JPH09504526A - 感染または炎症の病巣部位をイメージするための標識化走化性ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、実質的には、感染している、または炎症している部位に蓄積する、診断上もしくは治療上、有効な量の検出可能に標識された走化性ペプチド、または治療上、コンジュゲートした走化性ペプチドを個体に投与することにより、個体における感染または炎症部位を検出する方法、そのような感染または炎症を治療するための方法に関し、該走化性ペプチドは、 ［式中、Ｘはアミノ保護基であり、Ｙはアミノ酸残基であり、Ｚはスペーサー配列であり、ｎは０または１であり、またＷは標識用または結合置換基である］で示される一般構造を有する。

Description

【発明の詳細な説明】 感染または炎症の病巣部位をイメージするための標識化走化性ペプチド 関連出願についてのクロス−リファレンス 本出願は、 Ａ．１９８９年５月４日に出願し、現在は放棄されている米国特許出願番号第０ ７／３４９，１８６号の継続出願である、１９９３年５月５日に出願した米国特 許出願番号第０８／０５６,９５０号の一部継続出願；および Ｂ．１９９３年５月３日に出願した米国特許出願番号第０８／０５５,３１２号 の一部継続出願 である。 発明の背景 発明の分野 本発明は、走化性ペプチド、および個体における感染並びに炎症部位を検出し て、組織傷害を治療する際のそれらの使用に関する。関連技術の説明 炎症は、種々の形態の組織傷害に応じて起こる。この組織傷害は、微生物の侵 入、自己免疫過程、組織もしくは臓器の同種移植片拒絶反応、または熱、寒さ、 放射エネルギー、電気もしくは化学刺激、あるいは機械的外傷といったような有 害な外部影響から起こり得る。たとえ原因が何であろうとも、または身体の部位 がどこであろうとも、その後の炎症性応答は極めて類似しており、複雑な機能お よび細胞調節の組み合わせからなり、微小循環、体液の移動、および炎症性細胞 (白血球)の流入並びに活性化の変化が関与する。この応答パターンは、感染に対 する生来の宿主防衛機構の重要な部分を成し、また炎症性過程そのものから起こ る付加的な組織傷害という「犠牲」をもたらすが、最終的には、後の修復過程を 促進する。 微生物感染、または後に続くある形態の組織傷害では、複雑な一連の事象から なる炎症性応答のカスケードを開始する可溶性の化学物質が作られる。炎症性部 位における血流が増加し、また毛細管透過性の増加に応じて、血液から体液が流 出する。この損傷部位に局在化する体液の滲出には、通常、比較的小さい速度で 毛細管を通過する血漿タンパクが含まれる。白血球もまた、受動および能動過程 の両方により毛細管を通って炎症部位に入る。炎症性細胞の滲出液は、最初、主 として多核(ＰＭＮ)白血球(好中球または顆粒球とも呼ばれる)からなる。その後 、単球、リンパ球および血漿細胞を炎症性湿潤物中に見い出すことができる。 感染並びに炎症部位の同定および特性決定は、ヒトおよび獣医学における臨床 診断に重要である。早期の局所的な感染の場合、熱や体重減少ほど特異的ではな い臨床症候群を示す個体における「隠れた炎症部位」を探すことが必要であるこ とが多い。同様に、慢性関節リウマチのような自己免疫疾患を患っている患者に おいて、または組織もしくは臓器の同種移植片に拒絶反応を示すレシピエントに おいては、炎症性部位を同定し、それらの程度を明確にして、治療開始後の変化 をモニターする能力が有効な臨床ケアに重要である。 その後、その(それらの)部位を同定して、炎症性過程の程度を評価しようと、 多大なる努力が払われて、多くの技術が開発されているのは驚くに当たらない。 これらの技術には、従来のＸ線技術、ＣＡＴ走査、および種々の放射性核種走査 が含まれる［Ｓutton，Ａ Ｔextbook of Ｒadiology and Ｉmaging，第３版，Ｃ hurchill Ｌivingston（１９８０）；Ｍayseyら，Ｃlinical Ｎuclear Ｍedicin e 版，Ｗ.Ｂ.Ｓanders（１９８３）］。利用されている放射性核種走査に関する 技術の例には、以下のものが含まれる： １．⁶⁷ガリウム、これは、注入後、血漿タンパクであるトランスフェリンに結 合して、慢性炎症部位に局在化する傾向がある； ２．¹¹¹インジウム−標識化顆粒球、これは、宿主に再度注入された場合、炎 症部位に蓄積するであろう； ３．放射能標識化キレート、これは、細胞外液中に入った後、体液の蓄積部位 に蓄積し得る；および ４．血流の増加領域を評価するためのタリウム走査またはいわゆる一次通過放 射性核種血管造影図。 従来の核医学技術では、以下の放射性医薬品を感染炎症イメージングに使用す る：⁶⁷Ｇaクエン酸塩、¹¹¹Ｉn標識化白血球、^99mＴc標識化白血球、および¹¹¹Ｉ n標識化ヒトポリクローナルＩgＧ。これらの薬剤は各々、特異的状況において有 用な結果を得ることができるが、改良の余地がかなり残っている。 静脈注射後、⁶⁷Ｇaクエン酸塩は、血漿中の循環トランスフェリン(分子量：１ ００kＤ)およびラクトフェリン(分子量：〜１００kＤ)へ容易にトランスキレー トを作ることから、⁶⁷Ｇaクエン酸塩は、¹¹¹Ｉn−ＩgＧ(分子量：１５０kＤ)と 共に、標識化タンパクとして機構論的に分類することができる。標識化タンパク を用いての炎症イメージングは、炎症部位内における蓄積率と正常組織からのク リアランス率との差の結果である［Ｊuweid,Ｍ.ら，Ｅur.Ｊ.Ｎucl.Ｍed．１９ ：１５９−１６５（１９９２）］。これらの試薬を用いると、正常組織からの優 先流出および血液クリアランスから、最適な病変検出が一般に、注入後＞２４時 間で起こる。 Ｔhakurらは、インビトロにおける好中球の標識化に基づいた方法を広範囲に わたり分析して、論じている［Ｓem.Ｍucl.Ｍed．１４：１０７−１１７（１９ ８４）］。この方法では、個体の好中球をγ線放射性核種で標識し、選択される 核種は¹¹¹Ｉnである。そのような標識化好中球をインビトロにおける動力学的研 究に、また炎症性病巣のイメージングに使用することができた。この技術の不利 な点の１つは、インビトロにおいて標識化する前に、好中球を除去して単離する 必要があることである。 白血球は、炎症性応答の程度や期間を調節する様々なメディエーターを産生し 、また炎症性体液中に存在する化学メディエーターや他のタンパクに結合して応 答し得る様々なレセプターをそれらの表面上に有する。そのようなレセプター− メディエーター相互作用は、炎症性部位内における白血球機能を調節する際に重 要である。炎症性メディエーターのうち、化学誘因物質とも呼ばれる走化性因子 は、 ＰＭＮおよびマクロファージの指向性移動並びに活性化を誘発する能力を有する ［一般評論および討議については、Ｒoitt，Ｉmmunology，Ｇower Ｍedical Ｐu b.，ロンドン（１９８５）を参照されたい］。 ¹¹¹Ｉn標識化白血球は、非常に良好なイメージング剤であるが、かなりの調製 時間と血液の取り扱いが必要とされる。化学誘因物質のシグナルを検出した後、 炎症部位に移動しなければならないことから、注入後、放射能標識化細胞が局在 化するには数時間必要であるので、研究時間がさらに長引く。また、線量測定の 見地から投与することができる放射能の量が制限される結果、イメージの質が悪 くなることが多い。ずっと多い用量の^99mＴc標識化白血球を使用することができ るが、一般適用性は、非標的臓器における放射能の蓄積により制限される。 注入と病変検出との間の時間は、循環炎症性細胞に、さらにはまた炎症部位に 既存する細胞に結合する低分子量の放射性医薬品を開発することにより、有意に 減少させることができた。これらの特性を有する候補分子には、以下のものが含 まれる：ＩＬ−８［Ｂaggiolini,Ｍ.ら，Ｊ.Ｃlin.Ｉnvest．８４（４）：１０ ４５−１０４９（１９８９）］、血小板第４因子［Ｄeuel,Ｔ.Ｆ.ら，Ｐroc.Ｎa tl.Ａcad.Ｓci．ＵＳＡ７８（１） ：４５８４−４５８７（１９８１）およびペ プチドであるＮ−ホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニン(Ｆor− ＭＬＦ)(分子量：４３７)［Ｓhowell,Ｈ.Ｊ.ら，Ｊ.Ｅxper.Ｍed．１４３：１１ ５４−１１６９（１９７６）；Ｓchiffmann,Ｅ.ら，Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.Ｕ SＡ ７２ ：１０５９−１０６２（１９７５）；Ｗilliams,Ｌ.Ｔ.ら，Ｐroc.Ｎat l.Ａcad.Ｓci．ＵＳＡ ７４ ：１２０４−１２０８（１９７７）］。 Ｆor−ＭＬＦは、白血球膜上の高親和性レセプターに結合することにより、白 血球走化性を開始する細菌産生物である［Ｗilliams,Ｌ.Ｔ.ら，Ｐroc.Ｎatl.Ａ cad.Ｓci．ＵSＡ ７４ ：１２０４−１２０８（１９７７）；Ｓhowell,Ｈ.Ｊ.ら ，Ｊ.Ｅxper.Ｍed．１４３：１１５４−１１６９（１９７６）；Ｓchiffmann,Ｅ ．ら，Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci．ＵＳＡ ７２：１０５９−１０６２（１９７５ ）］。これらのレセプターは、ＰＭＮおよび単核食細胞の両方に存在する。イン ビトロにおける多くの構造−活性研究は、これらの小さいＮ−ホルミル−メチオ ニル ペプチドの多くの合成アナログが、天然ペプチドと比べて、同等の、またはより 大きい親和性で好中球およびマクロファージに結合することを実証している［Ｎ iedel,Ｊ.ら，Ｊ.Ｂiol.Ｃhem．２５５：７０６３−７０６６（１９８０）；Ｏ' Ｆlaherty,Ｊ.Ｔ.ら，Ｊ.Ｉmmunol．１２０：１３２６−１３３２（１９７８） ；Ｒot,Ａ.ら，Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Sci．ＵSＡ ８４：７９６７−７９７１（１ ９８７）；Ｉqbal,Ｍ.ら，ＦＥＢＳ １６５：１７１−１７４（１９８４）］が 、インビボにおける生体内分布および生物学的活性研究は、比較的限られている 。顆粒球は化学誘因物質のグラジエントに応答するので、細胞が炎症部位に達す るまで、付加的なレセプターが発見されるにつれてレセプターの親和性が減少し 、炎症部位で化学誘因物質の濃度は最大となる［Ｓnyderman,Ｒ.ら，Ｒev.Ｉnfe ct.Ｄis．９ ：Ｓ５６２−Ｓ５６９（１９８７）；Ｆletcher,Ｍ.Ｐ.，Ｊ．Ｉmmu nol.１２８ ：９４１−９４８（１９８８）；Ｎiedel,Ｊ.ら，Ｊ.Ｂiol.Ｃhem． １０ ：７００−７１０（１９７９）］。Ｆor−ＭＬＦの大きさが非常に小さい( 分子量：４３７)ので、その分子構造を容易に操作して、最適のイメージング剤 を設計することができる。 多くの細菌種は、１つまたはそれ以上の種類の走化性分子を、小さいペプチド 、より大きなタンパク、または脂質のいずれかで産生することができる［Ｋlein ,Ｊ.，Ｉmmunology：Ｔhe Ｓcience of Ｓelf-Ｎonself Ｄiscrimination，Ｗil ey Ｉnterscience，ニューヨーク（１９８２）］。例えば、Ｅ.coli菌は、それ らの活性成分としてブロックされたアミノ基を含む小さい異種ペブチドを有する 、強力な走化性分子を産生することが知られている。そのようなペプチドは合成 されており、またＰＭＮの強力な化学誘因物質であることが示されている。これ らの走化性ペプチドのうち最も知られているものは、Ｆor−ＭＬＦおよび幾つか の関連テトラペプチドである［Ｓchiffmannら，Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci．ＵＳ Ａ７２ ：１０５９−１０６２（１９７５）；Ｓchiffmannら，米国特許第４,４２ ７,６６０号（１９８４）］。これらのペプチドの構造−機能研究は、標的細胞 の表面上に立体−特異的レセプターが存在することを示唆した［Ｂecker,Ｅ.Ｌ. ，Ａm.Ｊ.Ｐathol．８５：３８５−３９４（１９７６）］；その後、そのような レセ プターが、リガンドとして放射能標識化ホルミルペプチドを用いて検出された［ Ｗilliamsら，Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci．ＵＳＡ ７４：１２０４−１２０８（１ ９７７）］。 その後、構造Ｎ−ホルミル−Ｎle−Ｌeu−Ｐhe−Ｎle−Ｔyr−Ｌysを有する走 化性ペプチドが合成され、そのものは、より高い比放射能までＴyr残基を¹²⁵Ｉ で標識することができ、またヒト好中球上のレセプターに強く結合することが示 された［Ｎiedelら，Ｊ.Ｂiol.Ｃhem．２５４：１０７００−１０７０６（１９ ７９）］。 細菌細胞はまた、例えば、宿主の補体系成分を活性化し、走化性分子であるＣ ５aおよびＣ５b６７の局所的な産生を増大させることにより、宿主細胞を誘発し て走化性因子を産生することもできる。続いて免疫応答が宿主において起こると 、ＩgＧ抗体分子もまた、活性化Ｔリンパ球により産生される分子と同様に、走 化性因子として作用し得る。様々な走化性分子が、炎症性細胞タイプ上の適当な レセプターの存在に基づいて、種々のＰＭＮ(例えば、好中球、好塩基球、好酸 球)、肥満細胞、単球／マクロファージ、またはリンパ球に対する選択性を有す る。 走化性ペプチドは、レセプター結合および活性化を担う分子の特異的特徴を決 定することを目的とする多くの構造−活性研究の中心となっている［Ｄeuel,Ｔ. Ｆ.ら，Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci.ＵＳＡ ７８（１）：４５８４−４５８７（１ ９８１）；Ｏ'Ｆlaherty,Ｊ.Ｔ.ら，Ｊ.Ｉmmunol．１２０：１３２６−１３３２ （１９７８）；Ｒot,Ａ.ら，Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci．ＵＳＡ ８４：７９６７ −７９７１（１９８７）；Ｉqbal,Ｍ.ら，ＦＥＢＳ １６５：１７１−１７４（ １９８４）］。これらの研究の多くは、Ｆor−ＭＬＦ配列中の天然アミノ酸の置 換に関して集中している。しかし、レセプター結合および活性化に関して、天然 ペプチド以下の、または天然ペプチドと同等のＥＣ₅₀を有する、伸長ペプチドお よび高度に陰性に帯電したペプチドに関しての報告がなされている［Ｆischman, Ａ.Ｊ.，Ｊ.Ｎucl.Ｍed．３２：４８３−４９１（１９９１）；Ｔoniolo,Ｃ.ら ，Ｂiochem．２３：６９８−７０４（１９８４）］。一般に、これらの構造−活 性研究の結果は、Ｎ−末端での修飾はレセプター結合および活性化に対して強い 負の 効果を有するが、Ｃ−末端修飾は最小効果を有することを確証している［Ｓpisa ni,Ｓ.ら，Ｉnflammation １０：３６３−３６９（１９８６）］。さらに、レセ プター結合と生物学的活性とは非常に関連がある［Ｄeuel,Ｔ.Ｆ.ら，Ｐroc.Ｎa tl.Ａcad.Ｓci．ＵＳＡ ７８（１） ：４５８４−４５８７（１９８１）；Ｓchif fmann,Ｅ.ら，Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci．ＵＳＡ ７２：１０５９−１０６２（１ ９７５）］。これらのデータに基づいて、レセプター−ペプチド複合体のコンホ メーションに関するモデルが提唱されており、該モデルではＮ−末端の４つのア ミノ酸残基のみがレセプターと相互作用する［Ｆreer,Ｒ.Ｊ.ら，Ｂiochem．２ １ ：２５７−２６３（１９８２）］。 Ｃ−末端を修飾したＦor−ＭＬＦの合成アナログは、天然ペプチドと比べて、 同等の、またはより大きい親和性で好中球およびマクロファージに結合すること が実証されている［Ｄeuel,Ｔ.Ｆ.ら，Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci．ＵＳＡ ７８（ １） ：４５８４−４５８７（１９８１）；Ｓchiffmann,Ｅ.ら，Ｐroc.Ｎatl.Ａc ad.Ｓci．ＵＳＡ ７２ ：１０５９−１０６２（１９７５）；Ｎiedel,Ｊ.ら，Ｊ. Ｂiol.Ｃhem．２５５ ：７０６３−７０６６（１９８０）］。従って、Ｃ−末端 での標識化部分の封入は、レセプター結合を保持したままでの放射能標識化アナ ログの調製を可能とする。 この感染イメージング方法は、現在使用されている放射性医薬品より幾つかの 理論的利点を有する。注入と病変検出との間隔は、循環顆粒球に、さらにはまた 炎症部位に既存する白血球に結合するこれらの小さい分子の能力により、実質的 に減少させることができた。低分子量のペプチド(＜１，０００ダルトン)は、標 識化タンパクおよび白血球と比べて、感染および炎症領域内へより迅速に拡散さ れる。さらに、系中での顆粒球の放射能標識化は、従来の標識化手順に伴う細胞 機能の変化を無くし、また職員および患者に対して固有の危険を伴う血液の取り 扱いを排除する。 Ｚoghbiら，Ｊ.Ｎuc.Ｍed．２２：３２（１９８１）は、ペプチドにカップリ ングしたタンパクトランスフェリンを用いて、Ｆor−ＭＬＦを¹¹¹Ｉnで標識して 、この試薬がヒト好中球を選択的に標識化する見込みがあることを提唱した。こ の 方法は、標識化の特異性の問題に対する解決の可能性を提供するが、個体から細 胞を除去し、それらをインビトロにおいて操作した後、それらを再度注入すると いう複雑さに関する解決法は提唱していない。 ある報告は、¹²⁵Ｉ−標識化Ｎ−ホルミル−Ｎle−Ｌeu−Ｐhe−Ｎle−Ｔyr− Ｌysをウサギに直接注射することにより、インビボにおける無菌膿瘍を局在化し ようとする試みを記載している［Ｊiangら，Ｎucl.Ｍed．２１：１１０−１１３ （１９８２）］。有効な標識化率(膿瘍−対−筋肉)を得たが、この薬剤の使用は 、一過性好中球減少後、リバウンドで好中球増加を引き起した。著者らは、好中 球減少／好中球増加の副作用を避けて、この方法を臨床的に有用なものとするた めに、さらに開発が必要であることを認識した。さらに、¹²⁵Ｉは十分にイメー ジを造らず、またこの文献は、¹²³Ｉ、¹¹¹Ｉn、または^99mＴcといったような、 より良いイメージング同位体を開示もしていなければ、提唱もしていない。 Ｍorganらは、米国特許第４,９８６,９７９号において、炎症組織部位に蓄積 する標識の量を増す方法を開示した。その活性化による、白血球上の表面抗原マ ーカーに基づく上方調節が利用された。白血球にコンジュゲートした親和性標識 および放射性核種標識を含む走化性ペプチドを利用するイメージング方法が記載 され、さらにはまた増強に関するイメージング適用が記載された。これらの著者 らは、アンタゴニスト合成に関する合成方法を、またはそのようなアンタゴニス トが好中球減少応答を避けるために有用であり得ることを何ら開示しなかった。 上述の技術は有用な情報を提供し得る一方、それらの技術はまた結果的に、偽 正および偽負の結果の両方を許容され得ないほど高い頻度で起し、許容され得な い量の取り扱いや処理を必要とするか、または許容され得ない副作用を伴い得る 。従って、感染もしくは炎症部位を検出する、また局在化するための、より直接 的な、より鋭敏な、またより特異的な方法、特に連続的に行って、経時的な治療 に対する応答を評価することのできる技術に関して、当業界における必要性が依 然認められている。 発明の要約 本発明は、動物に全身注射した検出可能に標識された走化性ペプチドが局所感 染部位に蓄積するという発見に基づいて、感染または炎症部位をイメージングす るための、実質的に非観血的な(invasive)方法に関する。 とりわけ、本発明は、個体における感染または炎症部位を検出する方法であっ て、 ａ．診断上、有効な量の検出可能に標識された走化性ペプチド Ｘ−Ｙ−Ｌeu−Ｐhe−[Ｚ]n−Ｗ ［式中、 Ｘはアミノ保護基であり、 Ｙはアミノ酸残基であり、 Ｚはスペーサー配列であり、 ｎは０または１であり、また Ｗは、 −[Ｋ]ν−Ｍ¹ （式中、 Ｋは中間官能基であり、 νは０または１であり、また Ｍ¹は診断上、検出可能な標識である） で示される構造を有する標識用または結合置換基である］（ここで、該走化性ペ プチドは、実質的には、感染または炎症部位に蓄積し、また実質的には、感染し ていない、または炎症していない部位には蓄積しない） を個体に投与して、 ｂ．その走化性ペプチドを検出する ことを含んでなる方法に関する。 好ましい態様において、本発明は、個体における感染または炎症部位を検出す る方法であって、 ａ．診断上、有効な量の検出可能に標識された走化性ペプチド Ｘ−Ｙ−Ｌeu−Ｐhe−[Ｚ]n−Ｗ ［式中、 Ｘはアミノ保護基であり、 Ｙは、 ｛式中、Ｒ¹はベンジル、アルキル、または−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｒ₂−ＣＨ₃ （ここで、Ｒ²は、 である） である｝ であり、 Ｚはスペーサー配列であり、 ｎは０または１であり、また Ｗは、 −[Ｋ]ν−Ｍ¹ （式中、 Ｋは中間官能基であり、 νは０または１であり、また Ｍ¹は診断上、検出可能な標識である） で示される構造を有する標識用または結合置換基である］（ここで、該走化性ペ プチドは、実質的には、感染または炎症部位に蓄積し、また実質的には、感染し ていない、または炎症していない部位には蓄積しない） を個体に投与して、 ｂ．その走化性ペプチドを検出する ことを含んでなる方法に関する。 別の態様において、本発明は、検出可能に標識された走化性ペプチド Ｘ−Ｙ−Ｌeu−Ｐhe−[Ｚ]n−Ｗ ［式中、 Ｘは、 （式中、 Ｒ³は水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アラルコキ シ、およびアミノよりなる群から選択され、また Ｒ⁴は酸素または硫黄である） で示される構造を有するアミノ保護基であり、 Ｙはアミノ酸残基であり、 Ｚは１〜６個の炭素原子を有する脂肪族ジアミン、[Ｒ⁶]m（ここで、Ｒ⁶はア ミノ酸残基であり、またｍは１以上の整数である）、およびそれらの混合物より なる群から選択されるスペーサー配列であり、 ｎは０または１であり、また Ｗは、 −[Ｋ]ν−Ｍ¹ （式中、 ＫはＤＴＰＡ、ＥＤＴＡ、またはＨＹＮＩＣであり、 νは１であり、また Ｍ¹は¹¹¹Ｉnまたは^99mＴcである） で示される構造を有する標識用または結合置換基である］（ここで、該走化性ペ プチドは、実質的には、感染または炎症部位に蓄積し、また実質的には、感染し ていない、または炎症していない部位には蓄積しない） に関する。 