z]n-[K]v w którym [K]_v oznacza pośrednią grupę funkcyjną, w której K oznacza DTPA, EDTA lub HYNIC.

v jest równe 0 lub 1, a

M' oznacza wykrywalny znacznik oraz ewentualnie zawiera dodatkowo farmaceutycznie dopuszczalny nośnik odpowiedni do podawania pozajelitowego.

Szczególnie korzystny środek według wynalazku jako chemotaktyczny peptyd zawiera iBOC-L-Metionylo (sulfotlenek)-L-Leu-Phe-L-lizynamid, iBOC-L-Norleucylo-L-Leu-L-Phe-L-lizynamid, iz.opropylomocznik-Met-Pcu-Phc-Lys-SHNH-BOC, izopropylomocznik-Met-Leu-Phe-n-propylodiamino-Asp-SHNH HBr, izopropylomocznik-Met-Leu-Phe-Lys-Asp-SHNH HBr, izopropylomocznik-Met-Leu-Phe-Lys-SHNH HBr, izopropylomocznik-Met-Leu-Phe-propanodiamino-SHNH HBr, N-n-butylomocznik-Phe-Leu-Phe-Leu-Phe, N-izopropylomocznik-Phe-Leu-Phe-Leu-Phe-COOH lub

N-cynamoilo-Phe-Leu-Phe-Leu-Phe, przy czym wymieniony peptyd jest ewentualnie znaczony izotopem radioaktywnym lub paramagnetycznym. Jeśli peptyd chemotaktyczny znaczony jest izotopem radioaktywnym, to jest on dobrany spośród ^93,,nTc, ^l23I, ^,25I, ^l31I, ⁹⁷Ru, 6⁸Ga, ^Zr, 7²As, 9°Y, ⁶⁷Cu, ^TI, *⁷Bi,²¹'At, ²ⁱ²Pb, 4^?Sc, In lub ^Pd.

Korzystny środek zawiera peptyd chemotaktyczny, w którym M⁴ jest dobrane z grupy obejmującej: leki, pektyny, toksyny, środki przeciwbakteryjne, lub peptyd chemotaktyczny, w którym M jest dobrane z grupy obejmującej 99^mTc, '1³I, ^l25I, ^l3lI, Ru ^ć8Ga, ^Zr, 7²As, ⁹⁰Y, 6^?Cu, ²⁽”TI, -^l7Bi, ²Α2^2I2P b, ⁴⁷Sc, 'In lub 9°d?d.

W korzystnym peptydzie chemotaktycznym n jest równe 1 a Z oznacza R6, przy czym reszta aminokwasowa lub dwie lub więcej takich samych lub różnych reszt aminokwasowych w R6 niezależnie dobrane są spośród norleucyny, tyrozyny, kwasu asparaginowego, lizyny, leucyny i fenyloalaniny.

Szczególnie korzystny środek farmaceutyczny do stosowania diagnostycznego/terapeutycznego zawierający peptyd chemotaktyczny kumulujący się zasadniczo tylko w miejscach infekcji lub zapalenia zawiera peptyd chemotaktyczny o wzorze

X - Y - Leu - Phe - [Z]n - K - [Μ']μ

177 585 w którym,

X oznacza grupę zabezpieczającą grupę aminową o wzorze R³ - C = R⁴ w której R³ jest wybrany z grupy obejmującej atom wodoru, alkil, alkenyl, alkinyl, alkoksy, aryloalkoksy i grupę aminową, a R⁴ oznacza atom tlenu lub siarki,

Y oznacza resztę aminokwasową,

Z oznacza sekwencję rozporki wybraną z grupy obejmującej diaminy alifatyczne o 1-6 atomach węgla, R6, i ich mieszanin, w którym R6 oznacza jedną lub więcej takich samych lub różnych reszt aminokwasowych, n jest równe 0 lub 1,

K oznacza pośrednią funkcyjną grupę hydrazynonikotynoamidową (HYNIC)

M1 oznacza diagnostyczny lub terapeutyczny izotop radioaktywny a μ jest równe 0 lub 1.

W wymienionym środku farmaceutycznym, w wymienionym wzorze, M1 jest dobrane z grupy obejmującej: leki, pektyny, toksyny, środki przeciwbakteryjne.

Środek farmaceutyczny według wynalazku zwykle zawiera peptyd chemotaktyczny wykrywalnie znaczony oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik do podawania pozajelitowego.

Niniejszy wynalazek pozwala na nieinwazyjne obrazowanie miejsc infekcji lub zapalenia po stwierdzeniu, że wykrywalnie znaczone chemotaktyczne peptydy wstrzykiwane układowo zwierzętom nagromadzają się w miejscach lokalnej infekcji. W szczególności, niniejszy wynalazek jest przydatny do wykrywania miejsca infekcji lub zapalenia u osobnika przez podawanie osobnikowi diagnostycznie skutecznej ilości powyższego wykrywalnie znaczonego peptydu chemotaktycznego. Peptyd chemotaktyczny zasadniczo nagromadza się w miejscu infekcji lub zapalenia i zasadniczo nie nagromadza się w miejscu, które nie jest w stanie infekcji lub zapalenia.

W zakres niniejszego wynalazku wchodzą również środki farmaceutyczne zawierające peptyd chemotaktyczny, chociaż w przypadku niektórych kompozycji, włączenie wykrywalnego ugrupowania nie jest wymagane.

Niniejszy wynalazek ma zastosowanie w wykrywaniu in vivo miejsca lub miejsc infekcji lub zapalenia u osobnika. Sposób wykrywania polega na podawaniu osobnikowi wykrywalnie znaczonego peptydu chemotaktycznego, w którym peptyd zasadniczo nagromadza się w miejscu infekcji lub zapalenia i nie nagromadza się w miejscach nie będących w stanie infekcji lub zapalenia.

Wynalazek także obejmuje różne peptydy chemotaktyczne, z którymi skoniugowano odpowiednie cząsteczki chelatujące i wykrywalne znaczniki.

Krótki opis rysunków

Figura 1 jest wykresem przedstawiającym wyniki próby wiązania czterech peptydów chemotaktycznych, skoniugowanych z DTPA, do ludzkich neutrofilów. Próba jest próbą wiązania kompetytywnego, w której [³H]For-MLF jest przesunięte przez wzrastające stężenia nieznaczonego peptydu.

Figura 2 jest wykresem przedstawiającym wyniki próby czterech peptydów chemotaktycznych, skoniugowanych z DTPA, dla stymulowania wytwarzania ponadtlenku przez ludzki neutrofil. MLF włączono do próby dla porównania.

Figura 3: przedstawia wyniki próby wytwarzania ponadtlenku przez analogi peptydu chemotaktycznego. Ludzkie PMN inkubowano przy użyciu samego HBSS lub wskazanego stężenia peptydu przez 10 minut w temperaturze 37°C, a następnie zmierzono redukcję ferrycytochromu.

% maksymalnego wytwarzania ponadtlenku = E/M x 100 gdzie E oznacza ilość ponadtlenku wytworzonego w obecności wskazanego stężenia peptydu, a M oznacza maksymalną ilość ponadtlenku wytworzonego przez peptyd. ForNleLFK-HYNIC: HP1; For-MLFK-HYNIC: HP2; For-MLFNH(CH₂)₆NH-HYNIC:HP3; ForMLF-(D)K-HYNIC: HP4.

177 585

Figura 4: pokazuje wpływ analogów peptydu chemotaktyczoego na wiązanie ForML[³H]F do ludzkich PMN. Nienaruszone ludzkie PMN (8 x 105) inkubowano przy użyciu bufora inkubacyjnego lub wskazanego stężenia peptydu w obecności 15 nM Fot-ML[³H]F przez 45 minut w temperaturze 24°C, a następnie oznaczono specyficzne wiązanie ForML[³H]F.

% maksymalnego wiązania For-ML[³H]F = E/C x 100 gdzie E jest specyficznym cpm związanym w obecności wkazanego stężenia niezaaczonego peptydu a C jest specyficznym cpm związanym z For-ML[³H]F w obecności samego bufora. For-NIeLFK-HYNIC: HP1; For-MLFK-HYNIC: HP2; For-MLFNH(CH,)₆NHHYNIC: HP3; For-MLF-(D)K-HYNIC: HP4.

Figura 5: przedstawia wpływ stężenia peptydu na wydajność radiochemiczną (%) i aktywność właściwą (mCi/Mol). Dane dotyczą For-MLF-(D)K-HYNIC. Podobne wyniki otrzymano dla wszystkich badanych peptydów.

Figura 6: przedstawia stosunki cel-tło (T/B) dla peptydów znaczonych 99™Tc u szczurów z infekcjami E. coli. Dane obliczono przez podzielenie % ID/gram w infekowanym mięśniu przez odpowiadającą temu wartość w kontralateralnym normalnym mięśniu. We wszystkich przypadkach infekcje spowodowano 24 godzin przed iniekcją. Każdy punkt jest średnią ± błędu standardowego średniej (SEM) dla 5 do 6 zwierząt.

Figura 7: przedstawia reprezentatywny obraz kamery gamma królika z infekcją uda E. coli po iniekcji analogu peptydu phdmotaktyczaego znaczonego 99mTc. Obraz uzyskano w 17 godzin po iniekcji w przybliżeniu 1 mCi HP2 znaczonego 99'ⁿTc. Infekcję spowodowano 24 godzin przed iniekcją.

Figura 8 przedstawia stężenia tkankowe (%ID/gram), oznaczone przez bezpośrednie zliczanie tkanek u królików z infekcją uda E. coli 17 godzin po iniekcji HP2 znaczonego 99™Tc. Dane są przedstawione jako średnia % dawki wstrzykniętej/gram tkanki. Słupki błędu wskazują SEM. Infekcję spowodowano 24 godzin przez iniekcją HP2 znaczonego ^99mTc.

Figura 9: przedstawia stosunki cel-tło (T/B) HP4 znaczonego 9’^mTc u królików z infekcją E. coli 17 godzin po iniekcji. Dane obliczono przez podzielenie % ID/gram w infekowanym mięśniu lub ropieniu przez odpowiadającą temu wartość w kontralateralnym normalnym mięśniu. We wszystkich przypadkach infekcje spowodowano 24 godzin przed iniekcją. W przypadku infekowanego mięśnia, dane obejmują 28 próbek od 6 zwierząt. W przypadku ropienia, dane to 6 próbek od 6 zwierząt.

Figura 10: przedstawia % dawki wstrzykniętej /gram dla czterech preparatów HP3 we krwi, płucach, wątrobie, śledzionie, nerkach i przewodzie pokarmowym w czterech punktach czasowych po iniekcji.

Figura 11: ilustruje schemat protokołu doświadczenia z przykładu 85, poniżej. Próbki krwi zebrano dla pomiarów hematologicznych w okresie - 15 oraz -5 min oraz 0.25, 0.50, 1, 3, 5, 10 oraz 20 minut po iniekcjach.

Figura 12: przedstawia wpływ ForNIeLFNIeYK-DTPA na poziomy obwodowego WBC u małp. Całkowite zliczenie obwodowego WBC wyrażono jako procent poziomu linii podstawowej. Zastosowano cztery dawki peptydu (ng/kg). P: iniekcja peptydu; V: iniekcja zarobki.

Figura 13: przedstawia obrazy kamery gamma małp Rhesus (samice) z zapaleniem uda 3 i 12 godzin po iniekcji (For-Met-Leu-Phd-NH-(CH2)6-NH-HYNIC znaczonego 99^. Wszystkie obrazy znormalizowano do najjaśniejszego piksela.

Figura 14: przedstawia obrazy kamery gamma królika z głęboką infekcją uda E. coli 6 i 18 godzin po koiniekcji Tc-H? i leukocytów znaczonych 'In. Obrazy 9⁹ⁱⁿTc skorygowano na fotony ¹¹ in w oknie tc. Wszystkie obrazy znormalizowano do całkowitej liczby zliczeń we wczesnym kontraście 99ⁿTc-HP. Infekcje spowodowano 24 godzin przed iniekcją.

Figura 15: ilustruje stosunki cel-tło 99^|nTc-HP i CIn-WBC z analizy ROI scyntygrafów 3, 6 i 18 godzin po iniekcji. Każdy punkt jest średnią ± SEM dla 6 zwierząt. We wszystkich przypadkach, zwierzęta infekowano 24 godzin przed iniekcją wskaźników promieniotwórczych.

Figura 16: przedstawia stosunki cel-tło dla^Tc-HP i CIn-WBC oznaczone przez bezpośrednie pomiary radioaktywności na próbkach wyciętych tkanek 18 godzin po iniekcji.

177 585

Małe kółka oznaczają wszystkie wartości (30 próbek z 6 zwierząt) dla ^99mTc-HP, duże kółko oznacza średnią ± SEM. Małe kwadraty oznaczają wszystkie wartości (30 próbek z 6 zwierząt) dla '''Io-WBC, duży kwadrat oznacza średnią ± SEM. We wszystkich przypadkach zwierzęta iofekowano 24 godzin przed iniekcją.

Figura 17: przedstawia stosunki ropienia do normalnego mięśnia dla 99^mTc-Hp i ¹¹ 'IoWBC oznaczone przez bezpośrednie pomiary radioaktywności na próbkach wyciętych tkaoek 18 godzin po iniekcji. Każdy punkt jest średnią ± SEM dla 6 zwierząt. We wszystkich przypadkach zwierzęta infekowano 24 godzin przed iniekcją.

Poniżej przedstawiooo korzystne warunki wynalazku.

Określenia „zapalenie” i „miejsce zapalenia” stosuje się dla oznaczenia stanów i miejsca ich występowania u osobnika wskutek uszkodzenia tkaoki, bez względu na przyczynę lub etiologię. Te uszkodzenia tkaoki mogą być wynikiem inwazji bakteryjnej, procesów autoimmuoologizznych, odrzucenia aloprzeszczepu tkaoki lub orgaou, lub takich zewnętrznych wpływów uszkadzających jak ciepło, zimoo, energia promieniująca, bodźce elektryczne lub chemiczne, lub urazy mechaniczne. Niezależnie od przyczyny i miejsca w organiźmie, następująca reakcja zapalna jest zawsze podobna, obejmuje złożony układ regulacji funkcyjnych i komórkowych, w odniesieniu do zmian mikrocyrkulacśi, ruchu płynów, i napływu oraz aktywacji komórek zapalnych (leukocyty).

Określenie „infekcja” oznacza wtargnięcie bakterii, wirusów, grzybów, pierwotniaków i innych mikroorganizmów.

Określenie „osobnik” jest rozumiane jako obejmujące zwierzęta np. ssaki, zwłaszcza ludzi.

Określenie „agonista” w ninieSczym tekście oznacza peptyd chemotaktyczny, który wiąże się do receptora i stymuluje funkcje receptora.

Określenie „antagonista” w niairSszym tekście oznacza peptyd chrmotaktycyoy, który zapobiega stymulowaniu receptora. Peptyd chemotaktyczny, który jest antagonistą ma powinowactwo do receptora komórki i, przez wiązanie się do niego, zapobiega reakcji komórki.

Określenie „diagnostycznie skuteczna” stosowane w niniejszym tekście w odniesieniu do dawki oznacza, że ilość wykrywalnie znaczonego podawanego peptydu zhrmotaktyzyorgo jest wystarczająca, by umożliwić wykrywanie miejsca infekcji lub zapalenia ponad jakikolwiek sygnał tła.

Zasadniczo, dawkowanie wykrywalnie znaczonego peptydu zhemotαktycznegk dla celów diagnostycznych będzie się zmieniać w zależności od takich aspektów jak wiek, stan, płeć i stopień choroby u pacjenta, przeciwwskazań, jeśli są, oraz innych zmiennych, i będzie określone przez lekarza prowadzącego. Dawkowanie może się zmieniać od około 0,01 mg/kg do około 2000 mg/kg, korzystnie około 0,1 mg/kg do około 1000 mg/kg.

Określenie „peptyd chemotaktyczny zmodyfikowany na końcu” jest rozumiane jako obejmujące, lecz nie ograniczone do, cząsteczki o następującym wzorze ogólnym:

X -Y -Leu -Phe-[Z]n-K-M’ w którym:

X oznacza grupę zabezpieczającą grupę aminową.

Y oznacza resztę aminokwasową,

Z oznacza sekwencję „rozporki”, n jest równe 0 lub 1, a

K - M¹ oznacza podstawnik znakujący lub przyłączający.

W powyższej strukturze ogólnej, X oznacza grupę zabezpieczającą grupę aminową, tzn. grupę, która ochrania grupy aminowe i może być dowolna z wielu znanych grup przydatnych do tego celu. Poniższy schemat ilustruje szereg przydatnych dróg syntezy, dzięki którym grupy zabezpieczające grupę aminową możoa dodać do peptydu chemotaktycznego:

177 585

N-końcowa ddzywatyzacja Met-Leu-Phe

R—NH wH—Met—Leu—Phe

X

R—O'^NH—Met-Leu—Phe (R-O)₂ P—NH-Met-Łeu—Phe

-nA NH—Met-,

Leu—Phe

N-Met-Lau—Phe

R NH—Met—Leu—Phe

R—S—NH-Met-Łau—Phe It

O

H_SN NH-Met-Łeu—Ph®

a. 1.RNCO, Et₃N, DMF; 2. H₃O⁺

b. 1.ROCOCI, EtjN, DMF; 2. H₃O+

c. 1.RCOCI, Et₃N, DMF; 2. H₃O⁺

d. 1. RSO₂CI, EtjN, DMF; 2. H₃O'

e. 1 chlorowodorek 1,1,1-pirazolo-1-karboksamidu, Et₃N, DMF; 2. H₃O+

f. 1. RNCS, Et₃N, DMF; 2. H₃O+

g. 1. (RO)₂POCI, Et₃N, DMF; 2. H₃O+

h. 1. 2,5-dimetoksytetrahydrofuran, Et₃N, DMF; 2. H₃O+

Na ogół, przy rozpatrywaniu grupy zabezpieczającej grupę aminową, tzn. grupy zabezpieczającej koniec N peptydu chemotaktycznego („CP”), najbardziej właściwe może być spojrzenie na ugrupowanie raczej jako na pojedyńczy jednostkę niż na „całościową” grupę oddzieloną od CP przez „rozpórkę”. Jest prawdopodobne, że obydwie z tych części grupy zabezpieczającej oddziałują z receptorem poprzez współoddziaływania stdrycznd, elektrostatyczne i hydrofobowe. Zatem skład grupy zabezpieczającej jako całości będzie ostatecznie określać aktywność CP. Ta koncepcja jest wsparta np. przez obserwację, że CP chroniony karbaminianem n-butylu jest niemal 10 krotnie mniej aktywny niż odpowiedni CP chroniony n-butylomocenikidm. Te dwie grupy zabezpieczające mają identyczne alifatyczne łańcuchy boczne, lecz różne kąty walencyjne, stopnie rotacji oraz charakterystykę elektrostatyczną.

Po zmianie zabezpieczenia N w CP z karbaminianu (uretan) na mocznik, jest prawdopodobne, że całkowity kształt końca N ulegnie zmianie. Mocznik będzie miał różne kąty walencyjne i znacząco mniejszą swobodę rotacji (około wiązania karbonyl-N jest mniejsza rotacja niż około wiązania karbonyl-O). Te efekty mogą mieć pewien wpływ na całkowite dopasowanie do receptora CP.

Zachowanie elektrostatyczne N-końcowego zakończenia CP ulegnie zmianie wraz z włączeniem mocznika. Te różnice elektrostatyczne mogą prowadzić do zmiany współoddziaływania wiązania wodorowego z receptorem.

Całkowita wielkość mocznika nie będzie znacząco różna od wielkości karbaminianu. Znów jednak jest możliwy wyjątek, że ograniczona rotacja mocznika może utrwalić go w specyficznej konformacji, która ma wyraźny wpływ na jego dopasowanie do receptora. To w większym stopniu dotyczy kształtu niż całkowitej wielkości.

177 585

Możliwe, że najbardziej racjonalnym uzasadnieniem dla wyposażenia końca N CP w grupę zabezpieczającą mocznika jest to, że mocznik jest bardziej trwały w szerszym zakresie warunków niż karbaminian. Zatem jego trwałość w warunkach silnie kwasowych pozwala na szerszy zakres transformacji chemicznych na ugrupowaniu linkera na końcu C.

Inne pokrewne grupy zabezpieczające grupę aminową mieszczą się także w ramach wynalazku, takie jak: moczniki zawierające heteroatom, tiomoczniki, sulfonamidy, fosfonamidy, guanidyny i sulfonylomoczniki.

Literatura ujawnia pewną liczbę innych grup zabezpieczających grupę aminową, np. t-butyloksykarbonyl, acetyl, benzyloksykarbonyl, formyl, tioformyl, cyjanoamidinę i metoksykarbonyl. _t

Skuteczne środki chemotaktyczne (agoniści lub antagoniści) mogą także być wytworzone przez zabezpieczenie ich końców aminowych i-butyloksykarbonylem i alkilo(C₃-C6 zarówno rozgałęzionym jak i cyklicznym)-karbamoilem.

Pewną liczbę grup zabezpieczających grupę aminową odpowiednich dla peptydów chemotaktycznych podano poniżej. Procedury syntetyczne dla grup zabezpieczających podano w „Protecting Groups In Organie Synthesis”; John Wiley & Sons: New York, 1981; rozdz. 6.

a. Karbaminiany:

Karbaminian cyklopropylometylu

Karbaminian 1 -metylo-1 -cyklopropylometylu

Karbaminian diizoopropylometylu

Karbaminian 2-metylotioetylu

Karbaminian 1,1-dimetylopropynylu

Karbaminian t-amylu

Karbaminian cyklopentylu

Karbaminian cykloheksylu

Karbaminian 9-fluorenylometylu

Karbaminian 1 -adamantylu

Karbaminian 1,1 -dimetylo-2-trichloroetylu

Karbaminian 2,2,2-trichloroetylu

Karbaminian 1 -metylo-1 -fenyloetylu

Karbaminian 2,4-dichlorobenzylu

b. Karboksamidy i odpowiadające im tiokarboksamidy.

Kaboksamid tiofenu

Karboksamid adamantylu

Karboksamid 4-bromobutyrylu

Karboksamid cinnamylu

Karboksamid nikotinoilu

c. Moczniki, odpowiadające im tiomoczniki i odpowiadające im pochodne cyjanoguanidyny

Benzylomocznik

2,4-Difluorofenylomocznik

-Naftylomocznńk

Fenylomocznik

Difenylomocznik

Propylomocznik

Heteromoczniki

d. Sulfonamidy

Benzenosulfonamid

Dimetoksybenzenosulfonamid

Toluenosulfonamid

Benzylosulfonamid

Trifluorometylosulfonamid

177 585

e. Fosfonamidy

Benzenofosfonamid

DimetoksybenzeaoCosfonnmid

T oluenoCosConnmid

Benzzlofosfonamid

TrifluorometylofosCnnamid

W korzystnym wykonaniu wynalazku, X oznacza grupę o wzorze

R³-C=R⁴ w którym Ri jest wybrane z grupy obejmującej atom wodoru, alkil, alkenyl, alkinyl, alkoksy, aralkoksy i grupę aminową, a R’ oznacza tlenowiec, korzystnie tlen lub siarkę.

Gdy Ri oznacza alkil, korzystny jest alkil o 1-6 atomach węgla, zwłaszcza 3-6 atomach węgla, np. metyl, etyl, propyl, butyl, pentyl, heksyl, lub ich izomery, np. izopropyl, izobutyl, sec-butyl, tert-butyl, neopentyl, 2-etylnbutzl itp. Izobutyl i t-butyl są najbardziej korzystne.

Gdy R3 oznacza alkenyl, korzystny jest alkenyl o 2-6 atomach węgla, zwłaszcza 2-4 atomach węgla, np. etenyl, propeny^ butenyl, pentenyl, heksenyl lub ich izomery, np. izopropenyl, izobutenyl, sec-butenyl, tert-butenyl, neopentenyl, 2-etzlbutenzl itp.

