HUT75056A - Labeled chemotactic peptides to image focal sites of infection or inflammation - Google Patents

Description

JELZETT KEMOTAKTIKUS PEPTIDEK FERTŐZÉSEK VAGY GYULLADÁSOK GÓCAINAK LEKÉPEZÉSÉRE

A találmány tárgyát gyulladások ill. fertőzések detektálására ill. kezelésére alkalmas kemotaktikus peptidek képezik.

A gyulladás a szövetek válasza az őket ért különböző károsodásokra. E szöveti károsodások származhatnak mikrobáktól, autoimmun folyamatokból, kilöködési reakcióból, vagy egyéb romboló külső befolyástól, mint pl. hő, fagy, sugárzó energia, elektromos- ill. kémiai ingerlés, vagy mechanikus behatások. Bármi legyen is a gyulladás oka, és a test bármely részén is jelentkezzen, a válasz meglehetősen hasonló. Bonyolult sejtes ill. funkcionális kárelhárító folyamatok rendszeréről van szó, amely magában foglalja a mikrokeringés megváltozását, a különböző testnedvek mozgását, ill. a gyulladás-ellenes sejtek (leukociták) aktivizálódását, ill. a gyulladás helyszínére áramlását. Ez a válaszrendszer a szervezet veleszületett védekező mechanizmusának fontos részét képezi, s bár a folyamat során meg kell fizetni a gyulladás által okozott szövetromlás árát, ez végül is elősegíti a későbbi javító folyamatokat.

Mikrobális fertőzések esetében, ill. bizonyos típusú szövetkárosodások esetében oldható vegyületek keletkeznek, amelyek megindítják a gyulladásos válasz komplex lépéssorozatát. A gyulladás helyén fokozódik a véráramlás, és a hajszálerek megnövekedett áteresztőképessége miatt a vérből folyadék áramlóik a gyulladás helyére. Az itt kivált folyadék olyan plazma-proteineket tartalmaz, amelyek normális esetben csak viszonylag alacsony koncentrációban áramlanak ki

83612-7177 BÉ/Pk a hajszálerekből. A leukociták ugyancsak a hajszálereken keresztül érkeznek a gyulladás helyére, aktív ill. passzív folyamatok segítségével. A gyulladási folyadék sejtes alkotórészeit főként polimorfonukleáris (PMN) leukociták (neutrofileknek vagy granulocitáknak is nevezik őket) alkotják, továbbá monociták, limfociták, valamint plazmasejtek is találhatók benne.

A fertőzések és gyulladások helyének meghatározása és jellemzése egyaránt fontos a klinikai diagnózisban valamint az állatgyógyászatban. Korai stádiumban lokalizálódott fertőzések esetében a páciensekben - akik nem mutatnak specifikusabb tüneteket mint a láz, ill. a súlyveszteség gyakran rejtett gyulladási helyeket kell keresni. Hasonlóképpen fontos, hogy az autoimmun betegségekben (mint pl. a rheumatoid arthritis) szenvedő paciensek, valamint azok esetében akiknél a beültetett szervek vagy szövetek kilökődése fordul elő, meg lehessen határozni a gyulladások helyét, kiterjedését, s követni lehessen a kezelés hatását a hatékony terápia érdekében.

Nem csoda hát, hogy komoly erőfeszítéseket tettek, és számos technikát fejlesztettek ki a gyulladásos folyamatok helyének meghatározására, ill. terjedelmének felbecsülésére. Ezek között mgtalálható a hagyományos röntgensugaras technika, a CAT vizsgálat, ill. a radioaktív jelzésen alapuló módszerek. (Sutton, A Textbook of Radíology and Imaglng, 3rd. Ed., Chuchill Livingston [ 1980] ; Maysey et al., Clinical Nuclear Medicine Ed., W.B. Sanders [ 1983] ) . A felhasznált radioaktív technikák pl. a következők:

1. A transzferrin nevű plazma-proteinhez kötődő Gallium⁶⁷, ami injektálás után a krónikus gyulladás helyén halmozódik fel.