そのような走化性ペプチドを含んでなる治療用組成物もまた本発明の範囲内で あるが、そのような組成物に関して、通常、検出可能な部分の封入は必要とされ ないであろう。とりわけ、本発明は、走化性ペプチド Ｘ−Ｙ−Ｌeu−Ｐhe−[Ｚ]n−[Ｔ]α ［式中、 Ｘは、 （式中、 Ｒ³は水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アラルコキ シ、およびアミノよりなる群から選択され、また Ｒ⁴は酸素または硫黄である） で示される構造を有するアミノ保護基であり、 Ｙはアミノ酸残基であり、 Ｚは１〜６個の炭素原子を有する脂肪族ジアミン、[Ｒ⁶]m（ここで、Ｒ⁶はア ミノ酸残基であり、またｍは１以上の整数である）、およびそれらの混合物より なる群から選択されるスペーサー配列であり、 ｎは０または１であり、 Ｔは治療用物質であり、また αは０または１である］（ここで、該走化性ペプチドは、実質的には、感染ま たは炎症部位に蓄積し、また実質的には、感染していない、または炎症していな い部位には蓄積しない） を含んでなる治療用組成物に関する。 従って、本発明は、個体における感染または炎症部位をインビボにおいて検出 する方法に関する。この方法は、検出可能に標識された走化性ペプチドを個体に 投与することを含んでなり、ここで、該ペプチドは、実質的には、感染または炎 症部位に蓄積するが、非感染、非炎症部位には蓄積しない。 本発明にはまた、適当なキレート化分子および検出可能な標識にコンジュゲー トしている、種々の走化性ペプチドも含まれる。 図面の簡単な説明 第１図は、ヒト好中球に対する、ＤＴＰＡとコンジュゲートした４つの走化性 ペプチドの結合アッセイの結果を説明するグラフである。該アッセイは、非標識 化ペプチドの濃度を増加することにより[³Ｈ]Ｆor−ＭＬＦを置換する、競合的 結合アッセイである。 第２図は、ヒト好中球によるスーパーオキシド産生刺激に関する、ＤＴＰＡに コンジュゲートした４つの走化性ペプチドのアッセイの結果を説明するグラフで ある。比較のためのアッセイにおいては、ＭＬＦが含まれていた。 第３図：走化性ペプチドのアナログによるスーパーオキシド産生。ヒトＰＭＮ を、ＨＢＳＳ単独、または示された濃度のペプチドと共に３７℃で１０分間イン キュベートした後、フェリシトクロムの還元を測定した： 最大スーパーオキシド産生（％）＝Ｅ／Ｍ×１００ ［式中、 Ｅは示された濃度のペプチドの存在下において産生されたスーパーオキシドの 量であり、また Ｍはペプチドにより産生されたスーパーオキシドの最大量である］。 Ｆor−ＮleＬＦＫ−ＨＹＮＩＣ：ＨＰ１； Ｆor−ＭＬＦＫ−ＨＹＮＩＣ：ＨＰ２； Ｆor−ＭＬＦＮＨ(ＣＨ₂)₆ＮＨ−ＨＹＮＩＣ：ＨＰ３； Ｆor−ＭＬＦ−(Ｄ)Ｋ−ＨＹＮＩＣ：ＨＰ４。 第４図：ヒトＰＭＮへのＦor−ＭＬ[³Ｈ]Ｆ結合に対する走化性ペプチドのア ナログの効果。１５nＭ Ｆor−ＭＬ[³Ｈ]Ｆの存在下、無傷のヒトＰＭＮ(８×１ ０⁵)を、インキュベーション緩衝液、または示された濃度のペプチドと共に２４ ℃で４５分間インキュベートした後、特異的Ｆor−ＭＬ[³Ｈ]Ｆ結合を測定した ： 最大Ｆor−ＭＬ[³Ｈ]Ｆ結合（％）＝Ｅ／Ｃ×１００ ［式中、 Ｅは示された濃度の非標識化ペプチドの存在下における特異的cpm結合であり 、また Ｃは緩衝液単独の存在下におけるＦor−ＭＬ[³Ｈ]Ｆの特異的cpm結合である］ 。 Ｆor−ＮleＬＦＫ−ＨＹＮＩＣ：ＨＰ１； Ｆor−ＭＬＦＫ−ＨＹＮＩＣ：ＨＰ２； Ｆor−ＭＬＦＮＨ(ＣＨ₂)₆ＮＨ−ＨＹＮＩＣ：ＨＰ３； Ｆor−ＭＬＦ−(Ｄ)Ｋ−ＨＹＮＩＣ：ＨＰ４。 第５図：放射化学的収率(％)および比放射能(mＣi／モル)に対するペプチド濃 度の効果。Ｆor−ＭＬＦ(Ｄ)Ｋ−ＨＹＮＩＣに関するデーターを示す。試験した 全てのペプチドで同様の結果が得られた。 第６図：Ｅ.coliに感染しているラットにおける^99mＴc−標識化ペプチドに関 する標的−対−バックグラウンド(Ｔ／Ｂ)比。データは、感染した筋肉における ＩＤ(％)／グラムを対側性の正常な筋肉における対応値で割ることにより計算し た。全ての場合において、注入２４時間前に感染を確立した。各々の点は、５〜 ６匹のラットに関する平均±平均の標準誤差(ＳＥＭ)である。 第７図：^99mＴc−標識化走化性ペプチドのアナログ注入後の、大腿がＥ.coli に感染しているウサギの典型的なγ線カメライメージ。該イメージは、^99mＴc− 標識化ＨＰ２約１mＣi注入１７時間後に得た。注入２４時間前に感染を引き起こ した。 第８図：^99mＴc−標識化ＨＰ２注入１７時間後の、大腿がＥ.coliに感染して いるウサギにおける生体内分布。データは、注入した用量の平均(％)／組織のグ ラムとして表す。誤差バーはＳＥＭを示す。^99mＴc−標識化ＨＰ２注入２４時間 前に感染を引き起こした。 第９図：注入１７時間後の、Ｅ.coliに感染しているウサギにおける^99mＴc− 標識化ＨＰ４に関する標的一対−バックグラウンド(Ｔ／Ｂ)比。データは、感染 した筋肉または膿におけるＩＤ(％)／グラムを対側性の正常な筋肉における対応 値で割ることにより計算した。全ての場合において、注入２４時間前に感染を確 立した。感染した筋肉に関して、該データは、６匹のウサギから得た２８の試料 を含んでなる。膿に関して、該データは、６匹のウサギから得た６つの試料であ る。 第１０図：血液、肺、肝臓、脾臓、腎臓、および胃腸管におけるＨＰ３の４つ の調製物に関して、注入後４つの時点での注入した用量(％)／グラムを示す。 第１１図：これは、以下の実施例８５の実験プロトコルの略図である。血液試 料を、注入後−１５、および−５分の時点で、また０.２５、０.５０、１、３、 ５、１０、および２０分の時点で血液学的測定のために集めた。 第１２図：サルにおける末梢ＷＢＣレベルに対するＦor−ＮleＬＦＮleＹＫ− ＤＴＰＡの効果。末梢ＷＢＣカウントを基底レベルのパーセンテージとして表す 。 ４つの用量のペプチド(ng／kg)を使用した。 Ｐ：ペプチド注入； Ｖ：ビヒクル注入。 第１３図：^99mＴc−標識化(Ｆor−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−ＮＨ−(ＣＨ₂)₆−ＮＨ −ＨＹＮＩＣ)注入３〜１２時間後の、大腿が炎症を起こしてる雌のＲhesusサル のγ線カメライメージ。イメージは全て、最も明るいピクセルに標準化する。 第１４図：^99mＴc−ＨＰと¹¹¹Ｉn標識化白血球とを共注入した６〜１８時間後 の、大腿がＥ.coliに深く感染しているウサギのγ線カメライメージ。^99mＴcイ メージを^99mＴcウインドウにおける¹¹¹Ｉn光子に関して補正した。イメージは全 て、初期の^99mＴc−ＨＰイメージにおけるカウントに標準化した。注入２４時間 前に感染を確立した。 第１５図：注入後３、６、および１８時間で、シンチグラフのＲＯＩアッセイ から得られた^99mＴc−ＨＰと¹¹¹Ｉn−ＷＢＣとの標的−対−バックグラウンド比 。各々の点は、６匹の動物に関する平均±ＳＥＭである。全ての場合において、 放射性トレーサー注入２４時間前に動物を感染させた。 第１６図：注入後１８時間で、切削した組織試料に対する直接放射能測定によ り測定した、^99mＴc−Ｈpおよび¹¹¹Ｉn−ＷＢＣに関する標的−対−バックグラ ウンド比。小さい円は^99mＴc−ＨＰに関する全ての値(６匹の動物から得た３０ の試料)を示し、大きい円は平均±ＳＥＭである。小さい四角は¹¹¹Ｉn−ＷＢＣ に関する全ての値(６匹の動物から得た３０の試料)を示し、大きい四角は平均± ＳＥＭである。全ての場合において、注入２４時間前に動物を感染させた。 第１７図：注入後１８時間で、切削した組織試料に対する直接放射能測定によ り測定した、^99mＴc−Ｈpおよび¹¹¹Ｉn−ＷＢＣに関する膿 対 正常筋肉比。各 々の点は、６匹の動物の平均±ＳＥＭである。全ての場合において、注入２４時 間前に動物を感染させた。 好ましい態様の説明 「炎症」および「炎症部位」という用語は、元となる原因または病因に関係な く、組織傷害により個体において起こる状態およびそれらの位置を示すのに使用 する。この組織傷害は、微生物の侵入、自己免疫過程、組織もしくは臓器の同種 移植片拒絶反応、または熱、寒さ、放射エネルギー、電気もしくは化学刺激、あ るいは機械的外傷といったような有害な外部影響から起こり得る。たとえ原因が 何であろうとも、または身体の部位がどこであろうとも、その後の炎症性応答は 極めて類似しており、複雑な機能および細胞調製の組み合わせからなり、微小循 環、体液の移動、および炎症性細胞(白血球)の流入並びに活性化の変化が関与す る。 「感染」という用語は、細菌、ウイルス、真菌、原虫、および他の微生物によ る侵入を示す。 「個体」という用語は、動物、例えば、哺乳動物、特にヒトが含まれることを 意味する。 本明細書中で使用する「アゴニスト」という用語は、レセプターに結合して、 レセプターの機能を刺激する走化性ペプチドである。 本明細書中で使用する「アンタゴニスト」という用語は、レセプター刺激を防 ぐ走化性ペプチドである。アンタゴニストである走化性ペプチドは、細胞レセプ ターに対する親和性を有し、またレセプターに結合することにより、細胞が応答 しないようにする。 本明細書中で投与量に対して適用する「診断上、有効な」という用語は、投与 する検出可能に標識された走化性ペプチドの量が、バックグラウンドのシグナル 以上に感染または炎症部位の検出を可能とするのに十分であることを意味する。 通例、診断のための検出可能に標識された走化性ペプチドの投与量は、患者に おける年令、健康状態、性別、並びに疾患の程度、もしあるなら、反対指標(cou nterindication)、および他の変数といった考慮事項によって変化し、また担当 医により調節されるであろう。投与量は、約０.０１μg／kg〜約２,０００μg／ kg、好ましくは約０.１μg／kg〜約１,０００μg／kgまで変化し得る。 「末端修飾した走化性ペプチド」という用語は、これに制限されるものではな いが、以下の一般構造： Ｘ−Ｙ−Ｌeu−Ｐhe−[Ｚ]n−Ｗ ［式中、 Ｘはアミノ保護基であり、 Ｙはアミノ酸残基であり、 Ｚはスペーサー配列であり、 ｎは０または１であり、また Ｗは標識用または結合置換基である］ を有する分子が含まれることを意味する。 先の一般構造において、Ｘはアミノ保護基、すなわち、アミノ基を保護する基 であり、またこの目的に有用であることが当業者に知られている多くの基のいず れでもあり得る。以下の概要図は、アミノ保護基を走化性ペプチド上に加えるこ とができる幾つかの有用な合成経路を説明する。 通例、走化性ペプチド(「ＣＰ」)上の、アミノ保護基、すなわち、Ｎ−末端保 護基を概念化する場合、その部分を、「スペーサー」によりＣＰから分けられた 「嵩高い」基というよりはむしろ特異的な(singular)単位として考えるのが最も 正確であり得る。これらの保護基部分は両方とも、立体的、静電的、および疎水 的相互作用によりレセプターと相互作用するらしい。従って、全体としての保護 基の組成が、最終的には、ＣＰの活性を決定するであろう。この概念は、例えば 、n−ブチルカルバメートで保護したＣＰが、対応するn−ブチル尿素で保護した ＣＰより約１０倍少ない活性であるという観察により支持される。これらの２つ の保護基は同じ脂肪族側鎖を有するが、結合角、回転の度合、および静電的特性 が異なる。 ＣＰのＮ−保護をカルバメート(ウレタン)から尿素に変えると、Ｎ−末端全体 の形が変化するらしい。尿素は様々な結合角を有し、また回転の自由度が著しく 小さい(カルボニル−Ｏ結合よりカルボニル−Ｎ結合に関してほとんど回転がな い)。これらの効果は、ＣＰ−レセプターへの全体適合に対してある効果を有し 得る。 ＣＰのＮ−末端の静電作用は、尿素を組み込むことで変化するであろう。これ らの静電的相違は、レセプター内における水素結合の相互作用に変化をもたらし 得る。 尿素全体の大きさは、カルバメート全体の大きさと著しく違わないであろう。 しかし、もう一度、尿素の束縛回転が、レセプターへの尿素の適合に対して著し い効果を有する特異的コンホメーションに尿素を閉じ込め得るという例外的可能 性があり得る。このことは、全体の大きさより形に関係する。 ＣＰのＮ−末端が尿素保護基を備えていること関する最も合理的な理由は恐ら く、尿素がカルバメートより、より広い範囲の条件に対してより安定であること である。従って、非常に酸性の条件下におけるその安定性が、Ｃ−末端上のリン カー部分での、より広い範囲の化学的変形を可能とする。 ヘテロ原子を含む尿素類、チオ尿素類、スルホンアミド類、ホスホンアミド類 、グアニジン類、およびスルホニル尿素類といったような、他の関連アミノ保護 基もまた、本発明の範囲内である。 文献は、多くの他のアミノ保護基、例えば、t−ブチルオキシカルボニル、ア セチル、ベンジルオキシカルボニル、ホルミル、チオホルミル、シアノアミジン およびメトキシカルボニルを開示している。 有効な走化性薬剤(それらは、アゴニストまたはアンタゴニストである)はまた 、それらのアミノ末端をi−ブチルオキシカルボニルおよびアルキル(分枝鎖状並 びに環式の両方のＣ₃−Ｃ₆)カルバモイルで保護することにより製造することも できる。 走化性ペプチドに適当な、多くのアミノ保護基を以下に挙げる。その保護基に 関する合成手順は、「Ｐrotecting Ｇroups Ｉn Ｏrganic synthesis」；Ｊohn Ｗiley ＆ Sons：ニューヨーク，１９８１；第６章を参照されたい。 ａ．カルバメート類： シクロプロピルメチルカルバメート、 １−メチル−１−シクロプロピルメチルカルバメート、 ジイソプロピルメチルカルバメート、 ２−メチルチオエチルカルバメート、 １,１−ジメチルプロピニルカルバメート、 t−アミルカルバメート、 シクロペンチルカルバメート、 シクロヘキシルカルバメート、 ９−フルオレニルメチルカルバメート、 １−アダマンチルカルバメート、 １,１−ジメチル−２−２−トリクロロエチルカルバメート、 ２,２,２−トリクロロエチルカルバメート、 １−メチル−１−フェニルエチルカルバメート、 ２,４−ジクロロベンジルカルバメート； ｂ．カルボキシアミド類およびそれらの対応するチオカルボキシアミド類： チオフェンカルボキシアミド、 アダマンチルカルボキシアミド、 ４−ブロモブチリルカルボキシアミド、 シンナミルカルボキシアミド、 ニコチノイルカルボキシアミド； ｃ．尿素類、それらの対応するチオ尿素類およびそれらの対応するシアノグア ニジン誘導体類： ベンジル尿素、 ２,４−ジフルオロフェニル尿素、 １−ナフチル尿素、 フェニル尿素、 ジフェニル尿素、 プロピル尿素、 ヘテロ尿素類； ｄ．スルホンアミド類： ベンゼンスルホンアミド、 ジメトキシベンゼンスルホンアミド、 トルエンスルホンアミド、 ベンジルスルホンアミド、 トリフルオロメチルスルホンアミド； ｅ．ホスホンアミド類： ベンゼンホスホンアミド、 ジメトキシベンゼンホスホンアミド、 トルエンホスホンアミド、 ベンジルホスホンアミド、 トリフルオロメチルホスホンアミド。 本発明の好ましい態様において、Ｘは、 ［式中、 Ｒ³は水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アラルコキシ 、およびアミノよりなる群から選択され、また Ｒ⁴はカルコゲン、好ましくは酸素または硫黄である］ である。 Ｒ³がアルキルである場合、１−６個の炭素原子、さらに好ましくは３−６個 の炭素原子を有するアルキル、すなわち、メチル、エチル、プロピル、ブチル、 ペンチル、ヘキシル、またはそれらの異性体、例えば、イソプロピル、イソブチ ル、sec−ブチル、tert−ブチル、ネオペンチル、２−エチルブチル等であるの が好ましい。イソブチルおよびt−ブチル基が最も好ましい。 Ｒ³がアルケニルである場合、２−６個の炭素原子、さらに好ましくは２−４ 個の炭素原子を有するアルケニル、すなわち、エテニル、プロペニル、ブテニル 、ペンテニル、ヘキセニル、およびそれらの異性体、例えば、イソプロペニル、 イソブテニル、sec−ブテニル、tert−ブテニル、ネオペンテニル、２−エチル ブテニル等であるのが好ましい。 Ｒ³がアルキニルである場合、２−６個の炭素原子、さらに好ましくは２−４ 個の炭素原子を有するアルキニル、すなわち、エチニル、プロピニル、ブチニル 、ペンチニル、ヘキシニル、およびそれらの異性体、例えば、イソプロピニル、 イソブチニル、sec−ブチニル、tert−ブチニル、ネオペンチニル、２−エチル ブチニル等であるのが好ましい。 Ｒ³がアルコキシである場合、１−６個の炭素原子、さらに好ましくは３−６ 個の炭素原子を有するアルコキシ、すなわち、メトキシ、エトキシ、プロポキシ 、ブトキシ、ペントキシ、ヘキソキシ、またはそれらの異性体であるのが好まし い。 Ｒ³がアラルコキシである場合、ベンゾキシ、すなわち、Φ−ＣＨ₂−Ｏ−［式 中、フェニル基(Φ)は置換されていても、または置換されていなくてもよい］で あるのが好ましい。 Ｒ³がアミノである場合、−Ｎ(Ｈ)Ｒ⁵［式中、Ｒ⁵は水素、アルキル、シクロ アルキル、およびアリールよりなる群から選択される］で示される構造を有する ものが好ましい。 Ｒ⁵がアルキルである場合、１−４個の炭素原子、さらに好ましくは３−４個 の炭素原子を有するアルキル、すなわち、メチル、エチル、プロピル、ブチル、 またはそれらの異性体、例えば、イソプロピル、イソブチル、sec−ブチル、ter t−ブチルであるのが好ましい。 Ｒ⁵がシクロアルキルまたはアリールである場合、好ましくはシクロペンチル 、シクロヘキシル、アダマンチル、フェニル、またはジフェニル、さらに好まし くはシクロヘキシルまたはフェニルであり、これらの基は置換されていても、ま たは置換されていなくてもよい。 上記一般構造におけるＹはアミノ酸残基であって、その目的に有用ないずれの 残基であってもよい。本発明の好ましい態様において、Ｙは、 ［式中、Ｒ1はベンジル、アルキル、または−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｒ₂−ＣＨ₃ （ここで、Ｒ²は、 である） である］ である。 Ｒ¹がアルキルである場合、１−６個の炭素原子を有するアルキル、すなわち 、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、またはそれらの異 性体、例えば、イソプロピル、イソブチル、sec−ブチル、tert−ブチル、ネオ ペンチル、２−エチルブチル等であるのが好ましい。さらに好ましくは、Ｒ¹が アルキルである場合、３−４個の炭素原子を有するアルキルである。 本発明の別の好ましい態様において、Ｙは４−アミノテトラヒドロピラン−４ −カルボン酸(Ｔhp)である。Ｔhpにより、ヒト好中球に対する化学結合剤である が、スーパーオキシド産生は刺激しないアナログを産生した。調製して試験した ペプチドは、ホルミル−Ｔhp−Ｌeu−Ｐhe−ＯＭeであった。 上記一般構造において、Ｚは全ての有用な長さのスペーサー配列である。ｎが ０であるか、または１であるかにより、存在してもよく、または存在しなくても よい。ｎが１である場合、Ｚは存在して、脂肪族ジアミンまたは[Ｒ⁶]_m［ここで 、Ｒ⁶はアミノ酸残基であり、またｍは１以上の整数、好ましくは１〜３の整数 である］であるのが好ましい。Ｚはまた、脂肪族ジアミンと[Ｒ⁶]mとの組み合わ せであってもよい。 Ｚが脂肪族ジアミンである場合、１〜６個の炭素原子を有する脂肪族ジアミン 、 例えば、メチレンジアミン、エチレンジアミン、プロピレンジアミン、テトラメ チレンジアミン、ペンタメチレンジアミン、およびヘキサメチレンジアミンであ るのが好ましい。さらに好ましくは、Ｚが脂肪族ジアミンである場合、４〜６個 の炭素原子を有する脂肪族ジアミン、例えば、テトラメチレンジアミン(カダベ リンとしても知られている)、ペンタメチレンジアミン(プトレッシンとしても知 られており、以下、Ｐuと称する)、およびヘキサメチレンジアミンであろう。 Ｚが[Ｒ⁶]mである場合、ｍの値により、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基が 存在するであろう。２つまたはそれ以上の残基が存在する場合、それらは、同じ であっても、異なっていてもよい。スペーサー配列が構成されるアミノ酸は、必 須または非必須の、当業者に周知のいずれのアミノ酸であってもよい。例えば、 Ｒ⁶は、単独の、または組み合わせた、アルギニン、グルタミン酸、リジン、ア スパラギン酸、バリン、システイン、ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、 メチオニン、ヒスチジン、プロリン、トリプトファン、チロシン、アスパラギン 、グルタミン、セリン、トレオニン、アラニン、グリシン、またはフェニルアラ ニンであり得る。本発明の実施においてスペーサー配列としての使用に好ましい アミノ酸残基は、単独の、または組み合わせた、ノルロイシン、チロシン、アス パラギン酸、リジン、ロイシン、およびフェニルアラニンである。 上述のように、Ｗは標識用または結合置換基である。Ｗは、本発明の実施にお いて使用する走化性ペプチドが検出可能に標識することができる部分を示す。「 検出可能に標識する」という用語は、走化性ペプチドが、診断上、検出可能な標 識を結合していることを意味する。 当業者に知られている多くの様々な標識および標識化方法がある。本発明にお いて使用することができる標識のタイプの例には、放射性同位体、常磁性同位体 、および位置発光断層撮影法(ＰＥＴ)によりイメージすることができる化合物が 含まれる。当業者は、本発明において使用する走化性ペプチドに結合するのに適 当な他の標識を知っているであろうし、または通常の実験を利用したりして確か めることができるであろう。さらに、これらの標識の走化性ペプチドへの結合は 、当業者に普及している標準技術を利用して行うことができる。 インビボにおける診断用イメージングに関して、利用可能な検出機器のタイプ は、一定の放射性核種を選択する際の重要な因子である。