Gdy r3 oznacza alkinyl, korzystny jest alkinyl o 2-6 atomach węgla, zwłaszcza 2-4 atomach węgla, np. etynyl, propy^l, butynyl, pentynyl, heksynyl lub ich izomery, np. izopropznzl, izobutynyl, sec-butynyl, tert-butynyl, neopentynyl, 2-etzlobutzazl i podobne.

Gdy R3 oznacza grupę alkoksy, korzystna jest grupa alkoksy o 1-6 atomach węgla, zwłaszcza, 3-6 atomach węgla, np. metoksy, etoksy, propoksy, butoksy, pentoksy, heksoksy, lub ich izomery.

Gdy R3 oznacza grupę aralkoksy, korzystna jest grupa benzoksy, np. F-CH2-O-, w której grupa fenylowa (F) może być podstawiona lub niepodstawionn.

Gdy R3 oznacza grupę aminową, korzystna jest grupa o strukturze - N(H)R⁵, w której R⁵ jest wybrane z grupy obęimująpee atom wodoru, alkil, cykloalkil i aryl.

Gdy R5 oznacza alkil, korzystny jest alkil o 1-4 atomach węgla, zwłaszcza o 3-4 atomach węgla, np. metyl, etyl, propyl, butyl, lub ich izomery, np. izopropyl, izobutyl, sec-butyl, tert-butyl.

Gdy R5 oznacza pzkloalkil lub aryl, korzystny jest czklopenzl, cykloheksyl, adamantyl, fenyl lub difenzl, zwłaszcza cykloheksyl lub fenyl, które to grupy mogą być podstawione lub aiepodstnwione.

Y w powyżej opisanej ogólnej strukturze oznacza resztę aminokwasową i może być jakąkolwiek taką resztą przydatną do tego celu. W korzystnym wykonaniu wynalazku, Y oznacza grupę o wzorze

O

II —NH-CH-C— I w którym

R1 oznacza benzyl, alkil, lub a R2 oznacza -S-, -SO2, -SO- lub -OGdy R1 oznacza alkil, korzystny jest alkil o 1-6 atomach węgla, np. metyl, etyl, propyl, butyl, pentyl, heksyl, lub ich izomery, np. izopropyl, izobutyl, sec-butyl, tert-butyl, neopentyl, 2-etylobutyl itp. Zwłaszcza, R1 gdy oznacza alkil, oznacza alkil o 3-4 atomach węgla.

W innym korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku, Y oznacza kwas 4nmmotetrnhydropirnno-4-knrbnkszlowy (Thp). Z Thp otrzymano analog, który był chemoatraktantem względem ludzkich neutrofilów, lecz nie stymulował wytwarzania ponadtlenku. Wytworzonym i zbadanym peptydem był fnrmzlo-Thp-Leu-Phe-OMe.

177 585

W powyższej strukturze ogólnej, Z oznacza sekwencję „rozporki” o jakiejkolwiek przydatnej długości. Może ona być lub nie być obecna w zależności od tego czy n wynosi 0 lub 1. Gdy n wynosi 1, Z jest obecne i korzystnie jest diaminą alifatyczną lub [R6]_m, gdzie R6 oznacza resztę aminokwasową, a m oznacza liczbę całkowitą większą lub równą 1, korzystnie liczbę całkowitą od 1 do 3. Z może także być połączeniem diaminy alifatycznej i [R⁶]_m.

Gdy Z oznacza diaminę alifatyczną, korzystnie jest to diamina alifatyczna o 1-6 atomach węgla, np. metylenodiamina, etylenodiamina, propylenodiamina, tetrametylenodiamina, pentametylenodiamina i heksametylenodiamina. Zwłaszcza, gdy Z oznacza diaminę alifatyczną, będzie ona mieć 4-6 atomów węgla, np. tetrametylenodiamina (także znana jako kadaweryna), pentametylenodiamina (także znana jako putrescyna, poniżej: Pu) oraz heksametylenodiamina.

Gdy Z oznacza [R⁶]_m, występować będzie jedna lub więcej reszt aminokwasowych, w zależności od wartości m. Gdy są obecne dwie lub więcej reszt, mogą być one takie same lub różne. Aminokwas (aminokwasy) zawarty w sekwencji „rozporki” może (mogą) być dowolnym aminokwasem znanym specjalistom z tej dziedziny techniki, zarówno aminokwasem podstawowym jak i aminokwasem niepodstawnym. Np., R6 może, samo lub w połączeniu, być argininą kwasem glutaminowym, lizymą kwasem asparaginowym, waliną, cysteriną, leucyną izoleucyrną norleucyną, metioniną, hist/sy^b^yną prolitną. tryptofanem, tyrozyna, asparaginą glutaminą, sery tną treoniną, alanina. glicyną lub fenyloalaniną. Korzystnymi resztami aminokwasowymi dla stosowania jako sekwencja „rozporki” w praktyce niniejszego wynalazku są same lub w połączeniu, norleucyną, tyrozyna, kwas asparaginowy, lizyna, leucyna i fenyloalanina.

Jak podano powyżej, K-M⁴ oznacza podstawnik znakujący lub przyłączający. Reprezentuje on ugrupowanie, dzięki któremu peptyd chemotaktyczny zastosowany w praktyce niniejszego wynalazku może być wykrywalnie znaczony. Określenie „wykrywalnie znaczony” oznacza, że peptyd chemotaktyczny przyłączył diagnostycznie wykrywalny znacznik.

Istnieje wiele różnych znaczników i metod znakowania znanych specjalistom z dziedziny techniki. Przykłady typów znaczników, które mogą być użyte w niniejszym wynalazku, obejmują izotopy radioaktywne, izotopy paramagnetyczne i związki, które mogą dawać obraz za pomocą pozytronowej tomografii emisyjnej (PET). Specjaliści z tej dziedziny techniki znają inne odpowiednie znaczniki dla wiązania do peptydów chemotaktycznych stosowanych w wynalazku, lub będą mogli upewnić się co do tego za pomocą rutynowych doświadczeń. Ponadto, wiązanie tych znaczników do peptydu chemotaktycznego można wykonać przy użyciu standardowej techniki powszechnie znanej specjalistom z dziedziny techniki.

W celu diagnostycznego uzyskiwania obrazów in vivo, głównym czynnikiem w wyborze danego radionuklidu jest rodzaj dostępnego przyrządu do wykrywania. Wybrany radionuklid musi charakteryzować się rodzajem rozpraszania, który jest wykrywalny przez dany rodzaj przyrządu. Na ogół, można stosować każdą tradycyjną metodę wizualizacji obrazu diagnostycznego. Innym ważnym czynnikiem w wyborze radionuklidu w celu diagnozowania in vivo jest to, by okres półtrwania był dostatecznie długi, by znacznik był wciąż wykrywalny w czasie maksymalnego wychwytu przez tkankę docelową lecz dostatecznie krótki, by zminimalizować szkodliwe napromieniowanie gospodarza. W jednym korzystnym wykonaniu, radionuklid zastosowany dla uzyskiwania obrazu in vivo nie emituje cząstek, lecz wytwarza dużą liczbę fotonów w zakresie 140-200 keV, które mogą być łatwo wykryte za pomocą tradycyjnych kamer gamma.

Dla celów diagnozy in vivo, radionuklidy mogą być związane z peptydem chemotaktycznym bezpośrednio lub pośrednio za pomocą pośredniej grupy funkcyjnej. Pośrednimi grupami funkcyjnymi, które są często stosowane do wiązania radioizotopów jonów metali do peptydów chemotaktycznych są środki chelatujące, kwas dietylenotriaminopentaoctowy (DTPA) (Hnatowich, D. J., Int. J. Appl. Radiat. Izot., 33:327-332, (1982)) i kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA). Inne typowe grupy chelatujące dla wiązania Tc do peptydów obejmują ligandy dioksymowe (1), funkcjonalizowane cyklamy (2), ligandy N₂S₂ (3) i ligandy N₃S (4). '

177 585

Alternatywnie, reaktywny tiol może być dołączony do reszty lizynowej przez iminotiolan (5) lub reszty tiolowe mogą być skoniugowane z peptydem przy użyciu sekwencji aminokwasowej zawierającej jedną lub więcej reszt cys.

U (2)

X (3) (4) (5)

Przykładami jonów metali, które mogą być związane z peptydarni chemotaktycznymi są 99mTc, 'I; I, 9’Ru, 6^?Cu, 6^?Ga, '“I, 6⁸Ga, ^As, 89Zr oraz “Ίί. Korzystne są⁹9ⁿ’Tc i 1¹¹^.

Peptydy chemotaktyczne znaczone mIn są skutecznymi środkami dla zewnętrznego obrazowania ogniskowych miejsc infekcji u szczurów (Fischman, A. J., J. Nuci. Med. 32:483491 (1991)). Jednak, krótki biologiczny okres półtrwania peptydów zmniejsza przydatność In (t,: 67,9 godz.) dla obrazowania. Dzięki jego krótkiemu fizycznemu okresowi półtrwania, wysokiej aktywności właściwej, doskonałym właściwościom obrazowania, niskiemu kosztowi i powszechnej dostępności, ⁹⁹ⁱⁿTc jest idealnym radionuklidem do znakowania peptydów chemotaktycznych. Chociaż do znakowania 9^9mTc zastosowano liczne techniki, szczególnie obiecująca okazała się grupa hydrazynonikotynamidu (HYNIC). Aktywny ester sukcynimidylowy kwasu hydrazynonikotynowego (SHNH) pomyślnie zastosowano do derywatyzacji grup amino epsilon reszt lizyny w proteinach. Inkubowanie tych koniugatów przy użyciu prostych kompleksów zawierających rdzeń Tc(V) okso takich jak 99ⁿ’Tc-glukoheptonian daje w wyniku ilościowe znakowanie (Abrams, M. J. i wsp., J. Nucl. Med. 31:2022-2028 (1990)).

Znakowanie macrocząsteczek przy użyciu 9^9mTc może być zaklasyfikowane do trzech głównych metod: znakowanie bezpośrednie, chelaty dwufunkcyjne oraz chelaty wstępnie utworzone. Obecnie korzystnym sposobem znakowania przy użyciu linkera HYNIC (SHNH) jest użycie pomocniczego ligandu, np., redukcja jonu pertechnetanu w obecności prekursora chelatującego tworząc labilny kompleks prekursora ^TCn ntyywany w ninisjsyym k^ł^.śeie „ligandem pomocniczym”, który z kolei reaguje z grupą wiążącą metal dwufunkcyjnie zmodyfikowanego CP tworząc koniugat ⁹9'ⁿTc-CP. Jak podano wyżej ligand pomocniczy 9n>T_cglukoheptonian może być użyty do radioznakowania protein, które zmodyfikowano grupami SHNH (Schwartz, D.A. i wsp., Bioconiugate chem. 2:333:336 (1991)). Jednak, wymaga to sześćdziesięciu minut inkubowania i aktywności właściwych większych niż 25 mCi/mg, by uzyskać wydajności radioznakowania większe niż 90%. Trycynę kwasu polyhydroksyamino można użyć jako bardziej skuteczny i łatwiejszy prekursor znakowania dla znakowania ^Tc polipeptydów i protein zmodyfikowanych SHNH.

Trycynę, tris(hydroksymetylo)metyloglicyna, i jej analogi, można sformułować w roztworach wodnych, pH 6-8, ze środkiem redukującym - chlorkiem cynawym do spontanicznego tworzenia prekursorów ®^9,mr_c. Analiza tworzenia pomocniczych liganów „Tc-trycyna”

177 585 została przeprowadzona na paskach ITLC-SG, podobnie do analizy 99^|nTc-glukohrptooianu, przy użyciu roztworu soli dla ozoaczenia ilościowego koloidu TcSn na początku oraz metyloetylokrtknu dla oznaczenia ilościowego pertechoetanu oa czele rozpuszczalnika. Roztwory „Tc-trycyna” (36 mg/ml prekursora, 50 mg/ml chlorku cynawego, pH 6.0), w podobnych warunkach jak dla 9⁹”Tc- glukoheptooianu, radiozaokowaoe SHNH zmodyfikowały IgG do więcej oiż 90% w ciągu kilku minut w temperaturze pokojowej. Pooadto, roztwory „Tc-trycyna” mogą osiągnąć >90% radiozoakowania IgG-SHNH przy aktywoościach właściwych większych oiż 150 mCi/mg proteiny w porównaniu do Tz-glukohrptonianu. Użyteczność ilościowego radiozoakowania przy wysokich aktywoościach właściwych jest ważniejsza przy znakowaniu małych cząsteczek zmodyfikowanych SHNH, np. CP.

Peptydy zmodyfikowane HYNIC możoa znakować za pomocą następującej ogólnej procedury: 99'ⁿTcO4 (30 mCi/ml) wymyte z generatora dodaje się w równej objętości podczas mieszania do świeżo przyrządzonego roztworu Sn/trycyna (72 mg/ml trycyoy, pH 7.0-7.2, 100 mg/ml SoCI2.2H₂O). Wytwarzanie 9’^mTc-trycyny jest oznaczane za pomocą pasków ITLC-SG 1x8 cm przy użyciu eluentów - roztworu soli lub metylortylokrtonu w celu oznaczenia koloidu lub pertezh0rtaau, odpowiednio. 9^9mTc-trycyna jest dodawana bez czekania oa roztwór peptydu. Roztwór 1 mg/ml peptydu, np. hydrazoo ibocMLF-HYNIC, może być przyrządzony przez rozpuszczenie 1 mg peptydu w 600 mL etanolu i dodanie 400 mL słabo zakwaszonej wody. Po odstawieniu na trzydzieści minut dla odbezpieczenia hydrazonu, peptyd rozcieńczono 1:10 buforem octanowym pH 5.2. Koniugat 99^mT-peptyd wytworzono przez zmieszanie 100 ml 9^9mTz-trycyoy z 15 mL roztworu peptydu. Po iokubowaniu przez 1 godzinę, % wydajność mTc-peptydu oznacza się przez paski ITLC-SG 1x8 cm przy użyciu 25% wag/wag roztworu NaCl jako eluenta, gdzie ⁹9'”Tc-peptyd pozostaje jak na początku, a wszystkie iooe indywidua wymywają się z pierwszym rozpuszczalnikiem.

Przykłady odpowiednich peptydów chemotaktycz.aych obejmują, bez żadnych ograniczeń:

N-For-NIe-Lru-Phr-Nlr-Tyr-Lys-DTPA

N-For-Mrt-Lru-Phr-Pu-DTPA

N-Fkr-NIe-Leu-Phr-Lys-DTPA

N-For-NIe-Lru-Phe-Lys(NH2)-DTPA

N-For-Met-Leu-Phr-Lys-DTPA

N-For-Met-Leu-Phe-D-Lys (NH2)- DTPA

N-Ac-NIe-Leu-Phr-Lys(NH2)- DTPA

Ester N-karbobrnykksy-Met-Leu-Phe-Metylowy

IBOC-L-Metiooylo(sulnokcydo)-L-Leu-L-Phe-L-lizynαmid

IBOC-L-Norleuzylo-L-Leu-L-Phr-L-lizynamid

N-For-L-Mrtionylo(sulfoksydo)-L-Leu-L-Phe-DTPA-L-Lys

N-For-L-Metiooylk(sulnono)-L-Lru-L-Phe-N-DTPA-L-Lys

N-izobutylomozzoiko-Met-Leu-Phr-kαrboksylao

Iyobutyloksykarbooylo-Mrt-Leu-Phe-N-DTPA-Lys

N-For^Dj-Met-Leu-Phe-Lys Amid, solwatowany t-BOC-NIe-Leu-Phe-Lys, solwatowany N-For-Metionylo-Sulnotlenek-Leu-Phr-Lys Amid, solwatowany N-For-Metionylo-Sulnkno-Leu-Phr-Lys Amid, solwatowany N-Karbamylo-Met-Leu-Phe-Lys Amid, solwatowany N-Tn metyloacetylo-Met-Leu-Phe-I.ys Amid, solwatowany Izobutyloksykarbonylo-Met-Leu-Phe-Lys Amid, solwatowany N-For-NIr-Leu-Phe-NIr-Tyr-N’ -DTPA-Lys Iyopropylomozznik-Met-Leu-Phe-Lys-SHNH-BOC Iyopropylomocznik-Met-Leu-Phe-n-propylodiαmino-Asp-SHNH HBr Iyopropylomocznik-Met-Lru-Phe-Lys-Asp-SHNH HBr Iyopropylomocynik-Met-Leu-Phe-Lys-SHNH HBr N-F enyfomozzoik-Met-Leu-Phr

Izopropylomocznik-Met-Lru-Phe-Prkpankdiamino-SHNH

N-n-Butylo-tiomozzniko-Met-Leu-Phr

177 585

N-n-butylomoczniko-Phe-Leu-Phe-Leu-Phe a-izopropylcιmocnniko-Phe-L.eu-Phe-I,eu-Phe-C'OOH iBOC-Met-Leu-Phe-COOH

Ester iBOC-Met-Leu-Phe(amido(propylamido)kαrboksy[(propylo)kαrboksy)]-(fmidopropanolo-SPNH)

N-izobutylomocnniko-Met-Leu-Phe-kαrboksylfn

N-n-Propylo-moczniko-Met-Leu-Phe

N-t-Butylo-moczniko-Met-Leu-Phe

N-n-Butylo-moczniko-Met-Leu-Phe iBOC-Met-Leu-Phe-(amidoetoksyetylo[3-amido]-6-propenalohydrazono)-pirydyna

N-iBOC-Met-Leu-Phe-SPNH-tioester

N-izopropylomoczniko-Met-Leu-Phe a-iBOC-Met-ί.eu-Phe-Prυpylenodiamino-SPaH

Cykloheksylomocnniko-Met-Leu-Phe-COOH

Ester a-n-Butylokarbaminiano-Met-P.eu-Phe-Metylowy

Ester N-IBOC-Met-Leu-Phe-Metylowy

Ester a-Metylo-karbaminiano-Met-Leu-Phe-Metylowy

N-Adamantylomocznik-Met-Leu-Phe

N-Cynamoilo-Met-Leu-Phe

P-Tolylomocnniko-Met-Leu-Phe M-Tolylomoczniko-Met-Leu-Phe

N-Cynamoilo-Phe-Leu-Phe-Leu-Phe

Ponadto środek według wynalazku może być użyty do identyfikacji i scharakteryzowania miejsc lokalnej infekcji i zapalenia u osobnika. Zatem, przez pomiar zwiększenia lub zmniejszenia wielkości lub liczby miejsc zapalenia, jest możliwe określenie czy konkretny tryb terapii ukierunkowany na poprawienie infekcji lub innej przyczyny procesu zapalnego, lub ukierunkowany na sam proces zapalny, jest skuteczny.

W innym wykonaniu, środek według wynalazku jest stosowany dla diagnozowania specyficznej przyczyny zapalenia w danym miejscu. W tym sposobie osobnikowi, co do którego się podejrzewa, że występuje u niego miejsce zapalne, jest najpierw podawana diagnostycznie skuteczna ilość peptydu chemotaktycznego, jak opisano uprzednio, a następnie fotograficznie jest uzyskiwany obraz, by określić obecność i ulokowanie miejsca.

Peptydy chemotaktyczne stosowane w praktyce niniejszego wynalazku mogą być agonistami lub antagonistami. W pewnych przypadkach, dany peptyd może być obydwoma z nich, w zależności od stężenia, w którym jest stosowany.

Peptydy iBoc-MLFK oraz iBoc-MLFK-DTPA antagonizują stymulowane przez ForMLF uwalnianie wolnych rodników z neutrofilu, jak również adhezję aktywowanych neutrofilów do naczyniowych komórek śródbłonkowych in vitro. Aktywność antagonisty jest zachowana przy modyfikacji końca C ¹¹'In linkerem DTPA. Te peptydy nie wykazują jakiejkolwiek aktywności agonisty.

Badanie obrazowania in vivo przeprowadzono porównując peptyd-agonistę formylonorleuzylo-leucylo-fćnyloalanyΊo-norleucylo-tyrozylo-lizyno-DT'PA (For-NIeLFNIeYKDTPA) i peptyd - antagonistę iBoc-MLFK-DTPA. Peptydy znaczone 'Un lokalizowały się szybko w miejscu infekcji. Lokalizację potwierdzono za pomocą obrazu z kamery gamma i przez biodystrybucję tkanki. Główna różnica między tymi dwoma peptydami polegała na tym, że peptyd - agonista był ulokowany w obszarach ciał takich jak płuca, śledziona i szpik kostny, wskazując aktywację i przyścienne układanie się komórki, podczas gdy peptyd - antagonista nie był. Peptyd - agonista indukował przejściowy spadek liczby białych ciałek krwi (neutropenia), podczas gdy peptyd - antagonista nie dawał znaczącego efektu. Te wyniki są takie, jakich spodziewano się dla agonisty względem antagonisty. Peptyd - agonista wykazuje poprawiający się stosunek celu do tła przez 5 godzin, podczas gdy peptyd - antagonista był maksymalnie skuteczny po 1 godzinie. To sugeruje, że wyższe powinowactwo wiązania, jak w przypadku peptydu - agonisty, może dawać w wyniku poprawione stosunki celu do tła, jak również korzystne cechy terapeutyczne. Te wyniki są także interesujące, ponieważ dotychczas

177 585 nie wiedziano, czy antagonista będzie wykazywał zdolność do tworzenia obrazu, czy też nie. Taka zdolność nie była oczywista dla specjalistów z tej dziedziny techniki, ponieważ istniała możliwość, że dla wiązania i tworzenia obrazu może być wymagana aktywacja przez agonistę. Odkryto, że tak nie było.

Peptyd - antagonista t-Boc-Phe-Leu-Phe-Leu-Phe inhibicje uwalnianie enzymu lizosomalnego za pośrednictwem neutrofilu. Ponadto, inne metanowe N-końcowe grupy zabezpieczające nie przemieniają peptydów w antagonistów, lecz raczej w agonistów (metoksykarbonyl, karbobenzoksy). N-końcowa grupa zabezpieczająca iBoc także jest odpowiednia dla peptydu - antagonisty, a peptyd iBoc zmodyfikowany DTPA na końcu C lizyny utrzymuje odpowiednią aktywność biologiczną.

Niniejszy wynalazek stanowi postęp w tej dziedzinie techniki wykazując, ze związane z chorobą neutrofilowe funkcje adhezji do śródbłonka i uwalnianie wolnych rodników są inhibitowaoe przez antagonistę iBoc-MLFK. Ten peptyd także lokalizuje miejsce choroby in vivo. Ponadto, dokonuje tego bez zmiany liczby białych ciałek krwi. Te wyniki są spójne z zastosowaniem deptydu-aotagonisty blokującego kaskadę adhezji oraz potencjalnie innych antagonistów, jako terapeutycznych środków diagnostycznych w chorobach infekcji/zapalenia.

Modyfikacje łańcucha głównego peptydu

W zakres wynalazku wchodzi również podstawienie innych związków pod jedno z ugrupowań Leu lub Phe o wyżej podanej strukturze ogólnej.

a. Leucyna

Zastąpienie reszty leucynowej ^propy^l^ną (Dpg), dało analog, który był chemoatraktantem względem ludzkiego neutrofilu. Wytworzonym i zbadanym peptydem był Formylo-Met-Ddg-Phd-OH.

Zastąpienie reszty leucynowej kwasem 1-aminocykloheksanokarboksylowym (Acc¹') dało analog, który był silnym czynnikiem indukującym uwalnianie lizozymu w neutrofilach królika. Wytworzonym i zbadanym peptydem był formyloMet-Acp6-Phe-OH.

b. Fenyloalanina

Zastąpienie reszty fenylalaninowej z-ddhydrofenylo-alaniną(r-Phd), dało analog, który stymulował wytwarzanie ponadtlenku przez neutrofil królika. Wytworzonym i zbadanym związkiem był formylo-Met-Leu-z-Phe-OMe.