2. Indium¹¹¹-gyel jelzett granulociták, amelyek a gazda- szervezetbe újra injektálva összegyűlnek a gyulladás helyén.

3. Radioaktivan jelzett kelátok, amelyek a sejten kívüli folyadékba jutnak, és a gyulladásos folyadékgyülemben halmozódnak fel; és

4. Talliummal, ill. ún. először áthatoló radio-nuklidokkal felvett angiogramok, amelyek a megnövekedett véráramlás helyét jelzik.

A hagyományos nuleáris orvosi technikákban az alábbi radiofarmakonokat használják a fertőzéses gyulladás helyének leképezésére: gallium⁵⁷-citrát, indium¹¹¹-gyel jelzett leukociták, technécium^m-mel jelzett leukociták, és indium¹¹¹gyel jelzett humán poliklonális IgG. Habár ezen anyagok mindegyikével figyelemrméltó eredmények érhetők el bizonyos esetekben, tág tere van még a módszerek javításának.

A gallium⁶⁷-citrát éppúgy jelzett proteinként viselkedik mit az indium¹¹¹-gyel jelzett IgG (mt.:150kD), ui. injektálás után készségesen kelát-komplexet képez a plazmában lévő transzferrinnel (mt.:100kD), ill. laktoferrinnel (mt.:kb. lOOkD). A gyulladás helyének leképezése ezen jelzet proteinekkel annak köszönhető, hogy a gyulladásos szövetekben feldúsúlnak, míg a normál szövetekben csökken a koncentrációjuk.(Juweid, M., et al., Eur. J. Nucl. Med. 19: 159-165 [1992]). E vegyületekkel az optimális detektálás 24 óra, vagy hosszabb idő alatt érhető el, ui. ennyi idő kell a jelzett anyagoknak a normális szövetekből, ill. a véráramból való kiürüléséhez.

Thakur és mtsai. alaposan elemezték a jelzett neutrofilek in vitro használatán alapuló módszereket (Sem. Nucl. Med. 14:107-117 [ 1984] ) . A vizsgálatok során a paciens neutrofiljeit gamma-sugárzó In¹¹¹ izotóppal jelezték. Az igy jelzett neutrofilek in vivő kinetikus mérésekhez ill. a gyulladásos gócok leképezéséhez használhatók. Az eljárás hátránya, hogy az in vitro végbemenő jelzéshez a neutrofileket előzetesen el kell különíteni.

A leukociták számos közvetítő anyagot (mediátort) termelnek, amelyek a gyulladás kiterjedését, ill. időtartamát szabályozzák. Felületükön különböző receptorok találhatók, amelyek az említett kémiai közvetítőkhöz, ill. egyéb, a gyulladási folyadékban jelenlévő proteinekhez képesek kötődni, ill. azokkal reagálni. Ezek a receptormediátor kölcsönhatások fontosak a leukociták működésének kontrollálása szempontjából a gyulladás helyén. Az említett gyulladási mediátorok közt találhatók az. ún. kemotaktikus faktorok, másnéven kemoattraktánsok, amelyek képesek kiváltani a polimorfonukleáris leukociták irányított vándorlását (migrációját) ill. aktivzálódását (részletes áttekintés és magyarázat végett 1.: Roitt. et al., Immunology, Gower Medical Pub., Londoni 1985] ) .

Az indium¹¹¹-gyel jelzett leukociták igen sikeres leképező ágensnek bizonyultak, de a vérből való előállításuk igen hosszadalmas és bonyolult. A kérdés további tanulmányozást igényel, mivel a radioaktívan jelzett sejtek csak több óra múlva lokalizálhatok, amikor megtalálták a kemoattraktánsokat, és a gyulladás helyére vándoroltak. Mivel az alkalmazható radioaktivitás mennyiségét dozimetriai megfontolások korlátozzák, gyakran csak gyenge minőségű leképezés nyerhető. Ámbár a technécium^m-rnel jelzett leukociták esetében jóval nagyob dózis alkalmazható, a radioaktivitás felhalmozódása a nem-célzott szervekben mégis korlátot jelent.