選択される放射性核種 は、一定のタイプの機器により検出可能である崩壊型を有していなければならな い。一般に、診断用イメージングを視覚化するためのいずれの常法も本発明によ り利用することができる。 インビボにおける診断のために放射性核種を選択する際の重要な別の因子は、 その半減期が、標的組織による取り込みが最大となる時点でもなお検出可能であ る程度に十分長いが、宿主の有害な放射線を最小とする程度に十分短いことであ る。好ましい一態様において、インビボニおけるイメージングに使用する放射性 核種は、粒子を放出しないが、従来のγ線カメラにより容易に検出することがで きる、１４０−２００keＶの範囲内における多数の光子を生ずる。 インビボにおける診断に関して、放射性核種は、直接的に、または中間官能基 により間接的に走化性ペプチドに結合することができる。金属イオン放射性核種 を走化性ペプチドに結合するのに使用されることが多い中間官能基は、キレート 化剤であるジエチレントリアミン五酢酸(ＤＴＰＡ)［Ｈnatowich,Ｄ.Ｊ.，Ｉnt.Ｊ.Ａppl.Ｒadiat.Ｉsot．３３ ：３２７−３３２（１９８２）］およびエチレン ジアミン四酢酸(ＥＤＴＡ)である。Ｔcをペプチドに結合するための他の一般的 なキレート化基には、ジオキシムリガンド類（１）、官能基化シクラム類（２） 、Ｎ₂Ｓ₂リガンド類（３）、およびＮ₃Ｓリガンド類（４）が含まれる。あるい はまた、反応性チオールをイミノチオラン（５）を介してリジン残基に結合する ことができ、または１つまたはそれ以上のcys残基を含むアミノ酸配列を用いて 、チオール残基をペプチドに結合することができる。 走化性ペプチドに結合することができる金属イオンの例は、^99mＴc、¹²³Ｉ、¹³¹ Ｉ、⁹⁷Ｒu、⁶⁷Ｃu、⁶⁷Ｇa、¹²⁵Ｉ、⁶⁸Ｇa、⁷²Ａs、⁸⁹Ｚr、および²⁰¹Ｔlである 。^99mＴcおよび¹¹¹Ｉnが好ましい。 ¹¹¹Ｉn−標識化走化性ペプチドは、ラットにおける感染病巣部位の外部イメー ジングに有効な薬剤である［Ｆishman,Ａ.Ｊ.，Ｊ.Ｎucl.Ｍed．３２：４８３− ４９１（１９９１）］。しかし、ペプチドの短い生物学的半減期が、イメージン グするための¹¹¹Ｉn(ｔ_1/2：６７.９時間)の有効性を減少する。その短い物理的 半減期、高い比放射能、優れたイメージング特性、低コスト、および広範囲にわ たるアベイラビリティーにより、^99mＴcは走化性ペプチドを標識化するための理 想的な放射性核種である。多くの技術が^99mＴcの標識化に使用されているが、ヒ ドラジノニコチンアミド基(ＨＹＮＩＣ)が特に有望である。ヒドラジノニコチン 酸の活性スクシンイミジルエステル(ＳＨＮＨ)は、タンパク中のリジン残基のε アミノ基を誘導体化するのに上手く使用されている。これらのコンジュゲートを 、^99mＴc−グルコヘプトネートのような、Ｔc(Ｖ)オキソ核を有する単一複合体 と共にインキュベーシュンすると、定量的な標識化が起こる［Ａbrams,Ｍ.Ｊ.ら ，Ｊ.Ｎucl.Ｍed．３１：２０２２−２０２８（１９９０）］。 ^99mＴcを用いての高分子の標識化は、３つの主要な方法に分類することができ る：直接標識化、二官能性キレート、および予備形成キレート。ＨＹＮＩＣ(Ｓ ＨＮＨ)リンカーを用いる、現在好ましい標識化方法は、補助リカンドの使用、 例えば、キレート用前駆体の存在下において過テクネチウム酸イオンを還元して 、反応活性な^99mＴc−前駆体の複合体(本明細書中、以下、「補助リガンド」と 呼ぶ)を形成した後、これを二官能的に修飾したＣＰの金属結合基と反応させて 、^99mＴc-ＣＰのコンジュゲートを形成することである。上述のように、^99mＴc −グルコヘプトネートの補助リガンドは、ＳＨＮＨ基で修飾されている放射能標 識化タンパクに使用することができる［Ｓchwartz,Ｄ.Ａ.ら，Ｂioconjugate Ｃ hem．２ ：３３３−３３６（１９９１）］。しかし、このことは、放射能標識化 率を９０％以上で得るために、６０分のインキュベーションと２５mＣi／mg以上 の比放射能を必要とする。ポリヒドロキシアミノ酸トリシンは、ＳＨＮＨで修飾 したポリペプチドおよびタンパクの^99mＴc標識化のための、より有効かつ容易な 標識化前駆体として使用することができる。 トリシン、すなわち、トリス(ヒドロキシメチル)メチルグリシン、およびその アナログは、^99mＴc前駆体を自然形成するための塩化第一スズ還元剤と共に、水 溶液(pＨ ６−８)中で製剤化することができる。「Ｔc−トリシン」補助リガン ドの形成に関する分析は、開始時点でＴcＳnコロイドを定量するために生理食塩 水を、また溶媒前端の時点で過テクネチウム酸塩を定量するためにメチルエチル ケトンを用い、^99mＴc−グルコヘプトネート分析と同様に、ＩＴＬＣ−ＳＧスト リップ上で行う。^99mＴc−グルコヘプトネートと同じ条件下、「Ｔc−トリシン 」溶液(３６mg／ml 前駆体、５０μg／ml 塩化第一スズ、pＨ ６.０)は、ＳＨＮ Ｈで修飾したＩgＧを室温で数分以内に９０％以上放射能標識した。さらに、「 Ｔc−トリシン」溶液は、Ｔc−グルコヘプトネートと比べて、ＩgＧ−ＳＨＮＨ の放射能標識を１５０mＣi／mg タンパク以上の比放射能で＞９０％得ることが できる。高い比放射能での定量的な放射能標識化の利用は、ＳＨＮＨで修飾した 小さい分子、例えば、ＣＰの標識化において、より重要である。 ＨＹＮＩＣで修飾したペプチドは、以下の一般手順により標識することができ る。 ジェネレーターで溶出した^99mＴcＯ₄ ^-(３０mＣi／ml)を、新たに調製したＳn ／トリシン溶液(７２mg／ml トリシン、pＨ ７.０−７.２、１００μg／ml Ｓn Ｃ l₂・２Ｈ₂Ｏ)に撹拌しながら等体積加える。^99mＴc−トリシンの産生を、各々、 コロイドまたは過テクネチウム酸塩を測定するための生理食塩水またはメチルエ チルケトン溶離剤を用いて、ＩＴＬＣ−ＳＧ １×８cm ストリップにより測定す る。ペプチド溶液を待つことなく、^99mＴc−トリシンを加える。１mg／ml ペプ チド溶液、例えば、ibocＭＬＦ−ＨＹＮＩＣヒドラゾンは、ペプチド １mgをエ タノール６００μlに溶解して、僅かに酸性の水４００μlを加えることにより調 製することができる。３０分間放置してヒドラゾンを脱保護したら、ペプチドを 酢酸塩緩衝液(pＨ ５.２)で１：１０に希釈する。^99mＴc−トリシン１００μlを ペプチド溶液 １５μlと混合することにより、^99mＴc−ペプチドのコンジュゲー トを調製する。１時間インキュベートした後、^99mＴc−ペプチドの収率（％）を 、溶離剤として２５％ ｗ／ｗ ＮaＣl溶液を用い、ＩＴＬＣ−ＳＧ １×８cmス トリップにより測定し、ここで^99mＴc−ペプチドは開始時点では残留し、また他 の種は全て溶媒前端に溶離する。 適当な走化性ペプチドの例には、制限なく、以下のものが含まれる： Ｎ−Ｆor−Ｎle−Ｌeu−Ｐhe−Ｎle−Ｔyr−Ｌys−ＤＴＰＡ、 Ｎ−Ｆor−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−Ｐu−ＤＴＰＡ、 Ｎ−Ｆor−Ｎle−Ｌeu−Ｐhe−Ｌys−ＤＴＰＡ、 Ｎ−Ｆor−Ｎle−Ｌeu−Ｐhe−Ｌys(ＮＨ₂)−ＤＴＰＡ、 Ｎ−Ｆor−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−Ｌys−ＤＴＰＡ、 Ｎ−Ｆor−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−Ｄ−Ｌys(ＮＨ₂)−ＤＴＰＡ、 Ｎ−Ａc−Ｎle−Ｌeu−Ｐhe−Ｌys(ＮＨ₂)−ＤＴＰＡ、 Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−メチルエステル、 ＩＢＯＣ−Ｌ−メチオニル(スルホキシド)−Ｌ−Ｌeu−Ｌ−Ｐhe−Ｌ−リジ ンアミド、 ＩＢＯＣ−Ｌ−ノルロイシル−Ｌ−Ｌeu−Ｌ−Ｐhe−Ｌ−リジンアミド、 Ｎ−Ｆor−Ｌ−メチオニル(スルホキシド)−Ｌ−Ｌeu−Ｌ−Ｐhe−ＤＴＰＡ −Ｌ−Ｌys、 Ｎ−Ｆor−Ｌ−メチオニル(スルホン)−Ｌ−Ｌeu−Ｌ−Ｐhe−Ｎ− ＤＴＰＡ−Ｌ−Ｌys、 Ｎ−イソブチル尿素−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−カルボキシレート、 イソブチルオキシカルボニル−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−Ｎ−ＤＴＰＡ−Ｌys、 Ｎ−Ｆor−(Ｄ)-Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−Ｌysアミド溶媒和物、 t−Ｂoc−Ｎle−Ｌeu−Ｐhe−Ｌys溶媒和物、 Ｎ−Ｆor−メチオニル−スルホキシド−Ｌeu−Ｐhe−Ｌysアミド溶媒和物、 Ｎ−Ｆor−メチオニル−スルホン−Ｌeu−Ｐhe−Ｌysアミド溶媒和物、 Ｎ−カルバミル−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−Ｌysアミド溶媒和物、 Ｎ−トリメチルアセチル−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−Ｌysアミド溶媒和物、 イソブチルオキシカルボニル−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−Ｌysアミド溶媒和物、 Ｎ−Ｆor−Ｎle−Ｌeu−Ｐhe−Ｎle−Ｔyr−Ｎ^ε−ＤＴＰＡ−Ｌys、 イソプロピル尿素−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−Ｌys−ＳＨＮＨ−ＢＯＣ、 イソプロピル尿素−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−n−プロピルジアミン−Ａsp−ＳＨ ＮＨ ＨＢr、 イソプロピル尿素−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−Ｌys−Ａsp−ＳＨＮＨ ＨＢr、 イソプロピル尿素−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−Ｌys−ＳＨＮＨ ＨＢr、 Ｎ−フェニル尿素−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe、 イソプロピル尿素−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−プロパンジアミン−ＳＨＮＨ、 Ｎ−n-ブチル−チオ尿素−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe、 Ｎ−n−ブチル尿素−Ｐhe−Ｌeu−Ｐhe−Ｌeu−Ｐhe、 Ｎ−イソプロピル尿素−Ｐhe−Ｌeu−Ｐhe−Ｌeu−Ｐhe−ＣＯＯＨ、 iＢＯＣ−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−ＣＯＯＨ、 iＢＯＣ−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe[アミド(プロピルアミド)カルボキシ−[(プロピ ル)カルボキシ]]−(アミドプロパノール ＳＰＮＨ)エステル、 Ｎ−イソブチル尿素−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−カルボキシレート、 Ｎ−n−プロピル尿素−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe、 Ｎ−t-ブチル尿素−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe、 Ｎ−n−ブチル尿素−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe、 iＢＯＣ−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−(アミドエトキシエチル[３−アミド]−６−プ ロペナールヒドラゾン)−ピリジン、 Ｎ−iＢＯＣ−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−ＳＰＮＨ−チオエステル、 Ｎ−イソプロピル尿素−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe、 Ｎ−iＢＯＣ−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−プロピレンジアミン−ＳＰＮＨ、 シクロヘキシル尿素−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−ＣＯＯＨ、 Ｎ−n−ブチルカルバメート−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−メチルエステル、 Ｎ−iＢＯＣ−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−メチルエステル、 Ｎ−メチルカルバメート−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−メチルエステル、 Ｎ−アダマンチル尿素−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe、 Ｎ−シンナモイル−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe、 Ｐ−トリル尿素−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe、 Ｍ−トリル尿素−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe、 Ｎ−シンナモイル−Ｐhe−Ｌeu−Ｐhe−Ｌeu−Ｐhe。 局所感染並びに炎症部位を同定すること、また特性決定することの他に、本発 明の方法は、個体における炎症の経過をモニターするのに使用することができる 。従って、炎症部位の大きさもしくは数の増加または減少を測定することにより 、感染もしくは炎症過程の他の原因を改善することを目的とした、または炎症過 程そのものを目的とした個々の治療レジメが有効であるかどうかを決定すること が可能である。 別の態様において、本発明は、その部位での炎症の特異的基礎原因を診断する ために使用する。この方法では、先に記載したように、まず最初に、炎症性部位 を有するのではないかと思われる個体に、診断上、有効な量の走化性ペプチドを 与えた後、写真によりイメージして、該部位の存在および位置を測定する。 本発明の実施において使用する走化性ペプチドは、アゴニストであっても、ま たはアンタゴニストであってもよい。幾つかの場合には、使用する濃度により、 あるペプチドは両方ともであり得る。 ペプチドであるiＢoc−ＭＬＦＫおよびiＢoc−ＭＬＦＫ−ＤＴＰＡは、Ｆor− ＭＬＦが刺激する好中球からのフリーラジカルの放出、さらにはまたインビトロ における活性化好中球の血管内皮細胞への接着に拮抗する。アンタゴニスト活性 は、Ｃ−末端を¹¹¹インジウムリンカーＤＴＰＡで修飾することにより保持され る。これらのペプチドは、アゴニスト活性を示さない。 インビボにおけるイメージング研究は、アゴニストペプチドであるホルミル− ノルロイシル−ロイシル−フェニルアラニル−ノルロイシル−チロシル−リジン −ＤＴＰＡ(Ｆor−ＮleＬＦＮleＹＫ−ＤＴＰＡ)とアンタゴニストペプチドであ るiＢoc−ＭＬＦＫ−ＤＴＰＡとを比較することにより行った。¹¹¹Ｉn−標識化 ペプチドは、炎症部位へ迅速に局在化した。その局在化をγ線カメライメージと 組織生体内分布の両方により確認した。２つのペプチドの間の大きな相違は、ア ゴニストペプチドは細胞活性化および辺縁趨向の指標となる、肺、脾臓、および 骨髄といったような領域に局在化するが、アンタゴニストペプチドは局在化しな いことであった。アゴニストペプチドは、白血球カウントにおける一過性降下( 好中球減少)を誘発したが、アンタゴニストペプチドは有意な効果を何ら有して いなかった。これらの結果は、アゴニスト 対 アンタゴニストに関して予期され るものと同じである。アゴニストペプチドは、標的−対−バックグラウンド比を ５時間にわたり改善することを示したが、アンタゴニストペプチドは、１時間で 最大に有効であった。このことは、アゴニストペプチドの場合のような、より高 い結合親和性が、結果的に、標的−対−バックグラウンド比の改善を起こすこと ができ、さらにはまた治療上の利点を有することを示唆する。以前、アンタゴニ ストがイメージング能力を示すかどうかは知られていなかったので、これらの結 果もまた興味がある。アゴニストによる活性化が結合およびイメージングに必要 とされるかもしれないという可能性があったので、そのような能力は、当業者に 明らかではなかった。このことは、実際にはないことが発見された。 アンタゴニストペプチドであるt−Ｂoc−Ｐhe−Ｌeu−Ｐhe−Ｌeu−Ｐheは、 好中球が媒介するリソソーム酵素放出を抑制する。さらに、他のウレタン Ｎ− 末端保護基は、ペプチドをアンタゴニストには転換しないが、むしろアゴニスト (メトキシカルボニルおよびカルボベンゾキシ)に転換する。Ｎ−末端 iＢoc保護 基もまた、アンタゴニストペプチドに適当であり、またＣ−末端のリジンをＤＴ ＰＡで修飾したiＢocペプチドは、適当な生物学的活性を保持する。 本発明は、内皮への接着およびフリーラジカルの放出という、疾患が関連する 好中球機能をアンタゴニストであるiＢoc−ＭＬＦＫにより阻害することを示す ことにより、技術を進歩させる。このペプチドはまた、インビボにおける発病部 位を局部に制限する。さらに、このペプチドは、このことを、白血球数を変える ことなく行う。これらの結果は、接着カスケードを阻止するアンタゴニストペプ チド、および可能性のある他のアンタゴニストの、感染／炎症疾患に対する治療 用および診断用薬剤としての使用を両立する。 ペプチド骨格修飾 上記一般構造のＬeuまたはＰhe部分の１つの代わりに他の化合物を使用するこ ともまた、本発明の範囲内である。 ａ．ロイシン ロイシン残基をジプロピルグリシン(Ｄpg)で置換して、ヒト好中球への化学結 合剤であるアナログを得た。調製して試験したペプチドは、ホルミル−Ｍet−Ｄ pg−Ｐhe−ＯＨであった。 ロイシン残基を１−アミノシクロヘキサンカルボン酸(Ａcc⁶)で置換して、ウ サギの好中球におけるリゾチーム放出の強力な誘発物質であるアナログを得た。 調製して試験したペプチドは、ホルミル−Ｍet−Ａcc⁶−Ｐhe−ＯＨであった。 ｂ．フェニルアラニン フェニルアラニン残基をz−デヒドロフェニルアラニン(z−Ｐhe)で置換して、 ウサギの好中球によりスーパーオキシド産生を刺激するアナログを得た。調製し て試験した化合物は、ホルミル−Ｍet−Ｌeu−z−Ｐhe−ＯＭeであった。 骨格修飾のための置換アミノ酸調製に関する参考文献を以下に挙げる： ａ） ４−アミノテトラヒドロチオピラン−４−カルボン酸(メチオニン置換) は、Ｔｏrriniら，Ｉndian Ｊournal of Ｐeptide Ｐrotein Ｒesearch ３８： ４９５−５０４（１９９１）に開示されている； ｂ） ジプロピルグリシンおよび１−アミノシクロヘキサンカルボン酸(ロイシ ン置換)は、Ｄentinoら，Ｔhe Ｊournal of Ｂiological Ｃhemistry ２８：１ ８４６０−１８４６８（１９９１）に開示されている； ｃ） z−デヒドロフェニルアラニン(フェニルアラニン置換)は、Ｃhauhanら，Ｔetrahedron ４４ ：２３５９−２３６６（１９８８）に記載されている方法を 利用して調製した。 ｄ） ２−アミノインダノン−２−カルボン酸(フェニルアラニン置換)は、Ｇa vuzzoら，Ｉndian Ｊournal of Ｐeptide Ｐrotein Ｒesearch ３７：２６８− ２７６（１９９１）に開示された；また ｅ） アニリノグリシン(フェニルアラニン置換)は、Ｋrausら，Ｅuropean Ｊo urnal of Ｍedicinal Ｃhemistry ２７ ：１９−２６（１９９２）に記載されて いるように調製した。 本発明の別の態様において、走化性ペプチドは、「治療上、コンジュゲートし た」ものであり得、治療用薬剤を感染または炎症部位へ届けるのに使用すること ができる。「治療上、コンジュゲートした」という用語は、走化性ペプチドが治 療用薬剤にコンジュゲートすることを意味する。この方法において使用する治療 用薬剤は、炎症の基礎原因、例えば、感染性生物もくしは腫瘍を、または炎症過 程の成分そのものを目的とする。炎症を治療するのに使用される薬剤の例は、ス テロイド系および非ステロイド系抗炎症性薬物である。非ステロイド系抗炎症性 薬物の多くは、プロスタグランジン合成を阻害する。 本発明の方法により、走化性ペプチドに結合することができる他の治療剤は、 薬物、放射性同位体、レクチン、毒素、および抗微生物剤である。投与する治療 上の投与量は、治療上、有効な量であって、当業者により容易に決定されるであ ろう。該投与量はまた、レシピエントの年令、健康状態、並びに体重、もしある なら、並行して行われる治療の種類、治療の頻度、および例えば、抗炎症性効果 または抗菌効果といったような、望まれる効果の性質にも左右される。 レクチンは、植物から誘導されることの多い、炭水化物に結合するタンパクで ある。多くのレクチンは細胞を凝集することもでき、また幾つかはリンパ球を刺 激する。リシンは、毒性の原因であるα鎖を抗体分子に結合することにより、毒 性効果を部位特異的にもたらすことができる、治療上、使用されている毒性レク チンである。本発明の態様において、リシンのα−鎖を走化性ペプチドにコンジ ュゲートする。 毒素は、十分な投与量で死に至らしめることができる、植物、動物、および微 生物により産生される有毒物質である。Ｃorynebacterium diphtheriaeにより産 生されるタンパクであるジフテリア毒素は、分離可能なαおよびβサブユニット からなる。毒性成分は、走化性ペプチドに結合させて、感染または炎症応答部位 への部位特異的運搬に使用することができる。 