Odsyłacze literaturowe dotyczące zastępowania aminokwasów przy modyfikacji łańcucha głównego podano poniżej:

a) kwas 4-aminotdtrahydrotiopiraoo-4-karboksylowy (zastąpienie metioniny) - ujawnił Torrini i wsp., Indian Joumal of Peptide Protein Research 38:495:504 (1991);

b) diprodyloglipyną oraz kwas 1-aminocyklohdksano-karboksylowy (zastąpienie leucyny) - ujawnił Dentino i wsp., The Journal of Biological Chemistry 28:18460-18468 (1991);

c) z-ddhydrofdnyloalaninę (zastąpienie fenylolaniny) wytworzono przy użyciu sposobu opisanego przez Chaubana i wsp., Tetrahedron 44:2359-2366 (1988);

d) kwas 2-aminoindaoono-2-karboksylowy (zastąpienie fenyloalaniny) - ujawnił Gavuzrk i wsp., Indian Journal of Peptide Protein Research 37:268-276 (1991);

oraz

e) anilinoglicynę wytworzono (zastąpienie fenyloalaniny) jak opisał Kraus i wsp., European J^rnal of Medicinal Chemistry 27:19-26 (1192).

W innym wykonaniu wynalazku, peptydy chemotaktyczne mogą być „terapeutycznie skoniugowand” i zastosowane dostarczając środek terapeutyczny do miejsca infekcji lub zapalenia. Określenie „terapeutycznie skoniugowany” oznacza, że peptyd phemotaktypzny jest skoniugowany ze środkiem terapeutycznym. Środki terapeutyczne stosowane w ten sposób są kierowane do przyczyny leżącej u podłoża zapalenia, np., organizmów infekcyjnych lub nowotworu, lub do samych składników procesu zapalnego. Przykładami środków stosowanych do leczenia zapalenia są steroidowe i niesteroidowe leki przeciwzapalne. Wiele spośród niesteroidowych leków przeciwzapalnych inbibitujd syntezę drostaglandyny.

Innymi środkami terapeutycznymi, które można sprzęgnąć z peptydami chemotaktycznymi według wynalazku są leki, radioizotopy, lektyny, toksyny oraz środki drzeciwbakteryj177 585 ne. Podawana dawka terapeutyczna oznacza ilość, która jest terapeutycznie skuteczna i która będzie łatwa do określenia przez specjalistów z tej dziedziny techniki. Dawkowanie także zależy od wieku, stanu zdrowia i wagi biorcy, rodzaju leczenia współistniejącego, jeśli ma miejsce, częstotliwości leczenia oraz charakteru żądanego efektu, takiego jak np. efekt przeciwzapalny lub przdciwbakteryjny.

Lektyny są proteinami, często pochodzącymi od roślin, które wiążą się do węglowodanów. Wiele lektyn jest także zdolne do aglutynacji komórek i kilka stymuluje limfocyty. Rycyna jest toksyczną lektyną, którą stosowano terapeutycznie przez wiązanie łańcucha alfa, który jest odpowiedzialny za toksyczność, do cząsteczki przeciwciała, by umożliwić dostarczanie specyficzne dla miejsca efektu toksycznego. W wykonaniu niniejszego wynalazku, łańcuch alfa rycyny jest skoniugowany z peptydem chemotaktycznym.

Toksyny są trującymi substancjami wytworzonymi przez rośliny, zwierzęta i mikroorganizmy, które w wystai-cz.ajacej dawce, mogą być śmiertelne. Toksyna błonicy, proteina wytwarzana przez Cozyndbactezium difreriad, składa się z oddzielalnych podjednostek alfa i beta. Składnik toksyczny może być związany z peptydem chemotaktycznym i zastosowany do specyficznego dla miejsca dostarczania do miejsca infekcji lub reakcji zapalnej.

Przykładami radioizotopów, które mogą być związane z peptydem chemotaktycznym dla celów terapeutycznych, stosowanymi według wynalazku, są ^|25I, ^n,1,^TOY, 6’Cu, 21^?Bi,² At, 21²Pb, 'Sc, ¹⁸⁶Re, ^l88Re, '“Rh, ^lsSm oraz ^,tl9Pd.

Środki przdciwbaktdryjnd przydatne w praktyce niniejszego wynalazku są substancjami, które inhibitują mikroorganizmy infekcyjne, takie jak bakterie, wirusy, grzyby i pasożyty (Goodman, A. G. i wsp., 1985, powyżej) i mogą być dowolnymi środkami znanymi specjalistom z tej dziedziny techniki.

Środki farmaceutyczne składające się z peptydów chemotaktycznych do obrazowania lub z terapeutycznie-skoniugowanych peptydów chemotaktycznych, do podawania pozajelitowego, mogą zawierać sterylne wodne lub niewodne roztwory, zawiesiny i emulsje. Przykładami niewodnych rozpuszczalników są glikol propylenowy, glikol polietylenowy, olej roślinny, taki jak olej z oliwek oraz estry organiczne nadające się do iniekcji, takie jak oleinian etylu. Wodne nośniki obejmują: wodę, roztwory alkoholowo/wodne, emulsje lub zawiesiny, włączając w to roztwór soli i środki buforujące, zarobki pazentera1ne włączając w to roztwór chlorku sodu, dekstrozę Ringera, destrozę i chlorek sodu, mleczany Ringera, lub oleje zestalone. Dożylne zarobki obejmują płyny i uzupełnienia pożywienia, uzupełnienia elektrolitu, takie jak oparte na dekstrozie Ringera itp.. Środki konserwujące i inne dodatki mogą być także obecne, takie jak, mp., środki przeciwbaktdryjmd, przdciwur1eniacze, środki chelatujące i gazy obojętne. Zasadniczo takie jak opisane w Remington^ Pharmacdutica1 Science, wyd. 16, Mac Eds. 1980.

Środki farmaceutyczne składające się z peptydów chemotaktycznych do obrazowania lub terapeutycznie-skomiugowanych peptydów chemotaktycznych według wynalazku mogą być podawane dowolnym sposobem, zapewniającym osiągnięcie zamierzonego celu. Np., podawanie może być pozajelitowe, włączając w to drogi podskórne, dożylne, domięśniowe, dootrzewnowe, transdermalne lub dopoliczkowe. Alternatywnie lub współbieżnie, można stosować podawanie doustne. Korzystną drogą podawania wykrywalnie znaczonych peptydów chemotaktycznych dla obrazowania jest droga dożylna. Peptyd chemotaktyczny może być podawany w pojedynczej dawce lub przez stopniową perfuzję, która jest korzystnie dożylna, przy użyciu środków perystaltyczmych, dla wykonania stopniowej perfuzji.

Środek farmaceutyczny według wynalazku może być wykorzystany do wykrywania infekcji lub zapalenia w szerokim zakresie miejsc ciała włączając w to, lecz bez ograniczania mięśnie, ściany naczyń, brzuch, miednicę, kości, stawy lub płuca.

Środek farmaceutyczny według wynalazku może być wykorzystany do diagnozowania infekcji dowolnym z szeregu mikroorganizmów, lub zapalenia wywołanego przez infekcję dowolnym z szeregu mikroorganizmów, lub przez uraz, proces autoimmunologiczny lub nowotwory.

Wynalazek jest także przydatny jako środek do oceny skuteczności i reakcji na leczenie terapeutyczne infekcji lub zapalenia.

177 585

Dla pełniejszego zrozumienia wynalazku podano poniższe przykłady wykonania, które podano w niniejszym tekście jedynie dla celów ilustracji i nie są one zamierzone jako ograniczające, o ile nie zaznaczono inaczej.

Przykład 1.

Obrazowanie miejsc ogniskowych doświadczalnej infekcji bakteryjnej

Peptyd chemotaktyczny N-formylo-NIe-Leu-Phe-NIe-Tyr-Lys /.syntetyzowano przy użyciu standardowych sposobów w fazie stałej, dobrze znanych w stanie techniki (Merrifield, R.B., J. Am. Chem. Soc. 15:2149-2154 (1963); Stewart, J. M., Young, J. D., Solid Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman & Company, San Francisco, CA (1969)). Grupę aminową epsilon C-końcowej lizyny zmodyfikowano DTPA przy użyciu cyklicznego bezwodnika. EC₅₍₎ powstałego peptydu i pochodnej DTPA były prawie identyczne, w przybliżeniu 10- M, wskazując, że derywatyzacja przy użyciu DTPA nie wpłynęła na aktywność biologiczną peptydu. (Podobne wyniki otrzymano w przypadku wszystkich badanych peptydów). Wynik ten był bardzo zaskakujący, ponieważ można by się spodziewać, że wprowadzając silnie ujemnie naładowaną grupę DTPA znacząco zmieniono by właściwości takich małych peptydów·'. Peptyd był łatwo radioznaczony przy użyciu ^H1In.

Sześć szczurów Sprague-Dawley doświadczalnie infekowano przez iniekcję 10⁸ zdolnych do życia E. coli w ich lewe uda. W przybliżeniu 100 mCi znaczonego peptydu (5-10 mg) wstrzyknięto w 24 godzin po infekcji. Seryjne obrazy kamery gamma uwidoczniły lokalizację radioaktywności w miejscu infekcji przy piku nagromadzenia występującym po 1 godzinie (stosunek cel-tło wynosił około 4.0). W czasie do 2 godzin, poziom aktywności obniżył się co do intensywności i po 24 godzinach zmiana chorobowa była ledwie odróżnialna.

Te wyniki stwierdziły przydatność nowego środka do obrazowania ogniskowych miejsc zapalnych w modelu zwierzęcym infekcji.

Przykład 2

Bidystrybucja wiązania leukocytów i bioaktywność peptydów chemotaktycznych

Wiązanie leukocytowe: Cztery peptydy chemotaktyczne skoniugowane z DTPA poddano próbie na wiązanie do ludzkich neutrofilów za pomocą próby wiązania kompetytywnego, w której [³H]For-MLF został przemieszczony przez wzrastające stężenia nieznaczonego peptydu (Babior, B. M. i wsp., J. Clin. Invest. 52:741(1973)). Wyniki przedstawiono na fig. 1. Trzy peptydy niederywatyzowane DTPA włączono do próby dla porównania.

Wytwarzanie SOD: Cztery peptydy chemotaktyczne skoniugowane z DTPA poddano próbie na stymulowanie wytwarzania ponadtlenku przez ludzki neutrofil (Pike, M. C. i wsp., Methods in Enzymol. 162:236 (1988)). Wyniki te przedstawiono na fig. 2. MLF włączono do próby dla celów porównawczych.

Neutropenia in vivo: Dwa peptydy chemotaktyczne skoniugowane z DTPA podano szczurom w dawce w przybliżeniu 10-krotnie wyższej niż przy standardowej dawce do uzyskiwania obrazu. Krew obwodową zebrano (poprzez żyłę ogonową) na 5 minut przez iniekcją oraz 1, 2, 5, 10, 15 i 30 minut po iniekcji. W przypadku wszystkich badanych zwierząt, nie było znaczącego indukowania neutropenii.

Przykłady 3-5

Następujące przykłady 3-5 pokazują, że peptyd izobutyloksykarbonylometionyloleucylo-fenylalanylo-N-dietylenotriaminopentacetylo-li/yna (iBoc-MLFK-DTPA) jest antagonistą aktywacji neutrofilu przez ForMLF, który lokalizuje się do miejsc ogniskowych infekcji in vivo. Lokalizacja występuje bez zmiany liczby białych ciałek krwi.

Przykład 3

Izolowane ludzkie neutrofile (2,5 x 10⁵) inkubowano wstępnie przez 10 minut przy użyciu 1 mM iBoc-MLFK-DTPA przed stymulowaniem przy użyciu 10 nM ForMLF w obecności 2,8 mM luminolu jako środka wzmacniającego chemiluminescencję zależną od wolnych rodników. W tych warunkach próby reakcję całkowicie inhibitowano. Następujące po tym badanie wykazało, że inhibitowanie jest zależne od dawki z IC5₀ 0,2 mM.

Przykład 4

Antagonistę peptydu iBoc-MLFK-DTPA porównano z agonistą peptydu formylonorleucylo-leucylo-fenyloalanylo-norleucylo-tyro/ylo-lizyno-DTPA (ForNIeLFNIeYK177 585

DTPA) w modelu królika infekcji ogniskowej. Infekcję ogniskową indukowano w tylnej łapie każdego królika (2-3 kg) przy użyciu E. coli. Postępowano tak jak w przykładzie 100 B. Po 24 godzinach, jedna grupa królików (n=3) otrzymała peptyd - antagonistę iBoc-MLFKDTPA, podczas gdy druga grupa (n=3) otrzymała peptyd - agonistę ForNIeLFNIeYK-DTPA. Peptydy radioznaczono przy użyciu In do aktywności właściwej w przybliżeniu 400 mCi/mg peptydu. Każdemu królikowi, który został znieczulony przy użyciu ketaminyksylazyny i 100 mCi lub 0,25 mg peptydu wstrzyknięto przez brzeżną żyłę uszną. Zmierzono następujące parametry po 5, 15, 30 i 60 minutach: liczbę białych ciałek krwi, obrazy całego ciała i, po 60 minutach, zwierzęta uśmiercono dla określenia biodystrybucji tkanek. Peptyd agonista indukował przejściowy spadek liczby białych ciałek krwi, podczas gdy antagonista nie. Ogniskowe miejsce infekcji było wykrywalne już po 10 minutach po iniekcji agonisty lub antagonisty. Biodystrybucja wykazała wyższe nagromadzenie peptydu agonisty w śledzionie i wątrobie w porównaniu do peptydu - antagonisty. Obydwa peptydy szybko nagromadziły się w nerkach. Poziomy we krwi były nieznacznie wyższe dla antagonisty, co mogłoby wskazywać na dłuższy biologiczny okres półtrwania tego peptydu. Stosunki infekowanych mięśni sięgały od 4:1 do 7:1 wskazując na znaczący wychwyt do miejsca infekowanego mięśnia. Stosunek cel - tło dla peptydu - agonisty zwiększył się w ciągu 5 godzin, podczas gdy stosunek dla peptydu - antagonisty osiągnął maksimum po 1 godzinie. To może być odbiciem wyższego powinowactwa do wiązania dla agonisty. Powyższe pokazuje, że peptyd chemotaktyczny - antagonista jest zdolny do szybkiego lokalizowania się w miejscu ogniskowej infekcji, a zatem jest użyteczny do diagnostycznego obrazowania miejsc infekowanych lub zapalnych. Ponadto, te dane wskazują potencjalne zastosowanie peptydu antagonisty w leczeniu choroby związanej z tym specyficznym receptorem.

Przykład 5

Ten nieskoniugowany peptyd iBoc-MLFK oceniono za pomocą próby adhezji neutrofilu do komórek śródbłonkowych. W tej próbie, neutrofile (5 x 105 znaczone dioctanem 5karboksy-fluoresceiny dodano do zagłębień płytki o 48 zagłębieniach zawierającej zrastające się ludzkie komórki śródbłonkowe żyły pępkowej. Peptyd iBoc-MLFK dodano w stężeniu 10 mM 10 minut przed stymulowaniem neutrofili przy użyciu 30 nM ForMLF. Adhezję procentową oznaczono przez wymycie nieprzyłączonego neutrofilu po okresie inkubowania 25 minut. Peptyd ten przy tym stężeniu inhibitował adhezję w 66%. Następnie, zbadano stężenia między 0,1-3,0 mM. Peptyd w sposób zależny od dawki inhibitował adhezję neutrofilu do komórek śródbłonkowych przy IC₅0 w przybliżeniu 14 mM. Inhibitowanie adhezji zmniejszyłoby infiltrację leukocytów, takich jak neutrofile, do miejsca choroby, tym samym ograniczając uszkodzenie tkanki związane z zapaleniem. Dane te dostarczają dalszego dowodu wspierającego zastosowanie peptydów - antagonistów w lecznictwie chorób związanych z aktywowanymi leukocytami.

Przykłady 6-98

Postępowanie według przykładu 5 powtórzono dla dodatkowych CP. Wyniki przedstawiono w tabeli I. W tabeli, MPO oznacza próbę mieloperoksydazową, znak oznacza, że brak było efektu przy 30 mM, znak „+” oznacza, że był efekt dodatni przy 30 mM, a „N. T.” oznacza „nie badane”.

177 585 lane dotyczące biologii komórki

Antago- nista względem adhezji IC50, mM	CM CM II ii h- Z co co Z T £§ V O CM ’Γ LO P CO · LO CD CM ν-iOCM CO
Agonista względem adhezji EC50, mM	.006
Uwalnia-nie MPO EC50, mM
E 5 ό § o ·° c en ar ~ c ™ -2 oj = £ f £ i Π e 2	in 10 W co TT10 <Ρ T 00 O> Nr- b- co T- in in in ·>φ oj
Agonista względem wolnych rodników EC501 mM	lO 0 (O ó P
ro c 8 N, 0 .2 2 UJ 5 E	CN £ ' CM 0 Φ _ 1^ i-i ^“AW^b-ycN^^Aoo v-xj-
Sekwencja i	N(N-tosylomocznik)-MLF N-adamantylomocznik-MLF Leu-Ala-SHNH-Boc tBoc-Phe-Leu-Phe N(N-izopropylomocznik)-FLF FMOC-Leucyna N(karbaninion winylu)-MLF N-propylotiomocznik-MLF fenylotiomocznik-MLF FMOC-MLF tBoc-M(D)LF tBoc-MAc(5)cF izopropylomocznik-FLFLF-Lys-Lys- SHNH formylo-MLF-Lys-SHNH
Przy- kład	Ot-CNCO^IDCDSCO O) (ΟΓ'-ΟΟΟϊν-'Τ-Τ-Τ— T— T-* T- τ— Ύ—

177 585

Tabela 1 (ciąg dalszy)

Antago- nista względem adhezji IC50, mM	5 5 CM μ. OOO ^0 CO CO CO r- CM co co Η Λ Λ Λ
Agonista względem adhezji EC50. mM 1	Ο) ο <Ο ΙΟ cO ρ ρ ą ι> «
<x> ϊ 2 .S E S 2 Os 3 Σ LU	CM ΙΟ CM CM CM
E 5 0 -s -s -0 1 O) _ ®* >. c S S σι S £ g 5 ΐ § 5 e a	0 tn “? ιη ,· !< Τ ιη <9 U cm 1— 0 t- w cn Z
Agonista względem wolnych rodników ECso, mM	0 ooo 0 0 0 0 0 ° X τ X X 7
(0 ‘c m *c- O .<? S UJ 5 E	o 0 O) CO (Λ Tt T-h-L. τ- O 1Λ ” o p λ T oó Tt O
Sekwencja	N-N-izopropylomocznik-FLFLF kwas pirośluzowy-MLF izopropylomocznik M-Ac5c-F N-cynamoilo-MLF N-N-izopropylomocznik-M-l_- -heksahydro-F pirolo-M-L-F HYNIC N-butylomocznik-MLF-Lys- -SHNH i-propylomocznik-MLF-Lys- -Asp-SHNH N-i-propylomocznik-MLF- -propanodiamina-SHNH i-propylomocznik-MLF- -n-propylodiamina-Asp-SHNH
Przy- kład	O τ- CM CQ Tt W (O S 00 O) O CM CM CM CM CM CMCMCM CM CM O

177 585

Tabela 1 (ciąg dalszy)

Antago-

nista

względem

adhezji |

2 E a u

>30

7.82

N.T.

>30

>30

>30

CO

E

2

ne

!*-* ω c o <

o ar O)

N <D x: Ό CO

b 8 υ LU

v—

IT +

CM c\i

H Ż

c ε N +

1— H

CD

Φ

A S i n E i 2 J z> Σ ui	lO X o. •nj* 't
® jc 5 2 O Ό O ·θ C 03 Φ* >* ™ c <S 12 c c ó ΓΗ Π o	h 5 o? 2 «? <5 ° Z r- r- v- IO CO Λ
Agonista względem wolnych rodników Εθ50ι mM	O CM ° CO CM Λ +
to Έ 8 N, <«5 o .<? ? ui 5 ε	in io cm li) in 7 CM IO CO IO CM 03 b- >- <- CO A- TT A CM Ρ τ-' -Γ o o ó ó
Sekwencja 1	i-propylomocznik)-MLF- -n-propylodiamino-Asp-SHNH i-propylomocznik-M LF-Lys- -SHNH-Boc i-propylomocznik-FLFLF-Lys -SHNH N(N-fenylomocznik-ML-heksa- -F cykloheksylomocznik-MLF- -Lys-SHNH formylo-MLF-Lys-SHNH iBoc-MLF-SPNH iBoc-MLF-O-SPNH iBoc-MLF-S-SPNH iBoc-MLF-rozszczepialny koniugat
Przy- kład	’τ- <n co tj- m £ £ $ $ 2 co co co co co co co co CO TJ-

177 585

Tabela 1 (ciąg dalszy)

Antago- nista względem adhezji ICso. mM	<O <9 *9 <9 V- h* P** CD
Agonista względem adhezji EC60, mM	i— i— <0 Η Η Η Η H ZZóolZZZZ+ł z
Φ E S 2 J ZO Σ LU
© -c 2 O O U ·© c cn ay > _ c £3 *2 o> -£ .£= o Π Π 2	? żżżżzżżżzzż z
Agonista względem wolnych rodników EC50, mM	o <9 <9 χ- + + co m
ro ‘c 8 N, — O .2 2 ul 5 E	O Λ ° ° ° cM^j-ΛΛτ-ιη o- σ- οι co r*- o λ
Sekwencja	φ X. Σ > j y O <d © H R Jh o 5 5 § roSŚ“2io|^555 óó5©^?o^fóóOoOŁ>,sl ooE-¥oo°o°°<1>aj,S,SCD “S'5Ź£i£Si£iSS2c5!So
Przy- kład	•ł-cMco^rmcoh-aocnoT-CMCo^io - tO LO IO U> ΙΟ lO

177 585

Tabela 1 (ciąg dalszy)

Antago- nista względem adhezji IC50, mM L	10 φ to co co w Tt CO CM « (O CM CM di Tfr
Agonista względem adhezji ECm! mM 1	φ O c c c c <D <D i_J ui Ι^’Μ· p co C ui Η Η O ’Γ- g co 5 Π Z Z A A + A + Z Z
Φ Λ 2 i E. g 0 g 3 CL 0 O 2 tli
' ® -c s 2 0 -o 0 § p O) <D> >. ii c ™ 15 o> .£ = ó < c § 5 2	11 Ί7 11 T- w 2 2 2 I? 00 m u, h i> 0 A 2 A A A A T-T-Z <O O) Tt 05 O CO t- W
Agonista względem wolnych rodników EC50, mM	H 2 co
ECso wiązania mM 1	CO 0 l‘ b- ιη 0 M- CM O CM Tt CM CO ip CO co co in A ó co 0 T- co .
Sekwencja	tBoc-MLF tBoc-NleLF tBoc-F(D)LF(D)LF ForMLF ForMLFK multimer izopropylomocznik- -MLF A3 multimer izopropylomocznik- -MLF A2 N-metylomocznik-MLF N-etylomocznik-MLF N-butylomocznik-MLF i-butylomocznik-MLF t-butylomocznik-MLF N-N-butylotiomocznik-MLF
Przy- kład	co r- co oj 0 T- cn co n- uo co c- co co m co in co co co co co co co co co

177 585

Tabela 1 (ciąg dalszy)

Antago- nista względem adhezji ICso, mM	P o £ cm rt in <° ° 2 c° «> ? 00 co ę\j V” v 5^ Λ CO 05 Λ CO
Agonista względem adhezji EC50, mM L	in O H H H CM Z Z Z P
Q> ? 2 S m E- | 2 Os
o -σ o 9 p w ® *5) £ c ó 1-2 ί Π o	IT A- T7 T- V- T- T- z II 4 II II II II T- co oo z 2. z z ż ż <0 °° * o o . <R cm o o cm Z o cm w o a- co Ύ cm co cm r- t- r-
Agonista względem wolnych rodników ECso, mM	m o Λ T
cg ’c S N, o < | ω 5 E	s 1 w in oo i _ CM W CM CM (fj CO W ą (N O 7 Ó CM CM O A- CM P (\i U CM CM
Sekwencja	N-butylomocznik-FLFLF N-propylomocznik-MLF izopropylomocznik-MLF izopropylomocznik-FLFLF i-propylomocznik-MLF-Lys octan i-propylomocznik-MLF-n-propylodiaminy cykloheksylomocznik-MLF N-fenylomocznik-MLF N-benzylomocznik-MLF N-benzoil-MLF n-butylo-amidylo-MLF mezylo-MLF n-butylo-sulfonoamidylo-MLF benzeno-sulfonoamidylo-MLF
Przy- kład	CD O v- CM CO Tj- hw h- rSh-NNh-COCOCO

177 585

Tabela 1 (ciąg dalszy)

Antago- nista względem adhezji ICS0, mM	CM CM II II CM z z 4, O 0 0 z n O O O O . T- m . τ— τ— CO T- Λ CO rt- Λ Λ Λ τ-
Agonistą względem adhezji ECm, mM	II Z δ co V ΟΟ oz V + A +
1 ε § 2 oa Ό Ξ> LU
O -O O ~3 P cn αχ c .2 -2 cd .£= s 5 i § i 2 2	τ- Η Z 0 ? co cm co co Λ CO τ- O> Tt CN CN
Agonistą względem wolnych rodników EC50, mM	i ? 'ί Λ A 5 <D 0 ν H r- ’τ-
EC50 wiązania mM	II ¥ z z CO co 5- 1- b- q 0 i 0 p σι in ą cn co cn co cm’ b- ν' ν P τ— cm iri F F
Sekwencja	i-butyrylamido-M(s=0)LF i-butyrylamido-MLF NN4-chlorofenylomocznik-MLF P-metoksybenzylomocznik-MLF P-tolilomocznik-MLF M-tolilomocznik-MLF N(N-fenylo-sulfonylomocznik)-MLF 4-karboksy-2-okso-tiazolidyna-MLF 4-karboksytiazolidyna-MLF 4-karboksy-2-tio- -okso-tiazolidyna-MLF 1 -naftoilo-amid-MLF
Przy- kład	CO .rt cn CO CO 05 θ’- CM co 00 00 00 00 CO 03 CO <35 CD <35 <35

ΠΊ 585

Antago- nista względem adhezji IC50, mM	ip τ*“ «
Agonista względem adhezji EC50, mM	CM II T- Z π τι- z JL CD CM ? A <, <P
0) s o E ro O 8 5 9= O 3 2 UJ
ό -§ € -δ 1 en oy >. c ro ro 75. c c a 5 Έ § S 2 O	5.0 .038 4.9N=4
Agonista względem wolnych rodników EC50, mM	>100 2.9
ra 'c O 2 uj 5 E	CM CM O CO O) O) TT O CM
Sekwencja	n(N-izopropylomocznik- -FLFLF-propanodiamina-SPNH N-cynamoilo-FLFLF N-N-allilomocznik-MLF N(guanidyna)-MLF N-hydromocznik-MLF '
Przy- kład	ID CO h* co O O> O) 0) o

ω c

π

Ν ο

Ν ω

α.