Az injektálás és a detektálás közötti idő számottevően lerövidíthető az alacsony molekulatömegű radiofarmakonok kifejlesztésével, amelyek a keringésben található, ill. a gyulladási helyen található gyulladási sejtekhez kötődnek. Erre a célra szóbajöhetnek pl. az alábbi molekulák:

IL-8 (Baggiolini, M., et al., J. Clin. Invest. 84(4): 10451049 [1989]), platelet-faktor-4 ( Deuel, T.F., et al . , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75(1):4584-87 [1981]), valamint az Nformil-metionil-leucil-fenilalanil (For-MLF) peptid (mt. : 4 37) (Showell, H.J., et al., J. Exper. Med. 743:1154-1169 (1976)? Schiffmann, E., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:1059-1062 (1975); Williams, L.T., et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74:1204-1208 (1977)).

A For-MLF egy bakteriális termék, amely a leukociták kemotaxisát idézi elő, a fehérvérsejtek sejtmembránjának nagy _affinitású receptoraihoz kötődve.

(Williams, L.T., et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74:1204-1208 (1977); Showell, H.J., et al.,J. Exper. Med. 743:1154-1169 (1976); Schiffmann, E., etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:1059-1062 (1975)).

Ezek a receptorok egyaránt jelen vannak a polmorfonukleáris ill. a mononukleáris fagocitákon. Habár számos in vitro szerkezet-hatás vizsgálatban azt tapasztalták, hogy e kicsiny N-formil-metionil peptidek szintetikus analógjai a neutrofilekhez, ill. makrofágokhoz a natív vegyületekkel azonos, vagy akár nagyobb affinitással is kötődnek, (Niedel, J., et al., J. Bioi. Chem. 255.1Q63-1066 (1980); O’Flaherty, J.T., et al., J. Immunoi. 720:1326-1332 (1978); Rőt, A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:1961-7971 (1987); Iqbal, M., et al., FEBS 165:111-114 (1984)), in vivő viszonylag kevesebb vizsgálatot végeztek a biológiai eloszlásra, ill. aktivitásra vonatkozóan. Amint a granulociták reagálnak a kemoattraktáns gradiensre, a receptorok affinitása csökken s más receptorok fejeződnek ki, amíg a sejt a gyulladás helyére ér, ahol a kemoattraktánsok töménysége a legnagyobb (Synderman, R., et al.,Rev. Infect. Dis. 9:562-569 [ 1987] ; Fletcher, M.P., J. Immunoi. 128:941948 [ 1988] ; Niedel, J., et al., J. Bioi. Chem. 10:700-710 [ 197 9] ) .A For-MLF rendkívül csekély mérete miatt (mt. :437) molekulaszerkezete igen könnyen módosítható abból a célból, hogy optimális leképezöszert nyerhessünk.

Számos baktériumfaj termel egy vagy többfajta kemotaktikus molekulát kis peptideket, nagyobb proteineket, vagy lipideket (Kiéin, J., Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination, Wiley Interscience, New York [ 1982] ) .

Ismeretes pl., hogy az E. coli baktériumok potenciális kemotaktikus molekulákat termelnek, amelyeknek aktív komponensei kicsiny heterogén peptidek, védett aminocsoportokkal. A szintetikusan előállított efféle peptidek hatékony kemoattraktánsoknak bizonyultak a polmorfonukleáris leukocitákra nézvést. Legismertebb képviselőik a For-MLF és néhány tetrapeptid analógja (Schiffman et al. , US 4 427 660 [ 1984] ; Schiffman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:10591062 [ 1975] ) . E peptidek szerkezet-hatás vizsgálata arra mutatott, hogy a célsejtek felületén szterospecifikus receptorok vannak jelen (Becker, E.L., Am. J. Pathol., S5:385-394[ 1976] ); később ilyen receptorokat detektáltak, radioaktívan jelzett formil peptideket használva ligandumként (Williams et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 1204-1208 [ 1977] ) .