治療を目的として走化性ペプチドに結合させ、本発明の方法により使用するこ とができる放射性同位体の例は、¹⁵¹Ｉ、¹³¹Ｉ、⁹⁰Ｙ、⁶⁷Ｃu、²¹⁷Ｂi、²¹¹Ａt 、²¹²Ｐb、⁴⁷Ｓc、¹⁸⁶Ｒe、¹⁸⁸Ｒe、¹⁰⁵Ｒh、¹⁵³Ｓm、および¹⁰⁹Ｐbである。 本発明の実施において有用な抗微生物剤は、細菌、ウイルス、真菌、および寄 生虫を阻害する物質であって［Ｇoodman,Ａ.Ｇ.ら，１９８５（上記）］、全て 当業者に既知であり得る。 本発明の方法により使用する走化性ペプチドまたは特異的抗体にカップリング することができる他の治療剤もまた当業者により知られており、または容易に確 かめることができる。 イメージング走化性ペプチド、または治療上、コンジュゲートした走化性ペプ チドの経口投与用製剤には、無菌の水性または非水性溶液、懸濁液、およびエマ ルションが含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレン グリコール、オリーブ油のような植物油、およびオレイン酸エチルのような注入 用有機エステルである。水性担体には、生理食塩水および緩衝化媒体を含め、水 、アルコール性／水性溶液、エマルションまたは懸濁液、塩化ナトリウム溶液、 リンゲルのデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウムを含め、非経 口用ビヒクル、乳酸化リンゲル、または固定油が含まれる。静脈内用ビヒクルに は、リンゲルのデキストロース等に基づいたもののような、流体および栄養補給 液、電解質補給液が含まれる。例えば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート化剤、 およ び不活性ガスといったような、保存剤および他の添加剤もまた存在し得る。一般 的には、Ｒemington's Ｐharmaceutical Ｓcience，第１６版，Ｍac編，１９８ ０を参照されたい。 本発明のイメージング走化性ペプチド、または治療上、コンジュゲートした走 化性ペプチドの薬剤は、それらの意図する目的を達成する全ての方法により投与 することができる。例えば、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、または舌下 を含め、非経口経路により投与することができる。あるいはまた、または同時に 、経口投与を利用することができる。イメージングするための検出可能に標識さ れた走化性ペプチドの好ましい投与経路は、静脈内経路である。走化性ペプチド は、単一ボーラスで、または段階潅流により投与することができ、その段階潅流 を成し遂げるためには、静脈内の、臑動方法を利用するのが好ましい。 本発明は、これらに制限されるものではないが、筋肉、血管壁、腹部、骨盤、 骨、関節または肺を含め、広範囲にわたる様々な身体部位での感染または炎症を 検出するのに利用することができる。 本発明は、多くの微生物全てによる感染、またはそのような感染、あるいは外 傷、自己免疫過程、もしくは腫瘍により引き起こされる炎症を診断するのに利用 することができる。 本発明はまた、感染または炎症の治療上の処置の効力、またそれらに対する応 答を評価するための方法としても有用である。 先の開示は、一般的に本発明を記載する。以下の具体的な実施例を参照するこ とにより、より完全な理解を得ることができるが、これらは単に説明を目的とし て本明細書中に提供するものであって、特に指示しない限り、制限しようとする ものではない。 実施例１ 実験的細菌感染症の病巣部位のイメージング 走化性ペプチドであるＮ−ホルミル−Ｎle−Ｌeu−Ｐhe−Ｎle−Ｔyr−Ｌysは 当分野でよく公知の標準的固相法を用いて合成した［Ｍerrifield,Ｒ.Ｂ.，Ｊ. Ａm.Ｃhem.Ｓoc. ，１５：２１４９−２１５４（１９６３）；Ｓtewart,Ｊ.Ｍ.お よびＹoung,Ｊ.Ｄ.，Ｓolid Ｐhase Ｐeptide Ｓynthesis，Ｗ.Ｈ.Ｆreeman ＆ Ｃompany，サンフランシスコ，カリフォルニア（１９６９）］。Ｃ−末端リジン のイプシロンアミノ基を環状無水物を使用してＤＴＰＡで修飾した。発生期ペプ チドおよびそのＤＴＰＡ誘導体のＥＣ₅₀は殆ど同一で、約１０^-9Ｍであって、Ｄ ＴＰＡによる誘導体化はこのペプチドの生物学的活性には影響しなかったことを 示した。（検査したペプチド全てで同様な結果が得られた。）高度にマイナス荷 電したＤＴＰＡ基の導入はこのように小さなペプチドの性質を顕著に変化させる であろうと予期したと思われるので、この結果は大変驚くべきことである。この ペプチドは容易に¹¹¹Ｉnで標識された。 Ｓprague−Ｄawley系ラット６匹の左大腿部に健常大腸菌１０⁸個を注射して実 験的に感染させた。標識化ペプチド約１００μＣi(５−１０μg)を感染２４時間 後に注射した。連続的なγ線カメラのイメージは感染部位における局在化による 放射能蓄積のピークが１時間後に起きることを示した（標的−対−バックグラウ ンド比は約４.０であった）。２時間頃には、活性水準は強度が落ち、２４時間 頃には病変は殆ど認められなかった。 これらの結果から、感染症動物モデルにおいて炎症の病巣部位をイメージング するこの新試薬の有用性が確認される。 実施例２ 白血球結合の生体内分布および走化性ペプチドの生物活性 白血球結合：ＤＴＰＡと結合した走化性ペプチド４種を非標識化ペプチドの濃 度を順次増加して[Ｈ³]Ｆor−ＭＬＦを置換する拮抗的結合アッセイにより、ヒ ト好中球への結合について検定した［Ｂabior,Ｂ.Ｍ.ら，Ｊ.Ｃlin.Ｉnvest.， ５２：７４１（１９７３）］。その結果を第１図に示す。非ＤＴＰＡ誘導体化ペ プチド３種を比較のために検定に加えた。 ＳＯＤ産生：ＤＴＰＡと結合した走化性ペプチド４種をヒト好中球によるスー パーオキシド産生の刺激について検定した［Ｐike,Ｍ.Ｃ.ら，Ｍethods in Ｅnz ymol.，１６２：２３６（１９８８）］。これらの結果を第２図に示す。比較の 目的でＭＬＦをこのアッセイに加えた。 生体内好中球減少症：ＤＴＰＡと結合した走化性ペプチド２種を標準的なイメ ージング用量よりも約１０倍高い用量でラットに投与した。注射前５分および注 射後１、２、５、１０、１５および３０分に（尾静脈から）末梢血を採取した。 実験した動物全てにおいて、好中球減少症の有意な誘発はなかった。 実施例３−５ 以下の実施例３〜５はペプチドであるイソブチルオキシカルボニルメチオニル −ロイシル−フェニルアラニル−Ｎ−ジエチレントリアミンペントアセチルリジ ン(iＢoc−ＭＬＦＫ−ＤＴＰＡ)は生体内感染症病巣部位に局在するＦorＭＬＦ による好中球活性化に対するアンタゴニストであることを立証する。局在化は白 血球数の変化なしに起きる。 実施例３ 単離したヒト好中球(２.５×１０⁵)を１μＭ iＢoc−ＭＬＦＫ−ＤＴＰＡで１ ０分間前インキュベーションし、続いてフリーラジカル依存性化学発光の増強剤 として２.８μＭルミノールの存在下、１０nＭ ＦorＭＬＦで刺激した。これら 検定条件下に、この反応は完全に阻害された。後続する研究はこの阻害がＩＣ₅₀ ０.２μＭで用量依存的であることを証明した。 実施例４ ペプチド性アンタゴニストiＢoc−ＭＬＦＫ−ＤＴＰＡとペプチド性アゴニス トホルミル−ノルロイシル−ロイシル−フェニルアラニル−ノルロイシル−チロ ジル−リジン−ＤＴＰＡ(ＦorＮleＬＦＮleＹＫ−ＤＴＰＡ)とをウサギ病巣感染 症モデルで比較した。各ウサギ(２〜３kg)の後肢に大腸菌を使用して病巣感染症 を誘発した。手順については実施例１００Ｂを参照。２４時間後、第一群(ｎ＝ ３)のウサギにはペプチド性アンタゴニストiＢoc−ＭＬＦＫ−ＤＴＰＡを、第二 群(ｎ＝３)にはペプチド性アゴニストＦorＮleＬＦＮleＹＫ−ＤＴＰＡを投与し た。ペプチドは¹¹¹インジウムで約４００μＣi／μg比放射能まで放射能標識し た。各ウサギをケタミン−キシラジンで麻酔し、ペプチド１００μＣiまたは０. ２５μgを耳の辺縁静脈から注射した。５、１５、３０、および６０分後に次の パラメータを測定した：白血球数、全血像、および６０分の時点では動物を屠殺 して生体内組織分布を測定した。アゴニストペプチドは白血球数の一過性低下を 誘発したが、アンタゴニストは誘発しなかった。病巣感染症部位はアゴニストま たはアンタゴニストの注射後１０分後には早くも検出できた。生体内分布は脾臓 および肝臓においてアンタゴニストペプチドよりもアゴニストペプチドの蓄積が 高いことを示した。両ペプチドとも腎臓には急速に蓄積した。血中濃度はアンタ ゴニストの方が僅かに高く、このペプチドの生物学的半減期が長いことを示すの であろう。感染した筋肉の比率は４：１から７：１の範囲にわたり、感染した筋 肉部位への顕著な取込みを示す。アゴニストペプチドは５時間まで標的−対−バ ックグラウンド比が改善したが、アンタゴニストペプチドの比は１時間で最大に なった。これはアゴニストの高い結合親和性を反映するのであろう。前記はアン タゴニスト走化性ペプチドは感染症病巣部位に急速に局在することができ、そこ で感染部位または炎症部位の診断用イメージングに有用性があることを立証する 。これに加え、これらデータはこの特異的受容体が関与する疾患の処置にペプチ ドアンタゴニストが使用される潜在能を示す。 実施例５ 非結合ペプチドiＢoc−ＭＬＦＫを好中球内皮細胞接着アッセイで評価した。 この検定では、５−カルボキシフルオレッセインジアセテートで標識した好中球 (５×１０⁵)を融合性ヒト臍帯静脈内皮細胞を入れた４８穴ディッシュの各穴に 添加した。iＢoc−ＭＬＦＫペプチドを１０μＭ濃度で添加して１０分後に好中 球を３０nＭ ＦorＭＬＦで刺激した。接着百分率は２５分のインキュベーション 期間後に非接着好中球を洗い去って測定した。このペプチドはこの濃度で接着を ６６％阻害した。続いて０.１と３.０μＭとの間の濃度を検査した。このペプチ ドは約１４μＭのＩＣ₅₀で用量依存的に好中球の内皮細胞への接着を阻害した。 接着の阻害は、たとえば好中球のような白血球の患部への浸潤を減少させ、そこ で炎症に伴う組織の損傷を限定する。これらのデータは活性化した白血球に伴う 疾患の処置用にペプチドアンタゴニストを使用することを支持する別の証拠を提 供する。 実施例６〜９８ 本発明の範囲内にあるその他のＣＰ類について、実施例５の操作を反復した。 結果を表Ｉに示す。表中、ＭＰＯは骨髄ペルオキシダーゼアッセイであり、「− 」の記号は３０μＭでの無効を意味し、「＋」記号は３０μＭでの有効を意味し 、「Ｎ.Ｔ.」は３０μＭでの「検定せず」を意味する。 実施例９９ 次に記載する実施例では、Ｍet−Ｌeu−Ｐhe塩化水素塩を通常の液相法により 合成した［Ｂodansky,Ｍ.およびＢodansky,Ａ.，１９８４，「Ｔhe Ｐractice o f Ｐeptide Ｓynthesis」，Ｓpringer Ｖerlag，ニューヨーク］。入手可能なイ ソシアネート類はＡldrichから入手した。入手できなかったイソシアネートはＡ ldrichからのトリホスと所期のアミンとの標準的な反応により製造した。¹Ｈ− ＮＭＲスペクトルは全てＢruker３０ＭＨz装置でＤＭＳＯｄ⁶またはＭeＯＨｄ³ 中で記録し、ＴＭＳ内部基準に対する相対値で報告する。 Ｎ−末端尿素保護ペプチドは遊離アミノペプチドと適当なイソシアネートとの 反応により、好都合に高収率で製造した。Ｎ−n−ブチル−Ｎ'−メチオニル−ロ イシル−フェニルアラニン尿素の例示的合成を次に記載する。Ｍet−Ｌeu−Ｐhe 塩酸塩１.０ｇ(２.２mＭ)を乾燥ＤＭＦ１０ml中に懸濁し、２.２当量の乾燥トリ エチルアミン(.７０ml、５.０ミリモル)を添加し、続いて１.２５当量のn−ブチ ルイソシアネート(.３１ml、２.８ミリモル)を添加した。反応混合物を室温で１ ６時間撹拌し、その後、ＤＭＦを回転蒸発器で除去した。得られた残留物をメタ ノール１mlに溶解し、急速に撹拌しながら、１５mlの１Ｎ−ＨＣｌを加えた。得 られた白色固体(.８１ｇ、７１％)を濾過、水洗し、一夜真空乾燥した。 Ｃ₂₅Ｈ₄₀Ｎ₄Ｏ₅Ｓとして計算したＦＡＢＭＳ：実験値５０９（Ｍ＋１）。 ¹Ｈ−ＮＭＲ（ＭeＯＨ,ｄ⁶）：δ８.１２(ｄ,Ｊ＝８Ｈz,１Ｈ)、８.０１(ｄ, Ｊ＝８Ｈz,１Ｈ)、７.２１(ｍ,５Ｈ)、４.６２(ｍ,１Ｈ)、４.３０(ｍ,１Ｈ)、 ４.２５(ｍ,１Ｈ)、３.１７(ｍ,４Ｈ)、２.４５(ｔ,Ｊ＝７Ｈz,２Ｈ)、１.９５( ｍ,１Ｈ)、１.７７(ｍ,２Ｈ)、１.４０(ｍ,６Ｈ)、.９２(ｍ,９Ｈ)。 実施例１００ この実施例は^99mＴc-標識化走化性ペプチドのアナログが感染症病巣部位の外 部イメージングに有効な試薬であることを証明する。 ヒドラジノニコチンアミド(ＨＹＮＩＣ)で誘導体化された走化性ペプチドのア ナログの４種：Ｆor−ＮleＬＦＫ−ＨＹＮＩＣ（ＨＰ１）、Ｆor−ＭＬＦＫ−Ｈ ＹＮＩＣ（ＨＰ２）、Ｆor−ＭＬＦＮＨ(ＣＨ₂)₆ＮＨ−ＨＹＮＩＣ（ＨＰ３）、 およびＦor−ＭＬＦ−(Ｄ)Ｋ−ＨＹＮＩＣ（ＨＰ４）を合成し、試験管内生物活 性および受容体結合について評価した。 材料および方法 ペプチド合成および構造決定 Ｎ−Ｆor−ノルロイシル−ロイシル−フェニルアラニル−リジン−ＮＨ₂、Ｎ −Ｆor−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニル−リジン、Ｎ−Ｆor−メチオ ニル−ロイシル−フェニルアラニル−ジアミノヘキシルアミド、およびＮ−Ｆor −メチオニル−ロイシル−フェニルアラニル−Ｄ−リジン−ＮＨ₂をＦischman, Ａ.Ｊ.がＪ.Ｎucl.Ｍed.，３２：４８３−４９１（１９９１）に記載したように して標準的固相技術により合成し、精製した［Ｍerrifield,Ｒ.Ｂ.，Ｊ.Ａm.Ｃh em.Soc. ，１５：２１４９−２１５４（１９６３）；Ｓtewart,Ｊ.Ｍ.およびＹou ng,Ｊ.Ｄ.，Ｓolid Ｐhase Ｐeptide Ｓynthesis，Ｗ.Ｈ.Ｆreeman ＆ Ｃompany ，サンフランシスコ，カリフォルニア（１９６９）］。試薬は全て商業的供給元 から得られる最高級品を入手した。これら化合物のニコチニルヒドラジンとの結 合は以下にＨＰ３について記載するようにして行った。 Ｎ−Ｆor−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−ジアミノヘキシルアミド１８６mgにジメチルホ ルムアミド(ＤＭＦ)２mlおよびジイソプロピルエチルアミン６０μl、続いてサ クシンアミジル−６−t−Ｂoc−ヒドラジノピリジン−３−カルボン酸１５４mg ［Ａbrams,Ｍ.Ｊ.ら，Ｊ.Ｎucl.Ｍed.，３１：２０２２−２０２８（１９９０） ］のＤＭＦ１ml溶液を添加した。この混合物は黄色になり、ペプチドは短時間に 溶解した。２時間後、反応混合物にエーテル−石油エーテルを添加し、上層を廃 棄した。油状残留物に水を添加すると固体が形成された。固体を５％炭酸水素ナ トリウム、水、および酢酸エチルで洗浄して生成物１８３mgを得た。粗製の生成 物をp−クレゾール０.１mlを含有するトリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)５mlとともに２ ０℃で１５分間撹拌してt−Ｂoc−保護基を除去した。ＴＦＡとともに長時間処 理すると副産物濃度の増加を招いた。ＴＦＡを回転蒸発器で除去し、残留物にエ ー テルを加えて脱保護ペプチドの沈殿を得た。生成物をＷhatmanＯＤＳ−３の２. ５×５０cmカラム上、逆相ＨＰＬＣで精製し、０.１％ ＴＦＡ中のアセトニトリ ル勾配で溶離した。主成分を含む画分を集め、溶媒を除去して所望の生成物を得 た。ペプチドはＵＶおよび質量スペクトルならびにアミノ酸分析により構造決定 した。細胞標本 ３％ デキストラン［Ｐharmacia，Ｎutley，ニュージャージー］中の沈降法と それに続くＬymphoprep(Ｏrganon Ｔeknika，Ｄurham，ノースカロライナ］によ る勾配遠心分離によってヒト末梢血多形核白血球(ＰＭＮ)を分離した。ライト染 色標本の光学鏡検による評価によれば、細胞標本は＞９５％のＰＭＮを含有して いた。Ｆor−ＭＬＦ受容体結合アッセイ Ｎ−ホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニン(Ｆor−ＭＬＦ)、Ｎ −ホルミル−ノルロイシル−ロイシル−フェニルアラニン(Ｆor−ＭＬＦ)および Ｎ−ホルミル−ノルロイシル−ロイシル−フェニルアラニル−ノルロイシル−チ ロジル−リジン(ＦorＮleＬＦＮleＹＫ)はＳigma［Ｓt.Ｌouis，ミズーリ］から 入手した。Ｆor−ＭＬ[³Ｈ]Ｆ(６０Ｃi／ミリモル)はＮew Ｅngland Ｎuclear［ Ｂoston、マサチューセッツ］から入手した。 分離したヒトＰＭＮ(健常ボランティアから採取)８×１０⁵個を１.７mＭ ＫＨ₂ ＰＯ₄、８.０mＭ Ｎa₂ＨＰＯ₄、０.１１７Ｍ ＮaＣl、０.１５mＭ ＣaＣl₂、０ .５mＭ ＭgＣl₂、および１.０mＭ ＰＭＳＦを含有するリン酸緩衝液食塩水、ｐ Ｈ７.４(インキュベーション緩衝液)中、誘導体化したペプチドおよび１５nＭ Ｆor−ＭＬ[³Ｈ]Ｆ［Ｄuel,Ｔ.Ｆ.ら，Ｐroc.Ｎatl.Ａcad.Ｓci．ＵSＡ ７８（ １） ：４５８4−４５８７（１９８１）；Ｆischman,Ａ.Ｊ.ら，Ｊ.Ｎucl.Ｍed． ３２ ：４８３〜４９１（１９９１）；Ｐike,Ｍ.Ｃ.ら，Ｍethods Ｅnzymol．１ ６２ ：２３６−２４５（１９８８）］の種々の濃度の存在および不在下に、全容 積０.１５ml中、４５分間２４℃でインキュベーションした。インキュベーショ ンに続いて、細胞をガラス繊維ディスク［ＷhatmanＧＦ／Ｃ，Ｗhatman,Ｉnc.， Ｃlifton，ニュージャージー］で濾過し、これを次に氷冷インキュベーション緩 衝液２０mlで洗浄した。フイルターをＳafety−Ｓolve［Ｒesearch Ｐroducts Ｉnternational Ｃorp，Ｍt.Ｐrospect，イリノイ］１０mlとともにシンチレー ションバイアルに入れて液体シンチレーションスペクトル分析法により放射能を 測定した。特異的結合は全結合マイナス非特異的結合として定義する。非特異的 結合は１０μＭ 非標識化Ｆor−ＭＬＦ存在下における残留結合放射能の量とす る。非特異的結合は全結合の約１０％であった。 結合親和性に対する^99mＴcでの放射能標識の影響を測定するため、分離したヒ トＰＭＮ(２×１０⁶細胞)をＨＢＳＳ／ＢＳＡ中、種々の濃度のＦor−ＮleＬＦ ＮleＹＫまたは対応する非標識化ペプチドおよび一定量の^99mＴc−標識化ペプチ ドの存在または不在下に、全容積０.１５ml中、６０分間４℃でインキュベーシ ョンした。インキュベーション後、よく混合した細胞懸濁液の一部分(０.１ml) を０.４mlマイクロ遠心分離管中に入れたＨＢＳＳ／ＢＳＡ：Ｌymphoprep（１： １）０.２mlに層積し、内容物を毎分１５０００回転で４分間遠心分離［Ｅ型Ｍi crofuge，Ｂeckman，Ｃolumbia，メリーランド］した。管を液体窒素で凍結し、 細胞ペレットを分離した。放射能はγ線を計測して測定した。非特異的な結合は ５μＭ 非標識化ＦorＮleＬＦＮleＹＫまたは対応する非標識化ペプチドの存在 下における残留結合放射能の量とする。非特異的結合は全結合の約１０％であっ た。スーパーオキシド産生の検定 ホルボールミリステートアセテート(ＰＭＡ)およびサイトカラシンＢはＳigma ［Ｓt.Ｌouis，ミズーリ］から入手した。スーパーオキシドの放出は２９.５／ ミリモル／Ｌ／cmの吸光係数を使用するフェリチトクロームＣのスーパーオキシ ドジスムターゼ阻害性還元を監視することによって検定した。略述すれば、分離 したヒト好中球をハンクの平衡塩溶液(ＨＢＳＳ)［ＧＩＢＣＯ、Ｇrand Ｉsland ，ニューヨーク］とインキュベーションした。ＨＢＳＳ単独または１０μＭ サ イトカラシンＢプラスまたはマイナススーパーオキシドジスムターゼ(５０μg／ ml)の存在下、ペプチド(ＨＰ１、ＨＰ２、ＨＰ３、ＨＰ４、ＦorＮleＬＦ、Ｆor −ＭＬＦまたはＦor−ＮleＬＦＮleＹＫ)を１nＭから１μＭに至る範囲にわたる 各種 濃度を含むＨＢＳＳと３７℃で１０分間。フェリシトクロムＣの還元は分光光学 的に測定した。ＨＹＮＩＣ誘導体化走化性ペプチドの^99mＴc標識 過テクネチウム酸^99mＴc(⁹⁹Ｍo／^99mＴc−発生源)とグルコヘプトン酸錫(Ｇlu coscan)とはＮew Ｅngland Ｎuclear［Ｂoston，ＭＡ］から入手した。^99mＴc− グルコヘプトネートを使用してヒドラジノニコチンアミド結合ペプチドを標識す るために必要なＴc(Ｖ)オキソ種を得た。凍結乾燥キットに０.９％ ＮaＣl中の 過テクネチウム酸^99mＴc約２.５mlを添加した。最終放射能濃度は５〜１０mＣi ／mlであり、生成物の放射化学的純度は移動相溶媒としてアセトンおよび０.９ ％ ＮaＣlの両方を用いる迅速(instant)薄層シリカゲルクロマトグラフィー(Ｉ ＴＬＣ−sg)双方により測定した。 次の操作を用いて走化性ペプチドのアナログを^99mＴcで放射能標識した。ペプ チド約０.２mgをジメチルスルホキシド５０μlに溶解し、溶液をpＨ５.２の０. １Ｍ 酢酸緩衝液で０.１mg／mlの最終濃度に希釈した。ペプチド溶液１／２mlを 洗浄したガラスバイアル中に入れ、^99mＴcグルコヘプトネート０.５mlを添加し た。混合物を簡単にかきまぜ、室温に１時間放置した。放射化学的純度はアセト ン、０.９％ ＮaＣl、およびアセトン：水（９：１）の溶媒系３種中でのＩＴＬ Ｃ−sgにより測定した。 ^99mＴc標識化ペプチドのアナログは系２種を使用する逆相ＨＰＬＣによっても 分析した。系ＡはＢeckmanＣ₁₈逆相カラム［５μ，４.５×４６mm，Ｂeckman， Ｃolumbia，メリーランド］を次の溶離条件で採用した：溶媒Ａ：５０mＭ アセ テート中、５％ アセトニトリル、pＨ５.２；溶媒Ｂ：５０mＭ アセテート中、 ５０％ アセトニトリル、pＨ５.２；勾配：０％ Ｂから１００％ Ｂまで２０分 間；流速２ml／分。系ＢはＶydacＣ₁₈逆相カラム［３００Å，５μ，４.５mm× ２５cm，Ｖydac］を次の溶離条件で採用した：溶媒Ａ：０.１％ トリフルオロ酢 酸水；溶媒Ｂ：０.