Ν

Ο

Ν

Ό •ω ο

C α

177 585

Przykład 99

W następującym przykładzie, chlorowodorek Met-Ldu-ehe zsyntetyzowano tradycyjnymi metodami faz w roztworze (Bodansky, M., Bodansky, A., 1984, „The Practice of edpride Synthesis”, Springer Verlag, New York). Izocyjaniany otrzymano z firmy Aldrich, o ile były dostępne. Izocyjaniany, które były niedostępne wytworzono przez standardową reakcję żądanej aminy z „triphos” z firmy Aldrich. Wszystkie widma Ή NMR zarejestrowano na przyrządzie Bruker 30 MHz w DMSO⁶ lub MeOH d³ i są podane względem wzorca wewnętrznego TMS.

Peptydy o końcach N zabezpieczonych mocznikiem dogodnie wytworzono z dobrą wydajnością przez reakcję peptydów o wolnych grupach aminowych z odpowiednim izocyjanianem. Przykładową syntezę N-m-buty1o-N’-mdtiony1o-1ducylo-fdny1oa1anino-mocznika przeprowadzono jak następuje: 1,0 g chlorowodorku Met-Ldu-Phe (2.2 mMol) przeprowadzono w stan zawiesiny w 10 ml suchego DMF i dodano 2,2 równoważnika (0,70 ml, 5,0 mMol) suchej trietyloaminy, a następnie 1,25 równoważnika (0,31 ml, 2.8 mMol) n-butyloizocyjanianu. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej przez 16 godzin, po czym DMF usunięto na wyparce rotacyjnej. Otrzymaną pozostałość rozpuszczono w 1ml metanolu i dodano 15 ml 1n HCl podczas szybkiego mieszania. Otrzymaną białą substancję stałą (0,81 g, 71%) odsączono, przemyto wodą i osuszono przez noc pod próżnią. FABMS obliczone dla CYsHujNANS oznaczono 509 (M+1). ‘H NMR (MeOH, d⁶): d 8,12 (d, J=8 Hz., 1H), 8,01 (d, J=8 Hz., 1H), 7,21 (m, 5H), 4,62 (m, 1H), 4,30 (m, 1H), 4,25 (m, 1H), 3,17 (m, 4H), 2,45 (t, J=7Hz, 2H), 1,95 (m, 1H), 1,77 (m, 2H), 1,40 (m, 6H), 0,92 (m, 9H)

Przykład 100

Ten przykład wykazuje, że analogi peptydu chemotaktycznego znaczonego ^mTc są skutecznymi środkami zewnętrznego obrazowania ogniskowych miejsc infekcji.

Cztery analogi peptydu chemotaktycznego ddrywaryeowand hydzazynonikotynamidem (HYNIC), For-NleLPK-HYNIC (HP1), For-MLFK-HYNIC (HP2), For-MLFNH(CH₂)6NHHYNIC (hP3) oraz For MLF-(D)K-HYNIC (HP4) zsyntetyzowano i oceniono in vitro bioaktywność i wiązanie receptora.

Materiały i metody

Synteza i charakterystyka peptydu

N-For-Noz1ducy1o-Lducylo-Fdnylalanilo-Lieyno-NH5, N-For-Mdriony1o-Lducy1oFeny1oa1ani1o-Lizymę, N-For-Mdriony1o-Lducylo-Fdny1oa1ani1odiammobeksy1oamidd oraz NFor-Meriomy1o-Leucy1o-Fdnyloa1anilo-D-Lieyno-NH2 zsyntetyzowano i oczyszczono przy użyciu standardowych sposobów w fazie stałej (Merrifield, R. B., J. Am. Chem. Soc. 15:2149-2154 (1963); Stewart, J. M. i Young, J. D., Solid Phase Peptide Syntbesis, W. H. Freeman & Company, San Francisco, CA (1969)) jak opisano w: Fischman, A. J., J. Nucl. Med. 32:483-491 (1991). Wszystkie reagenty nabyto o najwyższej klasie jakości dostępnej w handlu. Skoniugowanie tych związków z mikoryny1ohydrazyną wykonano jak opisano poniżej dla HP3.

Do 186 mg N-For-Mdr-Ldu-Pbd-diaminobdksy1oamidu dodano 2 ml dimetyloformamidu (DMF) oraz 60 ml diizopropyloetylaminy, a następnie 154 mg kwasu sukcynamidylo-6-tBoc-bydrazynopirydyno-3-kaboksy1owdgo (Abrams, M. J. i wsp., J. Nucl. Med. 31:2022-2028 (1990)) w 1 ml DMF. Mieszanina zżółkła i peptyd rozpuścił się w krótkim czasie. Po 2 godzinach, do mieszaniny reakcyjnej dodano eter-eter naftowy i górną warstwę odrzucono. Do oleistej pozostałości dodano wodę powodując zestalenie.

Substancję stałą przemyto 5% wodorowęglanem sodu, wodą i octanem etylu uzyskując produkt o ciężarze 183 mg. Grupę zabezpieczającą t-BOC usunięto przez mieszanie nieoczyszczonego produktu przez 15 minut w temperaturze 20°C z 5 ml kwasu trifluorooctowego (TFA) zawierającego 0,1 ml p-krezolu. Dalsze działanie TFA dało w wyniku zwiększone ilości produktu ubocznego. TFA usunięto na wyparce rotacyjnej, a do pozostałości dodano eter, aby wytrącić odbezpieczony peptyd. Produkt oczyszczono za pomocą HPLC z odwróconymi fazami na kolumnie Whatman ODS-3 2,5 x 50 cm wymywanej gradientem acdtonirry1u w 0,1% TFA. Frakcje zawierające główny składnik połączono i rozpuszczalnik usunięto uzy177 585 skując żądany produkt. Peptydy scharakteryzowano za pomocą UV i spektroskopii masowej, jak również przez analizę aminokwasów.

Przygotowanie komórki

Ludzką krew obwodową leukocytów cechujących się róznokształtanśpir jąder komórkowych (PMN) wyizolowano drogą sedymentacji w 3% Dextranie (Pharmacia, Nutley, NJ), a następnie przez odwirowanie gradientowe na Lzmphożrep (Organon Teknika, Durham, NC). Preparaty komórkowe zawierały >95% PMN jak oceniono za pomocą mikroskopii próbek barwionych Wrighta.

Próba Wiązania Receptora For-MLF

N-formzlo-metionylo-leuczln-fenylnalaaiaę (For-MLF), N-formzlo-aorleuczlo-leucyloCenzloalaniaę (For-NIeLF) oraz N-formyln-norleucylo-leuczlo-Cenylonlnnzlo-norleupylotyrozzlo-lirzaę (For-NIeLFNIeYK) otrzymano z Sigma (St. Louis, MO). For-ML[3H]F (60 Ci/mmol) otrzymano z New England Nuclear (Boston, MA).

Wyizolowane ludzkie PMN (otrzymane od zdrowych ochotników), 8 x 10⁵, iakubowaao w roztworze soli buforowanym fosforanem zawierającym 1,7 mM KH2PO4, 8,0 mM N112HPO4, 0,117 M NaCl, 0,15 mM CaCL, 0,5 mM MgCl2 oraz 1,0 mM PMSF pH 7,4 (bufor iakubapyjaz) w temperaturze 24°C przez 45 minut w całkowitej objętości 0,15 ml w obecności i nieobecności zmieniających się stężeń derywatyzownaego peptydu i 15 nM For-ML[³H]F (Deuel, T. F. i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78(l):4584-4587 (1981); Fischman, A. J. i wsp., J. Nucl. Med. 32:483-491 (1991); Pike M. C. i wsp., Methods Enzymol. 162:236-245 (1988)). Po inkubowaniu, komórki przesączono na dyski z włókna szklanego (Whatman GFIC; Whatman, Inc., Clifton, NJ) które następnie przemyto 20 ml lodowatego buforu inkubacyjnego. Filtry umieszczono w fiolkach scyntylacyjnych z 10 ml SaCetz-Solve (Research Products International Corp., Mt. Prospect, IL) i radioaktywność zmierzono za pomocą cieczowej spektroskopii scyntylacyjnej. Wiązanie specyficzne jest określone jako całkowite wiązanie minus wiązanie niespecyficzne. Wiązanie niespecyficzne jest to ilość radioaktywności resztkowego wiązania w obecności 10 mM niez^czonego For-MLF. Wiązanie niespecyficzne stanowiło w przybliżeniu 10% całkowitego wiązania. By określić wpływ radioznakowania oTc na powinowactwo wiązania, wyizolowane ludzkie pMn (2 x 10⁶ komórek) iakubowaao w HBSS/BSA w temperaturze 4°C przez 60 minut w obecności i nieobecności zmieniających się stężeń For-NIeLFNIeYK lub odpowiedniego niez^czonego peptydu i ustalonej ilości peptydu znaczonego ⁹⁹ⁿⁱTc, w całkowitej objętości 0,15 ml. Po inkubowaniu, dobrze zmieszaną próbkę (0,1 ml) zawiesiny komórek ułożono jako warstwę na 0,2 ml HBSS/BSA:Lzmphopreż (1:1) w probówce do mikrnwirowanin 0,4 ml i zawartość odwirowywano przez 4 minuty przy 15.000 obr/min (Microfuge E, Beckman, Columbia, MD). Probówki zamrożono w ciekłym azocie i wyizolowano grudki komórek. Radioaktywność zmierzono przez zliczanie gamma. Wiązanie niespecyficzne to ilość radioaktywności resztkowego wiązania w obecności 5 mM niez^czonego For-NIeLFNIeYK lub odpowiedniego nieznaczonego peptydu. Wiązanie niespecyficzne stanowiło w przybliżeniu 10% całkowitego wiązania.

Próba Wytwarzania Ponadtlenku

Octan mirystynianu forbolu (PMA) i cztophnlazynę B otrzymano od firmy Sigma (St. Louis, MO). Uwalnianie ponadtlenku badano przez monitorowanie redukcji ferrzcztochromu C inhiżitowalaee przez dysmutazę [mnadtlpanku przy użyciu współczynnika ekstynkcji 29,5/mmol/1/cm. Ujmując to w skrócie, wyizolowane ludzkie neutrofile inkubowano przy użyciu roztworu soli bilansowanego Hank (HBSS) (GIBCO, Grand Island, NY). HBSS sam lub ze wzrastającymi stężeniami peptydu (HP1, HP2, HP3, HP4, For-NIeLF, For-MLF or ForNIeLFNIeYK) sięgającymi od 1 nM do 1 mM w obecności 10 mM cztophnlazzaz B plus lub minus dzsmutara ponadt^ku (50 mg/ml) w temperaturze 37°C przez 10 minut. Redukcję ferrzpztnchromu C zmierzono sżektrofotometrypraie.

Znakowanie ^WmTc peptydów chemotnktzprazch derzwntzzowaazch HYNIC.

99oTp-aadtechnetan (generator ^Mo^Oc) i glukoheptonian cynawy (Glucoscan) otrzymano z New England Nuclear (Boston, MA). 99oτp-glukoheptonian użyto, by dostarczyć niezbędne indywidua Te(V) okso dla radiozanknwnnin żeżtzdów skoniugowanych z hydrazy38

177 585 aoaikotyoamidrm. Do zestawu lionllizacyjnrgo dodano w przybliżeniu 2,5 ml ”TcnadtechOrtaou w 0,9% NaCl. Końcowe stężenie radioaktywne wynosiło 5-10 mCi/ml i czystość radiochemiczną produktu ozoaczono za pomocą chromatografii cienkowarstwowej błyskawicznej na żelu krzemionkowym (ITLC-sg) przy użyciu acetonu i 0,9% NaCl jako rozpuszczalników fazy ruchomej.

Następującą procedurę zastosowano do radioznakowaoia analogów peptydu chemotaktyczoego ⁹9”Tc. W przybliżeniu 0,2 mg peptydu rozpuszczono w 50 ml dimetylosulfotlenku i roztwór rozcieńczono do końcowego stężenia 0,1 mg/ml przy użyciu 0,1 M buforu octanowego pH 5,2. Pół mililitra roztworu peptydu umieszczono w czystej fiolce szklanej i dodano 0,5 ml ^99mTc-glukoheptoniaou. Mieszaninę krótko wirowano i pozostawiono do stania w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Czystość radiochemiczną oznaczono za pomocą ITLC-sg w układach trzech rozpuszczalników: acetonie, 0,9% NaCl i układzie acrtoo:woda (9:1).

Analogi peptydu znaczone ^99l”Tc także analizowano za pomocą HPLC z odwróconymi fazami przy użyciu dwóch układów. Układ A wykorzystał kolumną Beckmaoa Cis z odwróconymi fazami (5m, 4,5 x 46 mm, Beckmao, Columbia, MD) przy następujących warunkach wymywania: Rozpuszczalnik A: 5% acrtooitrylu w 50 mM octanu, pH 5,2; rozpuszczalnik B: 50% acetonitrylu w 50 mM octanu, pH 5,2: gradient: 0% B do 100% B przez 20 minut; szybkość przepływu 2 ml/mioutą. Układ B wykorzystał kolumnę Vydac Cis z odwróconymi fazami (300 Aogstr., 5m, 4,5 mm x 25 cm, Vydac) przy następujących warunkach wymywania; Rozpuszczalnik A: 0,1% kwasu trifluorooctowrgo w wodzie; rozpuszczalnik B: 0,1% kwasu trifluorooctowego w acetknitrylu; gradient: 0% B do 100% B przez 10 minut; szybkość przepływu 2 ml/minutę. Absorpcją UV monitorowano za pomocą spektrofotometru przepływowego Miltoo-Roy/LDC flow-through, a radioaktywność monitorowano przy użyciu Beckmana 170 (Beckmao, Columbia MD). Wyjście z obydwu dektektorów zarejestrowano i zanalizowano przy użyciu integratora z podwójnym kanałem (Waters Model 746 Data Module, Waters, Marlboro, MA).

Maksymalizacja aktywności właściwej

By uniknąć efektów neutropeoicznych związanych z dawkami farmakologicznymi analogów peptydu chemotaktyzyorgo, aktywność właściwą peptydów chemotaktycznych znaczonych ^mTc zmaksymalizowano, tak że dla dawki obrazującej ^99mTc, końcowa masa podanego peptydu wyniosła znacznie poniżej znanego stężenia EC50 (około 20 nM) aktywacji.

Generator ^99mTc wymyto pięć godzin po uprzednim wymyciu próbując zminimalizować udział ⁹⁹Tc przy równoczesnym utrzymaniu elueata ^99mTc>300 mCi. Masę Tc i względny udział ⁹⁹”Tc oraz ⁹9”Tc obliczono przy użyciu równań kinetycznych generatora w połączeniu ze znaną historią użytego generatora t^M^or^TTc . (Tc-GH) wytworzono jak opisano powyżej. W przybliżeniu 180 mg peptydu chemotaktyczoego, (M. cz.: 720), rozpuszczono w 50 ml DMSO i rozcieńczono do końcowego stężenia 100 mg/ml z 0,1 M buforem octanowym, pH 5,2. Próbki roztworu peptydu seryjnie rozcieńczono buforem octanowym uzyskując zakres stężenia od 2 do 80 mg/ml. Znakowanie peptydu zapoczątkowano przez dodanie 0,5 ml ⁹⁹”Tc-GH do równej objętości peptydu w buforze octanowym. Roztwór wirowano krótko i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Stopień znakowania peptydu ozoaczono za pomocą ITLC-sg przy użyciu trzech oddzielnych układów rozpuszczalników; aceton, 0,9% NaCl i acetoo:woda (9:1). Aktywność właściwą rαdioznαczkorgo peptydu obliczono przy użyciu zależności:

(%RCY x mCi obecnej/mMo^ peptydu x 100).

Badania In-Vivo

Trzy badania wykonano oa zwierzętach:

A) Aby określić dystrybucję io vivo analogów radiozoazzonrgo peptydu u zdrowych zwierząt, badania biodystrybucji wykonano dla każdego analogu;

B) Aby określić zdolność analogów radiozoaczoorgo peptydu do lokalizowania w ogniskowych miejscach zapalenia, pomiary radioaktywności tkaoki wykonano u szczurów z infekcją E. coli; oraz

C) Aby ocenić właściwości obrazowania infekcji radiozoaczooych peptydów, wykonano obrazowanie za pomocą kamery gamma u królików infekowanych E. coli.

177 585

A. Biodystrybucja u szczurów normalnych

Grapom dwudziestu czterech normalnych szczurów Sprague-Dawley (samców) o ciężarze w przybliżeniu 150 g (Charles River Breeding Laboratories, Burlington MA) wstrzyknięto w przybliżeniu 5 mCi każdego z peptydów znaczonego ^mTc, by określić biodystrybucję po 5, 30, 60 i 120 minutach (każdy peptyd oceniono u 6 zwierząt w każdym punkcie czasowym). Próbki krwi, serca, płuc, wątroby, śledziony, żołądka, nerek, przewodu pokarmowego, mięśni szkieletowych, jąder i kości zważono i zmierzono radioaktywności przy użyciu licznika gamma typu wnękowego (LKB model #1282, Wallac Oy, Finlandia). By wprowadzić poprawkę na rozpad radioaktywny, próbki dawki wstrzykniętej zliczano równocześnie. Wyniki wyrażono jako % dawki wstrzykniętej na gram.

B. Badania szczurów infekowanych

Pojedyńczy kliniczny izolat E. coli zastosowano do wytworzenia infekcji ogniskowej. Bakterie inkubowano przez noc na płytkach z agarem tryptykazy soi w temperaturze 37°C i indywidualne kolonie rozcieńczono sterylnym 0,9% NaCI, aby wytworzyć zmętnioną zawiesinę zawierającą w przybliżeniu 2 x 10⁹ organizmów/ml. Szczury Sprag^-nawley (samce) o ciężarze w przybliżeniu 150 gram (Charles River Breeding Laboratories, Burlington MA) znieczulono ketaminą wstrzykniętą domięśniowo w ich lewe tylne udo z 0,1 ml zawiesiny zawierającej w przybliżeniu 2 x 108 organizmów.

Dwadzieścia cztery godziny po bakteryjnej inokulacji, zwierzętom ze znacznym obrzmieniem infekowanego uda wstrzyknięto w przybliżeniu 5 mCi (3 pMole) peptydu znaczonego ^mTc przez boczną żyłę ogonową. 30 i 120 minut po iniekcji, grupy pięciu zwierząt uśmiercono przez zwichnięcie szyi. Pobieranie próbek tkanki, pomiar radioaktywności i obliczenie wyników wykonano jak opisano powyżej.

C. Obrazowanie infekowanych królików

Aby określić dostępność stosowania radioznaczonych peptydów chemotaktycznych do lokalizacji infekcji u zwierząt, które są wrażliwe na efekty neurropdniczne tych środków, badania obrazowania wykonano u królików z ogniskowymi infekcjami E. coli. W tych badaniach użyto wysoką aktywność właściwą peptydu ^mo^^cznego znaczonego ^mTc. Sześć nowozelandzkich białych królików (samców) o ciężarze 2-3 kg znieczulono ketaminą i ksylazyną (15,0 i 1,5 mg/kg) i wstrzyknięto w lewy tylny mięsień uda 1,0 ml zawiesiny w przybliżeniu 2 x 10⁹ E. coli. Dwadzieścia cztery godziny po inokulacji, królikom ze znacznym obrzmieniem infekowanego uda wstrzyknięto przez boczną żyłę uszną 600-1000 mCi HP2 znaczonego ^99mTc oczyszczonego za pomocą HPLC (aktywność właściwa > 10,000 mCi/mMol, oddzielony od niezmaczondgo peptydu za pomocą HPLC jak opisano powyżej). Zwierzęta znieczulono ketaminą i ksylazyną (15,0 i 1,5 mg/kg) i uzyskano seryjne scyntygramy o godzinie 0 do 3 i 16 do 17 godzin po iniekcji przy użyciu znaczonego pola widzenia kamery gamma (Technicare Omega 500, Solon, Ohio) wyposażonej w wysokiej rozdzielczości kolimator o równoległym otworze i podłączono do dedykowanego komputera (Technicare 560, Solon, Ohio). Obrazy zarejestrowano dla ustalonego czasu 5 minut/widok z 15% okna centrowanego, tak aby objąć fotopik 140 KeV 9^9mTc. Aby scharakteryzować lokalizację znaczonego peptydu, wykonano analizę obszaru zainteresowania (ROI), porównując infekowane udo do konrza1ateza1nego mięśnia normalnego uda jako funkcję czasu.