Szintetizálták az N-formil-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys szerkezetű peptidet, amelyet igen specifikusan lehet jelezni I^12j izotóppal a tirozin oldalláncán, s amely erősen kötődik a humán neutrofilekhez (Niedel, J., et al., J. Bioi. Chem.

254 :10700-10706 [ 1979] ) .

A baktériumsejtek a gazdasejtekből is kiválthatják kemotaktikus faktorok termelését, pl. aktiválva a gazdasejt komplement rendszerének komponenseit, s igy megindítva a C5a ill. a C5b67 kemotaktikus molekulák helyi termelődését. Ha az immunválasz megindult a gazdaszervezetben az IgG antitest molekulák is kemotaktikus faktorként funkcionálhatnak, csakúgy mint az aktivált T limfociták által termelt molekulák. A különböző kemotaktikus molekulák szelektivitással rendelkeznek a különféle polmorfonukleáris leukocitákra (pl. neutrofilek, bazofilek, eozinofilek), ill. mast-sejtekre, monocita/makrofágokra, valamint limfocitákra nézvést, ami a megfelelő receptor-tipusoknak a gyulladásos sejtek felületén való jelenlétén alapul.

Számos szerkezet-hatás vizsgálat középpontjában amelyek a receptorkötödésért, ill. aktiválásért felelős molekulák sajátosságainak felderítésére irányulnak,bizonyos kemotaktikus peptidek állnak (Deuel, T. F., et alia

Proc. Natl Acad. Sci. USA 78(7):4584-4587 (1981); O’Flaherty, J.T., et al., J. Immunoi. 720:1326-1332 (1978); Rőt, A., et al.,Pro. Natl. Acad. Sci. USA 84:7967-7971 (1987); Iqbal, M., et al., FEBS 165:171-174 (1984)).

A legtöbb ilyen vizsgálat a For-MLF pepiidben végrehajtott aminosav-cserékre vonatkozott, ismeretesek azonban nagyobb peptidek, ill. jelentős negatív töltéssel bíró molekulák is (Fischman, A.J., J. Nucl. Med. 32:483-491 [ 1991] ; Tonio, C., et al., Biochem. 23:698-704 [ 1984] ), amelyeknek receptorkötésre, ill. aktiválásra vonatkozó EC₅₀ értéke kisebb vagy egyenlő a természetes peptidekével. Ezek a szerkezet-hatás vizsgálatok általában arra mutatnak, hogy az N-terminálison végrehajtott módosításoknak jelentős hatásuk van a receptorkötésre, ill. aktiválásra, a C-terminálison végzett módosítások hatása elenyésző (Spisani, S., et al., Inflammation 10:363-369 [ 1986] ) . Ezen túlmenően a receptorkötés ill. a biológiai aktivitás egymással szoros korrelációban vannak (Deuel, T.F., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1) :4584-4587 [ 1981] ; Schiffman, E., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:105 9-10 62[ 1975] ) . A fenti adatokra alapozva javasoltak egy modellt a receptor-peptid komplex konformációjára, amelyben csak a négy N-terminális aminosav van kölcsönhatásban a receptorral (Freer, R.J., et al., Biochem. 21:257-263 [ 1982] ) .

Bebizonyították, hogy a For-MLF C-terminálison módosított szintetikus analógjai azonos, ill. nagyobb affinitással kötődnek a neutrofilekhez, ill. makrofágokhoz mint a natív peptid (Deuel, T.F., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73(1):4584-4587 [1981]; Schiffman, E., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:1059-1062 [ 1975] ; (Niedel, J., et al. , J. Bioi. Chem. 255:7063-7066 [ 1980] ) . így egy jelző-egység beépítése a C-terminálison lehetővé teszi jelzett analógok előállítását megőrzött receptorkötö képességgel.