１％ トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液；勾配０％ Ｂか ら１００％ Ｂまで1０分間；流速２ml／分。ＵＶ吸収はＭilton−Ｒoy／ＬＤＣ 流通分光分析系で監視し、放射能はＢeckman１７０型［Ｂeckman，Ｃolumbia， メリーランド］を用いて監視した。両検出器からの出力を記録し、二重経路積分 器［Ｗaters７４６型データモジュール，Ｗaters，Ｍarlboro，マサチューセッ ツ］を使用して分析した。比放射能の最大化 走化性ペプチドのアナログの薬理学的用量に伴う好中球減少効果を避けるため に、ペプチドの最終的投与量である^99mＴcのイメージング用量が活性化について の既知ＥＣ₅₀濃度(〜２０nＭ)より十分低くなるように^99mＴc標識化走化性ペプ チドの比放射能を最大化した。 ^99mＴc発生源を前回の溶離後５時間後に溶離して^99mＴc溶離物を＞３００mＣi に維持しながら、⁹⁹Ｔcの比率を最小化することを試みた。Ｔcの量および⁹⁹Ｔc と^99mＴcとの相対的比率を発生源の力学的等式を用い、⁹⁹Ｍo／^99mＴc発生源の 既知の経過を勘案して算出した。^99mＴcグルコヘプトネート(Ｔc−ＧＨ)は前記 のように製造した。走化性ペプチド(分子量：７２０)約１８０μgをＤＭＳＯ５ ０μlに溶解し、０.１Ｍ 酢酸緩衝液、ｐＨ５.２で最終濃度１００μg／mlに希 釈した。ペプチド溶液適量を酢酸緩衝液で順次希釈して２から８０μg／mlの濃 度範囲を得た。^99mＴc−ＧＨ０.５mlを等容積のペプチドの酢酸緩衝液に添加し てペプチドの標識を開始した。溶液を簡単にかきまぜて室温で１時間インキュベ ーションした。ペプチド標識の程度は溶媒系：アセトン、０.９％ ＮaＣl、およ びアセトン：水（９：１）を使用するＩＴＬＣ−sg３種によって測定した。放射 能標識化ペプチドの比放射能は関係式： （％ ＲＣＹ×存在するmＣi）／μモルペプチド×１００） を使用して算出した。生体内研究 動物で３種類の研究を行った：Ａ）健常動物での放射能標識化ペプチドのアナ ログの生体内分布を決定するために、各アナログについて生体内分布研究を行っ た；Ｂ）放射能標識化ペプチドのアナログが炎症の病巣部位に局在化する能力を 決定するため、大腸菌感染症のラットについて組織の放射能測定を行った；Ｃ） 放射能標識化ペプチドの感染症のイメージング性能を評価するために、大腸菌感 染ウサギでγ線写真撮影を行った。Ａ．正常ラットにおける生体内分布 体重約１５０ｇの正常雄性Ｓprague−Ｄawleyラット［Ｃharles Ｒiver Ｂree ding Ｌaboratories，Ｂurlington，マサチューセッツ］２４匹の群を^99mＴc標 識化ペプチド各５μＣiを注射して、５、３０、６０、および１２０分での生体 内分布を決定した（各時点で各ペプチドを動物６匹で評価した）。血液、心臓、 肺臓、肝臓、脾臓、胃、腎臓、消化管、骨格筋、睾丸、および骨の標本を秤量し 、放射能をウェル型γ線計数器［ＬＫＢ＃１２８２型、Ｗallac Ｏy、フィンラ ンド］で測定した。放射能崩壊を補正するため、注射用量の一部を同時に計数し た。結果は注射したグラム当り用量に対する百分率として表現した。Ｂ．感染ラットでの研究 大腸菌臨床分離単一株を採用して感染病巣を作製した。この細菌をトリプチカ ーゼ大豆寒天板上、一夜３７℃でインキュベーションし、各コロニーを無菌０. ９％ ＮaＣlで希釈し、約２×１０⁹菌／mlを含む懸濁液を作製した。体重約１５ ０ｇの雄性Ｓprague−Ｄawleyラット［Ｃharles Ｒiver Ｂreeding Ｌaboratori es，Ｂul1ington，マサチューセッツ］をケタミンで麻酔し、左後肢大腿部に約 ２×１０⁸個の菌を含む懸濁液０.１mlを筋肉内注射した。 細菌接種２４時間後、感染大腿部に大きな腫脹が認められた動物に側部尾静脈 から^99mＴc標識化ペプチド約５μＣi(３pモル)を注射した。注射３０および１２ ０分後に動物５匹の群を頚部脱臼によって屠殺した。組織標本採取、放射能測定 、および結果の計算は前記の通りに実行した。Ｃ．感染ウサギのイメージング これら試薬の好中球減少効果に感受性のある動物での感染位置の決定に放射能 標識化走化性ペプチドを使用する可能性を検討するため、ウサギの大腸菌病巣感 染についてイメージング研究を実行した。高比放射能^99mＴc−標識化走化性ペプ チドをこれら研究に使用した。体重２〜３kgの雄性ニュージーランド白色ウサギ ６羽をケタミンおよびキシラジン(１５.０および１.５mg／kg)で麻酔し、その左 後肢大腿部筋肉内に大腸菌約２×１０⁹の懸濁液１.０mlを注射した。接種２４時 間後、感染大腿部に大きな腫脹が認められた兎に縁辺部耳静脈から６００〜１０ ００μＣiのＨＰＬＣ精製^99mＴc−標識化ＨＰ２（前記ＨＰＬＣで非標識化ペプ チドから分離した比放射能＞１００００mＣi／μモルのもの）を注射した。動物 をケタミンおよびキシラジン(１５.０および１.５mg／kg)で麻酔し、注射の０か ら３時間後および１６から１７時間後に高解像度平行ホールコリメータを装着し 、専用コンピュータ［Ｔechnicare ５６０，Ｓolon，オハイオ］と連結した大視 野γ線カメラ［Ｔechnicare Ｏmega ５００，Ｓolon，オハイオ］を使用して逐 次シンチグラムを撮影した。イメージは^99mＴcの１４０ＫeＶフォトピークを中 心に含むようにした１５％ウインドウで５分／視野に時間設定をして記録した。 標識化ペプチドの局在の特性を見るため、目的領域(ＲＯＩ)分析を行い、感染大 腿部の筋肉と対側性正常大腿部の筋肉とを時間の関数として比較した。 最終イメージを撮影した後、動物を過剰用量のペントバルビタールで屠殺し、 前記の通り血液、心臓、肺臓、肝臓、脾臓、腎臓、胃、小腸、睾丸、骨、骨髄、 正常骨格筋、感染骨格筋、および膿の標本を秤量し、放射能を測定した。放射能 崩壊を補正するため、注射薬剤適量を同時に計数した。結果はグラム当り注射用 量の百分率で表現した。循環中の血球結合活性の量を決定するため、血液を遠心 分離して血球および血漿を分離した。血球を０.９％ ＮaＣlで洗浄し、血球およ び上清の中の残留放射能を測定した。感染部位における血球に結合した活性の量 を決定するために、膿を０.９％ ＮaＣlを使用して２回洗浄し、血球および可溶 性画分中の残留放射能を測定した。統計的方法 イメージングおよび生体内分布の研究結果は器官と時間とを分類変数とし、％ ＩＤ／ｇまたは％ ＩＤ／器官＝器官＋時間＋器官×時間とする線形モデルの分 散分析(ＡＮＯＶＡ)により評価した。ペプチド濃度のpost−hoc比較はダンカン の新多重範囲アッセイ［Ｄuncan,Ｄ.Ｂ.，Ｂiometrics，１１，１−４２（１９ ５５）］によって実行した。各Ｆ値の第一サブスクリプトは第１分類変数（ｎ− １）、第２分類変数（ｍ−１）、または交互作用項（ｎ−１）×（ｍ−１）の自 由度の数値である。第二サブスクリプトは自由度残差の数（全観測数−ｎｘｍ） である。結果は全て平均値±ＳＥＭで表記する。 結果 ペプチド合成 ＨＹＮＩＣ誘導体化走化性ペプチドのアナログ４種全てを高い収率および純度 で製造した。ＵＶ分析はペプチド４種全てでＨＹＮＩＣ基特有の２６８および３ １５nmに吸収極大値を示した。質量スペクトルおよびアミノ酸分析によって所望 の結合ペプチド生成物と一致することが見出された。走化性ペプチドのアナログの生物学的活性 スーパーオキシド産生検定の結果を第３図に示す。最高反応の５０％が起きる ペプチド濃度(ＥＣ₅₀)を表IIに示す。ペプチドＨＰ２、ＨＰ３、およびＨＰ４は Ｆor−ＭＬＦ(１００nＭ)と同等またはそれ以上の力価を示した。ＨＰ１の力価 は少なくとも１桁低い。そこで、スーパーオキシド産生力価の順序はＨＰ２＞Ｈ Ｐ３＞ＨＰ４＞＞ＨＰ１であった。 スーパーオキシドアニオン産生最大量として定義されるペプチドの効率は検査 したペプチド全てについて同程度であって、２.０７から３.０８モル産生Ｏ₂ ^-／ １０⁶細胞／１０分間の範囲であった。ペプチド全ての効率はＰＭＮ酸化性バー ストの無関連性活性化剤であって、０.１μＭの濃度で２２.９モル産生Ｏ₂ ^-／１ ０⁶細胞／１０分間の最大反応を示すホルボールミリステートアセテート(ＰＭＡ )の効果よりも低かった。化学誘引性受容体への走化性ペプチドのアナログの結合 第４図はＨＹＮＩＣ誘導体化走化性ペプチドのアナログがスーパーオキシドア ニオン産生力価と類似するオーダーの力価で、無傷なヒトＰＭＮへのＦor−ＭＬ [³Ｈ]Ｆの結合を阻害することを示す。Ｆor−ＭＬ[³Ｈ]ＦのヒトＰＭＮへの結合 に５０％阻害を起こすに必要なペプチド濃度(ＥＣ₅₀)は表IIに示す。ペプチドＰ Ｈ２、ＰＨ３、およびＰＨ４はヘキサペプチドＦorＮleＬＦＮleＹＫのそれと類 似のＥＣ₅₀値を示す。化学誘引性受容体に対するＨＰ１の親和性は、この系列の その他のＨＹＮＩＣ誘導体化ペプチドより約１００倍低い一方で、Ｆor−ＭＬＦ よりも力価は２倍低いに過ぎない。トリペプチドＦor−ＮleＬＦはヘキサペプチ ドおよびＦor−ＭＬＦのどちらより１００倍以上低い力価を示す。それ故に、化 学誘引性受容体に対する親和性の順序はＨＰ３＞ＨＰ２＞ＨＰ４＞＞ＨＰ１であ った。^99mＴc−ＨＰ２に対するＥＣ₅₀は＜１０nＭであった。 受容体結合に対する^99mＴc標識の効果を決定するため、前記検定条件を使用し て非標識化ＨＹＮＩＣ−ペプチドが^99mＴc標識化ペプチドを置換する能力を評価 した。これら実験結果は^99mＴc標識化ペプチドの好中球結合の５０％を置換する のに必要な非標識化ペプチドの濃度はＦor−ＭＬ[³Ｈ]Ｆをトレーサーとして使 用する時よりも約１０倍高いことを立証している。この結合親和性増加は、もし 放射能標識種がＴc−グルコヘプトネート１個についてペプチド単位１個または それ以上を含み、さらに結合が協働的であるならば説明できる。 ^99mＴcによる放射能標識 放射能標識を監視するために用いた溶媒系におけるシリカゲル板上迅速薄層ク ロマトグラフィーでの^99mＴc標識化ペプチドおよび^99mＴc−グルコヘプトネート のＲf値は次の通り：０.９％ ＮaＣl−^99mＴc−ペプチド＝０.０、^99mＴc−グル コヘプトネート＝１.０；アセトン−^99mＴc−ペプチド＝１.０、^99mＴc−グルコ ヘプトネート＝０.０；およびアセトン：水（９：１）−^99mＴc−ペプチド＝１. ０、^99mＴc−グルコヘプトネート＝０.０。第３の系はアセトン単独と比較して 、ピークのテイリングが少なく、鋭い^99mＴc−ペプチドバンドを得た。^99mＴc− ペプチド生成物全てについて、インキュベーション１時間後では放射能の＞９０ ％がペプチドに随伴していることをＩＴＬＣによって立証した。ＨＰＬＣシステ ムＡを使用する標識化ペプチドの分析で^99mＴc−グルコヘプトネート、^99mＴc− ＨＰ１、^99mＴc−ＨＰ２、^99mＴc−ＨＰ３、および^99mＴc−ＨＰ４の主な放射能 ピークが各々保持時間０.３〜０.５、１４.３７、１１.２５、１５.１１、およ び１２.９６分であることが立証された。比放射能の最大化 ⁹⁹Ｍo／^99mＴc発生源の溶離は全活性４５６mＣiを与えた。Ｔcの総量は３.４n Ｍであり、⁹⁹Ｔc対^99mＴcの比率は１.５３：１であり、^99mＴcの比放射能は１３ ４０００mＣi／マイクロモルであると算出された。^99mＴc−グルコヘプトネート (Ｔc−ＧＨ)は前記の通りに製造した；製造時点での最終放射能濃度＞１５０mＣ i／ml。アセトンあるいは０.９％ ＮaＣlを使用する迅速薄層クロマトグラフィ ーによって、^99mＴc−ＧＨの放射化学的純度は＞９５％であると測定された。 走化性ペプチドアゴニストアナログの薬理学的力価は、注射する溶液に存在す るペプチドの絶対量減少のための高比活性放射能標識を必要とする。理想的には 、この比放射能の水準は精製の必要なしに達成すべきである。第５図はペプチド 濃度の標識化率への影響を要約する。これらデータから、反応混合物の最終ペプ チド濃度が放射化学的収率に顕著な影響を持ち、ペプチド濃度１０μg／ml以下 の濃度では標識化率が低いことが明らかである。結果を反応液中のペプチド対Ｔ cモル比と相関的に表示する時、この比率が増加すると放射化学的収率（％）が 増加し、比放射能が低下することが明らかである。 この操作を使用して比放射能＞１００００mＣi／モルの達成は可能である；し かしながら、放射化学的収率は１０μg／ml以下のペプチド濃度では実質的に減 少する。＜１０μg／mlのペプチド濃度では非結合^99mＴcを除去する精製段階が 必要である。非反応^99mＴc−グルコヘプトネートと^99mＴcＯ₄ ^-との除去は逆相Ｓ ep−Ｐaksで達成することができる。これ以上の比放射能増加は非反応ペプチド をＨＰＬＣ（系Ｂを使用）で除去することにより得ることができる。^99mＴc標識 化ペプチド、非標識化ペプチド、および^99mＴc−グルコヘプトネートに対応する ピークはこのＨＰＬＣシステムでよく分離できるので、担体のない放射能標識化 ペプチドを分離できる。これらの条件下、放射能標識化ペプチドの比放射能は^{99 m} Ｔc発生源からの溶離物の比放射能によってのみ限定される。健常ラットにおける^99mＴc走化性ペプチドの生体内分布 ^99mＴc標識化走化性ペプチドのアナログ４種の生体内分布を表IIIに示す。生 体内実験全てで、動物は放射能標識化走化性ペプチドのアナログの静脈内投与に 対して病的影響の所見なしに忍容した。腎臓、胃、消化管を例外として、ペプチ ド全ての組織内濃度は時間とともに低下した。 血液中では、ＡＮＯＶＡはペプチド(Ｆ_3,70＝５６.７９、ｐ＜０.０００１)と 時間(Ｆ_3,70＝２５２.０１、ｐ＜０.０００１)との有意な主効果を立証した；し かしながら、ペプチド対時間交互作用は有意ではなかった。ペプチド血中濃度の 順序はＨＰ１＞ＨＰ２＞ＨＰ３＞ＨＰ４(ｐ＜０.０１)であった。心臓組織では 、ＡＮＯＶＡはペプチド(Ｆ_3,64＝４４.３６、ｐ＜０.０００１)と時間(Ｆ_3,64 ＝９８.０６、ｐ＜０.０００１)との有意な主効果、および有意なペプチド対時 間交互作用(Ｆ_9,64＝３６.９、ｐ＜０.００１)を示した。肺臓では、ＡＮＯＶＡ はペプチド(Ｆ_3,6570＝１８３.２５、ｐ＜０.０００１)と時間(Ｆ_3,65＝２４.５ ６、ｐ＜０.０００１)との有意な主効果、および有意なペプチド対時間交互作用 (Ｆ_9,65＝１３.８０、Ｐ＜０.０００１)を立証した。ペプチド濃度の順序はＨＰ ３＞＞ＨＰ１＝ＨＰ４＝ＨＰ２(ｐ＜０.０１)であった。肝臓では、ＡＮＯＶＡ はペプチド(Ｆ_3,65＝１０００.００、ｐ＜０.０００１)および時間(Ｆ_3,65＝１ ２.８ ０、ｐ＜０.０００１)の有意な主効果を示した；しかしながら、ペプチド対時間 交互作用は有意でなかった。肺臓でと同様に、濃度の順序はＨＰ３＞＞ＨＰ１＝ ＨＰ４＞ＨＰ２(ｐ＜０.０１)であった。脾臓では、ＡＮＯＶＡはペプチド(Ｆ_{,6 33} ＝４３１.００、Ｐ＜０.０００１)の有意な主効果および有意なペプチド対時 間交互作用(Ｆ_9,63＝４.６４、ｐ＜０.０００１)を立証した。この器官では時間 の主効果は有意でなかった。ペプチド濃度の順序はＨＰ３＞＞ＨＰ２＝ＨＰ４＝ ＨＰ１(ｐ＜０.０１)であった。腎臓では、ＡＮＯＶＡはペプチド(Ｆ_3,69＝２９ １.５８、ｐ＜０.０００１)と時間(Ｆ_3,69＝４０.１４、ｐ＜０.０００１)との 有意な主効果、および有意なペプチド対時間交互作用(Ｆ_9,69＝１０.９４、ｐ＜ ０.０００１)を示した。ペプチド濃度の順序はＨＰ４＝ＨＰ１＞ＨＰ２＞＞ＨＰ ３(ｐ＜０.０１)であった。胃では、ＡＮＯＶＡはペプチド(Ｆ_3,53＝２０２.９ ８、ｐ＜０.０００１)と時間(Ｆ_3,53＝３.１０、Ｐ＜０.０５)との有意な主効果 、および有意なペプチド対時間交互作用(Ｆ_9,53＝５.５６、ｐ＜０.０００１)を 立証した。ペプチド濃度の順序はＨＰ３＞ＨＰ４＝ＨＰ２(ｐ＜０.０１)であっ た。消化管では、ＡＮＯＶＡはペプチド(Ｆ_3,62＝６６.３０、Ｐ＜０.０００１) と時間(Ｆ_3,62＝３６.３２、ｐ＜０.０００１)との有意な主効果、および有意な ペプチド対時間交互作用(Ｆ_9,62＝５.５６、ｐ＜０.００５)を示した。ペプチド 濃度の順序はＨＰ３＝ＨＰ２＞ＨＰ４＝ＨＰ１(ｐ＜０.０１)であった。睾丸で は、ＡＮＯＶＡはペプチド(Ｆ_3,67＝２６.９７、ｐ＜０.０００１)と時間(Ｆ_{3,6 7} ＝１４.９４、ｐ＜０.０００１)との有意な主効果、および有意なペプチド対時 間交互作用(Ｆ_9,67＝４７７.、ｐ＜０.００１)を立証した。ペプチド濃度の順序 はＨＰ４＝ＨＰ１＞ＨＰ３＝ＨＰ２(ｐ＜０.０１)であった。骨格筋では、ＡＮ ＯＶＡはペプチド(Ｆ_3,59＝４８.７０、ｐ＜０.０００１)と時間(Ｆ_3,59＝９７. ６９、ｐ＜０.０００１)との有意な主効果を示した。しかしながら、ペプチド対 時間交互作用は有意でなかった。ペプチド濃度の順序はＨＰ１＞ＨＰ２＝ＨＰ４ ＞ＨＰ３(ｐ＜０.０１)であった。骨では、ＡＮＯＶＡはペプチド(Ｆ_3,68＝３０ .１５、ｐ＜０.０００１)と時間(Ｆ_3,68＝５２.８４、ｐ＜０.０００１)との有 意な主効果、および有意なペプチド対時間交互作用(Ｆ_3,68＝５.１５、ｐ＜０. ０ ００１)を立証した。ペプチド濃度の順序はＨＰ１＞ＨＰ４＝ＨＰ２＝ＨＰ３(ｐ ＜０.０１)であった。感染ラット筋肉内での^99mＴc−走化性ペプチドの局在 ^99mＴc標識化走化性ペプチドのアナログの正常大腿部筋肉および感染大腿部筋 肉中の組織内濃度(％ ＩＤ／グラム)を表IVに示す。 ＡＮＯＶＡはペプチド(Ｆ_3,25＝５６.５１、ｐ＜０.０００１)と時間(Ｆ_3,25 ＝５９.４５、ｐ＜０.０００１)との有意な主効果、およびペプチドと時間との 有意な交互作用(Ｆ_9,25＝６.７４、ｐ＜０.００５)を立証した。正常な筋肉では 、ＨＰ１(Ｐ＝０.０１)およびＨＰ２(ｐ＜０.０５)の濃度は時とともに減少した が、一方ではＨＰ３およびＨＰ４は変化しなかった。注射３０分後には、正常筋 肉内のＨＰ１は他のペプチドより大(ｐ＜０.０１)であり、ＨＰ２の濃度はＨＰ ３より大(ｐ＜０.０１)であった。注射１２０分後には、正常筋肉内のＨＰ４の 濃度はＨＰ２およびＨＰ３より大(ｐ＜０.０１)であって、ＨＰ１の濃度はＨＰ ３より大(ｐ＜０.０１)であった。 感染した筋肉では、ＨＰ１(Ｐ＝０.０１)、ＨＰ２(ｐ＜０.０１)、およびＨＰ ４(ｐ＜０.０５)の濃度は時とともに減少したが、ＨＰ３の濃度（両時点で蓄積 濃度は最低であった）は変化しなかった。注射３０分後には、ＨＰ１およびＨＰ ４の濃度はＨＰ２およびＨＰ３の濃度より大(ｐ＜０.０１)であり、ＨＰ２の濃 度はＨＰ３より大(ｐ＜０.０１)であった。注射１２０分後には、ＨＰ４の濃度 はＨＰ１、ＨＰ２およびＨＰ３より大(ｐ＜０.０１)であり、ＨＰ１の濃度はＨ Ｐ３より大(ｐ＜０.０１)であった。 標的−対−バックグラウンド(Ｔ／Ｂ)比(感染筋肉グラム当り％ ＩＤ／正常筋 肉グラム当り％ ＩＤ)を第６図に示す。ＡＮＯＶＡはペプチド(Ｆ_3,22＝５.８７ 、ｐ＜０.００５)の有意な主効果を立証した。しかしながら、時間の主効果およ びペプチド対時間交互作用は有意でなかった。ＨＰ４のＴ／Ｂ比はＨＰ２(ｐ＜ ０.０５)、ＨＰ１(ｐ＜０.０１)、およびＨＰ３(ｐ＜０.０１)のものより有意に 大であった。そこで、ＨＰ４は感染組織内で最高の絶対濃度を示したばかりでな く、注射後両時点で最高のＴ／Ｂ比を立証した。これとは対照的に、ＨＰ３は感 染組織内では最低な絶対濃度および最低なＴ／Ｂ比を示した。ウサギにおける感染症病巣部位のイメージング ウサギでは、注射直後に高濃度の^99mＴc−ＨＰ４が肺臓、肝臓および脾臓に検 出された。肺臓の活性は時間とともに減少し、注射後１〜３時間頃には放射能の 病巣蓄積が感染大腿部に観察された。注射後４時間頃にはＴ／Ｂ比は〜４：１で あった。注射１６時間後（第７図）に全病変の平均Ｔ／Ｂ比は１０：１、病巣部 分では＞２０：１に増大した。これに加え、ある程度の腸内蓄積が後刻(＞４時 間)に認められた。血球に関連する注射１６時間後の残留循環放射能百分率は約 ２５％と測定された。これとは対照的に、膿の分画では放射能の約９０％がＷＢ Ｃに関連することが立証された。 器官直接計数法による注射後１７時間の組織内濃度(％ ＩＤ／グラム)を第８ 図に要約する。最高濃度は脾臓＞肺臓＞肝臓＝腎臓(ｐ＜０.０１で)であった。 Ｔ／Ｂ比(感染筋肉または膿グラム当り％ ＩＤ／対側性正常筋肉グラム当り％ ＩＤ)を第９図に示す。膿および感染筋肉の平均Ｔ／Ｂ比はそれぞれ２５.７８： １(最大４８.５４：１、最小８.８４：１)および１４.１７：１(最大２５.６４ ：１、最小４.７８：１)であった。 議論の部 前記はＨＹＮＩＣ誘導体化走化性ペプチドのアナログは、Ｔc(Ｖ)オキソコア 源として^99mＴcグルコヘプトネートを使用して^99mＴcで高活性に容易に標識でき ることを証明する。さらにその上、^99mＴc標識化ペプチドは深部大腿感染症の実 験的モデルでは感染病巣部位の外部イメージングに有効な試薬である。 合成したＨＹＮＩＣペプチド４種のうち、３種(ＨＰ２、ＨＰ３、およびＨＰ ４)はヘキサペプチドＦor−ＮleＬＦＮleＹＫと同様な受容体結合ＥＣ₅₀を示し たが、一方ではＨＰ１はＦor−ＭＬＦの２倍以内であった。ＨＹＮＩＣ結合ペプ チドは全て化学誘引性受容体に対してＦor−ＭＬＦより強化された親和性を示し た。受容体結合力価の順序は、ＨＰ３＞ＨＰ２＞ＨＰ４＞Ｆor−ＮleＬＦＮleＹ Ｋ＞Ｆor−ＭＬＦ＞ＨＰ１＞Ｆor−ＮleＬＦであった。Ｆor−ＭＬＦでＮleをＭ etに置換すると受容体結合親和性の１０−１５倍低下を招来した。しかしながら 、さらにＣ−末端をＬys−ＨＹＮＩＣで誘導体化すると受容体結合の強化を招来 した。 ＨＰ２、ＨＰ３、およびＨＰ４のスーパーオキシド産生に対するＥＣ₅₀はヘキ サペプチドおよびＦor−ＭＬＦと比べて２−８倍強化された。Ｆor−ＮleＬＦは Ｆor−ＭＬＦよりも３倍低い力価が立証された。Ｆor−ＮleＬＦと比較してのＨ Ｐ１の受容体結合増強効果とは対照的に、スーパーオキシド産生についてのＥＣ₅₀ はＦor−ＭＬＦおよびＦor−ＮleＬＦＮleＹＫの５倍の率で増強された。 ペプチド−受容体相互作用について提案されたモデルに照らして解釈する時、 これらデータは第４のアミノ酸残基でのＨＹＮＩＣ誘導体化が立体配座の動揺を 招来し、これが受容体結合およびスーパーオキシド発生の双方に影響するのでは ないかということを示唆する。