Po uzyskaniu końcowych obrazów, zwierzęta uśmiercono przez przedawkowanie pentobarbitalu i próbki krwi, serca, płuc, wątroby, śledziony, nerek, żołądka, jelit, jąder, kości, szpiku, normalnego mięśnia szkieletowego, infekowanego mięśnia szkieletowego i ropienia, zważono oraz radioaktywność zmierzono jak opisano powyżej. By wprowadzić poprawkę na rozpad radioaktywny, próbki dawki wstrzykniętej zliczano równocześnie. Wyniki wyrażono jako % dawki wstrzykniętej na gram. Aby określić ilość aktywności związanych komórek w obiegu, krew odwirowano, a komórki i osocze oddzielono. Komórki przemyto 0,9% NaCl i zmierzono radioaktywność resztkową w komórce i roztworze sklarowanym nad osadem. Aby określić ilość aktywności związanych komórek w miejscu infekcji, ropień przemyto dwukrotnie przy użyciu 0,9% NaCl i zmierzono resztkową radioaktywność we frakcjach komórkowych i rozpuszczalnych.

177 585

Metody statystyczne

Wyniki badania obrazowania i biodystrybucji oceniono przez analizę wariancji (ANOVA) przy użyciu liniowego modelu, w którym zmiennymi klasyfikacyjnymi były organ i czas;

%lD/g lub %ID/organ = Organ + Czas + Organ x Czas.

Porównanie post-factum stężenia peptydu wykonano za pomocą nowego testu wielokrotnego zasięgu Duncana (Ducan, D. B., Biometrics 2 2:242 (1955)). Pierwszy dolny indeks każdej wartości F jest liczbą stopni swobody dla pierwszej zmiennej klasyfikacyjnej (n-1), drugiej zmiennej klasyfikacyjnej (m-1) lub oddziaływania (n-i) x (m-i). Drugi dolny indeks jest liczbą resztkowych stopni swobody (Całkowita liczba obserwacji - n x m). Wszystkie wyniki wyrażono jako średnią +/- SEM.

Wyniki

Synteza peptydów

Wszystkie cztery analogi peptydu chemotaktycznego derywatyzowanego HYNIC wytworzono z dobrą wydajnością i czystością. Analiza UV wykazała maksimum absorpcji przy 268 i 315 nm, charakterystyczne dla grupy HYNIC, dla wszystkich 4 peptydów. Stwierdzono, że spektroskopia masowa i analiza aminokwasów są zgodne ze spodziewanymi produktami skoniugowanego peptydu.

Aktywność biologiczna analogów peptydu chemotaktycznego

Wyniki próby wytwarzania ponadtlenku przedstawiono na fig. 3. Stężenia peptydów, które wytworzyły 50% maksymalnej reakcji (EC50) podano w tabeli Π. Peptydy HP2, HP3 i HP4 wykazywały moc równą lub większą niż For-MLF (100 nM). Moc HP1 i była co najmniej jeden rząd wielkości niższa. Zatem, kolejność mocy wytwarzania ponadtlenku była następująca HP2> HP3> HP4> >HP1.

T a b e l a II

EC50 wytwarzania ponadtlenku i powinowactwa wiązania analogów peptydu chemotaktycznego

Peptyd	Wytwarzanie nadtlenku nM	Powinowactwo wiązania nM
HP1	500	40
HP2	12	0,18
HP3	40	0,12
HP4	60	0,35
For-MLF	100	20
For-NIeLF	320	300
For-NIeLFNIeYK	100	1

Skuteczność peptydów, określona jako maksymalna ilość wytworzonego anionu ponadtlenku, była podobna dla wszystkich badanych peptydów i sięgała od 2,07 do 3,80 moli O2 wytworzonego/106 komórek/10 minut. Skuteczność wszystkich peptydów była mniejsza niż octanu mirystynianu forbolu (PMA), niepokrewnego aktywatora pękania utleniającego PMN, który daje maksymalną reakcję 22,9 nmoli O₂ wytworzonego/20ć komórek/10 minut przy stężeniu 0,1 mM. .

Wiązanie analogów peptydu chemotaktycznego do receptora chemoatraktanta

Figura 4 pokazuje, że analogi peptydu chemotaktycznego derywatyzowanego HYNIC inhibitują wiązanie For-ML[³H]F do nienaruszonych ludzkich PMN przy rzędzie mocy podobnym do tego jak przy wytwarzaniu anionu ponadtlenku. Stężenia peptydu wymagane do wytworzenia 50% inhibitowania wiązania For-ML[3H]F do ludzkich PMN's (EC5) podano w Tabeli II. Peptydy HP2, HP3 i HP4 miały wartości EC50 podobne do wartości heksapeptydu For-NIeLFNIeYK. Podczas gdy powinowactwo HP1 do receptora chemoatraktanta jest w przybliżeniu 100-krotnie niższe niż innych peptydów tej serii derywatyzowanych HYNIC, jest

177 585 jedynie o czynnik 2 niższe co do mocy niż w przypadku For-MLF. Tripeptyd For-NIeLF miał ponad 100-krotnie niższą moc niż zarówno heksapeptyd jak i For-MLF. Zatem, uszeregowanie powinowactwa do receptora chdmoatrakranta było następujące: HP3> HP2> HP4>> HP1. EC50 dla ^mTc-HP2 wyniosło <10 nM.

Aby określić wpływ znakowania ^99mTc na wiązanie receptora, oceniono zdolność nieznacznego HYNIC-peptydu do przemieszczenia peptydu znaczonego ⁹9^mTc przy użyciu warunków próby opisanych powyżej. Wyniki tych doświadczeń wykazują, że stężenie nieznacznego peptydu wymagane do przemieszczenia 50% wiązania neutronlu peptydu znaczonego 99mTc jest w przybliżeniu ‘O-krotnie wyższe niż gdy For-ML[³H]F jest stosowany jako wskaźnik. To zwiększenie „zachłanności” wiązania można by wyjaśnić, jeśli zadioznaczmd indywiduum zawiera więcej niż jedną jednostkę peptydu na Tcv-g1ukohdptoman i wiązanie jest współdziałające.

Radioznakowanie przy użyciu 99^mTc

Wartości Rf peptydu znaczonego ⁹9^|nTc i 9^9rnTc-glukoheptonianu na paskach błyskawicznej chromatografii cienkowarstwowej z żelem krzemionkowym w układzie rozpuszczalników zastosowanej do monitorowania radioznakowania były następujące: 0,9% NaCl- ^mTcpeptyd = 0,0, ^99mTc-g1ukobdprnian = 1,0; aceton - 99^mTc-peptyd = 1,0, ^99raTc-g1ukobdprnian = 0,0; i acetoniwoda (9:1)- mTc-peptyd = 1,0, 9^9mTc-glukoheptonian = 0,0. Trzeci układ zminimalizował wleczenie się piku, dając ostrzejsze pasma mTc- peptydu, w porównaniu do samego acetonu. Dla wszystkich preparatów mTc-peptydu ITLC wykazało, że >90% radioaktywności było związane z peptydem po 1 godzinie inkubowania. Analiza znaczonych peptydów przy użyciu HPLC (układ A) wykazała główne radioaktywne piki dla ^99tnTcg1ukobdprnianu, mTc-HP1, 99mTc-HP2, 99^.^3 i ⁹⁹mTc-HP4 przy czasach retencji 0,30,5, 14,37, 11,25, 15,11 i 12,96 minut, odpowiednio.

Maksymalizacja aktywności właściwej

Wymycie generatora ⁹⁹Mo/mTc dało całkowitą aktywność 456 mCi. Całkowita ilość Tc wyniosła 3,4 nMol, przy stosunku Tc do Tc 1.53:1 i obliczono, że aktywność właściwa '‘Tc wynosiła 134.000 mCi/mmol. 99mτc-g1ukobdprnian (Tc-GH) wytworzono jak opisano powyżej; końcowe stężenie radioaktywne wyniosło > 150 mCi/ml w czasie wytwarzania. Czystość radiochemicznąZ^mTc-GH określono jako >95% za pomocą natychmiastowej chromatografii cienkowarstwowej przy użyciu acetonu i 0,9% NaCl.

Moc farmakologiczna analogów agonisty peptydu cbdmorakryczndgo wymaga wysokiej aktywności właściwej zadioznakowania, by zmniejszyć bezwzględną ilość peptydu obecną w roztworze iniekcyjnym. W idealnym przypadku, ten poziom aktywności właściwej powinien być osiągalny bez potrzeby oczyszczania. Na fig. 5 przedstawiono podsumowanie wpływu stężenia peptydu na wydajność znakowania. Z tych danych jasno wynika, że końcowe stężenie peptydu mieszaniny reakcyjnej ma znaczący wpływ na wydajność radiochemiczną; przy stężeniach peptydu poniżej 10 mg/ml uzyskuje się słabe wydajności znakowania. Gdy wyniki wyrazi się względem stosunku molowego peptyd - Tc w mieszaninie reakcyjnej, widać, że gdy ten stosunek wzrasta, wzrasta % wydajności radiochemicznej i obniża się aktywność właściwa.

Stosując tę procedurę jest możliwe osiągnięcie aktywności właściwych > 10000 mCi/Mole; jednak, wydajność radiochemiczna obniża się zasadniczo poniżej stężeń peptydu 10 mg/ml. Przy stężeniach peptydu <10 mg/ml, wymagany jest etap oczyszczania w celu usunięcia niezwiązanego ⁹ Tc. Usunięcie nidpredreagowanego 9?mτc-glukobeprnianu i ^99mTcO4' mońaa osiannąć aa pmmoąą eep-aaks z oewr0pnnni fzaamż. Lnlzzy wrrost aktywności właściwej można uzyskać przez usunięcie nieerzereaaowandao peptydu za pomocą HPLC (stosując układ B). Ponieważ piki odpowiadające eeptydpwi znaczonemu Tc, edetydowi nieznacznemu i aTo-a1ukohdetmianowi są dobrze rozdzielone przy użyciu tego układu HPLC można wyizolować zadipznaozny ederyd pozbawiony nośnika. W tych okolicznościach, aktywność właściwa zadioznaozndgo edetydu jest ograniczona jedynie przez aktywność właściwą eluatu z generatora Tc.

177 585

Biodystrybucja peptydu chemotaktycznego oTc u szczurów normalnych. Biodystrybucję czterech analogów peptydu chemotaktycznego znaczonego 'Tc przedstawiono w tabeli ΠΙ. We wszystkich eksperymentach in vivo, zwierzęta tolerowały dożylne podawanie analogów radioznaczonego peptydu chemotaktycznego bez widocznych efektów choroby. Z wyjątkiem nerek, żołądka i przewodu pokarmowego, stężenia wszystkich peptydów w tkance obniżały się w czasie.

Tabela III

Biodystrybucja analogów peptydu chemotaktycznego znaczonych ^Tc. Procent wstrzyknięcia dawki/gram (średnia ± SEM)

Organ	Czas (min.)	HP1	HP2	HP3	HP4
Krew	5	1.17±0.070	1.18±0.056	1.01±0.056	0.78±0.046
	30	0.82±0.019	0.67±0.036	0.55±0.017	0.48±0.052
	60	0.67±0.016	0.57±0.033	0.47±0.035	0.36±0.012
	120	0.52±0.010	0.48±0.015	0.39±0.015	0.31±0.010
Serce	5	0.75±0.45	0.50±0.019	0.72±0.089	0.42±0.027
	30	0.50±0.010	0.32±0.016	0.27±0.021	0.22±0.024
	60	0.40±0.012	0.28±0.018	0.29±0.026	0.20±0.013
	120	0.37±0.028	0.26±0.013	0.25±0.024	0.16±0.012
Płuco	5	1.54±0.122	0.85±0.043	10.65±1.473	1.11±0.099
	30	0.63±0.043	0.78±0.032	8.45±0.818	0.61±0.071
	60	0.64±0.039	0.46±0.030	5.10±0.449	0.49±0.026
	120	0.46±0.026	0.50±0.025	2.44±0.435	0.37±0.027
Wątroba	5	0.76±0.056	0.99±0.023	5.72±0.467	0.74±0.091
	30	0.53±0.012	0.62±0.019	4.81±0.205	0.52±0.022
	60	0.45Ó0.012	0.50±0.022	4.60±0.101	0.51±0.010
	120	0.43±0.016	0.58±0.026	4.75±0.175	0.46±0.016
Śledziona	5	0.34±0.014	0.35±0.023	2.27±0.281	0.35±0.041
	30	0.30±0.012	0.39±0.045	2.28±0.231	0.27±0.017
	60	0.26±0.006	0.25±0.013	3.11±0.191	0.32±0.017
	120	0.25±0.007	0.29±0.020	3.01±0.220	0.27±0.009
Nerka	5	3.08±0.092	3.30±0.173	1.90±0.199	3.67±0.436
	30	5.13±0.282	4.82±0.246	1.68±0.064	5.22±0.139
	60	5.16±0.115	4.36±0.213	1.63±0.057	5.36±0.178
	120	5.68±0.143	4.17±0.121	1.60±0.030	4.74±0.201
Żołądek	5	0.17±0.024	0.10±0.004	0.38±0.053	0.19±0.011
	30	0.12±0.012	0.15±0.010	0.56±0.029	0.09±0.023
	60	0.15±0.01.3	0.10±0.005	0.51±0.034	0.15±0.017
	120	0.16±0.015	0.11±0.011	0.39±0.008	0.15±0.012
Przewód	5	0.20±0.013	0.25+0.012	0.33±0.038	0.16±0.005
pokarmowy	30	0.32±0.026	0.64±0.074	0.64±0.046	0.32±0.039
	60	0.23±0.020	0.64Ó0.089	0.70±0.050	0.39±0.030
	120	0.32±0.028	0.72±0.055	0.81±0.047	0.41±0.035

177 585

Tabela III (ciąg dalszy)

Jądra	5	0.15±0.010	0.12±0.008	0.12±0.011	0.19±0.006
	30	0.14±0.005	0.11 ±0.003	0.11 ±0.006	0.14±0.015
	60	0.13±0.005	0.10±0.006	0.11 ±0.004	0.13±0.008
	120	0.14±0.003	0.10±0.003	0.10±0.005	0.11 ±0.004
Mięsień	5	0.32±0.013	0.25±0.020	0.23±0.015	0.27±0.017
	30	0.22±0.004	0.17±0.018	0.10±0.005	0.17±0.013
	60	0.19±0.008	0.14±0.016	0.12±0.012	0.15±0.009
	120	0.20±0.012	0.15±0.014	0.10±0.007	0.12±0.006
Kość	5	0.55±0.026	0.39±0.011	0.39±0.023	0.37±0.038
	30	0.41±0.009	0.32±0.013	0.26±0.017	0.37±0.019
	60	0.33±0.007	0.30±0.020	0.28±0.023	0.34±0.009
	120	0.32±0.011	0.28±0.012	0.24±0.017	0.28±0.009

We krwi, za pomocą ANOVA wykazano znaczące główne efekty peptydów ^(F3^,70 =56,79, p<0,0001) i czasu (F3,70=252,01,p<0,0001); jednak oddziaływanie peptyd - czas nie było znaczące. Kolejność stężeń peptydów we krwi była następująca: HP1>HP2>HP3>hP4 (p<0,01). W tkaoce sercowej, za pomocą ANOVA wykazano znaczące główne efekty peptydu (F3,66,=44,36, p<0,0001) i czasu (1^64=98,06, p<0,0001) i znaczące oddziaływanie peptyd - czas Πχ6·ι-36,9, p<0,001). W płucach, za pomocą ANOVA wykazano znaczące główne efekty peptydu (F3,₃650=183,25. p<0,0001) i czasu (1^365=24,56). p<0,0001) i znaczące oddziaływanie peptyd - czas (F966⁼13,80, P<0,0001). Kolejność stężeń peptydów była następująca: Hp3>>HP1=HP4 = HP4 (p<0,01). W wątrobie, ANOVA wykazała znaczące główne efekty peptydu (F3 65=1000,00, p<0,0000)) i czasu (F365=12,80, p<0,0001); jednak oddziaływanie peptyd - czas oie było znaczące. Tak jak w płucach, kolejność stężeń peptydów była następująca: HP3>>HP1 = HP4 > HP2 (p<0,01). W śledzionie, za pomocą ANOVA wykazano znaczący główny efekt peptydu (1-(0(63=431.0, p<0,0001) i znaczące oddziaływanie peptyd - czas (©9(6=4.64, p<0,0001). W tym organie, główny efekt czasu oie był znaczący. Kolejność stężeń peptydów była następująca: HP3>> HP2 = HP4 = HP1 (p<0,01). W nerkach, za pomocą ANOVA wykazano znaczące główne efekty peptydu (F369 =291,58, p<0,0001) i czasu (F3,,6 =^(014, p<0,0001), i znaczące oddziaływanie peptyd - czas (^9^9= 10,94, p<0,0001). Kolejność stężeń peptydów była następująca:

HP4 = HP1> HP2>> HP3 p<0,01). W żołądku, za pomocą ANOVA wykazano znaczące główne efekty peptydu (F3,53=202,98, p<0,0001) i czasu (F_3>53=3,10, p<0,05) i znaczące oddziaływanie peptyd - czas (F9,53=5,56, p<0,001). Kolejność stężeń peptydów była następująca: HP3 > HP4 = HP2 (p<0,01). W przewodzie pokarmowym, za pomocą ANÓVA wykazano znaczące główne efekty peptydu (ł^;362=66,30, p<0,0001) i czasu (F362=36,32, p<0,0001) i znaczące oddziaływanie peptyd - czas (F962=5,56, p <0,005). Kolejność stężeń peptydów była następująca: HP3 = HP2> HP4 = HP1 (p <0,01). W jądrach, za pomocą ANOvA wykazano znaczące główne efekty peptydu (F_3667=26,97, p<0,0001) i czasu (F367= 1-4,94, p<0,0001) i znaczące oddziaływanie peptyd - czas (l^;967-477 p<0,001). Kolejność stężeń peptydów była następująca: HP4 = HP1 > HP3 = HP2 (P<0,01). W mięśniu szkieletowym za pomocą ANOVA wykazano znaczące główne efekty peptydu (Ft 59=48,70. [<0)00011) i czasu (F3 57-97,69, p<0,0001); jednak oddziaływanie peptyd - czas oie było znaczące.

Kolejność stężeń peptydów była następująca: HP1 > HP2 = HP4 > HP3 (p<0,01). W kości, za pomocą ANOVA wykazano znaczące główne efekty peptydu (Ιχ₍,8=3Ο. 15,

177 585 p<0.0001) i czasu (F3_-68=52,84, p<0,0001), i znaczące oddziaływanie peptyd - czas (F3,₆₈=5,15, p<0,0001). Kolejność stężeń peptydów była następująca: HP1> HP4 = HP2 = HP3 (p<0,01).

Lokalizacja peptydu chemotaktycznego w infekowanym mięśniu szczura.

Stężenia w tkankach (%ID/gram) analogów peptydu chemotaktycznego znaczonego

99^mTc w normalnym i infekowanym mięśniu uda przedstawiono w tabeli IV.

Tabela IV

Stężenia w tkankach peptydów chemotaktycznych znaczonych ^Tc w normalnym i infekowanym mięśniu szczura (% ID/gram tkanki ± SEM)

Tkanka	Czas (min.)	HP1	HP2	HP3	HP4
Normalna	30	0.16+0.009	0.11+0.003	0.05+0.009	0.13+0.007
	120	0.10+0.006	0.07+0.004	0.05+0.005	0.13+0.125
Zainfe-	30	0.39+0.013	0.28+0.013	0.11+0.007	0.42+0.049
kowana	120	0.21+0.008	0.16+0.007	0.10+0.004	0.32+0.019

Za pomocą ANOVA wykazano znaczące główne efekty peptydu ^25=56,51, p<0,0001) oraz czasu (F3_₂5=59,45, p<0,0001) oraz znaczące oddziaływanie peptyd - czas (F3,25=6,74, p<0,005). W normalnym mięśniu, stężenia HP1 (P<0,01) i Hp2 (p<0,05) obniżały się ’z czasem, podczas gdy stężenia HP3 i HP4 pozostały niezmienione. Po 30 minutach po iniekcji, stężenie HP1 w normalnym mięśniu było większe (p<0,01) niż innych peptydów, a stężenie HP2 było większe (p<0,01) niż HP3. Po 120 minutach, stężenie HP4 w normalnym mięśniu było większe (p<0,01) niż HP2 i HP3; a stężenie HP1 było większe (p<0,01) niż HP3.

W mięśniu infekowanym, stężenia HP1 (p<0,01), HP2 (p<0,01) oraz HP4 (p<0,05) obniżały się z czasem, stężenie HP3 (które wykazywało najniższy poziom nagromadzania się przy obydwu czasach) pozostało niezmienione. Po 30 minutach po iniekcji, stężenia HP1 i HP4 były większe (p<0,01) niż stężenia HP2 i HP3; a stężenie HP2 było większe (p<0,01) niż HP3. Po 120 minutach stężenie HP4 było większe (p<0,01) niż HP1, HP2 i Hp3, a stężenie HP1 większe (p<0,01) niż HP3.

Stosunki cel-tło (T/B), (% ID na gram infekowanego mięśnia / %ID na gram normalnego mięśnia), przedstawiono na fig. 6. Za pomocą ANOVA wykazano znaczący główny efekt peptydu (F3,22=5,87, p<0,005). Jednak, główny efekt czasu i oddziaływanie peptyd - czas nie były znaczące. Stosunek T/B dla HP4 był znacząco większy niż dla HP2 (p<0,05), HP1 (p<0,01) i HP3 (p<0,01). Zatem HP4 wykazuje nie tylko najwyższe stężenie bezwzględne w infekowanej tkance, lecz także najwyższe stosunki T/B przy obydwu czasach po iniekcji. Natomiast HP3 wykazywał zarówno najniższe bezwzględne stężenie w infekowanym mięśniu jak i najniższy stosunek T/B.

Obrazowanie ogniskowych miejsc infekcji u królików

U królika, wysokie poziomy ⁹9^|nTc-HP4 wykryto w płucach, wątrobie i śledzionie bezpośrednio po iniekcji. Aktywność w płucach obniżyła się z czasem i 1-3 godzin po iniekcji, zaobserwowano ogniskowe nagromadzenie się radioaktywności w zainfekowanym udzie. Do 4 godzin po iniekcji stosunek T/B wyniósł około 4:1. 16 godzin po iniekcji (fig. 7) średni stosunek T/B dla całej zmiany chorobowej wzrósł do 10:1 z obszarami ogniskowymi >20:1. Ponadto stwierdzono w późniejszych (>4 godzin) punktach czasowych pewne nagromadzenie w jelitach. Procentową resztkową radioaktywność obiegową, która była związana z komórką, 16 godzin po iniekcji oznaczono w przybliżeniu jako 25%. Natomiast, frakcjonowanie ropienia wykazało, że w przybliżeniu 90% radioaktywności było związane WBC.

177 585

Stężenia tkankowe (%ID/gram) 17 godzin po iniekcji, oznaczone przez bezpośrednie zliczanie tkanek, zestawiono w fig. 8. Najwyższe stężenia były jak następuje: śledzioaa> płuca > wątroba = nerki (przy p < 0,01). Stosunki T/B, (% ID na gram infekowanego mięśnia lub ropienia / %ID na gram kontralateralnego mięśnia normalnego), przedstawiono na fig. 9. Średnie stosunki T/B dla ropienia i infekowanego mięśnia wyniosły 25,78:1 (maksimum 48,54:1, minimum 8,84:1) oraz 14,17:1 (maksimum 25,64:1, minimum 4,78:1), odpowiednio.

Omówienie

Powyższe wykazuje, że analogi peptydu chdmotaktypzndgk derywatyzkwandgk HYNIC mogą być łatwo znaczone ^Tc z wysoką aktywnością przy użyciu glukoaedtonianu jako źródła rdzenia Tc(V) okso. Ponadto, peptydy znaczone ^WinTc są skutecznymi środkami dla zewnętrznego obrazowania ogniskowych miejsc infekcji w doświadczalnych modelach głębokiej infekcji uda.