A fertőzések leképezésének ez a megközelítése számos elméleti előnnyel jár a szokásos radiofarmakonokhoz képest. Az injektálás és a detektálás közti idő jelentősen lerövidül a fenti kis molekulák azon képessége miatt, hogy kötődnek a keringő granulocitákhoz éppúgy mint a gyulladás helyén már jelenlévő leukocitákhoz. A peptid csekély molekulatömege (<1000D) lehetővé teszi a jelzett proteineknél ill. leukocitáknál még gyorsabb diffúziót a fertőzött ill.

gyulladt területekre. A granulociták ilyen in situ jelzése kiküszöböli a sejtfunkciók megváltozását, valamint a páciensre és a személyzetre egyaránt veszélyes vérkezelést. Zoghbi és mtsai. (J. Nuc. Med. 22:32 [ 1981] ) Indium¹¹¹ -gyei jelezték a For-MLF-et, majd transzferrinnel kapcsolták. Véleményük szerint e vegyület ígéretes lehet a humán neutrofilek szelektív jelzésére. E módszer megoldást ad ugyan a jelzés fajlagosságára, nem küszöböli ki azonban azokat a nehézségeket, amelyek a sejteknek a páciensből való eltávolításából, kezeléséből, majd ismételt visszajuttatásából fakadnak.

Egyhelyütt steril tályogok in vivő lokalizálásáról számolnak

5 be, I izotóppal jelzett N-formil-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys közvetlen injektálásával nyulakba (Jiang et al. , Nucl. Med. 21.Ί10-113 [ 1982] ) . Amíg a megfelelő jelzési arányt (tályog/izom) elérik, a fenti peptid használata során átmeneti neutropénia, lép fel majd visszaáll a neutrofília. A szerzők szerint a módszert tovább kell fejleszteni, hogy elkerüljék a fenti mellékhatásokat, s a módszer klinikailag használható legyen. Ezenfelül a I nem is a legjobb leképezőszer, a szerzők azonban nem vetik fel a jobb η ι ' - ι j_ η 123_τ 111_τ η ι 99^mm lekepezoszerek, mint pl. a I, In, 111. a Te alkalmazását.

Morgan és mtsai. (US 4 986 979) módszert írnak le a gyulladt szövetekben felhalmozódó jelzés mennyiségének növelésére. Kihasználható a leukociták felületi antigén markereinek túlszabályozása aktiválásuk során. Leképezési mmódszert írnak le, amelyben egy affinitási- valamint egy radionuklid címkével ellátott kemotaktikus peptidet használnak fel, amely a leukocitákhoz kötődve javítja a leképezést. A szerzők nem írják le antagonisták szintézisét, és azt sem, hogy az ilyen antagonisták hasznosak a neutropéniás válaszreakció kiküszöbölésére.

Habár a fenti technikák segítségével hasznos információk nyerhetők, túl gyakran szolgáltatnak hamis pozitív, ill. negatív eredményeket, túl sok veszödséggel és mellékreakcióval járnak együtt. Ezért nyilvánvaló, hogy szükség van direktebb, érzékenyebb, és specifikusabb módszerekre a fertőzések ill. gyulladások helyének lokalizálására és detektálására, különösen olyan technikákra, amelyek sorozatosan, folyamatosan alkalmazhatók a terápia során.

A találmány tárgya alapjában nem invazív módszer fertőzési és gyulladási helyek leképezésére, amely azon a felismerésen alapul, hogy detektálható jelzéssel ellátott kemotaktikus peptideket szisztematikusan az állatokba injektálva, azok feldúsulnak a lokális fertőzés helyén.