最も印象的な発見は受容体結合のＥＣ₅₀における Ｆor−ＭＬＦの１５倍の増大、およびヘキサペプチドの３００倍より大きい増大 および活性化に対するＥＣ₅₀における１０倍以上の増大を招来した２位Ｍetに代 えるＮleへの置換で起きる効果であった。以前に報告されている走化性ペプチド のアナログではこの置換は最小の影響しか示さなかったので、この結果はことに 意義深い。４位Ｌ−Ｌysに代えるＤ−Ｌysへの置換により起きる受容体結合につ いてのＥＣ₅₀の２倍増加および活性化についてのＥＣ₅₀の５倍増加もこの仮説を 支持する。この位置のＬ−Ｌysに代える１,６−ジアミノヘキサンへの置換は結 合についてのＥＣ₅₀僅かな減少および活性化についてのＥＣ₅₀の３−４倍増大 とを招来した。ＨＹＮＩＣ結合ペプチドを^99mＴcで標識すると親和性について明 瞭な増大を招来した。^99mＴc−ＨＹＮＩＣ−ペプチド結合検定実験結果は^99mＴc ペプチド好中球結合の５０％を置換するに必要な非標識化ペプチドの濃度はＦor −ＭＬ[³Ｈ]Ｆをトレーサに使用する時よりも約２１０倍高いことを証明してい る。結合親和性のこの増大は、もし放射能標識種がＴc−グルコヘプトネート当 りペプチド単位１またはそれ以上を含み、結合が協調的であるとすれば、説明で きよう。同様な結合増大が四量体走化性ペプチドのアナログでも報告されている ［Ｋraus,Ｊ.Ｌ.ら，Ｂiochem.Ｂiophys.Ｒes.Ｃomm．１２４：９４５−９４９ （１９８４）］。これらの結果は誘導体化に対するＣ−末端の強固さをも証明す る。 これら観察は優秀な感染症イメージング放射性薬剤であるのに加え、ＨＹＮＩ ＣペプチドはＦor−ＭＬＦとその受容体との結合に付随する分子相互作用をさら に説明するためのモデル化合物としても役立ちうることを示唆する。 ＨＹＮＩＣ誘導体化走化性ペプチドのアナログの比放射能を最大化するに当り 、⁹⁹Ｍo／^99mＴc放射性核種発生源の溶離物である放射能核種源の操作に焦点を 合わせた。比放射能の高い^99mＴcＯ₄ ^-を得るについての潜在的問題点は寿命の長 い⁹⁹Ｔc(基底状態、ｔ_1/2〜１０⁵年)の蓄積である。⁹⁹Ｔcは⁹⁹Ｍo崩壊の８７％ の結果として、また^99mＴc崩壊の１００％により直接製造されるので、常に標識 反応での競合に参加しうる一定量の担体が存在する。比放射能＞１００００mＣi ／μモルを持つ^99mＴc標識化走化性ペプチドのアナログは容易に製造できるが、 しかし他の^99mＴc種からの標識化ペプチドのＳep−Ｐak分離は必要である。^99m Ｔc源の最適化に加えて、もし放射能標識化ペプチドのクロマトグラフィー精製 条件も最適化すれば、さらに高い比放射能が達成できる。ＨＰＬＣシステムにつ いては、^99mＴc標識化ペプチド、非標識化ペプチドおよび^99mＴc−グルコヘプト ネートに対応するピークは良く分離し、担体不含の放射能標識化ペプチドを分離 することができる。この条件下に、放射能標識化ペプチドの比放射能は^99mＴc発 生源の比放射能によってのみ限定される。^99mＴcの理論的比放射能によれば^99m Ｔc標識化ＨＹＮＩＣ誘導化走化性ペプチドのアナログの最大比放射能は約５０ ０００ ０mＣi／μモルである。この水準の比放射能を日常的取扱で達成することは非現 実的であるが、標識用に使用される^99mＴc−グルコヘプトネートと類似の比放射 能を持つ放射能標識化ペプチドを製造することは可能であろう。比放射能＞１０ ００００mＣi／μモルを持つ^99mＴc−グルコヘプトネートは日常的に製造できる ので、ＨＰＬＣを採用すればこの水準の比放射能を持つペプチドは可能であろう 。 ＨＹＮＩＣグルコヘプトネートのリガンドはテクネチウム配位軌道２個を占有 するだけなので、標識化生成物は別の基を含有する可能性が高い。グルコヘプト ネートは「コリガンド」として働くことによってこの役割を果たすものと信じら れる。走化性ペプチドは低分子量なので、テクネチウム標識に使用するコリガン ドはこれら分子の生体内分布に深刻な影響を与えるかも知れなかった。この可能 性を評価するため、異なるコリガンド４種：すなわち、グルカレート、グルコヘ プトネート、マンニトール、およびグルコサミン、を用いて放射能標識した^99m Ｔc標識化ＨＰ２およびＨＰ３の生体内分布を測定した。これら異なるリガンド の放射能標識用操作法はグルコヘプトネートで使用した方法と同一であった。全 ての場合、放射能標識したペプチドのＨＰＬＣ分析は単一のピークを示した。 第１０図はＨＰ３からの生成物４種の注射後４時点における血液、肺臓、肝臓 、脾臓、腎臓および消化管における％ 注射用量／ｇを示す。殆どの組織で生体 内分布に小さな相違点は検出されたが、最も明瞭な相違(ｐ＜０.０１)は肺臓(グ ルカレート、グルコヘプトネート＞マンニトール＞＞グルコサミン)、肝臓(グル カレート、グルコヘプトネート、マンニトール＞＞グルコサミン)、腎臓(マンニ トール＞グルカレート、グルコヘプトネート、グルコサミン)、脾臓(グルカレー ト＞＞グルコヘプトネート、マンニトール＞＞グルコサミン)、および消化管(グ ルカレート、グルコサミン＞＞グルコヘプトネート＞＞マンニトール)で観察さ れた。同様な結果はＨＰ２でも得られた。 感染症イメージングのために放射能標識化走化性ペプチドを使用する試行数種 が報告されている［Ｆischman,Ａ.Ｊ.，Ｊ.Ｎucl.Ｍed．３２：４８３−４９１ （１９９１）；ＭcＡfee,Ｊ.Ｇ.ら、Ｓemin.Ｎucl.Ｍed．１４：８３−１０６（ １９８４）；Ｔhakur,Ｍ.Ｌ.ら，Ｓemin.Ｎucl.Ｍed．１４：１０７−１１７（ １ ９８４）；Ｚogbhi,Ｓ.Ｓ.ら，Ｊ.Ｎucl.Ｍed．２２：Ｐ３２（１９８１）］。 しかしながら、これらの研究の時点で使用できた放射能標識法は相対的に比放射 能の低い試薬を与え、映像撮影には薬理学的量のペプチドを必要とした。これら 用量のペプチドはウサギでは深刻な一過性好中球減少症を起こすことが示された ［Ｏ'Ｆlaherty,Ｊ.Ｔ.ら，Ｊ.Ｉmmunol．１１８：１５８６−１５８９（１９７ ７）］。本発明の放射能標識技術によれば、これら副作用の可能性は完全に無視 できる。走化性ペプチドの好中球減少効果に高度に感受性の種であるウサギでは 、ＨＰＬＣで精製した^99mＴcＨＰ４は注射後１時間以内に大腸菌感染症の病巣部 位に局在化し、１５時間に最大Ｔ／Ｂ比に達した。 放射能標識のＨＹＮＩＣ法は極めて高い比放射能を持つ^99mＴcで標識したペプ チドおよび蛋白質を製造するための独特で効果的な手段を提供する。 達成された高い比放射能において、好中球減少反応のＥＣ₅₀より顕著に低いペ プチド濃度でイメージング実験を行うことが可能である。例えば、ＳＥＰ−ＰＡ Ｋ精製ペプチド(〜１００００mＣi／μモル)では２０mＣiの注射量はペプチド約 ２nモルを含む。７０kgの対象では、これは＜３０pモル／kgを示す。アカゲザル での研究によれば、このペプチド量は明確に好中球減少症を誘発する用量よりも はるかに低い。ＨＰＬＣ精製物質では安全性の余裕は約１０倍に増加することに なろう。 実施例１０１ この実施例はサルにおいて放射能標識化アゴニストである走化性ペプチドのア ナログが炎症部位用のイメージングに有効な試薬であることを証明する。高比放 射能に放射能標識することで、これら試薬が持つ好中球減少効果を回避すること ができる。 生体内生物学的活性、生体内分布、および炎症イメージングについての走化性 ペプチドのアナログの性質を非ヒト霊長類で評価した。正常なアカゲザルで、好 中球減少反応の用量依存性を評価した。^99mＴc標識化ヒドラジノニコチンアミド (ＨＹＮＩＣ)で誘導体化した走化性ペプチドのアナログを使用して生体内分布お よび炎症イメージングをサルで研究した。 正常動物での研究はこのペプチドが動物に明瞭な用量依存性好中球減少症を誘 発することを立証した。白血球数の減少は注射直後に起き、急速に基準値まで復 帰した。分別ＷＢＣ数、血圧、心拍数、または呼吸数には明瞭な影響は認めなか った。検査したペプチドの最低量(１０ng／kg)では、好中球の減少は極微であっ た。ＨＹＮＩＣ誘導体化ペプチドを優秀な収率と純度で製造でき、本来のペプチ ドと類似の生物学的活性を示し、容易に比放射能２００００mＣi／μモルに標識 された。無菌的炎症病巣を持つサルに放射能標識化ペプチド〜０.５mＣi(＜２. ０ng／kg)を注射した時、放射能標識化ＷＢＣのものと類似した生体内分布の型 が観察され、好中球減少症は検出されなかった。注射３時間後には、炎症部位は Ｔ／Ｂ比〜３：１で容易に認識された。材料 Ｎ−ホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニン(ＦorＭＬＦ)、Ｎ− ホルミル−ノルロイシル−ロイシル−フェニルアラニル−ノルロイシル−チロジ ル−リジル(ＦorＮleＬＦＮleＹＫ)、ホルボールミリステートアセテート(ＰＭ Ａ)、およびサイトカラシンＢはＳigma［Ｓt.Louis，ミズーリ］から入手した。 Ｆor−ＭＬ[³Ｈ]Ｆ(６０Ｃi／ミリモル)および^99mＴc(⁹⁹Ｍo／^99mＴc−発生源) はＮew Ｅngland Ｎuclear［Ｂoston，マサチューセッツ］から入手した。ハン クの平衡塩溶液(ＨＢＳＳ)はＧＩＢＣＯ［Ｇrand Ｉsland，ニューヨーク］から である。ペプチド合成および構造決定 Ｎ−ホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニル−リジンおよびＮ− ホルミル−ノルロイシル−ロイシル−フェニルアラニル−ノルロイシル−チロジ ル−リジル−ＤＴＰＡは以前の報告［Ｆischman,Ａ.Ｊ.ら，Ｊ.Ｎucl.Ｍed．３ ２ ：４８３−４９１（１９９１）］の通りに標準的固相技術により合成し、精製 した［Ｍerrifield,Ｒ.Ｂ.，Ｊ.Ａm.Ｃhem.Ｓoc．１５：２１４９−２１５４（ １９６３年）；Ｓtewart,Ｊ.Ｍ.ら，Ｓolid Ｐhase Ｐeptide Ｓynthesis，Ｗ. Ｈ.Ｆreeman ＆ Ｃompany，サンフランシスコ，カリフォルニア（１９６９年） ］。ニコチニルヒドラジン誘導体化した走化性ペプチドのアナログであるＮ−ホ ルミル−met−leu−phe−lys−ＨＹＮＩＣは次のようにして製造した。 ジイソプロピルエチルアミン６０μlを含有するサクシンアミジル−６−t−Ｂ oc−ヒドラジノピリジン−３−カルボン酸(１５４mg、ミリモル)のジメチルホル ムアミド(ＤＭＦ)１ml溶液にＮ−Ｆor−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−Ｌys(１８６mg、ミ リモル)のＤＭＦ２ml懸濁液を添加した。ペプチドは急速に溶解し、２時間後に エーテル−石油エーテルを添加した。上層を廃棄し、残留物に水を添加すると固 体が形成された。固体を５％ 炭酸水素ナトリウム、水、および酢酸エチルで洗 浄した。粗製生成物の収量は１８３mgであった。粗製の生成物をp−クレゾール ０.１mlを含有するトリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)５mlとともに２０℃で１５分間撹 拌して保護基を除去した。ＴＦＡを回転蒸発器で除去し、残留物にエーテルを加 えて脱保護ペプチドを沈殿させた。生成物をＷhatmanＯＤＳ−３の２.５×５０c mカラム上、逆相ＨＰＬＣにより、アセトニトリルから０.１％ ＴＦＡ中までの 勾配で溶離して精製した。主成分を含む画分を集め、溶媒を除去して所望の生成 物を得た。 最終生成物の化学的純度はＴＬＣ、ＨＰＬＣ、ＵＶスペクトル、質量スペクト ル、およびアミノ酸分析によって評価した。ヒトＰＭＮ上の化学誘引受容体への 結合とスーパーオキシド発生についてのＥＣ₅₀測定はＰike,Ｍ.Ｃ.およびＳnyde rman,Ｒ.，Ｍethods Ｅnzymol．１６２：２３６−２４５（１９８８）；Ｐike， Ｍ.Ｃ.ら，Ｂlood ６７：９０９−９１３（１９８６）；およびＦischman,Ａ.Ｊ .，Ｊ.Ｎucl.Ｍed．３２：４８３−４９１（１９９１）に記載の通り行った。 ^99mＴcによる標識 走化性ペプチドのアナログの薬理学的用量の投与に伴う好中球減少効果を避け るため、ＨＹＮＩＣ誘導体を比放射能を最大化する条件下に^99mＴcで放射能標識 した。高比放射能の^99mＴcイメージング用量を達成するために、ペプチドの注射 量はそのＥＣ₅₀(〜２０nＭ)よりはるかに低くした。 ⁹⁹Ｍo／^99mＴc発生源を前の溶離後５時間に溶離して全活性〜５００mＣiを得 た。Ｔcの質量および⁹⁹Ｔc対^99mＴcの相対比をＬamsonら，Ｊ.Ｎucl.Ｍed．７： ６３９−６４１（１９７５）の方法によって算出した。典型的な溶離では、Ｔc の総量は約３nＭ、⁹⁹Ｔc対^99mＴcの比率は〜１.５：１、^99mＴcの比放射能は１ ０００００mＣi／μモルであった。^99mＴc−グルコヘプトネート(Ｔc−ＧＨ)は グルコヘプトン酸錫［Ｇlucosan，ＤuＰont］から製造してヒドラジノニコチン アミド結合ペプチド［Ｐike,Ｍ.Ｃ.ら，Ｂlood ６７：９０９−９１３（１９８ ６）］を放射能標識するためのＴc(Ｖ)オキソ種を得た。^99mＴc過テクネテート の食塩水溶液２.５mlを凍結乾燥キットに加え、放射能の最終濃度を製造時点で １５０mＣi／mlとした。生成物の放射化学的純度はアセトンおよび食塩水を移動 層溶媒とする迅速薄層シリカゲルクロマトグラフィー(ＩＴＬＣ−sg)２種により ＞９５％と判定した。 走化性ペプチド、Ｆor−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−ＮＨ−(ＣＨ₂)₆−ＮＨ−ＨＹＮＩ Ｃ(分子量：７２０)約１８０μgをＤＭＳＯ５０μlに溶解、pＨ５.２の０.１Ｎ −酢酸緩衝液で最終濃度１０μg／mlに希釈した。ペプチド溶液１／２mlを洗浄 したガラスバイアルに入れ、^99mＴc−グルコヘプトネート０.５mlを添加した。 混合物を簡単にかきまぜ、室温に１時間放置した。ペプチド標識の程度は相違す る溶媒系３種：アセトン、食塩水、およびアセトン：水（９：１）を使用するＩ ＴＬＣ−sgで監視した。^99mＴc標識化ペプチドをＣ₁₈カラム［５μ，４.５×４ ６mm,Ｂeckman，Ｃolumbia，メリーランド］上、二成分系勾配で溶離する逆相Ｈ ＰＬＣで精製した。展開条件は：溶媒Ａ−５％ アセトニトリルの５０mＭ アセ テー ト溶液、pＨ５.２；溶媒Ｂ−５０％ アセトニトリルの５０mＭ アセテート溶液 、pＨ５.２；勾配：０から１００％ Ｂ、２０分間；流速２ml／分であった。放 射能標識したペプチドの比放射能は関係式： （回収％×存在ｍＣｉ）／（ペプチドミリモル×１００） を使用して算出した。動物モデル 体重各〜１０kgの雄性アカゲザル４頭各々を非発熱性食塩水０.２mlに溶解し たＦorＮleＬＦＮleＹＫ−ＤＴＰＡ４用量(１００００、１０００、１００、お よび１０ng／kg)で評価した。各動物は各用量水準の間に１週間の休止期間をは さんでペプチドの４用量全てで処理した。動物をケタミン／キシラジンで麻酔し 、順次０.５ml静脈血標本を８０分間にわたって採取した。各実験は基剤、ペプ チド、ペプチド、基剤の注射４回から構成した。ベースライン血液標本は第一回 注射１５分および５分前、および各注射後０.２５、０.５、１、３、５、１０、 および２０分後に採取した。２０分血液採取直後に、次回の注射を行った。実験 の間を通じて、血圧、心拍数、および呼吸数を監視した。白血球数(ＣＢＣ)、分 画白血球数、赤血球数、および充填赤血球量を各血液標本について測定した。こ れに加え、行動および所見、食餌消費量、および体重について動物を監視した。 実験プロトコールの要約図式を第１１図に示す。 体重約１０kgの成体雌性アカゲザル２頭をイメージング実験に使用した。これ ら動物は以前に他種放射性薬剤に関するイメージング実験に使用されていたので 、麻酔導入の間に右後肢大腿部への多数の筋肉内注射を受け入れた。これら注射 は顕著な無菌性炎症を起こした。イメージング ケタミンで軽く麻酔(５.５mg／kg)しつつ、動物に脚静脈から約０.５mＣiの^{99 m} Ｔc−標識化ペプチド(＜２.０ng／kg)を静脈注射した。放射能標識化ペプチド の注射後５分、３０分、１時間、および１９時間に、動物をケタミン／キシラジ ン(１５.０および１.５mg／kg)で麻酔し、専用コンピューターシステムに接続し た平行ホール高分解能低エネルギーコリメーターを装着した大視野γ線カメラ［ Ｔ echnicare Ｇemini ７００，Ｔechnicare ５６０，Ｓolon，オハイオ］を使用し て全身のシンチグラムを撮影した。イメージは全て走査速度１０cm／分で、１４ ０ＫeＶでの^99mＴc−フォトピークを中心とする１５％ ウインドウで撮影した。 注射前５分および注射後１、３、５、および１５分に血液０.５mlを採取しＣＢ Ｃを測定した。 目的範囲は：全動物、心臓血液貯留、肺臓、肝臓、脾臓、腎臓、小腸、骨、正 常筋肉、および炎症筋肉とし、カウント密度(ＣＰＭ／ピクセル)を算出した。結 果は組織対血液プール、％ 注射用量／グラム(％ ＩＤ／ｇ)および標的−対−バ ックグラウンド比(炎症大腿部／対側性大腿部)として表現した。統計的方法 イメージング実験の結果は、分散分析法(ＡＮＯＶＡ)と、続くダンカンの新多 重範囲アッセイ［Ｄuncan,Ｄ.Ｂ.，Ｂiometrics １１：１−４２（１９５５）に よって統計的な評価を行った。 結果 ＨＹＮＩＣ誘導体化ペプチドを優秀な収率および化学的純度で製造した。最終 生成物はＴＬＣとＨＰＬＣとでは単一バンドを示した。ＵＶ分析は吸収極大を２ ６８および３１５nmに示した。質量スペクトルはｍ／ｚを６７１に示した。アミ ノ酸分析は所望の生成物と一致した(Ｍet−１.００、Ｌeu−１.００、Ｐhe−０. ９７、Ｌys−１.００)。ＨＰＬＣ精製後、放射能標識化ペプチドの比放射能は＞ ２００００mＣi／μモルであった。ヒトＰＭＮ上の化学誘引受容体への結合およ びスーパーオキシド発生に関する試験管内検定はそれぞれＥＣ₅₀値２.０および ２０nＭを与えた。 第１２図はＦorＮleＬＦＮleＹＫ−ＤＴＰＡが明瞭な用量依存性好中球減少反 応をサルにおいて誘発することを示す。ペプチドの最高用量２個(１００００お よび１０００ng／kg)において、白血球数は殆ど注射直後に対照の約４０％まで 減少し、２回目のペプチド投与時点では６０から８０％まで回復した。２回目の ペプチド投与後、白血球数は対照の４０から５０％迄減少した。最高用量では、 白血球数は２回目の基剤投与の時点には対照の８０％まで回復し、実験の終了時 −１回目の基剤注射から８０分後−には対照の９０％まで回復した。１０００ng ／kg用量では白血球数は２回目の基剤注射時には対照の９０％まで回復し、研究 終了時では基準値まで回復した。１００ng／kg用量では白血球数は注射直後に対 照の７０％に減少し、２回目のペプチド投与時には基準値まで回復した。２回目 の基剤注射時には白血球水準は基準値まで回復した。ペプチドの最低用量(１０n g／kg)では白血球数減少は小さく、各ペプチド注射後３分以内に基準値まで回復 した。 どの動物も何れの用量のペプチドを注射後も病的影響の所見を示さなかった。 分画ＷＢＣ、血圧、脈拍数、および呼吸数について有意な効果は検出されなかっ た。 第１３図は^99mＴc標識化ペプチド 約１.０mＣi注射の３時間後および１５時間 後のサルの描写、前面、および背面のイメージを示す。早期のイメージでは肺臓 、肝臓、脾臓、および骨に高濃度の放射能があり、白血球の結合と整合する。腎 臓と膀胱にも高濃度の放射能が集中した。筋肉および消化管には低濃度が検出さ れた。これに加えて、炎症部位はこの時点でよく可視化された(Ｔ／Ｂ〜３.１) 。ペプチドのこの用量ではＷＢＣ水準には顕著な効果はなかった。 後期のイメージでは、肺臓の活性が減少したが、しかし他の器官における放射 能の分布は比較的一定であった。注射１５時間後、炎症部位の放射能蓄積は顕著 に減少した。両方のイメージングの時点で、他の動物でも類似の生体内分布型が 観察された。 議論の部 この実施例で、ウサギにおいて［Ｏ'Ｆlaherty,Ｊ.Ｔ.ら，Ｊ．Ｉmmunol．１ １８ ：１５８６−１５８９（１９７７）］と同様にして、サルでも走化性ペプチ ドアゴニストは有意な一過性好中球減少症を誘発することを確認した。しかしな がら、１０ng／kgより少ない用量のペプチドでは、この効果は有意ではなかった 。時間とともに減少する肺臓の活性に見られるように、最初は活性化好中球にい く らかの最小な辺縁趨向が起きうる。穏やかな無菌性炎症病変を持つサルに標識化 ＨＹＮＩＣ誘導体化走化性ペプチドを注射した時、生体内分布の型は放射能標識 した白血球のそれと良く平行しており、炎症病巣は注射３時間以内に標的−対− バックグラウンド比〜３：１で容易に検知された。非常に高度な比放射能(＞２ ００００mＣi／μモル)で放射能標識することにより、放射性薬剤のイメージン グ用量のペプチド全量は好中球減少症の閾値：２００００mＣi／μモル、以下に 削減することができ、１０kgの動物への０.５mＣiの注射はペプチド用量として は＜２ng／kgに対応する。体重の８％が血液容量で、そのヘマトクリットが５０ ％であると仮定すれば、ペプチドのこの容量は初期循環濃度６０pＭに対応し、 これは受容体活性化ＥＣ₅₀より２桁以上低い。予期通り、このペプチド用量は末 梢白血球水準には影響を示さなかった。 この実施例は放射能標識化走化性ペプチドのアナログは好中球減少効果に感受 性な動物における有効な炎症イメージング試薬であることを証明する。同様な結 果はこのペプチドの特性の感染イメージングをウサギで研究した［Ｂabich,Ｊ． Ｗ.ら，印刷中］時にも得られている。 無菌性炎症部位は注射３時間後には高度に明瞭であるが、標的−対−バックグ ラウンド比は注射の１２時間後には劇的に減少する。これは大腸菌感染症の病巣 部位でＴ／Ｂ比が３時間後に３：１であるが、１２時間後に２０：１に増加する ウサギでの結果とは明確に相違する。この相違点の可能な説明中には、病変密度 の相違および細菌感染と無菌性炎症との間の相違を含む。将来の研究がこの病変 機構における相違として確認すれば、この試薬の有用性は顕著に増加する。何故 なら、感染性炎症と無菌性炎症との間の区別が可能になるであろうから。 