Z czterech zsyntetyzowanych peptydów HYNIC, trzy (HP2, HP3 i HP4) wykazywały EC50 dla wiązania receptora podobne do hdksapddtydu, For-NIeLFNIeYK, podczas gdy HP1 mieściło się w ramach czynnika 2 od For-MLF. Wszystkie peptydy skoniugowane HYNIC wykazywały zwiększone powinowactwo do receptora chemoatraktanta w porównaniu do ForMLF. Kolejność mocy wiązania receptora była następująca: HP3> HP2> HP4> ForNIeLFNlIYK> For-MLF>HP1> For-NIeLF. Podstawienie Nle za Met w For-MLF dało w wyniku W^-krotny spadek powinowactwa do wiązania receptora. Jednak, dalsza derywatyzacja przy użyciu -Lys-HYNIC na końcu C dała w wyniku zwiększone wiązanie receptora.

Wartości EC50 wytwarzania ponadtlenku dla HP2, HP3 i HP4 były zwiększone względem hdksadeptydu i For-MLF 2-8 krotnie. For-NIeLF wykazał trzykrotnie niższą moc niż ForMLF. W przeciwieństwie do efektu zwiększonego wiązania receptora HP1 w porównaniu do For-NIeLF, wartości EC wytwarzania ponadt^ku zwiększyły się o czynnik 5 w porównaniu do For-MLF i For-NIeLENIeYK.

Przy interpretacji w świetle proponowanego modelu oddziaływania receptor - peptyd, dane te sugerują, że derywatyzacja HYNIC przy czwartej reszcie aminokwasowej może dać w wyniku zaburzenia konformacji wpływające zarówno na wiązanie receptora jak i wytwarzanie donaetleoku. Najbardziej uderzająca obserwacja, to efekt podstawienia Nle za Met w położeniu 2, co dało w wyniku ponad 15-krotny wzrost względem For-MLF oraz 300-krotny wzrost względem heksapeptydu w wartościach EC50 wiązania receptora oraz ponad O-krotny wzrost w EC50 aktywacji. Tn wynik jest szczególnie znaczący, ponieważ w przypadku uprzednio opisywanych analogów peptydu ρhemotaktyczndgo, podstawienie to dawało minimalny efekt. Dwukrotny wzrost wartości EC50 wiązania receptora oraz f-krotny wzrost wartości EC50 aktywacji wytworzony przez podstawienie D-Lys za L-Lys w położeniu 4 także potwierdza tę hipotezę. Podstawienie 1,6-eiaminohdksanu za L-Lys w tym położeniu dało w wyniku jedynie nieznaczny spadek EC50 wiązania i 3-4-krotny wzrost EC50 aktywacji. Znakowanie peptydów skacowanych z HYNIC przy użyciu 'Tc dało w wyniku widoczny wzrost powinowactwa. Wyniki badań próby wiązania ⁹n^mTρ-HYNIC-dddtyd wykazują, że stężenie nieznaρzondgo peptydu wymagane do przemieszczenia 50% wiązania neutrofilu peptydu myc jest w przybliżeniu 210 razy wyższe niż w przypadku, gdy ForML[3H]F jest stosowany jako wskaźnik. Ten wzrost w „ zachłanności” wiązania można by wyjaśnić, gdyby radioznaczond indywiduum zawierało mniej niż jedną jednostkę peptydu na Tp-glukohdptonian i gdyby wiązanie było współdziałające. Podobny wzrost dotyczący wiązania podawano dla tetramerycznych analogów peptydu cadmktaktyczadgo (Kraus, J. L. i wsp., Biochem, Bikdays. Res. Comm. 124:945-949 (1984)). Wyniki te wykazują także odporność końca C względem derywatyzacji.

Obserwacje te sugerują, że peptydy HYNIC oprócz tego, że są znakomitymi radiofarmaceutykami dla obrazowania infekcji, mogą także służyć jako związki modelowe dla dalszego wyjaśniania oddziaływań cząsteczkowych, które towarzyszą wiązaniu For-MLF do jego receptora.

Przy maksymalizacji aktywności właściwej analogów peptydu caemotaktyczodgo derywatyzowanego HYNIC, skoncentrowano się w pierwszym rzędzie na manipulowaniu źródłem radionuklidu - eluatem generatora radionuklidu ⁹⁹Mo/9⁹mτp. Potencjalnym problemem z otrzymaniem wysokiej aktywności właściwej 99mTcO4' jest uzyskanie Tc o długim czasie

177 585 życia (stan podstawowy, t'/2y 105 lat). Ponieważ⁹⁹Tc jest bezpośrednio wytwarzane w wyniku 87% rozpadu ⁹⁹Mo oraz 100% rozpadu ^99l”Tc, istnieje zawsze pewna ilość nośnika dostępnego, by współzawodniczyć w reakcji znakowania. Analogi peptydu chemotaktycznego znaczonego 99m-p_c o aktywnościach właściwych > 10 000 mCi/mMol można łatwo wytworzyć, lecz jest wymagane rozdzielanie Sep-Pak znaczonego peptydu od innych indywiduów 99mTc. Jeżeli oprócz optymalizowania źródła 99mTc, optymalizuje się również warunki chromatograficznego oczyszczania radioznaczonego peptydu, można osiągnąć nawet wyższe aktywności właściwe. W przypadku układu HPLC, piki odpowiadające peptydowi znaczonemu “Tc, peptydowi nieznaczonemu oraz ⁹9mTc-glukoheptonianowi można dobrze rozdzielić i wyizolować radioznaczony peptyd wolny od nośnika. W tym przypadku, aktywność właściwa radioznaczonego peptydu jest ograniczona jedynie przez aktywność właściwą generatora 99mTc. Zatem, opierając się na teoretycznej aktywności właściwej 99ttc, maksimum aktywności właściwej analogów peptydu chemotaktycznego znaczonego 99mTc derywatyzowanego HYNIC wynosi w przybliżeniu 500 000 mCi/mmol. Chociaż osiągnięcie tego poziomu aktywności właściwej w rutynowej praktyce jest nieprawdopodobne, powinno być możliwe wytworzenie radioznaczonych peptydów o aktywnościach właściwych podobnych do mTc-glukoheptonianu, który jest stosowany do znakowania. Ponieważ 99mTc-glukoheptonian o aktywności właściwej >100 000 mCi/mmol można wytworzyć rutynowo, powinny być możliwe peptydy o tym poziomie aktywności właściwej, jeśli stosuje się oczyszczanie za pomocą HPLC.

Ponieważ ligand glukoheptonianowy HYNIC może zajmować jedynie dwa miejsca w sferze koordynacyjnej technetu, produkt znaczony najprawdopodobniej zawiera dodatkowe grupy. Sądzi się, ż glukoheptonian pełni tę rolę działając jako „koligand”. Dzięki niskiemu ciężarowi cząsteczkowemu peptydu chemotaktycznego, koligand użyty do znakowania technetem mógłby wywrzeć znaczący wpływ na biodystrybucję tych cząsteczek. Aby oszacować tę możliwość, zmierzono biodystrybucję HP2 i HP3 znaczonego ^99l”Tc radioznaczonego przy użyciu czterech różnych koligandów - glukaranu, glukoheptonianu, mannitolu i glukozammy. Procedura radioznakowania różnymi ligandami była identyczna z metodą użytą w przypadku glukoheptonianu. We wszystkich przypadkach, analiza HPLC radioznaczonego peptydu wykazała pojedyńczy plik.

Figura 10 przedstawia % dawki wstrzykniętej/gram tych czterech preparatów HP3 we krwi, płucach, wątrobie, śledzionie, nerkach i przewodzie pokarmowym w czterech punktach czasowych po iniekcji. Chociaż wykryto małe różnice w biodystrybucji większości tkanek, najbardziej znaczne różnice (p < 0,01) zaobserwowano w płucach (glukaran, glukoheptonian > mannitol >> glukozamina); wątrobie (glukaran, glukoheptonian, mannitol >> glukozamina); nerkach (mannitol > glukaran, glukoheptonian, glukozamina); śledzionie (glukaran » glukoheptonian, mannitol >>gluoozamina); przewodzie pokarmowym (glukaran, glukozamina >>glukoheptornaa»mannitol). Podobne wyniki otrzymano dla HP2.

Podejmowano szereg prób stosowania radioznaczonych peptydów chemotaktycznych do obrazowania infekcji (Fischman, A. J., J. Nucl. Med. 32:483-491 (1991); McAfee, J. G. i wsp., Semin. Nucl. Med. 14:83-106 (1984); Thakur, M. L. i wsp., Semin. Nucl. Med. 14:107-117 (1984); Zogbhi, S. S. i wsp., J. Nucl. Med. 22:P32 (1981)). Jednak, metody radioznakowania dostępne w czasie tych badań dały środki o stosunkowo niskiej aktywności właściwej, wymagając dla obrazowania farmakologicznych ilości peptydu. Stwierdzono, że te dawki peptydu wytworzyły znaczną przejściową neutropenię u królików (O’Flaherty, J. T. i wsp. J. Immunol. 2 28:2586-2589 (1977)). Wraz z technikami radioznakowania środkiem według wynalazku, te potencjalne niekorzystne efekty mogą być całkowicie wyeliminowane. U królików, indywiduum wysoce wrażliwe na efekty neutropeniczne peptydu chemotaktycznego, oczyszczone przez HPLC mTcHP4 zlokalizowało się w miejscach ogniskowych infekcji E. coli w ciągu pierwszych godzin po iniekcji i osiągnęło maksymalny stosunek T/B po 15 godzinach.

Metoda HYNIC radioznakowania dostarcza jedynego i skutecznego sposobu wytworzenia znaczonych 99mTc peptydów i protein o skrajnie wysokich aktywnościach właściwych.

Przy wysokich osiągniętych aktywnościach właściwych, powinno być możliwe wykonanie doświadczeń z obrazowaniem przy stężeniach peptydu, które są znacząco poniżej ECd

177 585 dla reakcji aeutrożenicznee. Np., w przypadku peptydu oczyszczonego SEP-PAK (ok. 10 000 mCi/mmoly), wstrzyknięta dawka 20 mCi zawiera w przybliżeniu 2 nMole peptydu. W przypadku obiektu 70 kg, odpowiada to dawce wstrzykniętej <30 żMnli/kg. Opierając się na badaniach małp Rhesus, ta ilość peptydu jest znacznie poniżej dawki wywołującej znaczącą neutropenię. W przypadku materiału oczyszczonego HPLC, margines bezpieczeństwa winien wzrosnąć w przybliżeniu 10-krotnie.

Przykład 101

Przykład ten wykazuje, że analogi radio znaczonego agonisty - peptydu phemntaktypznego są skutecznymi środkami obrazowania miejsc zapalnych u małp. Przez radiozankowanie o wysokiyj oktyjenożci anlapciwni. mojno unilorąć neutropenicz.nego np/gown łych reagentów.

Aktywność biologiczną in vivo, żioCystηybucję oraz właściwości obrazowania zapalenia cechujące analogi peptydu phemotaktypraego oceniono u naczelnych nie ludziach. U normalnych małp Rhesus, opynioao zależność reakcji aeutηożenicznej od dawki. Znaczony 99,Tc analog peptydu phemotaktypznego dyrywatzzowanz hzdrazynonikotznamidym (HYNIC) użyto do badania biodystrybucji i obrazowania zapalenia u małp.

Badania u normalnych zwierząt wykazały, ży peptyd indukuje wyraźną zależną od dawki ayutropyntę u zwierząt. Obniżenie liczby leukocytów występuje prawie bezpośrednio po iniekcji i szybko powraca do linii podstawowej. Nie wykryto znaczących efektów różnicowego zliczania WBC, ciśnienia krwi, szybkości pulsu lub szybkości oddychania. Przy najniższej dawce badanego pyptydu (10 ng/kg), obniżenie neutrofilów było minimalne. Peptyd derywatyzowany HYNIC wytworzono ze znakomitą wydajnością i czystością i miał on aktywność biologiczną podobną do rodzimego peptydu oraz był łatwo znaczony przy aktywności właściwej 20 000 mCi/mmol. Gdy około 0,5 mCi <2,0 ng/kg) radioznaczonego peżtzdu wstrzyknięto małpom o ogniskowych miejscach sterylnego zapalenia, zaobserwowano schemat biodystrybucji podobny do radioznaczonych WBC i aputηopenii nie wykryto. Trzy godziny po iniekcji, miejscy zapalenia było łatwo widoczne przy T/B około 3:1.

Materiały

N-Foηmzlo-mytionylo-leuczlo-Cenzlalantaę (ForMLF), N-Coηmylo-nnηlyuczlo-leucyloCenzloalanylo-nnrlyuczlo-tyrozylo-lizynę (ForNIeLFNIpYK), octan miηystzaianu forbolu (PMA) oraz cyto^ala^^ B otrzymano od Sigma (St. Louis, MO). ForML[³H]F (60 Ci/mmol) oraz 99^ (generator 9⁹Mo/99^|nTc) otrzymano z New England Nuclear (Boston, MA). Roztwór soli bilansowany Hank (HBSS) otrzymano z GIBCO (Grand Island, NY).

Synteza i charakterystyka peptydu

N-Foηmzln-Mytionzlo-Lyucylo-Fenzloalnnylo-Lysinę i N-Formylo-NorleucyloLeucylo-Feaylnlnazln-Norlpucylo-Tyrorylo-Ltzylo-DTPA zsyntetzzowaao i oczyszczono standardowymi technikami w fazie stałej (Merrifiyld, R. B. J. Am. Chem. Soc. 15:2149-2154 (1963); Stewart, J. M. i wsp., Solid Phase Pyptidy Synthesis, W. H. Freeman & Company, San Francisco, CA (1969)) jak opisano uprzednio (Fischman, A. J. i wsp., J. Nucl. Med. 32:483491 (1991)). Analog peptydu chemotnktzpraego deηzwatzzowany hzdrazyaonikotynamidym, N-Cormylo-met-lyu-żhy-lzs-HYNIC wytworzono jak opisano poniżej.

Kwas sukcznnmiCylo-6-t-Bop-hzCrazynożiηzdzno-3-knηbokszlowy (154 mg, mMole) w 1,0 ml dimetyloformamidu (DMF) zawierający 60 ml diizożropzloetzlnminz dodano do zawiesiny N-For-Myt-Lau-Phe-Lys (186 mg, mMoly) w 2 ml DMF. Peptyd rozpuścił się szybko i po dwóch godzinach dodano yter-yter naftowy. Górną warstwę odrzucono i dodanie wody do reszty spowodowało utworzenie się ciała stałego. Substancje stałą przemyto 5% wodorowęglanem sodu, wodą i octanem etylu. Wydajność niyoczyszczonpgo produktu wyniosła 183 mg. Grupę zabezpieczającą usunięto przez mieszanie nieoczzszpzonpgo produktu przez 15 minut w temperaturze 20°C z 5 ml kwasu tnifluorooctowego (TFA) zawierającego 0,1 ml p-kryzolu. TFA usunięto na wyparce rotacyjnej i dodano eter dla wytrącenia odbezpieczonego pyptydu. Produkt oczyszczono za pomocą HPLC z odwróconymi fazami na kolumnie 2,5 x 50 cm Whatman ODS-3 wymywanej gradientem apetonttηzlu do 0,1% TFA. Frakcje zawierające główny składnik połączono i rozpuszczalnik usunięto uzyskując żądany produkt.

Czystość chemiczną końcowego produktu oceniono za pomocą TLC, HPLC, spektroskopii UV, spektroskopii masowej i analizy aminokwasów. Oznaczenia HC©; wiązania do

177 585 receptora chemoatraktanta na ludzkich PMN i wytwarzania ponadtlenku wykonano jak opisano w: Pike, M. C., Snyderman, R., Methods Enzymol. 162:236-245 (1988); Pike, M. C. i wsp., Blood 67:909-913 (1986); i Fischman, A. J. i wsp., J. Nucl. Med. 32:483-491 (1991).

Radioznakowanid Tc

By uniknąć efektów ndutzopemioznycb związanych z podawaniem farmakologicznych dawek analogów peptydu chemotaktycznego, pochodną HYNIC radioznakowano Tc w warunkach maksymalizujących aktywność właściwą. Przez osiągnięcie dawki Tc obrazowania o wysokiej aktywności właściwej, wstrzyknięta masa eeerydu była znacznie poniżej EC₅0 (około 20 nM).

Generator Mo^Tc wymyto pięć godzin po uprzednim wymyciu uzyskując całkowitą aktywność około 500 mCi. Masę Tc i względną proporcję Tc do Tc obliczono metodą Lamsona i wsp., J. Nucl. Med., 7:639-641 (1975). W przypadku typowego wymycia, całkowita ilość Tc wyniosła w przybliżeniu 3 nMole, stosunek Tc do ⁱⁿTc - 1,5:1, a aktywność właściwa Tc > 100 000 mCi/mmol. ⁹⁹'ⁿTc-g1ukoheptoniam (Tc-GH) wytworzono z glukoheptonianu cynawego (Glucoscan, DuPont) dostarczając indywiduum Tc(V) okso do radioznakowania peptydu skoniugowaneao z hydrazynonikotynamidem (Pike, M. C. i wsp., Blood, 67:909-913 (1986)). W przybliżeniu 2,5 ml ⁹⁹aTc-peztdchmeranu w roztworze soli dodano do zestawu liofilizacyjnego i końcowe stężenie radioaktywności w czasie wytwarzania wyniosło 150 mCi/ml. Czystość radiochemiczną produktu oznaczono jako >95% za pomocą błyskawicznej chromatografii cienkowarstwowej na żelu krzemionkowym (ITLC-sg) przy użyciu acetonu i roztworu soli jako rozpuszczalników fazy ruchomej.

W przybliżeniu 180 mg peptydu chdmotakryozndgo, Foz-Mer-Leu-ehe-NH-(CH2)₆-NHHYNIC (M.cz.:720), rozpuszczono w 50 ml DMSO i rozcieńczono do końcowego stężenia 10 mg/ml przy użyciu 0,1 N buforu octanowego, pH 5,2. Pół milimetra roztworu ederydu umieszczono w czystej fiolce szklanej i dodano 0,5 ml ⁹⁹aTo-a1ukoheptonianu. Mieszaninę krótko wirowano i pozostawiono do stania w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Stopień znakowania peptydu monitorowano za pomocą ITLC-sg przy użyciu trzech oddzielnych układów rozpuszczalników: acetonu, roztworu soli i układu aceton:woda (9:1). edetyd znaczony 'Tc oczyszczono za pomocą HPLC z odwróconymi fazami na kolumnie Cu (5 m, 4,5 x 46 mm, Beckman, Columbia, MD) wymywanej gradientem binarnym. Warunki wymywania: Rozpuszczalnik A - 5% acetonitrylu w 50 mM octanu, pH 5,2; Rozpuszczalnik B - 50% acdtomirzy1u w 50 mM octanu, pH 5,2; Gradient: 0% do 100% B przez 20 minut; Szybkość przepływu 2 ml/minutę. Aktywność właściwą zadioznaczoneao peptydu obliczono przy użyciu zależności: (% odzyskania x mCi obecne)/(mMole peptydu x 100).

Modele zwierzęce

Cztery małpy Rhesus (samce), o ciężarze 10 kg każda oceniono przy użyciu czterech dawek ForNIeLFNIeYK-DTPA (10,000; 1,000; 100; i 10 ng/kg) rozpuszczonych w 0,2 ml nieeiroaenmego roztworu soli. Na każde ze zwierząt podziałano wszystkimi czterema dawkami peptydu z jednym tygodniem przerwy między każdym poziomem dawki. Zwierzęta znieczulono ketaminą/ksylazyną i zbierano przez 80 minut seryjne 0,5 ml próbki krwi z żyły. Każde doświadczenie składało się z czterech iniekcji - zaróbka, peptyd, peptyd, zaróbka. Próbki krwi linii podstawowej nakreślono przy 15 i 5 minutach przed pierwszą iniekcją i 0,25, 0,5, 1, 3, 5, 10 oraz 20 minut po każdej iniekcji. Bezpośrednio po zebraniu próbki krwi po 20 minutach, wykonano następną iniekcje. Przez całe doświadczenie monitorowano ciśnienie krwi, szybkość pulsu i szybkość oddychania.

Dla każdej próbki krwi wykonano: zliczenie białych ciałek krwi (CBC), różnicowe zliczenie białych ciałek krwi, zliczenie czerwonych ciałek krwi i pomiar objętości upakowanych komórek. Ponadto, zwierzęta monitorowano na aktywność i wygląd, spożycie pożywienia i ciężar ciała. Schematyczne podsumowanie protokołu eksperymentalnego przedstawiono na fig. 1‘.

Dwie dorosłe małpy Rhesus (samice) o ciężarze w przybliżeniu 10 kg użyto do doświadczeń obrazowania. Ponieważ te zwierzęta użyto uprzednio w doświadczeniach obrazowania z innymi zadiofarmaodurykami, otrzymały one liczne domięśniowe iniekcje w prawe

177 585 tylne udo podczas indukowania znieczulenia. Te iniekcje dały w wyniku znaczący stopień sterylnego zapalenia.

Obrazowanie

Przy lekkim znieczuleniu ketaminą (5,5 mg/kg), zwierzętom wstrzyknięto dożylnie przez żyłę w nodze w przybliżeniu 0,5 mCi peptydu znaczonego Tc (<2,0 ng/kg). 5 minut, 30 minut, 1 godzina i 19 godzin po iniekcji zadioznaozondgo peptydu, zwierzęta znieczulono keramiImąksyllaamą(15,0 i 1,5 mg/kg) i uzyskano scyntygramy całego ciała przy użyciu szerokiego pola kamery gamma wyposażonej w miokoenezgdryoeny kp1imarpr wysokiej rozdzielczości z równoległym otworem podłączony do dedykowanego systemu komputerowego (Tdohmioard Gemini 700, Techn^am 560, Solon, OH). Wszystkie obrazy uzyskano przy szybkości skanu 10 cm/minutę przy 15% oknie centrowanym na fotopik Tc przy 140 KeV. 5 minut przed iniekcją i 1, 3, 5 oraz 15 minut po iniekcji pobierano 0,5 ml próbki krwi i zmierzono CBC. Obszarami zainteresowania były: całe zwierzę, pula krwi sercowej, płuca, wątroba, śledziona, nerki, jelito, kość, mięsień normalny, mięsień w stanie zapalnym; obliczono gęstości zliczeń (CPM/pixel). Wyniki wyrażono jako pula tkanki-do-krwi, % dawki wstrzykniętej/gram (%ID/g) i stosunki celTło (udo w stanie zapalnym/udo konrra1atdra1nd).

Metody statystyczne

Wyniki badań obrazowania oceniono statystycznie przez analizę wariancji (ANOVA), a następnie przez nowy test wielokrotnego zakresu Duncana (Ducan, D. B., Biomdrrios,

11:142 (1955)).

Wyniki

Peptyd derywatyzowany HYNIC wytworzono z doskonałą wydajnością i czystością chemiczną. Końcowy produkt wykazał pojedyńcze pasma w TLC i HPLC. Analiza UV wykazała maksimum absorpcji przy 268 i 315 nm. Spektroskopia masowa dała m/z przy 671. Analiza aminokwasowa była zgodna ze spodziewanym produktem (Met-1,00, Ldu-Ι,O0; ebd-0,97, Lys-1,00). Aktywność właściwa edetydu zadioenaozondgo wyniosła >20000 mCi/mmol po oczyszczeniu HPLC. Próby in vitro na wiązanie do receptora chemoatraktanta na ludzkim PMN i wytwarzanie ponadtlenku dały wartości EC₅₀ 2,0 i 20 nM, odpowiednio.

Figura 12 wykazuje, że FozNIeLFNeYK-DTeA indukuje wyraźną, zależną od dawki reakcję neurzopdmozną u małp. Przy dwóch najwyższych dawkach peptydu (10000 i 1000 ng/kg), zliczanie leukocytów obniżyło się do w przybliżeniu 40% wartości kontrolnej niemal bezpośrednio po iniekcji i ppwzóoiło do 60 do 80% wartości kontrolnej w czasie drugiej próby z edptydem. Po drugiej iniekcji peptydu, zliczanie leukocytów obniżyło się do 40 do 50% wartości kontrolnej. W przypadku najwyższej dawki, zliczanie leukocytów powróciło do 80%) wartości kontrolnej w czasie drugiej iniekcji zarobki i osiągnęło 90% wartości kontrolnej przy końcu badania - 80 minut po pierwszej iniekcji zarobki.