Közelebbről a találmány tárgya módszer a páciensekben gyulladás ill. fertőzés helyének detektálására, amely az alábbi lépésekből áll:

a. / a páciensnek, diagnosztikusán hatásos mennyiségben, az alábbi, detektálhatóan jelzett kemotaktikus peptidet adagoljuk:

X - Y - Leu - Phe - [ Z] _n - W ahol:

X jelentése amino-védöcsoport,

Y jelentése aminosav-maradék,

Z jelentése távtartó (spacer) szekvencia, n értéke 0 vagy 1, és

W egy alábbi szerkezetű jelző vagy kapcsoló szubsztituens:

- [ K] _v - M¹ ahol;

K jelentése köztes funkciós csoport, v érétéke 0 vagy 1, és

M¹ diagnosztikalag detektálható jelzöegység; és amely kemotaktikus peptid döntően a fertőzés vagy gyulladás helyén gyűlik össze, és nem akkumulálódik a nem fertőzött vagy gyulladt helyeken; és

b. / detektáljuk a kemotaktikus peptidet.

A találmány tárgya előnyösen módszer a páciensekben gyulladás ill. fertőzés helyének detektálására, amely az alábbi lépésekből áll :

a./ a páciensnek, diagnosztikusán hatásos mennyiségben, az alábbi, detektálhatóan jelzett kemotaktikus peptidet adagoljuk:

X - Y - Leu - Phe - [ Z] _n - W ahol:

X jelentése amino-védöcsoport,

Y jelentése —NH-CH-C—

R¹ ahol R¹ jelentése benzil, alkil, vagy —CH₂—CH₂—R²—CH₃, és

0 ₂ II II

R jelentése —S—, —S —, —S—, vagy —0—,

Z jelentése távtartó (spacer) szekvencia, n értéke 0 vagy 1, és

W egy alábbi szerkezetű jelző vagy kapcsoló

szubsztituens:

- [ K] v - M1

ahol;

K jelentése köztes funkciós csoport,

v érétéke 0 vagy 1, és

M¹ diagnosztikalag detektálható jelzöegység; és amely kemotaktikus peptid döntően a fertőzés vagy gyulladás helyén gyűlik össze, és nem akkumulálódik a nem fertőzött vagy gyulladt helyeken; és

b./ detektáljuk a kemotaktikus peptidet.

A találmány tárgya másként az alábbi szerkezetű detektálható kemotaktikus peptid:

X - Y - Leu - Phe - [ Z] _n - W ahol :

X jelentése az alábbi aminovédö csoport

4

R—C=-R ahol R³ lehet hidrogén, alkil-, alkenil-, alkinil-, . , 4 alkoxi-, aralkoxi vagy amino-csoport, es R jelentése oxigén vagy kén,

Y jelentése aminosav-maradék,

Z jelentése távtartó (spacer) szekvencia 1-6 szénatomos alifás diaminok, [ R⁶] _m, és ezek keverékei, ahol R^b jelentése aminosav-maradék, m pedig 1 vagy annál nagyobb egész szám, n jelentése 0 vagy 1, és

W egy alábbi szerkezetű jelző vagy kapcsoló szubsztituens:

- [ K] _v - M¹ ahol;

K jelentése DTPA, EDTA, vagy HYNIC, v érétéke 1, és

M jelentese In vagy Te ; es amely kemotaktikus peptid döntően a fertőzés vagy gyulladás helyén gyűlik össze, és nem akkumulálódik a nem fertőzött vagy gyulladt helyeken.

A fenti kemotaktikus peptideket tartalmazó gyógyszerkészítmények szintén a találmány tárgyát képezik, ámbár ezekben nincs mindig szükség egy detektálható szerkezeti egység jelenlétére.