実施例１０２ この実施例では急性細菌感染症の動物モデル中で、^99mＴc−標識化走化性ペプ チドアゴニストと通常の¹¹¹Ｉn−標識化白血球との間の感染局所検出性能を比較 し、対照する。走化性ペプチドによる好中球減少効果に対する感受性が知られて いるので、ウサギを選択した。 ^99mＴc−標識化ホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニル−リジル −ヒドラジノニコチンアミド(^99mＴc−ＨＰ)の生体内分布と感染症イメージング 性能とを¹¹¹Ｉn−標識化白血球(¹¹¹Ｉn−ＷＢＣ)と大腸菌感染症ウサギで比較し た。動物６羽の群に１mＣiの^99mＴc−ＨＰプラス０.０５mＣiの¹¹¹Ｉn−ＷＢＣ を注射し、注射３時間から６時間後および１８時間後に逐次シンチグラムを撮影 した。最終イメージング後、動物を屠殺し、生体内分布を測定した。 イメージングの時点全てにおいて、^99mＴc−ＨＰおよび¹¹¹Ｉn−ＷＢＣの分布 は同様であって、感染部位は両放射性薬剤でよく可視化された。標的(感染筋肉) 対 バックグラウンド(対側性正常筋肉)比(Ｔ／Ｂ)は注射の３、６、および１８ 時間後にはそれぞれ：^99mＴc−ＨＰについては３.３８±０.４６、３.８０±０. ３７、および１０.８７５±１.４４であり、¹¹¹Ｉn−ＷＢＣについては１.７１ ±０.０４、１.８１±０.２６、および３.７９±０.８３であった。Ｔ／Ｂの平 均比率(^99mＴc−ＨＰ対¹¹¹Ｉn−ＷＢＣ)は２.９９±１.８８であって、１より低 い価はなかった。直接的な器官標本採取から算出したＴ／Ｂについては¹¹¹Ｉn− ＷＢＣより^99mＴc−ＨＰの方が有意に高かった(３３.６：１、８.１：１、ｐ＜ ０.０１)。これら相違は一次的に^99mＴc−ＨＰの正常骨格筋での蓄積の相違とい うよりも感染筋肉への絶対的蓄積量の増加（０.０２４ＩＤ／ｇ対０.１０２ＩＤ ／ｇ、ｐ＜０.０１)に起因する。 これら結果はおそらく感染部位での蓄積絶対量の増加の結果として^99mＴc−Ｈ Ｐは¹¹¹Ｉn−ＷＢＣで達成できるものよりも大きいか等しい標的−対−バックグ ラウンド比を与えることを示す。 材料および方法 無機塩は全てＦisher Ｓcientific Ｃo.から入手した。ＩＴＬＣ−シリカゲル クロマトグラフィー板はＧelman Ｌaboratories［Ａnn Ａrbor，ミシガン］から 入手した。¹¹¹Ｉn−オキシンはＡmersham Ｉnc.［Ａrlington Ｈeights，イリノ イ］から入手した。錫グルコヘプトネートキット(Ｇlucoscan)および⁹⁹Ｍo／^99m Ｔc発生源はＤuＰontの放射性薬剤部［Ｂillerica，マサチューセッツ］から入 手した。他の試薬は全て商業的に得られる最高級のものとして入手した。ペプチド合成 標準的な固相技術によってＮ−Ｆor−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニ ル−リジンを合成し、精製した。このペプチドのニコチニルヒドラジン結合体で あるＮ−Ｆor−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−(Ｎ−イプシロン−ＨＹＮＩＣ)Ｌys(ＨＰ)は Ｂabich,Ｊ.Ｗ.ら，Ｊ.Ｎucl.Ｍed．３３：９１０（１９９２）により記載され たようにして製造した。この生成物は２.５×５０cmのＷhatmanＯＤＳ−３カラ ム上、０.１％ ＴＦＡ中、アセトニトリルの勾配で溶離する逆相ＨＰＬＣによっ て精製した。主成分を含有する画分を集め、溶媒を除去して所望の生成物を得た 。ペプチドはＵＶおよび質量スペクトルならびにアミノ酸分析により構造決定し た。ＨＹＮＩＣ誘導体化走化性ペプチドの^99mＴc標識 ^99mＴc−グルコヘプトネートを使用してヒドラジノニコチンアミド［Ａbrams, Ｍ.Ｊ.ら，Ｊ.Ｎucl.Ｍed．３１：２０２２−２０２８（１９９０）］結合ペプ チドの放射能標識に必要なＴc(Ｖ)オキソ種を得た。凍結乾燥キットに^99mＴc− 過テクネテートの０.９％ ＮaＣl溶液 約２.５mlを添加した。最終放射能濃度は １００mＣi／mlであり、生成物の放射化学的純度はアセトンおよび０.９％ Ｎa Ｃlの双方を移動相溶媒として使用する迅速薄層シリカゲルクロマトグラフィー( ＩＴＬＣ−sg)により測定した。 次の操作を使用して走化性ペプチドのアナログを^99mＴcで放射能標識した。１ mg／mlペプチド溶液５μlを洗浄したガラスバイアルに入れた。このペプチド溶 液にpＨ５.２の０.１Ｍ酢酸緩衝液５００μl、続いて^99mＴc−グルコヘプトネー ト５００μlを添加した。混合物を簡単にかきまぜ、室温に１時間放置した。放 射化学的純度はＣ₁₈−逆相カラム［３００Å，５μ，４.５mm×２５cm，Ｖydac ］および次の溶離条件を使用するＨＰＬＣで測定した。溶媒Ａ：０.１％ トリフ ルオロ酢酸水溶液；溶媒Ｂ：０.１％ トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶液；勾 配０％Ｂから１００％Ｂ、１０分間；流速２ml／分。ＵＶ吸収は流通分光分析器 ［Ｍilton−Ｒoy／ＬＤＣ，Ｂoca Ｒaton，フロリダ］で監視し、放射能は放射 性同位元素検出器［Ｂeckman １７０，Ｂeckman，Ｃolumbia，メリーランド］を 用い て監視した。両検出器の出力を記録し、二重経路積分器［Ｗaters ７４６型デー タ処理器，Ｗaters，Ｍarlboro，マサチューセッツ］を使用して分析した。 ^99mＴc−ＨＰ注射液は前記ＨＰＬＣシステムを用いて^99mＴc−ＨＰを非標識化 ＨＰから分離して製造した。ペプチド溶液を穏やかに加熱し、Ｎ₂気流中で乾燥 した。残留物は注射用等張食塩水に溶解した。注射液の標本はＨＰＬＣで分析し た。 ¹¹¹Ｉn−標識化白血球 下記のように感染させた供血ウサギから採取したヘパリン化全血５０mlをヘタ スターチ［Ｈespan(商標)，ＤuＰont，Ｗilmington，デラウェア］で１：１に希 釈した。¹¹¹Ｉn−標識化白血球はＭcＡfee,Ｊ.Ｇ.ら，Ｊ.Ｎucl.Ｍed．２１：１ ０５９−１０６８（１９８０）およびＭcＡfee,Ｊ.Ｇ.ら，Ｓemin.Ｎucl.Ｍed． １４ ：８３−１０６（１９８４）に記載された操作に次の修正を加えて製造した 。白血球濃縮血漿(ＬＲＰ)はウサギ血液を４５分間沈降して分離した。このＬＲ Ｐを４５０×ｇで５分間遠心分離し、ＷＢＣペレットを食塩水１０ml中に再懸濁 し、６０分間放置した。上清液を抜去り、血球を食塩水５mlに再懸濁した。撹拌 しながら¹¹¹Ｉn−オキシン５００μＣiを滴加し、随時撹拌しながら混合物を３ ７℃で６０分間インキュベーションした。放置して血球を沈降させ、ペレットを 血小板不足血漿(ＰＰＰ)中に再懸濁、４５０×ｇで５分間遠心分離後、注射用Ｐ ＰＰ中に再懸濁した。細胞ペレットに添加した最初の¹¹¹Ｉn−オキシンの活性に 対する標識化媒体から分離後にＰＰＰで一回洗浄した後に血球に残留したものの 百分率として血球標識化率を算出した。感染モデル 体重２.２〜３.０kgの雄性ニュージーランド白ウサギを全研究に用いた。臨床 分離大腸菌単一株を一夜トリプチカーゼ大豆寒天板上に成育させ、個々のコロニ ーを無菌正常食塩水で希釈して約１×１０¹¹個／０.５ml(分光光度計で測定)を 含む濁った懸濁液を製造した。細菌懸濁液の種菌０.５mlをウサギの深部左大腿 部筋肉内に注射した。 接種２４時間後、感染大腿部に大きな腫脹のできたウサギに放射性薬剤を外側 耳静脈から注射した。動物６羽には１mＣiの^99mＴc−ＨＰ(＞５０００mＣi／μ モル)と０.０５mＣiの¹¹¹Ｉn−標識化白血球との混合物を注射した。イメージング 放射能標識化試薬を注射した３、６、および１８時間後に動物をケタミン／キ シラジン(１５.０および１.５mg／kg)で麻酔し、専用コンピューターシステムに 接続した平行ホール低エネルギーコリメーターを装着した大視野γ線カメラ［Ｔ echnicare Ｇemini ７００，Ｔechnicare ５６０，Ｓolon，オハイオ］を使用し て前側全身シンチグラムを撮影した。¹¹¹Ｉnおよび^99mＴcのイメージを二重フォ トンモードで１４０ＫeＶでの^99mＴcおよび２４７ＫeＶでの¹¹¹Ｉnのフォトピー クを中心とする１５％ ウインドウで同時に撮影した。注射３および６時間後は 時間５分／像に設定してイメージ２組を撮影した。注射１８時間後は撮影時間を １０分／像に延長した。目的部分を感染領域および対側性正常筋肉(バックグラ ウンド)に設定した。結果は標的−対−バックグラウンド比(感染大腿部／対側性 大腿部)で表現した。直接的器官標本採取 最終イメージング後、動物をペントバルビタールナトリウムの過剰投与で屠殺 し、生体内分布を測定した。血液、心臓、肺臓、肝臓、脾臓、腎臓、副腎、胃、 消化管、睾丸、骨、骨髄、正常筋肉、感染筋肉、および膿の標本を秤量し、放射 能をウエル型のγ線計数器［ＬＫＢ＃１２８２型，Ｗallac Ｏy，フィンランド ］により測定した。放射能崩壊を補正し、各器官の放射能濃度を投与用量の比率 で算出するために、注射用量の適量も同時に計数した。結果をグラム当り注射用 量に対する百分率(％ ＩＤ／ｇ)、感染筋肉対正常筋肉の比、および膿対正常筋 肉の比として表現した。 循環および感染部位における放射能の性質を決定するために、血液および膿の 標本をＬymphoprepにより勾配遠心分離して分画した。血漿はＳephadex Ｇ−１ ００(１.０×２５cm)カラム上で、pＨ７.４のＰＢＳで溶離してさらに分画した 。カラムは¹¹¹Ｉn−ＩgＧ、¹¹¹Ｉn−Ｆ(ab')₂、¹²⁵Ｉ−ヒトアルブミン、および^99m Ｔc−ＤＴＰＡを使用して補正した。模型的研究 模型的研究を行って¹¹¹Ｉnによる１７４ＫeＶ光子の^99mＴcのウインドウへの 交差と^99mＴcによる１４０ＫeＶ光子の¹¹¹Ｉnのウインドウへの交差の量を算出 した。略述すれば、動物に注射する時に、¹¹¹Ｉnおよび^99mＴcを同じ比率で注射 物中に含む標本を標準的点滴バッグ内で食塩水２５０ml中で完全に混合した。こ の模型をイメージング用の台に５cm離して置き、両ウインドウ内のイメージを撮 影した。各バッグの周りに設定した目的領域から交差係数を算出し、^99mＴcおよ び¹¹¹Ｉnイメージの補正に使用した。統計的方法 イメージングおよび生体内分布研究の結果は分散分析(ＡＮＯＶＡ)とそれに続 くダンカンの新多重範囲検定[Ｄuncan,Ｄ.Ｂ.，Ｂiometrics １１：１−４２（ １９５５年）]によって統計的に評価した。イメージデータでは「注射後時間」 と「放射性薬剤」(^99mＴc−ＨＰまたは¹¹¹Ｉn−ＷＢＣ)とを分類変数とする線形 モデル（Ｔ／Ｂ＝時間＋放射性薬剤＋時間×放射性薬剤）による二元ＡＮＯＶＡ を採用した。生体内分布データでは、器官および放射性薬剤を分類変数とする線 形モデル（％ ＩＤ／グラム＝器官＋放射性薬剤＋器官×放射性薬剤）による二 元ＡＮＯＶＡを採用した。これに加えて、¹¹¹Ｉn−ＷＢＣ対^99mＴc−ＨＰについ て標的−対−バックグラウンド比を線形回帰により比較した。結果は全て平均± ＳＥＭで表現した。 結果 ペプチド合成 ヒドラジノニコチンアミド誘導体化走化性ペプチドを好収率および高純度で製 造した。ＵＶ分析は２６８と３１５nmとに吸収極大を示した。質量スペクトルお よびアミノ酸分析(Ｍet−１.００、Ｌeu−１.００、Ｐhe−０.９７、Ｌys−１. ００)は所望の結合ペプチド生成物と良く一致した。放射性薬剤 ＩＴＬＣおよびＨＰＬＣ分析により、インキュベーション１時間後には放射能 の＞９０％がペプチドに関連していることが証明された。非精製^99mＴc−ＨＰの 比放射能は＞３０００mＣi／μモルであると算出された。前記精製操作を使用し て比放射能は＞１００００mＣi／μモルまで増加した。 これら実験で使用した¹¹¹Ｉn−白血球標識法は精製前に約７０％の標識化率お よび最終放射化学純度＞９５％をもたらした。模型実験 模型実験は放射性薬剤注射３時間後は^99mＴcウインドウで検出された光子の５ ％が¹¹¹Ｉnの寄与によることを示した。注射１８時間後は^99mＴcウインドウで検 出された光子の１７％が¹¹¹Ｉnの寄与による。両方のイメージングの時点で、^{11 1} Ｉnウインドウで検出された光子の２％が^99mＴcの寄与による。イメージデータ は全てこれら溢出効果について補正した。イメージング 第１４図は^99mＴc−ＨＰと¹¹¹Ｉn−ＷＢＣとを同時投与した６および１８時間 後でのウサギの代表的な、交差補正した前側イメージを示す。イメージングの両 時点で、放射性薬剤２種の全生体内分布は殆ど一致した。高濃度の両薬剤が肺臓 、肝臓、脾臓、および腎臓に検出された。両トレーサーの濃度は筋肉および消化 管では低かった。 イメージングデータから注射６および１８時間後の両時点とも、^99mＴc−ＨＰ は明確に感染部位に局在することが明白である。両薬剤のＴ／Ｂ比は時間ととも に増大した(ｐ＜０.０１)。イメージングの両時点とも、^99mＴc−ＨＰのＴ／Ｂ 比は¹¹¹Ｉn−ＷＢＣのものより有意に大きかった(ｐ＜０.０１)。両放射性薬剤 の標的−対−バックグラウンド比を第１５図に要約した。注射６時間後の^99mＴc −ＨＰのＴ／Ｂ比は注射１８時間後の¹¹¹Ｉn−ＷＢＣのものと同等であった。Ｔ ／Ｂの平均比(^99mＴc−ＨＰ対¹¹¹Ｉn−ＷＢＣ)は２.９９±１.８８で、１以下の 価は認められなかった。直接的組織標本採取 注射１８時間後に直接的組織放射能測定で測定した^99mＴc−ＨＰと¹¹¹Ｉn−標 識化ＷＢＣとの生体内分布を表Ｖに示す。 この時点で、数種の組織でこれらトレーサー２種の濃度に有意な差が見られた。^99m Ｔc−標識化走化性ペプチドは感染筋肉(ｐ＜０.０１)、膿(ｐ＜０.０１)、心 臓(ｐ＜０.０５)、肝臓(ｐ＜０.０５)、胃（ｐ＜０.０１)、および消化管(ｐ＜ ０.０１)でより大きい蓄積を示した。高水準の¹¹¹Ｉn−ＷＢＣが血液(ｐ＜０.０ ５)、脾臓(ｐ＜０.０１)、および睾丸(ｐ＜０.０１)に見出された。正常骨格筋 、骨、骨髄、肺臓、副腎、または腎臓では有意な差は認められなかった。 血液分画の結果、両時点で循環している^99mＴcの〜２５％のみが白血球に関連 していたが、一方では¹¹¹Ｉn−放射能の８５％以上が白血球に結合していること が判明した。両放射性核種で、赤血球への結合は微小(＜２％)であった。これと 対照的に、膿の分画は^99mＴcおよび¹¹¹Ｉnの双方とも放射能の約９０％がＷＢＣ に関連していることが判明した。血漿のカラムクロマトグラフィーではＷＢＣに 結合していない^99mＴc放射能の＞９５％が見掛の分子量１５００００(ＩｇＧ分 画)で溶離した；遊離ペプチドの溶離位置には放射能は検出されなかった。カラ ムからの放射能は９０％以上であった。 第１６図は注射１８時間後の摘出組織標本について直接的放射能測定により測 定した^99mＴc−ＨＰおよび¹¹¹Ｉn−ＷＢＣに関する感染筋肉対正常筋肉比のプロ ットを示す。感染筋肉対正常筋肉比の平均値は^99mＴc−ＨＰの方が¹¹¹Ｉn−ＷＢ Ｃと比較して有意に高かった(３３.６：１対８.１：１、ｐ＜０.０１)。この差 は、¹¹¹Ｉn−ＷＢＣ(０.０２４ ％ ＩＤ／ｇ)と比較して^99mＴc−ＨＰの感染筋 肉での絶対的蓄積量(０.１０２ ％ ＩＤ／ｇ)増加に起因するもので、正常骨格 筋内での蓄積の差(^99mＴc−ＨＰの０.００３ ％ ＩＤ／ｇ 対 ¹¹¹Ｉn−ＷＢＣの ０.００４ ％ ＩＤ／ｇ)に起因するものでない。回帰分析では^99mＴc−ＨＰと^{11 1} Ｉn−ＷＢＣとの間には、有意な相関を示さなかった(ｒ²＝０.０７６)。 注射１８時間後の直接的放射能測定で決定した膿対対側性正常筋肉比を第１７ 図に要約する。^99mＴc−ＨＰの膿と正常筋肉との比は６１.８±１１.０５に対し て¹¹¹Ｉn−ＷＢＣでは９.３２±２.５０であった(ｐ＜０.０１)。膿においては 、¹¹¹Ｉn−ＷＢＣ(０.０３５±０.００８ ％ ＩＤ／ｇ)と比較して高い^99mＴc− ＨＰの蓄積(０.１８８±０.０３４ ％ ＩＤ／ｇ)が高Ｔ／Ｂ比の主たる原因であ った。 議論の部 この実施例は、ウサギにおける細菌感染症のイメージングには、^99mＴc−標識 化走化性ペプチドが¹¹¹Ｉn−ＷＢＣよりも優れていることを立証する。感染筋肉 および膿における^99mＴc−標識化走化性ペプチド蓄積の絶対的水準(％ ＩＤ／グ ラム)は¹¹¹Ｉn−ＷＢＣのものより大であった。これに加え、標的−対−バック グラウンド比はイメージングの全時点で^99mＴc−ＨＰの方が大であった。注射６ 時間後の^99mＴc−ＨＰのＴ／Ｂ比は注射１８時間後の¹¹¹Ｉn−ＷＢＣと同等で、^99m Ｔc−標識化走化性ペプチドが迅速な感染イメージングの選択肢となりうるこ とを示唆している。正常筋肉内での蓄積の相違が有意ではないので、¹¹¹Ｉn−Ｗ ＢＣのものより改善された^99mＴc−ＨＰのＴＢ比は主として感染部位での^99mＴc −ＨＰの高濃度に起因する。 この発明を完全に記載した今、本発明の意図と範囲から離れることなしに、ま た過当な実験なしにこの発明が広範な均等パラメーター、濃度、および条件内で 実施できることを当業者は認識するものと思われる。 この発明はその特定的態様に関連して記載してきたが、さらに別の修飾も可能 であることを理解されると思われる。この出願には、一般的に、本発明の原理に 従い、本発明が所属する技術内で公知または慣例とされているような本開示から の逸脱を含み、前記記載および以下に追記する請求項範囲内の必須な特徴に適用 されうるであろうような、本発明のいかなる変化、使用、または応用も、保護を なされることを意図しているものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 5/103 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＸ (71)出願人 ジョンソン・マッシー・インコーポレイテ ッド アメリカ合衆国19380ペンシルベニア、ウ ェスト・チェスター、キング・ロード1401 番 (72)発明者 フィッシュマン、アラン・ジェイ アメリカ合衆国02114マサチューセッツ、 ボストン、ロングフェロー・プレイス１番 (72)発明者 ソロモン、ハワード・エフ アメリカ合衆国18938ペンシルベニア、ニ ュー・ホープ、ブルック・ドライブ1948番 (72)発明者 ディライアン、クラウディア・ケイ アメリカ合衆国19040ペンシルベニア、ハ ットボロ、イースト・ミル・ロード104番 (72)発明者 ブリッジャー、ゲーリー・ジェイ アメリカ合衆国19010ペンシルベニア、ブ ライン・モール、モントゴメリー・アベニ ュー900番、ナンバー609 (72)発明者 ヒギンス、ジョン・ディ・ザ・サード アメリカ合衆国19380ペンシルベニア、ウ ェスト・チェスター、エヌ・ニュー・スト リート10番 (72)発明者 ラーセン、スコット・ケイ アメリカ合衆国19380ペンシルベニア、ウ ェスト・チェスター、イースト・エバン ス・ストリート300番 (72)発明者 エルナンデス、ペドロ・イー アメリカ合衆国19355ペンシルベニア、マ ルベルン、デイジー・レーン３番 (72)発明者 ルービン、ロバート・エイチ アメリカ合衆国02146マサチューセッツ、 ブルックリン、クリントン・ロード78番 (72)発明者 シュトラウス、エイチ・ウィリアム アメリカ合衆国08550ニュージャージー、 スキルマン、サウスランド・ヒルズ・ロー ド47番 (72)発明者 フッセロ、アンソニー・ジェイ アメリカ合衆国08540ニュージャージー、 プリンストン、ブルック・ドライブ・イー スト４番 (72)発明者 ルーン、ダニエル・ジェイ アメリカ合衆国08822ニュージャージー、 フレミントン、フリントロック・ロード19 番 (72)発明者 リエキシンガー、ダグラス アメリカ合衆国08822ニュージャージー、 フレミントン、バイザー・ロード87番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．個体における感染または炎症部位を検出する方法であって、 ａ．診断上、有効な量の検出可能に標識された走化性ペプチド Ｘ−Ｙ−Ｌeu−Ｐhe−[Ｚ]n−Ｗ ［式中、 Ｘはアミノ保護基であり、 Ｙはアミノ酸残基であり、 Ｚはスペーサー配列であり、 ｎは０または１であり、また Ｗは、 −[Ｋ]ν−Ｍ¹ （式中、 Ｋは中間官能基であり、 νは０または１であり、また Ｍ¹は診断上、検出可能な標識である） で示される構造を有する標識用または結合置換基である］（ここで、該走化性ペ プチドは、実質的には、感染または炎症部位に蓄積し、また実質的には、感染し ていない、または炎症していない部位には蓄積しない） を個体に投与して、 ｂ．その走化性ペプチドを検出する ことを含んでなる方法。 ２．個体における感染または炎症部位を検出する方法であって、 ａ．診断上、有効な量の検出可能に標識された走化性ペプチド Ｘ−Ｙ−Ｌeu−Ｐhe−[Ｚ]n−Ｗ ［式中、 Ｘはアミノ保護基であり、 Ｙは、 ｛式中、Ｒ¹はベンジル、アルキル、または−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｒ²−ＣＨ₃ （ここで、Ｒ²は、 である） である｝ であり、 Ｚはスペーサー配列であり、 ｎは０または１であり、また Ｗは、 −[Ｋ]ν−Ｍ¹ （式中、 Ｋは中間官能基であり、 νは０または１であり、また Ｍ¹は診断上、検出可能な標識である） で示される構造を有する標識用または結合置換基である］（ここで、該走化性ペ プチドは、実質的には、感染または炎症部位に蓄積し、また実質的には、感染し ていない、または炎症していない部位には蓄積しない） を個体に投与して、 ｂ．その走化性ペプチドを検出する ことを含んでなる方法。 ３．Ｘがカルバメート類、カルボキシアミド類、チオカルボキシアミド類、尿 素類、チオ尿素類並びにそれらの対応するシアノグアニジン誘導体類、スルホン アミド類、およびホスホンアミド類よりなる群から選択されるアミノ保護基であ る、請求項１に記載の方法。 ４．Ｘが、 ［式中、 Ｒ³は水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アラルコキシ 、およびアミノよりなる群から選択され、また Ｒ⁴はカルコゲンである］ である、請求項１に記載の方法。 ５．Ｒ⁴が酸素または硫黄である、請求項４に記載の方法。 ６．Ｒ¹が−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｒ²−ＣＨ₃である、請求項２に記載の方法。 ７．検出可能に標識された走化性ペプチドが、 Ｘ−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−[Ｚ]n−Ｗ である、請求項６に記載の方法。 ８．メチオニン残基を４−アミノテトラヒドロチオピラン−４−カルボン酸で 置換する、請求項７に記載の方法。 ９．ロイシン残基をジプロピルグリシンで置換する、請求項７に記載の方法。 １０．ロイシン残基を１−アミノシクロヘキサンカルボン酸で置換する、請求 項７に記載の方法。 １１．フェニルアラニン残基をz−デヒドロフェニルアラニンで置換する、請 求項７に記載の方法。 １２．フェニルアラニン残基を２−アミノインダノン−２−カルボン酸で置換 する、請求項７に記載の方法。 １３．フェニルアラニン残基をアニリノグリシンで置換する、請求項７に記載 の方法。 １４．ｎが１であり、またＺが[Ｒ⁶]m（ここで、Ｒ⁶はアミノ酸残基であり、 またｍは１以上の整数である）である、請求項１に記載の方法。 １５．ｍが１であり、またＲ⁶がノルロイシン、チロシン、アスパラギン酸、 リジン、ロイシン、およびフェニルアラニンよりなる群から選択される、請求項 １４に記載の方法。 １６．ｍが２またはそれ以上であり、また各々のＲ⁶がノルロイシン、チロシ ン、アスパラギン酸、リジン、ロイシン、およびフェニルアラニンよりなる群か ら独立して選択される、請求項１４に記載の方法。 １７．検出可能に標識された走化性ペプチドが、 Ｎ−Ｆor−Ｎle−Ｌeu−Ｐhe−Ｎle−Ｔyr−Ｌys−ＤＴＰＡ、 Ｎ−Ｆor−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−Ｐu−ＤＴＰＡ、 Ｎ−Ｆor−Ｎle−Ｌeu−Ｐhe−Ｌys−ＤＴＰＡ、 Ｎ−Ｆor−Ｎle−Ｌeu−Ｐhe−Ｌys(ＮＨ₂)−ＤＴＰＡ、 Ｎ−Ｆor−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−Ｌys−ＤＴＰＡ、 Ｎ−Ｆor−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−Ｄ−Ｌys(ＮＨ₂)−ＤＴＰＡ、 Ｎ−Ａc−Ｎle−Ｌeu−Ｐhe−Ｌys(ＮＨ₂)−ＤＴＰＡ、 Ｎ−カルボベンゾキシ−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−メチルエステル、 ＩＢＯＣ−Ｌ−メチオニル(スルホキシド)−Ｌ−Ｌeu−Ｌ−Ｐhe-Ｌ−リジ ンアミド、 ＩＢＯＣ−Ｌ−ノルロイシル−Ｌ−Ｌeu−Ｌ−Ｐhe−Ｌ−リジンアミド、 Ｎ−Ｆor-Ｌ−メチオニル(スルホキシド)−Ｌ−Ｌeu−Ｌ−Ｐhe−ＤＴＰＡ −Ｌ−Ｌys、 Ｎ−Ｆor−Ｌ−メチオニル(スルホン)−Ｌ−Ｌeu−Ｌ−Ｐhe−Ｎ−ＤＴＰＡ −Ｌ−Ｌys、 Ｎ−イソブチル尿素−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−カルボキシレート、 イソブチルオキシカルボニル−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−Ｎ−ＤＴＰＡ−Ｌys、 Ｎ−Ｆor−(Ｄ)−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−Ｌysアミド溶媒和物、 ｔ−Ｂoc−Ｎle−Ｌeu−Ｐhe−Ｌys溶媒和物、 Ｎ−Ｆor−メチオニル−スルホキシド−Ｌeu−Ｐhe−Ｌysアミド溶媒和物、 Ｎ−Ｆor−メチオニル−スルホン−Ｌeu−Ｐhe−Ｌysアミド溶媒和物、 Ｎ−カルバミル−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−Ｌysアミド溶媒和物、 Ｎ−トリメチルアセチル−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−Ｌysアミド溶媒和物、 イソブチルオキシカルボニル−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−Ｌysアミド溶媒和物、 Ｎ−Ｆor−Ｎle−Ｌeu−Ｐhe−Ｎle−Ｔyr−Ｎ^ε−ＤＴＰＡ−Ｌys、 イソプロピル尿素−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−Ｌys−ＳＨＮＨ−ＢＯＣ、 イソプロピル尿素−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−n−プロピルジアミン−Ａsp−ＳＨ ＮＨ ＨＢr、 イソプロピル尿素−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−Ｌys−Ａsp−ＳＨＮＨ ＨＢr、 イソプロピル尿素−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−Ｌys−ＳＨＮＨ ＨＢr、 Ｎ−フェニル尿素−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe、 イソプロピル尿素−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−プロパンジアミン−ＳＨＮＨ、 Ｎ−n−ブチル−チオ尿素−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe、 Ｎ−n−ブチル尿素−Ｐhe−Ｌeu−Ｐhe−Ｌeu−Ｐhe、 Ｎ−イソプロピル尿素−Ｐhe−Ｌeu−Ｐhe−Ｌeu−Ｐhe−ＣＯＯＨ、 iＢＯＣ−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−ＣＯＯＨ、 iＢＯＣ−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe[アミド(プロピルアミド)カルボキシ−[(プロピ ル)カルボキシ]]−(アミドプロパノールＳＰＮＨ)エステル、 Ｎ−イソブチル尿素−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−カルボキシレート、 Ｎ−n−プロピル尿素−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe、 Ｎ−t−ブチル尿素−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe、 Ｎ−n−ブチル尿素−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe、 iＢＯＣ−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−(アミドエトキシエチル[３−アミド]−６−プ ロペナールヒドラゾン)−ピリジン、 Ｎ−iＢＯＣ−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−ＳＰＮＨ−チオエステル、 Ｎ−イソプロピル尿素−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe、 Ｎ−iＢＯＣ−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−プロピレンジアミン−ＳＰＮＨ、 シクロヘキシル尿素−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−ＣＯＯＨ、 Ｎ−n−ブチルカルバメート−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−メチルエステル、 Ｎ−iＢＯＣ−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−メチルエステル、 Ｎ−メチルカルバメート−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−メチルエステル、 Ｎ−アダマンチル尿素−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe、 Ｎ−シンナモイル−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe、 Ｐ−トリル尿素−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe、 Ｍ−トリル尿素−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe、 Ｎ−シンナモイル−Ｐhe−Ｌeu−Ｐhe−Ｌeu−Ｐhe よりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。 １８．Ｍ¹が放射性同位体を含んでなる、請求項１に記載の方法。 １９．Ｍ¹が¹¹¹Ｉnまたは^99mＴcである、請求項１８に記載の方法。 ２０．Ｍ¹が常磁性同位体、またはＰＥＴによりイメージすることができる化 合物を含んでなる、請求項１に記載の方法。 ２１．非経口により投与する、請求項１８に記載の方法。 ２２．非経口により投与する、請求項２０に記載の方法。 ２３．非経口投与が皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、または静脈内注射を含んで なる、請求項２１に記載の方法。 ２４．非経口投与が皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、または静脈内注射を含んで なる、請求項２２に記載の方法。 ２５．投与が段階潅流によるものである、請求項２３に記載の方法。 ２６．投与が段階潅流によるものである、請求項２４に記載の方法。 ２７．段階潅流が臑動方法を利用しての静脈内経路によるものである、請求項 ２５に記載の方法。 ２８．段階潅流が臑動方法を利用しての静脈内経路によるものである、請求項 ２６に記載の方法。 ２９．個体がヒトである、請求項１９に記載の方法。 ３０．νが１であり、またＫがＤＴＰＡ、ＥＤＴＡ、またはＨＹＮＩＣである 、請求項１に記載の方法。 ３１．Ｍ¹が放射性同位体を含んでなる、請求項３０に記載の方法。 ３２．該放射性同位体が¹¹¹Ｉnまたは^99mＴcである、請求項３１に記載の方法 。 ３３．Ｍ¹が常磁性同位体、またはＰＥＴによりイメージすることができる化 合物を含んでなる、請求項３０に記載の方法。 ３４．ＫがＨＹＮＩＣである、請求項３０に記載の方法。 ３５．ＷがさらにＬ（ここで、Ｌは補助リガンドである）を含んでなる、請求 項３４に記載の方法。 ３６．補助リガンドがグルコヘプトネート、トリシン、またはさらなるペプチ ド単位を含んでなる、請求項３５に記載の方法。 ３７．さらなるペプチド単位が、 Ｘ−Ｙ−Ｌeu−Ｐhe−[Ｚ]n−Ｗ ［式中、Ｗは、 −[Ｋ]ν−Ｍ¹ （式中、 ＫはＨＹＮＩＣであり、 νは１であり、また Ｍ¹は診断上、検出可能な標識である） で示される構造を有する標識用または結合置換基である］ である、請求項３６に記載の方法。 ３８．個体における感染または炎症部位を検出する方法であって、 ａ．診断上、有効な量の検出可能に標識された走化性ペプチド Ｘ−Ｙ−Ｌeu−Ｐhe−[Ｚ]n−Ｗ ［式中、 Ｘは、 （式中、 Ｒ³は水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アラルコキ シ、およびアミノよりなる群から選択され、また Ｒ⁴は酸素または硫黄である） で示される構造を有するアミノ保護基であり、 ＹはＭet、Ｐhe、またはＮleであり、 Ｚは１〜６個の炭素原子を有する脂肪族ジアミン、[Ｒ⁶]m（ここで、Ｒ⁶はア ミノ酸残基であり、またｍは１〜３の整数である）、およびそれらの混合物より なる群から選択されるスペーサー配列であり、 ｎは０または１であり、また Ｗは、 −[Ｋ]ν−Ｍ¹ （式中、 ＫはＤＴＰＡ、ＥＤＴＡ、またはＨＹＮＩＣであり、 νは１であり、また Ｍ¹は¹¹¹Ｉnまたは^99mＴcである） で示される構造を有する標識用または結合置換基である］（ここで、該走化性ペ プチドは、実質的には、感染または炎症部位に蓄積し、また実質的には、感染し ていない、または炎症していない部位には蓄積しない） を個体に投与して、 ｂ．その走化性ペプチドを検出する ことを含んでなる方法。 ３９．ＹがＭetである、請求項３８に記載の方法。 ４０．メチオニン残基を４−アミノテトラヒドロチオピラン−４−カルボン酸 で置換する、請求項３９に記載の方法。 ４１．ロイシン残基をジプロピルグリシンで置換する、請求項３９に記載の方 法。 ４２．ロイシン残基を１−アミノシクロヘキサンカルボン酸で置換する、請求 項３９に記載の方法。 ４３．フェニルアラニン残基をz−デヒドロフェニルアラニンで置換する、請 求項３９に記載の方法。 ４４．フェニルアラニン残基を２−アミノインダノン−２−カルボン酸で置換 する、請求項３９に記載の方法。 ４５．フェニルアラニン残基をアニリノグリシンで置換する、請求項３９に記 載の方法。 ４６．ｎが１であり、またＺが[Ｒ⁶]mである、請求項３８に記載の方法。 ４７．ｍが１であり、またＲ⁶がノルロイシン、チロシン、アスパラギン酸、 リジン、ロイシン、およびフェニルアラニンよりなる群から選択される、請求項 ４６に記載の方法。 ４８．ｍが２であり、また各々のＲ⁶がノルロイシン、チロシン、アスパラギ ン酸、リジン、ロイシン、およびフェニルアラニンよりなる群から独立して選択 される、請求項４６に記載の方法。 ４９．ｍが３であり、また各々のＲ⁶がノルロイシン、チロシン、アスパラギ ン酸、リジン、ロイシン、およびフェニルアラニンよりなる群から独立して選択 される、請求項４６に記載の方法。 ５０．ＫがＨＹＮＩＣである、請求項４９に記載の方法。 ５１．ＷがさらにＬ（ここで、Ｌは補助リガンドである）を含んでなる、請求 項５０に記載の方法。 ５２．補助リガンドがグルコヘプトネート、トリシン、またはさらなるペプチ ド単位を含んでなる、請求項５１に記載の方法。 ５３．さらなるペプチド単位が、 Ｘ−Ｙ−Ｌeu−Ｐhe−[Ｚ]n−Ｗ ［式中、Ｗは、 −[Ｋ]ν−Ｍ¹ （式中、 ＫはＨＹＮＩＣであり、 νは１であり、また Ｍ¹は診断上、検出可能な標識である） で示される構造を有する標識用または結合置換基である］ である、請求項５２に記載の方法。 ５４．非経口により投与する、請求項３８に記載の方法。 ５５．非経口投与が皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、または静脈内注射を含んで なる、請求項５４に記載の方法。 ５６．投与が段階潅流によるものである、請求項５５に記載の方法。 ５７．段階潅流が臑動方法を利用しての静脈内経路によるものである、請求項 ５６に記載の方法。 ５８．個体がヒトである、請求項３８に記載の方法。 ５９．検出可能に標識された走化性ペプチド Ｘ−Ｙ−Ｌeu−Ｐhe−[Ｚ]n−Ｗ ［式中、 Ｘは、 （式中、 Ｒ³は水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アラルコキ シ、およびアミノよりなる群から選択され、また Ｒ⁴は酸素または硫黄である） で示される構造を有するアミノ保護基であり、 Ｙはアミノ酸残基であり、 Ｚは１〜６個の炭素原子を有する脂肪族ジアミン、[Ｒ⁶]m（ここで、Ｒ⁶はア ミノ酸残基であり、またｍは１以上の整数である）、およびそれらの混合物より なる群から選択されるスペーサー配列であり、 ｎは０または１であり、また Ｗは、 −[Ｋ]ν−Ｍ¹ （式中、 ＫはＤＴＰＡ、ＥＤＴＡ、またはＨＹＮＩＣであり、 νは１であり、また Ｍ¹は¹¹¹Ｉnまたは^99mＴcである） で示される構造を有する標識用または結合置換基である］（ここで、該走化性ペ プチドは、実質的には、感染または炎症部位に蓄積し、また実質的には、感染し ていない、または炎症していない部位には蓄積しない）。 ６０．ＹがＭet、Ｐhe、またはＮleである、請求項５９に記載のペプチド。 ６１．ＫがＨＹＮＩＣである、請求項６０に記載のペプチド。 ６２．ＷがさらにＬ（ここで、Ｌは補助リガンドである）を含んでなる、請求 項６１に記載のペプチド。 ６３．補助リガンドがグルコヘプトネート、トリシン、またはさらなるペプチ ド単位を含んでなる、請求項６２に記載のペプチド。 ６４．さらなるペプチド単位が、 Ｘ−Ｙ−Ｌeu−Ｐhe−[Ｚ]n−Ｗ ［式中、Ｗは、 −[Ｋ]ν−Ｍ¹ （式中、 ＫはＨＹＮＩＣであり、 νは１であり、また Ｍ¹は診断上、検出可能な標識である） で示される構造を有する標識用または結合置換基である］ である、請求項６３に記載のペプチド。 ６５．非経口投与に適当な請求項５９に記載の走化性ペプチドの医薬品製剤。 ６６．Ｎ−Ｆor−Ｎle−Ｌeu−Ｐhe−Ｎle−Ｔyr−Ｌys−ＤＴＰＡ、 Ｎ−Ｆor−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−Ｐu−ＤＴＰＡ、 Ｎ−Ｆor−Ｎle−Ｌeu−Ｐhe−Ｌys−ＤＴＰＡ、 Ｎ−Ｆor−Ｎle−Ｌeu−Ｐhe−Ｌys(ＮＨ₂)−ＤＴＰＡ、 Ｎ−Ｆor−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−Ｌys−ＤＴＰＡ、 Ｎ−Ｆor−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−Ｄ−Ｌys(ＮＨ₂)−ＤＴＰＡ、 Ｎ−Ａc−Ｎle−Ｌeu−Ｐhe−Ｌys(ＮＨ₂)−ＤＴＰＡ、 ＩＢＯＣ−Ｌ−メチオニル(スルホキシド)−Ｌ−Ｌeu−Ｌ−Ｐhe−Ｌ−リジ ンアミド、 ＩＢＯＣ−Ｌ−ノルロイシル−Ｌ−Ｌeu−Ｌ−Ｐhe−Ｌ−リジンアミド、 Ｎ−Ｆor−Ｌ−メチオニル(スルホキシド)−Ｌ−Ｌeu−Ｌ−Ｐhe−ＤＴＰＡ −Ｌ−Ｌys、 Ｎ−Ｆor−Ｌ−メチオニル(スルホン)−Ｌ−Ｌeu−Ｌ−Ｐhe−Ｎ−ＤＴＰＡ −Ｌ−Ｌys、 Ｎ−イソブチル尿素−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−カルボキシレート、 イソブチルオキシカルボニル−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−Ｎ−ＤＴＰＡ−Ｌys、 Ｎ−Ｆor−(Ｄ)−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−Ｌysアミド溶媒和物、 t−Ｂoc−Ｎle−Ｌeu−Ｐhe−Ｌys溶媒和物、 Ｎ−Ｆor−メチオニル−スルホキシド−Ｌeu−Ｐhe−Ｌysアミド溶媒和物、 Ｎ−Ｆor−メチオニル−スルホン−Ｌeu−Ｐhe−Ｌysアミド溶媒和物、 Ｎ−カルバミル−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−Ｌysアミド溶媒和物、 Ｎ−トリメチルアセチル−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−Ｌysアミド溶媒和物、 イソブチルオキシカルボニル−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe−Ｌysアミド溶媒和物、 Ｎ−Ｆor−Ｎle−Ｌeu−Ｐhe−Ｎle−Ｔyr−Ｎ^ε−ＤＴＰＡ−Ｌys、 Ｎ−アダマンチル尿素−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe、 Ｎ−シンナモイル−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe、 Ｐ−トリル尿素−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe、 Ｍ−トリル尿素−Ｍet−Ｌeu−Ｐhe、 Ｎ−シンナモイル−Ｐhe−Ｌeu−Ｐhe−Ｌeu−Ｐhe よりなる群から選択される走化性ペプチドであり、診断上、検出可能な標識で標 識される走化性ペプチドであって、個体における感染または炎症部位に蓄積する ことができ、また実質的には、感染または炎症が存在していない部位においては 蓄積しない走化性ペプチド。 ６７．検出可能な標識が放射性同位体である、請求項６６に記載のペプチド。 ６８．放射性同位体が¹¹¹Ｉnまたは^99mＴcである、請求項６７に記載のペプチ ド。 ６９．検出可能な標識が常磁性同位体、またはＰＥＴによりイメージすること ができる化合物である、請求項６６に記載のペプチド。 ７０．走化性ペプチド Ｘ−Ｙ−Ｌeu−Ｐhe−[Ｚ]n−[Ｔ]α ［式中、 Ｘは、 （式中、 Ｒ³は水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アラルコキ シ、およびアミノよりなる群から選択され、また Ｒ⁴は酸素または硫黄である） で示される構造を有するアミノ保護基であり、 Ｙはアミノ酸残基であり、 Ｚは１〜６個の炭素原子を有する脂肪族ジアミン、[Ｒ⁶]m（ここで、Ｒ⁶はア ミノ酸残基であり、またｍは１以上の整数である）、およびそれらの混合物より なる群から選択されるスペーサー配列であり、 ｎは０または１であり、 Ｔは治療用物質であり、また αは０または１である］（ここで、該走化性ペプチドは、実質的には、感染ま たは炎症部位に蓄積し、また実質的には、感染していない、または炎症していな い部位には蓄積しない） を含んでなる治療用組成物。 ７１．αが１であり、またＴが薬物、レクチン、毒素、抗微生物剤、および −[Ｋ]ν−[Ｍ²]μ ［式中、 Ｋは中間官能基であり、 νは０または１であり、 Ｍ²は治療用放射性同位体であり、また μは０または１である］ で示される構造部分よりなる群から選択される、請求項７０に記載の治療用組成 物。 ７２．νが０である、請求項７１に記載の治療用組成物。 ７３．Ｍ²が¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、⁹⁰Ｙ、⁶⁷Ｃu、²¹⁷Ｂi、²¹¹Ａt、²¹²Ｐb、⁴⁷Ｓc、^{1 86} Ｒe、¹⁸⁸Ｒe、¹⁰⁵Ｒh、¹⁵³Ｓm、および¹⁰⁹Ｐbよりなる群から選択される、請 求項７２に記載の治療用組成物。