W przypadku dawki 1000 ng/kg, zliczanie leukocytów powróciło do 90% wartości kontrolnej w czasie drugiej iniekcji zarobki i powróciło do linii podstawowej przy końcu badania. Po dawce 100 ng/kg, zliczanie leukocytów obniżyło się do w przybliżeniu 70% wartości kontrolnej niemal bezpośrednio po iniekcji i powróciło do linii podstawowej do czasu drugiej próby z peptydem ederydu. W czasie drugiej iniekcji zarobki, poziom leukocytów powrócił do linii podstawowej. W przypadku najniższej dawki peptydu (10 ng/kg), obniżenie leukocytów było małe i powróciło do linii podstawowej w ciągu trzech minut po każdej iniekcji eeetydu.

Żadne ze zwierząt nie wykazywało widocznych objawów chorobowych po iniekcji którejkolwiek dawki eeetydu. Nie wykryto znaczących efektów przy różnicowym zliczaniu WBC, ciśnieniu krwi, szybkości pulsu lub szybkości oddychania.

Figura 13 przedstawia reprezentatywne obrazy (przed i po) małpy 3 i 15 godzin po iniekcji w przybliżeniu 1,0 mCi peptydu znaczonego ^mTc. Na wczesnym obrazie było wysokie stężenie radioaktywności w płucach, wątrobie, śledzione i kości spójne z wiązaniem do białych ciałek krwi. Wysokie poziomy radioaktywności skoncentrowały się w nerkach i pęcherzu. Niższe stężenia wykryto w mięśniu i przewodzie pokarmowym. Ponadto, miejsce zapalenia było dobrze wizualizowane w tym czasie (T/B około 3:1). Przy tej dawce eeetydu, nie było znaczącego wpływu na poziom WBC.

177 585

Przy późniejszym czasie obrazowania, aktywność płuc obniżyła się, lecz dystrybucja radioaktywności w innych organach pozostała stosunkowo stała. 15 godzin po iniekcji, nagromadzenie radioaktywności w miejscu zapalenia obniżyło się znacząco. Przy obydwu czasach obrazowania, podobny schemat biodystrybucji zaobserwowano u innego zwierzęcia.

Omówienie wyników

Ten przykład potwierdza, że, tak jak i u królika (O’Flaherty, J. T. i wsp., J. Immunol.

28:2586-2589 (1977)), agoniści - peptydy chemotaktyczne indukują znaczącą przejściową neutropenię u małp. Przy dawkach peptydu mniejszych niż 10 ng/kg jednak, ten efekt nie jest znaczący. Pewien minimalny margines aktywowanych neutrofilów może początkowo występować, jak odnotowano przez zmniejszenie aktywności płuc z czasem. Gdy znaczony peptyd chemotaktyczny derywatyzowany HYNIC wstrzyknięto u małp z łagodnymi sterylnymi stanami zapalnymi, schemat biodystrybucji był ściśle równoległy ze schematem radioznaczonych białych ciałek krwi i ogniska zapalne były łatwo wykrywalne w ciągu trzech godzin po iniekcji przy stosunkach cel: tło około 3:1. Przez radioznakowanie przy bardzo wysokiej aktywności właściwej (>20000 mCi/mmol), całkowitą masę peptydu w dawce do obrazowania radiofarmaceutyku można by zmniejszyć do poziomu, który jest poniżej progu neutropenii; przy 20000 mCi/mmol, iniekcja 0.5 mCi do zwierzęcia 10 kg odpowiada dawce peptydu <2 ng/kg. Zakładając, że objętość krwi stanowi 8% ciężaru ciała a hematokryt - 50%, ta dawka peptydu odpowiada początkowemu stężeniu obiegowemu 60 pM, co stanowi ponad dwa rzędy wielkości poniżej ECO dla aktywacji receptora. Jak było spodziewane, ta dawka nie miała wpływu na poziomy obwodowe leukocytów.

Przykład ten potwierdza, że radioznaczone analogi peptydu chemotaktycznego są skutecznymi środkami obrazowania zapalenia u zwierząt, które są wrażliwe na ich efekty neutropeniczne. Podobne wyniki otrzymano, gdy badano charakterystykę tych peptydów pod kątem obrazowania infekcji u królików (Babich, J. W. i wsp., (zgłoszone do publikacji)).

Chociaż miejsca sterylnego zapalenia były bardzo łatwe do zauważenia 3 godziny po iniekcji, stosunek cel-tło obniżył się znacznie do 12 godzin po iniekcji. Jest to wyraźna różnica w porównaniu z wynikami u królików z ogniskowymi miejscami infekcji E. coli, gdzie stosunek T/B wynosił w przybliżeniu 3:1 w 3 godziny po iniekcji i zwiększał się aż do 20:1 po 12 godzinach. Możliwe wyjaśnienia tej różnicy obejmują różnicę w intensywności zmiany chorobowej i różnicę między infekcją bakteryjną a sterylnym zapaleniem. Jeśli przyszłe badania potwierdzą tę różnicę w kinetyce zmiany chorobowej, przydatność reagentów można by znacząco zwiększyć, ponieważ różnicowanie między infekcją a sterylnym zapaleniem może być możliwe.

Przykład 102

W tym przykładzie porównano i przeciwstawiono właściwości znaczonych ⁹⁹’Tc agonistów - peptydów chemotaktycznych co do lokalizowania infekcji z konwencjonalnymi leukocytami znaczonymi Tn w modelu zwierzęcym ostrej infekcji bakteryjnej. Króliki wybrano wskutek ich znanej wrażliwości na efekty neutropeniczne peptydów chemotaktycznych.

Biodystrybucję i właściwości obrazowania infekcji znaczonego ⁹⁹ⁱⁿTc FormyloMetionylo-Leucylo-Fenyloalanylo-Lizylo-hydrazynonikotynamidu ('Tc HP) porównano do leukocytów znaczonych Tn (Tn-WBC) u królików z infekcjami E. coli. Grupom 6 zwierząt wstrzyknięto 1 mCi 'Tc-HP plus 0,05 mCi ''Tn-WBC i uzyskano seryjne scyntygramy od 3 do 6 godzin i 18 godzin po iniekcji. Po uzyskaniu końcowych obrazów, zwierzęta uśmiercono i oznaczono biodystrybucję.

Przy wszystkich czasach obrazowania, dystrybucje Tc-HP i ''Tn-WBC były podobne, a miejsca infekcji były dobrze wizualizowane w przypadku obydwu radiofarmaceutyków. Stosunki cel (infekowany mięsień): tło (kontralateralny normalny mięsień) (T/B) wyniosły: 3,38±0,46, 3,80±0,37 i 10,875±1,44 dla [Tc-HP oraz 1,71+0,04, 1,81±0,26 i 3,79±0,83 dla 1 Tn-WBC, 3,6 i 18 godzin po iniekcji, odpowiednio. Średni stosunek T/B ('Tc-HP do 1'TnWBC) wyniósł 2,99±1,88 bez żadnej wartości mniejszej niż jeden. Wartości T/B obliczone z bezpośredniego próbkowania tkanki były znacząco wyższe dla Tc-HP niż dla 1 Tn-WBC (33,6:1 wobec 8,1:1, p<0,01). Te różnice w pierwszym rzędzie wynikają raczej ze zwiększonego bezwzględnego nagromadzania się 'Tc-HP (0,102 % I. D./g wobec 0,024 % I. D. Ig,

177 585 p<:0,01) w zainfekowanym mięśniu, niż z różnicy nagromadzania się w normalnym mięśniu szkieletowym.

Wyniki te wskazują, że 99»Tc-HP daje stosunki cel-tlo większe lub równe wartościom uzyskiwalnym dla 'Io-WBC najprawdopodobniej jako wynik zwiększenia bezwzględnego nagromadzenia w miejscu infekcji.

Materiały i metody

Wszystkie sole nieorganiczne otrzymano z Fisher Scientific Co. Paski pbromatograficzne do ITLC z żelem krzemionkowym otrzymano z Gelmao Laboratories (Ann Arbor, MI). c^lIn-oksynę otrzymano z Amersham Inc. (Arlington Heights, iL). Zestawy glukohddtooianu cynawego (Glucoscao) oraz generatory 9⁹Mo/99mTc otrzymano z działu radiofarmaceutyków firmy DuPont (Billdripα, MA). Wszystkie inne reagenty nabyto o najwyższej dostępnej czystości ze źródeł handlowych.

Synteza peptydów

N-For-Metionylk-Leucylo-FdnLyloalanylk-Lizynę zsyntdtyzkwaoo i oczyszczono standardową techniką fazie stałej. Sk^Cowanie tego peptydu z olkotynylohyerazyoą, N-ForMet-Ldu-Phd-(N-epsllon-HYNIC) Lys (HP), wykonano jak opisano w: Babich, J. W. i wsp., J. Nucl. Med. 33:910 (1992). Produkt oczyszczono za pomocą HPLC z odwróconymi fazami na kolumnie Whatman ODS-3 2,5 x 50 cm wymywanej gradientem acetonitrylu w 0,1% TFA. Frakcje zawierające główny składnik połączono i rozpuszczalnik usunięto uzyskując żądany produkt. Peptyd scharakteryzowano za pomocą UV i spektroskopii masowej jak również analizy aminokwasów.

Znakowanie 99»^ peptydów chemktaktypzoypa derywatyzowaoych HYNIC

99mTc-glukoheptoniao użyto, by dostarczyć niezbędne indywiduum Tc(V) okso dla radioznakowania peptydu skoniugowanego z hydrazyni^^i^otynamidem (Abrams. M. J. i wsp., J. Nucl. Med. 31:2022-2028 (1990)). Do zestawu liofilizacyjnego dodano w przybliżeniu

2,5 ml ⁹9'ⁿTc- [ΧΊΐη'ηΙη^ίίΐηυ w 0,9% NaCl. Końcowe stężenie radioaktywne wyniosło 100 mCi/ml, a czystość radiochemiczną produktu oznaczono przez błyskawiczną chromatografię cienkowarstwową z żelem krzemionkowym (ITLC-sg) przy użyciu acetonu i 0,9% NaCl jako rozpuszczalników fazy ruchomej.

Do radlozoakowania analogu peptydu phemotaktyczoego 99^|nTc zastosowano następującą procedurę. Pięć ml 1 mg/ml roztworu peptydu przeniesiono do czystej fiolki szklanej. 500 ml 0,1 M buforu octanowego, pH 5,2, dodano do roztworu peptydu, a następnie 500 ml 99mTp-glucohedtoniaou. Mieszaninę krótko wirowano i pozostawiono do stania w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Czystość radiochemiczną oznaczono za pomocą HPLC przy użyciu kolumny z odwróconą fazą Cu (300 aogstr., 5m, 4,5 mm x 25 cm, Vydac) i przy następujących warunkach wymywania: Rozpuszczalnik A: 0,1 % kwas triflukrokptkwy w wodzie; rozpuszczalnik B: 0,1% kwas trifluorooctowy w acetonitrylu; Gradient: 0%) B to 100% B przez 10 minut; Szybkość przepływu 2 ml/minutę. Absorpcję UV monitorowano przez przepływ przez spektrofotometr (Milton-Roy/LDC, Boca Raton, fL), radioaktywność monitorowano przy użyciu detektora radioizotopu (Beckmao 170, Beckmao, Columbia, MD). Wyjście z obydwu detektorów zarejestrowano i zanalizowano przy użyciu integratora z podwójnym kanałem (Waters Model 746 data module, Waters. Marlboro, MA).

Roztwory iniekcyjne ^Tc-HP wytworzono przez wyizolowanie 99mTc-HP z niezoaczonego HP przy użyciu opisanego powyżej układu HPLC. Roztwór peptydu delikatnie ogrzewano i osuszono w strumieniu N^ Pozostałość rozpuszczono w izotonicznym roztworze soli dla iniekcji. Próbkę roztworu do iniekcji analizowano za pomocą HPLC.

Leukocyty znaczone CIn ml aedaryoizowanej całej krwi, zebranej od dawcy-królika, który został infekowany jak opisano poniżej, rozcieńczono 1:1 przy użyciu hetaskrobii (Hespan(R), DuPont, Wilmington, DE). Leukocyty znaczone In wytworzono według procedury opisanej w: McAfee, J. G. i wsp., J. Nucl. Med. 21:1059-1068 (1980) i McAfee, J. G., et al., Semin. Nucl. Med. 14:83-106 (1984) z następującymi modyfikacjami. Osocze bogate w leukocyty (LRP) wyizolowano przez sedymentację krwi królika przez 45 mm. LRP odwirowywano przy 450 x g przez 5 min i grudkę WBC powtórnie przeprowadzono w stan zawiesiny w 10 ml roztworu

177 585 soli i pozostawiono do stania przez 60 minut. Roztwór sklarowany odciągnięto i komórki powtórnie przeprowadzono w stan zawiesiny w 5 ml roztworu soli. 500 mCi 'In-oksyny dodawano kroplami mieszając i mieszaninę inkubowano przez 60 min w 37°C z przerywanym mieszaniem. Komórki pozostawiono do sedymentacji i grudkę powtórnie przeprowadzono w stan zawiesiny w osoczu ubogim w płytki (PPP), odwirowywano przy 450 x g przez 5 minut i powtórnie przeprowadzono w stan zawiesiny w PPP do iniekcji. Skuteczność znakowania komórek obliczono jako % początkowej aktywności 'In-oksyny dodanej do grudki komórek, która pozostała związana z komórką po jednym przemyciu PPP po rozdzieleniu od ośrodka znakującego.

Model Infekcji

Białe króliki nowozelandzkie (samce) o ciężarze 2,2-3,0 kg użyto we wszystkich badaniach. E. coli z pojedyńczego klinicznego izolatu hodowano przez noc na płytkach z agarem z tryptykazą soi i poszczególne kolonie rozcieńczono sterylnym normalnym roztworem soli, by wytworzyć nieklarowną zawiesinę zawierającą w przybliżeniu 1x10'' organizmów/0,5 ml (oznaczone przy użyciu spektrofotometru). 0,5 ml inokulatu zawiesiny bakteryjnej wstrzyknięto głęboko w mięsień lewego uda królików.

godziny po inokulacji, królikom z dużym obrzmieniem w infekowanym udzie wstrzyknięto radiofarmaceutyki przez boczną żyłę uszną. Sześciu zwierzętom wstrzyknięto mieszaninę 1 mCi 9^9mTe-HP (>5000 mCi/mmol) i 0,05 mCi białych ciałek krwi znaczonych 'In.

Obrazowanie

3,6 i 18 godzin po iniekcji radioznaczonych reagentów, zwierzęta znieczulono ketaminą/ksylazyną (15,0 i 1,5 mg/kg) i uzyskano scyntygramy całego ciała z przodu przy użyciu szerokiego pola widzenia kamery gamma wyposażonej w średnioenergetyczny kolimator z równoległym otworem podłączonym do dedykowanego systemu komputerowego (Technicare Gemini 700, Technicare 560, Solon, OH). Obrazy 'In i ^99mTc uzyskano równocześnie w trybie z podwójnymi fotonami przy 15% oknie centrowanym na fotopiki przy 140 KeV dla ⁹9'ⁿTc i 247 KeV dla 'In. 3 i 6 godzin po iniekcji uzyskano dwa zestawy obrazów przy czasie wstępnego ustawienia 5 minut/widok. 18 godzin po iniekcji, czas obrazowania przedłużono do 10 minut na widok. Obszarami zainteresowania były: obszar infekcji i kontralateralny normalny mięsień (tło). Wyniki wyrażono jako stosunki cel-tło (udo infekowane /udo kontralateralne).

Bezpośrednie próbkowanie tkanki

Po uzyskaniu końcowych obrazów, zwierzęta uśmiercono przez przedawkowanie pentobarbitalu sodowego i oznaczono biodystrybucję. Próbki krwi, serca, płuc, wątroby, śledziony, nerek, nadnercza, żołądka, przewodu pokarmowego, jąder, kości, szpiku kostnego, mięśnia normalnego, mięśnia infekowanego i ropienia zważono i radioaktywność zmierzono licznikiem gamma typu wnękowego (LKB model #1282, Wallac Oy, Finlandia). By wprowadzić poprawkę na rozpad radioaktywny i umożliwić obliczenie stężenia radioaktywności w każdym organie jako ułamek podanej dawki, próbki dawek wstrzykniętych zliczano równocześnie. Wyniki wyrażono jako % dawki wstrzykniętej na gram (%I. D./g), stosunek mięśnia infekowanego do mięśnia normalnego i stosunek ropienia do mięśnia normalnego.

By określić charakter radioaktywności w obiegu i w miejscu infekcji, próbki krwi i ropienia frakcjonowano przez odwirowanie gradientowe na Lymphoprep. Osocze dalej frakcjonowano na kolumnie Sephadex G-100 (1,0 x 25 cm) wymywanej PBS, pH 7.4. Kolumnę skalibrowano przy użyciu '1n-IgG, 'In-F(ab’)2, '^I-ludzka albumina i '-'''Tc-DTPA.

Badania fantomów

Badania fantomów wykonano w celu obliczenia ilości wzajemnej wymiany fotonów 174 KeV In w oknie 99^mTc i fotonów 140 KeV w oknie 'In. Ujmując to w skrócie, w czasie, gdy zwierzęta poddawano iniekcji, próbki 'In i ^Tc w tym samym stosunku jak iniektat starannie zmieszano z 250 ml roztworu soli w standardowych torebkach infuzyjnych. Fantomy umieszczono 5 cm od stołu do obrazowania i uzyskano obrazy w obydwu oknach. Z obszarów zainteresowania zakreślonych wokół każdej torebki obliczono czynniki wzajemnej wymiany i użyto do skorygowania obrazów 99^,nTc i 'In.

177 585

Metody statystyczne

Wyniki badania obrazowania i biodystrybucji oceniono statystycznie przez analizę wariancji (ANOVA), a następnie przez nowy test wielkorotorgo zakresu Duncana (Duocao,

D. B., Biometrics, 11:142 (1955)). Dla danych obrazowania, zastosowano podwójną ANOVA z modelem liniowym, w którym zmiennymi klasyfikacjami były „czas po iniekcji” i „radiofarmaceutyk” (”Tc-HP łub '”In-WBC) były;

T/B = Czas + Radionarmazeutyk + Czas x Radiofarmaceutyk.

Dla danych biodyctrybucji, zastosowano podwójną ANOVA z modelem liniowym, w którym zmiennymi klasyfikacjami były organ i radionarmacrutyk;

%I. D./gram = Orgao + Radiofarmaceutyk + Organ x Radiofarmaceutyk.

Pooadto, stosunki cel: tło dla 1'1Io-WBC względem ”Tc-HP prówoano za pomocą regresji liniowej. Wszystkie wyniki wyrażono jako średnia ± SEM.

Wyniki

Synteza peptydów

Peptyd chemotaktyczny derywatyzowaoy hydrazynonikotyoamidem wytworzono z dobrą wydajnością i czystością. Analiza UV wykazała maksimum absorpcji przy 268 i 315 om. Spektroskopia masowa i analiza aminokwasów (Mct-1.00, Leu-1,00, Phe-0,.97, Lys-1,00) były zgodne ze spodziewanym produktem - skooiugowanym peptydem.

Radiofarmaceutyki

Analiza ITLC i HPLC wykazały, że >90% radioaktywności było związane z peptydem po 1 godzinie iokubowania. Aktywność właściwą nirkczyszczoocgo '^Tc-HP obliczono jako >3000 mCi/mmol. Przy użyciu procedury oczyszczenia opisanej powyżej aktywność właściwą zwiększono do >10000 mCi/mmol.

Metoda znakowania '''In-leukocytów zastosowana w tych doświadczeniach dała w wyniku skuteczność znakowania w przybliżeniu 70% przed oczyszczeniem i końcową czystość radiochemiczną >95%.

Badania fantomów

Badania fantomów wskazały, że 3 godziny po iniekcji radiofarmaceutyków, 5% fotonów wykrytych w oknie ”Tc było przypisane In. 18 godzin po iniekcji, 17% fotonów wykrytych w oknie ^99,nTc było przypisane 'In. Przy obydwu czasach obrazowania 2% fotonów wykrytych w oknie In. było przypisane 99”Tc. Wszystkie dane dotyczące obrazowania skorygowano oa wymienione efekty oadmiarowości.

Obrazowanie

Figura 14 przedstawia reprezentatywne, skorygowane oa wzajemną wymianę fotonów, przednie obrazy królika 6 i 18 godzin po ko-iaiekcji ^99mmc-HPa i In-WBc.

Przy obydwu czasach obrazowania, całkowita biodystrybucja dwóch radiofarmaceutyków była prawie identyczna. Wysokie stężenia obydwu środków wykryto w płucach, wątrobie, śledzionie i nerkach. Stężenie obydwu wskaźników były niższe w mięśniu i przewodzie pokarmowym.

Z danych obrazowania jest widoczne, że ^99,nTc-HP w znaczącym stopniu lokalizuje się w miejscach infekcji zarówno 6 jak i 18 godzin po iniekcji. Stosunek T/B dla obydwu środków wzrósł znacząco z czasem (p<:0.01). Przy obydwu czasach obrazowania, stosunek T/B dla 9⁹”Tc-HP był znacząco większy (p<0.01) oiż dla 'Io-WBC. Stosunki cel: tło dla obydwu radiofarmaceutyków zestawiono oa fig. 15. Do 6 godzin po iniekcji, T/B ⁹⁹”Tc-HP był równoważny wartości dla ^lIn-WBC 18 godzpo iniekcji. Średni stosunek wartości T/B (99”Tc-HP do Io-WBC) wyniósł 2,99 ± 1,88, przy braku wartości poniżej jedności.

Bezpośrednie próbkowanie tkanki

Bikdyctrybucję ⁹⁹”Tc-HP i WBC znaczonego In (%I. D./g), oznaczono przez bezpośrednie pomiary radioaktywności tkaoki 18 godzin po iniekcji, jak podano w tabeli V.

177 585

Tabela V

Biodystrybucja ^99mTc i Ίη-WBC u królika (%1. D./g średnia ± SEM)

Organ	^Tc-HP	’”ln-WBC's
Krew	0.037 ± 0.003	0.127 ±0.029
Serce	0.043 ± 0.005	0.024 ± 0.004
Płuco	0.192 ±0.037	0.120 ±0.007
Wątroba	0.207 ±0.013	0.148 ± 0.020
Śledziona	0.601 ±0.025	2.080 ± 0.237
Nerka	0.136 ±0.021	0.086 ±0.016
Nadnercze	0.103 ±0.018	0.139 ±0.026
Żołądek	0.050 ± 0.008	0.013 ±0.003
Przewód pokarmowy	0.047 ± 0.005	0.018 ±0.004
Jądra	0.018 ±0.001	0.028 ± 0.003
Mięsień	0.003 ± 0.001	0.004 ± 0.001
Szpik	0.159 ±0.013	0.358 ±0.107
Kość	0.033 ± 0.004	0.039 ± 0.007
Zainfekowany mięsień	0.101 ±0.008	0.024 ± 0.002
Ropień	0.188 ±0.034	0.035 ± 0.008

W tym czasie, stwierdzono znaczące różnice w stężeniu tych dwóch wskaźników w szeregu tkanek. Peptyd chemotaktyczny znaczony ^99mTc wykazał większe nagromadzenie w infekowanym mięśniu, (p<0,01), ropieniu (p<0,01), sercu (p<0,05), wątrobie (p<0,05), żołądku (p<0,01) i przewodzie pokarmowym (p<0,01).

Wyższe poziomy 'In-WBC stwierdzono we krwi (p<0,05), śledzionie (p<:0,01) i jądrach (p<0,01). Nie stwierdzono znaczących różnic w normalnych mięśniach szkieletowych, kości, szpiku, płucach, nadnerczu lub nerkach.