Még közelebbről a találmány tárgya az alábbi szerkezetű kemotaktikus peptideket tartalmazó gyógyszerkészítmény:

X - Y - Leu - Phe - [ Z] _n - [ T] _α ahol:

X jelentése az alábbi aminovédő csoport

4

R —C=R ahol R lehet hidrogén, alkil-, alkenil-, alkinil-, alkoxi-, aralkoxi vagy amino-csoport, és R⁴ jelentése oxigén vagy kén,

Y jelentése aminosav-maradék,

Z jelentése távtartó (spacer) szekvencia 1-6 szénatomos alifás diaminok, [ R⁶] _m, és ezek keverekei, ahol R jelentése aminosav-maradék, m pedig 1 vagy annál nagyobb egész szám, n jelentése 0 vagy 1,

T jelentése terapeutikus ágens,és a értéke 0 vagy 1;

S amelynél a kemotaktikus peptid döntően a fertőzés vagy gyulladás helyén gyűlik össze, és nem akkumulálódik a nem fertőzött vagy gyulladt helyeken.

A találmány tárgya tehát in vivő módszer a páciensekben gyulladás ill. fertőzés helyének detektálására,amely abból áll,hogy a páciensnek, diagnosztikusán hatásos mennyiségben, detektálhatóan jelzett kemotaktikus peptidet adagolunk, mely peptid döntően a fertőzés vagy gyulladás helyén gyűlik össze, és nem akkumulálódik a nem fertőzött vagy gyulladt helyeken.

A találmány tárgyát képezik a különböző kemotaktikus peptidek is, amelyek megfelelő kelátképzö molekulák és detektálható címkék kon j ugátumai .

Az ábrák rövid ismertetése

1. ábra: A grafikonon 4, DPTA-val konjugált kemotaktikus peptidnek a humán neutrofilekhez való kötődését tüntettük fel. Kompetitív kötödésvizsgálatot végeztünk, melynek során [ H ] For-MLF-et helyettesítettünk a jelzetlen peptid egyre növekvő koncentrációival.

2. ábra: A grafikonon 4, DPTA-val konjugált kemotaktikus peptidnek a humán neutrofilek szuperoxid termelésének stimulálására gyakorolt hatása látható, az MLF hatásával összehasonlítva.

3. ábra: Az ábrán a kemotaktikus pepidek által termelt szuperoxid mennyiségét tüntettük fel. Humán polimorfonukleáris leukocitákat inkubáltunk HBSS-el, ill. a peptidek jelzett koncentrációival, 10 percre, 37°C-on, majd mértük a ferricitokróm redukcióját.

Maximális szuperoxid termelés %-a = E/M x 100 ahol E a termelt szuperoxid mennyisége a jelzett peptid koncentrációinál, és M a peptid által termelt szuperoxid maximális mennyisége. For-NleLFK-HYNIC: HP1;

For-MLFK-HYNIC: HP2; For-MLFNH(CH₂)₆NH-HYNIC: HP3; For-MLF(D)K-HYNIC: HP4.

4. ábra: Kemotaktikus peptid-analógok hatása a For-ML[ *Η] F kötődésére a humán polimorfonukleáris leukocitákhoz. Intakt humán polimorfonukleáris leukocitákat (8xl0⁵) inkubáltunk inkubációs pufferrel, ill. a peptidek jelzett koncentrációival, 15nM For-ML[ ³H] F jelenlétében, 45 percig, 24°C-on, majd meghatároztuk a For-ML[ ^JH] F specifikus kötődését.

Maximális For-ML[ ^JH] F kötődés %-a = E/C x 100 ahol E a specifikus cpm kötődés a jelzetlen peptidek feltüntetett koncentrációinak jelenlétében, és C jelentése a For-ML[ ^JH] F specifikus cpm kötődése, amikor csak a puffer van jelen. For-NleLFK-rHYNIC: HP1; For-MLFK-HYNIC: HP2;

For-MLFNHíCHjhNH-HYNIC: HP3; For-MLF-(D)K-HYNIC: HP4.

5. ábra: A peptid koncentráció hatása a radiokémiái kitermelésre (%), és a specifikus kötődésre (mCi/mól). Azadatok a For-MLF-(D)K-HYNIC peptidre vonatkoznak, de többi vizsgált vegyületre is hasonló adatokat kaptunk.