Wyniki frakcjonowania krwi wykazały, że w obydwu punktach czasowych, jedynie około 25% obiegowej radioaktywności ^99mTc było związane z leukocytami, podczas gdy ponad 85% radioaktywności Ίη było związane z białymi ciałkami. Dla obydwu radionuklidów, wiązanie do czerwonych ciałek krwi było minimalne (<2%). Natomiast, frakcjonowanie ropienia wykazało, że zarówno dla ^99mTc jak i dla Ίη, w przybliżeniu 90% radioaktywności było związane z WBC. Chromatografia kolumnowa osocza wykazała, że >95% radioaktywności ^99mTc, która nie była związana z WBC wymywała się z pozornym ciężarem cząsteczkowym 150000 (frakcja IgG); w pozycji wymywania wolnego peptydu nie wykryto radioaktywności. Radioaktywność z kolumny była większa niż 90%.

Figura 16 przedstawia wykres stosunków infekowanego mięśnia do normalnego mięśnia dla ^mTc-HP i Ίη-WBC oznaczonych przez bezpośrednie pomiary radioaktywności na próbkach wyciętych tkanek 18 godzin po iniekcji. Średnie wartości stosunków infekowanego mięśnia do normalnego mięśnia były znacząco wyższe dla ^99mTc-HP w porównaniu do ΊηWBC (33,6:1 wobec 8,1:1, p<0,01). Ta różnica wynikła raczej wskutek wzrostu bezwzględnego nagromadzenia w infekowanym mięśniu ^99mTc-Hp (0.102 %I. D./g) w porównaniu do ‘In-WBC (0,024 %I.D./g) niż w wyniku różnicy w nagromadzeniu w normalnym mięśniu szkieletowym (0,003 I. D./g wobec 0,004% I. D./g dla ^99mTc-HP i ¹ In-WBC, odpowiednio). Analiza regresyjna nie wykazała znaczącej korelacji między nagromadzeniem ^99mTc-HP i Ίη-WBC (r²=0,076).

Stosunki ropienia do kontralateralnego normalnego mięśnia, oznaczone przez bezpośrednie pomiary radioaktywności 18 godz. po iniekcji przedstawiono na fig. 17. Średni stosu177 585 nek ropienia do normalnego mięśnia dla Tc-HP wyniósł 61,8± 11,05 wobec 9,32+2,50 dla ^ln-WBC (p<0,01). Większe nagromadzenie Tc-HP w ropieniu (0,188+0,034 %I. D./g) w porównaniu do In-WBC (0,035±0,008 %I. D./g) było główną przyczyną wyższego stosunku T/B dla Tc-HP.

Omówienie wyników

Przykład ten wykazuje, że peptyd chemotaktyczny znaczony Tc jest lepszy od InWBC dla obrazowania infekcji bakteryjnej u królika. Bezwzględny poziom nagromadzenia peptydu chemotaktycznego znaczonego ⁹⁹ⁱⁿTc (% I.D./gram) w zainfekowanym mięśniu i ropieniu był większy niż poziom In-WBC. Ponadto, stosunki cel: tło są większe dla Tc-HP przy wszystkich czasach obrazowania. Po 6 godzinach po iniekcji, stosunek T/B dla ^mTc-HP był równoważny In-WBC 18 godzin po iniekcji, sugerując, że peptyd chemotaktyczny znaczony Tc może zaoferować szybką alternatywę dla obrazowania infekcji.

Ponieważ różnica nagromadzenia w normalnym mięśniu była nieznacząca, poprawione stosunki T/B Tc-HP do In-WBC wynikają głównie z większego stężenia 'Tc-HP w miejscu infekcji.

Obecnie po opisaniu w pełni wynalazku, specjaliści z tej dziedziny techniki docenią, że to samo może być wykonane w ramach szerokiego zakresu równoważnych parametrów, stężeń i warunków bez odchodzenia od ducha i zakresu niniejszego wynalazku i bez nadmiernego eksperymentowania.

Podczas, gdy niniejszy wynalazek opisano w związku ze szczególnymi jego wykonaniami, należy rozumieć, że są możliwe dalsze modyfikacje. To zgłoszenie ma w zamierzeniu ująć jakiekolwiek odmiany, zastosowania lub adaptacje wynalazku według, w ogólności, zasad wynalazku włączając w to takie odstępstwa od obecnego ujawnienia jakie wynikają ze znanej lub zwyczajowej praktyki w dziedzinie, do której wynalazek należy i jak może być zastosowany do zasadniczych powyższych cech wyłożonych jak następuje w zakresie załączonych zastrzeżeń.

177 585

ο ο

ο >- s Μ == r*j

rn 585

OJ o

Lu £5 lu o

tO m

<z

177 585

LOG [ PEPTYD ] (nM)

ForMLF	EC50 100
Heksapeptyd	100
HP2	12
HP3	40
HP4	60
HP1	500
ForNLF	320

FIG.3

177 585

ηιιη ι'πίιιμ}' .01 .1 1 —ο— Heksapeptyd ΗΡ2 ΗΡ3 —ΗΡ4 ΗΡ1

-ο- ForMLF —+- ForMLF

100 1000 10000 100000 LOG [ PEPTYD ) (ηΜ)

Heksapeptyd	EC50 1
ΗΡ2	0.18
ΗΡ3	0.12
ΗΡ4	0.35
ΗΡ1	40
ForMLF	20
ForNLF	300

FIG. 4 ffl 585

o o O o o —

O

FIG. 5 |otun/|3ui

ΠΊ 585

FIG. 6

177 585

FIG.7

177 585 stosunek cel: tło % ID/GRAM (SEM,

0.6

0.5

0.4

0.3

0.1 π

/A o .2

- s-te ST Ί3 S 5 d S.

V» «Ζ» .Si θ' Q_

FIG. 8

FIG. 9

ΠΊ 585

Lu

<50 rW?

W©?

—. UJ o .«= o UJ E r' °l ro OJ — O

WVH9/0I % αΣο □H0

Cl

177 585 o

oo _ O b-

_ o m _ o

CM oo

Ό

177 585

ίίΝΙΟΗΙΝΟΪ I3SO1HWA %

f3N10VliN0)J DSOIWM % ο

FIG!. 12A FIG. 12B

177 585

f3N10«lN0)lDS01WM%

ιζ> «X r—i

O

CM

O co o

FIG. 12C FIG. 120 [3N10H1N0H DS0iHVM %

177 585

FIG.13B

FIG.13A

177 585

FIG.14B

FIG. 14A

177 585

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 6,00 zł.

Claims (52)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Peptyd chemotaktyczny wykrywalnie znaczony o wzorze

   X -Y - Leu - Phe - [Z], - K - M¹ w którym:

   X oznacza grupę zabezpieczającą grupę aminową,

   Y oznacza aminokwas,

   Z oznacza sekwencję rozporki dobraną spośród grup obejmujących alifatyczne diaminy o 1-6 atomach węgla, R⁶, i ich mieszaniny, przy czym R® oznacza jedną lub więcej jednakowych lub różnych reszt aminokwasowy ch, n jest równe 0 lub 1, a

   K - Mi oznacza podstawnik znakujący lub przyłączający, w którym K oznacza pośrednią funkcyjną grupę hydrazyno-nikotynoamidową (HYNIC) a Mi oznacza wykrywalny znacznik.
2. 2. Peptyd według zastrz. 1, w którym Y oznacza grupę o wzorze

   - NH - CH(R‘) - (C=O)w którym R1 oznacza benzyl, alkil lub grupę -CH, - CH₂ - R²- CH₂, w której R² oznacza -S-, -SO2-, -SO- lub -O-, a X, [Z],, K - M¹ mają znaczenie podane powyżej.
3. 3. Peptyd według zastrz. 2, w którym X oznacza grupę zabezpieczającą - grupę aminową dobraną spośród grup N-formylowej, t-Boc, karbaminianów, karboksyamidów, tiokarboksyamidów, moczników, tiomoczników i odpowiadających im pochodnych cyjanoguanidynowych, sulfoamidów i iosfonoamidów, zaś pozostałe podstawniki mają wyżej podane znaczenia.
4. 4. Peptyd według zastrz. 2, w którym X oznacza grupę o wzorze

   R³ - C = R⁴ w którym R3 dobrane jest z grupy obejmującej wodór, alkil, alkenyl, alkinyl, grupę alkoksyl, aryloalkoksyl i amino a R⁴ oznacza tlenowiec.
5. 5. Peptyd według zastrz. 2, o wzorze

   X - Met -Leu -Phe- [Z],, - K - M1 w którym podstawniki X, [Z],, K - M1 mają znaczenie podane powyżej.
6. 6. Peptyd według zastrz. 5, w którym reszta metioninowa zastąpiona jest kwasem 4aminotdtrahydrotiopizano-4-kazboksylowym.
7. 7. Peptyd według zastrz. 5, w którym reszta leucynowa zastąpiona jest dipropyloglicyną.
8. 8. Peptyd według zastrz. 5, w którym reszta leucynowa zastąpiona jest kwasem 1aminocykloheksanokarboksylowym.
9. 9. Peptyd według zastrz. 5, w którym reszta fenyloalaninowa zastąpiona jest zdehydrofeny loalaniną.
10. 10. Peptyd według zastrz. 5, w którym reszta fenyloalaninowa zastąpiona jest kwasem 2-aminoindanono-2-karboksylowym.
11. 11. Peptyd według zastrz. 5, w którym reszta fenyloalaninowa zastąpiona jest anilinoglicyną.

    ΠΊ 585
12. 12. Peptyd według zastrz. 2, w którym n wynosi 1, a Z oznacza R^s.
13. 13. Peptyd według zastrz. 12, w którym aminokwas w R⁶ niezależnie dobrany jest z grupy obejmującej norleucynę, tyrozynę, kwas asparaginowy, lizynę, leucynę i fenyloalaninę.
14. 14. Peptyd według zastrz. 12, w którym dwie lub więcej reszt w R6 niezależnie dobranych jest z grupy obejmującej norleucynę, tyrozynę, kwas asparaginowy, lizynę, leucynę i fenyloalaninę.
15. 15. Peptyd według zastrz. 2, w którym chemotaktyczny wykrywalnie znaczony peptyd zawiera człon wybrany z grupy obejmującej:

    izopropylomocznik-Met-Leu-Phe-Lys-SHNH-BOC, izopropylomocznik-Met-Leu-Phe-n-propylodiamino-Asp-SHNH HBr, izopropylomocznik-Met-Leu-Phe-Lys-Asp-SHNH HBr, izopropylomocznik-Met-Leu-Phe-Lys-SHNH HBr i izopropylomocznik-Met-Leu-Phe-propanodiamino-SHNH HBr.
16. 16. Peptyd według zastrz. 2, w którym M¹ obejmuje izotop radioaktywny.
17. 17. Peptyd według zastrz. 16, w którym M1 oznacza ^99mTc, '^I, ^l25I, ^l31I, ⁹⁷Ru, 6⁸Ga, ⁸⁹Zr, ⁷²As, 9°Y, 6^?Cu, ^20,TI ²ⁿBi, ²At, ^2l2Pb, ⁴⁷Sc,’ In lub '1⁹Pd.
18. 18. Peptyd według zastrz. 2, w którym M' obejmuje izotop paramagnetyczny lub związek, który może być obrazowany za pomocą PET (positron emission tomography).
19. 19. Peptyd według zastrz. 2, w którym - K - M1 dodatkowo zawiera L oznaczające ligand pomocniczy przyłączony do M1.
20. 20. Peptyd według zastrz. 19, w którym ligand pomocniczy obejmuje glukoheptonian, trycynę lub dodatkowąjednostkę peptydu.
21. 21. Peptyd według zastrz. 2, w którym X oznacza grupę zabezpieczającą grupę aminową o wzorze

    R³ - C = R⁴, w którym R³ dobrane jest z grupy obejmującej atom wodoru, alkil, alkenyl, alkinyl, alkoksy, aryloalkoksy i grupę aminową, a R4 oznacza tlen lub siarkę,

    Y oznacza Met, Phe lub Nle,

    Z oznacza sekwencję rozporki dobraną z grupy obejmującej diaminy alifatyczne o 1-6 atomach węgla, R6 i ich mieszaniny, przy czym R6 oznacza jedną lub więcej takich samych lub różnych reszt aminokwasowych, n jest równe 0 lub 1, a

    K - M1 oznacza podstawnik znakujący lub przyłączający, w którym K oznacza pośrednią funkcyjną grupę hydrazynonikotynoamidową (HyNIC) a M1 oznacza wykrywalny znacznik.
22. 22. Peptyd według zastrz. 21, w którym Y oznacza Met.
23. 23. Peptyd według zastrz. 22, w którym reszta metioninowa jest zastąpiona przez kwas 4-aminotetrahydrotiopirano-4-karboksylowy.
24. 24. Peptyd według zastrz. 21, w którym reszta leucynowa jest zastąpiona przez dipropyloglicynę.
25. 25. Peptyd według zastrz. 21, w którym reszta leucynowa jest zastąpiona przez kwas 1 -aminocykloheksanokarboksylowy.
26. 26. Peptyd według zastrz. 21, w którym reszta fenyloalaninowa jest zastąpiona przez zdehydrofenyloalaninę.
27. 27. Peptyd według zastrz. 21, w którym reszta fenyloalaninowa jest zastąpiona przez kwas 2-aminoindanono-2-karboksylowy.
28. 28. Peptyd według zastrz. 21, w którym reszta fenyloalaninowa jest zastąpiona przez anilinoglicynę.
29. 29. Peptyd według zastrz. 21, w którym n jest równe 1, a Z oznacza R⁶.
30. 30. Peptyd według zastrz. 29, w którym reszta aminokwasowa w R6 niezależnie dobrana jest z grupy obejmującej norleucynę, tyrozynę, kwas asparaginowy, lizynę, leucynę i fenyłoalaninę.

    177 585
31. 31. Peptyd według zastrz. 29, w którym dwie lub więcej reszt aminokwasowych w R⁶ jest niezależnie dobranych z grupy obejmującej norleucynę, tyrozynę, kwas asparaginowy, lizynę, leucynę i fenyloalaninę.
32. 32. Peptyd według zastrz. 21, w którym K - M¹ dodatkowo zawiera L, w którym L oznacza ligand pomocniczy przyłączony do M¹.
33. 33. Peptyd według zastrz. 32, w którym ligand pomocniczy obejmuje glukoheptonian, trycynę lub dodatkową jednostkę peptydu.
34. 34. Peptyd według zastrz. 2, w którym:

    Z oznacza grupę zabezpieczającą grupę aminową o wzorze R³ - C = R⁴ w którym R³ dobrane jest z grupy obejmującej atom wodoru, alkil, alkenyl, alkinyl, alkoksy, aryloalkoksy i grupę aminową, a R⁴ oznacza atom tlenu lub siarki,

    Y oznacza resztę aminokwasową,

    Z oznacza sekwencję rozporki wybraną z grupy obejmującej diaminy alifatyczne o 1-6 atomach węgla, R6, i ich mieszaniny, przy czym R® oznacza jedną lub więcej takich samych lub różnych reszt aminokwasowych, o jest równe 0 lub 1 a

    K oznacza pośrednią funkcyjną grupę hydrazyoooikotyooamidkwą (HYNIC), a M¹ oznacza wykrywalny znacznik.
35. 35. Peptyd według zastrz. 34, w którym Y oznacza Met, Phe lub Nle.
36. 36. Peptyd według zastrz. 34, w którym K dodatkowo zawiera L oznaczające ligand pomocniczy przyłączony do K.
37. 37. Peptyd według zastrz. 36, w którym pomocniczy ligand obejmuje glukoheptonian, trycynę lub dodatkowajedinostkę peptydową.
38. 38. Peptyd według zastrz. 37, w którym dodatkowa jednostka peptydową oznacza jednostkę o wzorze

    X - Y - Leu - Phe - [Z]_n - W w którym

    X i Y mają wyżej podane znaczenie,

    Z oznacza sekwencję rozporki dobraną spośród grup obejmujących alifatyczne diaminy o 1 -6 atomach węgla, R6, i ich mieszaniny, przy czym R’ oznacza jedną lub więcej jednakowych lub różnych reszt aminokwasowych,

    W oznacza podstawnik znakujący lub przyłączający o wzorze [K]_v-M1 w którym K-M1 oznacza podstawnik znakujący lub przyłączający i w którym K oznacza, pośrednią grupę funkcyjną DTPA, EDTA lub HYNIC, v jest równe 0 lub 1, zaś

    M1 oznacza wykrywalny znacznik.
39. 39. Peptyd według zastrz. 2, ewentualnie znaczony, dobrany z grupy obejmującej: iBOC-L-Metiooylo(sulfotleoek)-L-Leu-Phe-L-lizyoamid, iBOC-L-Norleucylo-L-Leu-L-Phe-L-lizynamid, izkpropylomoczoik-Met-Leu-Phe-Lys-SHNH-BOC, izkpropylomoczoik-Met-Leu-Phe-o-propylodiamioo-Asp-SHNH HBr, izopropylomoczoik-Met-Leu-Phe-Lys-Asp-SHNH HBr, izkpropylomoczoik-Met-Leu-Phe-Lys-SHNH HBr, izkpropylomoczoik-Met-Leu-Phe-propaokdiamioo-SHNH HBr, N-o-butylomoczoik-Phe-Leu-Phe-Leu-Phe, N-izopropylomkczoik-Phe-Leu-Phe-Leu-Phe-COOH lub N-cynamono-Ehe-Leu-Piie-Leu-Pbie.
40. 40. Peptyd według zastrz. 39, który zawiera wykrywalny znacznik.

    177 585
41. 41. Peptyd według zastrz. 40, w którym wykrywalny znacznik jest izotopem radioaktywnym..
42. 42. Peptyd według zastrz. 41, w którym izotopem radioaktywnym jest ó8z-. 89/„ 72 λ „ 90τ,/ 67/-.,, 201 τι 217τ· 211 a + 2I2t>U 47c„ 111γ„ ,.ι 109nJ

    99m

    Tc,' 12I, ^,3'I, Ru, 'Ga, ⁸⁹Zr,⁷²As, ^9UY, ⁶⁷Cu, ^2U,TI, ^2,7Bi, ²At, ^2I2Pb, ⁴⁷Sc 'In bib ^loyPd.
43. 43. Peptyd według zastrz. 39, w którym wykrywalny znacznik jest izotopem paramagnetycznym lub związkiem, który może być obrazowany za pomocą PET.
44. 44. Środek farmaceutyczny do wykrywania miejsca infekcji lub zapalenia u osobnika, zawierający wykrywalnie znaczony chemotaktyczny peptyd, który kumuluje się w zasadzie tylko w miejscu infekcji lub zapalenia, znamienny tym, że zawiera chemostatyczny wykrywalnie znaczony peptyd o wzorze

    X - Y - Leu -Phe -[Z]_n - K - M' w którym:

    X oznacza grupę zabezpieczającą grupę aminową,

    Y oonacza aminokwas,

    Z oznacza sekwencję rozporki dobraną spośród grup obejmujących alifatyczne diaminy o 1-6 atomach węgla, R6, i ich mieszaniny, przy czym R6 oznacza jedną lub więcej jednakowych lub różnych reszt aminokwasowych, n jest równe 0 lub 1, a

    K - M¹ oznacza podstawnik znakujący lub przyłączający, w którym K oznacza pośrednią funkcyjną pn-idę hydrazyaoaikotyaosmidową (HYNIC) a M1 oznacza wykrywalny znacznik.
45. 45. Środek według zastrz. 44, znamienny tym,-że zawiera peptyd, w którym X oznacza grupę zabezpieczającą grupę aminową o wzorze

    R³-C=R⁴, w którym R³ dobrane jest z grupy obejmującej atom wodoru, alkil, alkenyl, alkinyl, alkoksyl, aryloalkoksyl i grupę aminową, a R⁴ oznacza atom tlenu lub siarki,

    Y oznacza resztę aminokwasową, korzystnie Met, Phe lub Nle,

    Z oznacza sekwencję rozporki wybraną z grupy obejmującej diaminy alifatyczne o 1-6 atomach węgla, R6, i ich mieszaniny, przy czym r6 oznacza jedną lub więcej takich samych lub różnych reszt aminokwasowych, n jest równe 0 lub 1,

    K oznacza pośrednią funkcyjną grupę hyerazyokoikotynoamidową (HYNIC), ewentualnie dodatkowo zawierającą przyłączony do niej pomocniczy ligand L, korzystnie taki jak glukoheptooian, trycyna lub dodatkową jednostkę peptydową o wzorze

    X-Y-Leu-Phe-[Z]_n-[K]_v, w którym [K]_v oznacza pośrednią grupę funkcyjną, w której K oznacza DTPA, EDTA lub HYNIC, v jest równe 0 lub 1, a M1 oznacza wykrywalny znacznik oraz ewentualnie zawiera dodatkowo farmaceutycznie dopuszczalny nośnik odpowiedni do podawania pozajelitowego.
46. 46. Środeś według zastrz. a4, ziunnienny tym. żejako chemotaktyczny pzntyd epwiera iBOC - 1-Metionylo (sulfktldnek)-L-LdU-Phd-L-lizynamid, iBOC-L-Norleucylo-L-Leu-L-Phd-L-lizyaamid, izkdropylomocznik-Met-Leu-Phd-Lys-SHNH-BOC, izoprodylomopzpak-Met-Leu-Phe-a-prodyiodiamiao-Asd-4HNH HBr, izopropylomocznik-Met-Leu-Phe-Lys-Asp- SHNH HBr, izopropylomoczoik-Met-Ldu-Phe-Lys-SHNH HBr, izopropylomocznik -Met-Ldu-Phe-prodankdiamiao-SHNH HBr,

    177 585

    N-n-butylomocznik-Phe-Leu-Phe-Leu-Phe,

    N-izopropylomocznik-Phe-Leu-Phe-Leu-Phe-COOH lub

    N-cynamoilo-Phe-Leu-Phe-Leu-Phe, przy czym wymieniony peptyd jest ewentualnie znaczony izotopem radioaktywnym lub paramagnetycznym.
47. 47. Środek według zastrz. 46, znamienny tym, że zawiera peptyd chemotaktyczny znaczony izotopem radioaktywnym dobranym spośród ^99mTc, ³I, q, 'I, ⁹⁷Ru, ⁶⁸Ga, ^S9Zr, ⁷² As, ⁹⁰Y, ⁶⁷Cu, 2^οΓΤΊ, 2^|7Bi, 2 At, 2^|iPb, ⁴⁷Sc, 'In lub ¹⁰⁹Pd.
48. 48. Środek według zastrz. 46, znamienny tym, że zawiera peptyd chemotaktyczny, w którym Mjest dobrane z grupy obejmującej: leki, pektyny, toksyny, środki przeciwbakteryjne.
49. 49. Środek według zastrz. 45, znamienny tym, że zawiera peptyd chemotaktyczny, w którym M jest dobrane z grupy obejmującej 29^mTc 2 23,2 125, , i,2 ⁵>/R^l,2 ⁶⁸Ga, ⁸⁹Zr, 72As , οογ, 67^„ 201-ΓΤ żi^Bi, 211 At, 2²Pb, 4^?Sc, 'In lub 09Pd.

    Cu, 20'TI,
50. 50. Środek według zastrz. 45, znamienny tym, że zawiera peptyd chemotaktyczny, w którym n jest równe 1 a Z oznacza R⁶.
51. 51. Środek według zastrz. 50, znamienny tym, że zawiera peptyd, w którym reszta aminokwasowa w R6 niezależnie dobrana jest spośród norleucyny, tyrozyny, kwasu asparaginowego, lizyny, leucyny i fenyloalaniny.
52. 52. Środek według zastrz. 50, znamienny tym, że zawiera peptyd, w którym dwie lub więcej takich samych lub różnych reszt aminokwasowych w R6 niezależnie dobranych jest spośród norleucyny, tyrozyny, kwasu asparaginowego, lizyny, leucyny i fenyloalaniny.