6. ábra: Céltárgy-háttér (target-to-background [ T/B] ) arányok Tc'ⁿ-mel jelzett peptidek esetében, E. coli-val fertőzött patkányoknál. Az adatokat úgy kaptuk, hogy a fertőzött • 4 - izmokban mért %ID/gramm értékeket elosztottuk a normál harántcsíkolt izmok esetében kapott értékekkel. A fertőzés valamennyi esetben 24 órával az injektálás előtt történt. A grafikon pontjai az 5 vagy 6 állat esetében kapott átlagos értékeket, ill. a standard hiba átlagát jelzik.

7. ábra: Gamma kamerával készült felvétel egy nyúlról, melynek combját E. coli-val fertőzték meg, majd az állatba Tc^m-mel jelzett kemotaktikus peptidet (1 mCi Tc’-mel jelzett HP2-öt) injektáltak, 24 órával a fertőzés után. A felvételt 17 órával az injektálás után készítették.

8. ábra: A jelzés eloszlása egy combján E. coli-val fertőzött nyúl testében, 17 órával a Tc^m-mel jelzett HP2 injektálása után, amely 24 órával a fertőzés után történt. Az oszlopok tetején lévő fekete sávok a standard hiba átlagát jelzik.

9. ábra: Céltárgy-háttér (target-to-background [ T/B] )

9 m aranyok Te -mel jelzett HP4 esetében, amelyet egy E. colival fertőzött nyálba injektáltak. A felvétel 17 órával az

9 m

Te -mel jelzett HP2 injektálása után készült,amely 24 órával követte a fertőzést. Az adatokat úgy kaptuk, hogy a fertőzött izmokban ill. a gennyben mért %ID/gramm értékeket elosztottuk a normál harántcsíkolt izmok esetében kapott értékekkel. A fertőzött izmokra vonatkozó értékek 6 állatból vett 28 mintából származnak. A gennyre vonatkozó adatok 6 állat 6 mintájából készültek.

10. ábra: A % injektált dózis (ID)/gramm értéke 4 HP3 preparátum esetében, 4 időpontban, a vérben, tüdőben, májban, epében, vesében, és a gasztrointesztinális traktusban.

11. ábra: A 85. példa szerinti kísérlet sematikus diagramja, infra. A vérmintákat a hematológiai mérésekhez a -15., -5., ill. a 0,25., 0,50., 1., 3., 5., 10., és 20. percben gyűjtötték, az injektáláshoz képest.

12. ábra: ForNleLFNleYK-DTPA hatása a perifériális WBC szintjére majmokban. A teljes perifériális WBC szintet a bázis-szint százalékában fejeztük ki. Négy adag pepiidet (ng/kg) használtunk. P: peptid injektálás; V: hordozó injektálás.

13. ábra: Gamma kamerával készült felvétel egy combján megfertőzött nőstény rhesus majomról, 3 ill. 12 órával a

Q Qm _

Te -mel jelzett For-Met-Leu-Phe-NH-(CH₂) ₆-NH-HYNIC injektálása után. Valamennyi felvételt a legfényesebb felvételhez normáltuk.

14. ábra: Gamma kamerával készült felvétel egy combján E. coli-val mélyen megfertőzött 6, ill. 18 órával Tc^99,n-HP és In¹¹¹-gyel jelzett leukociták együttes injektálása után. A Te -ra vonatkozó lekepezes korrigált az In -nek a Te ablakba eső fotonjaival. Valamennyi felvétel normáivá van a _f θ 9m korai Te -HP teljes beütésszámával. A fertőzés 24 órával az injektálás előtt történt.

15. ábra: Céltárgy-háttér (target-to-background [T/B] ) aranyok Te -mel jelzett HP és In -WBC-re nézve, amelyeket az injektálás után 3, 6, ill. 18 órával felvett szcintigrammok ROI analíziséből határoztunk meg. Valamennyi pont 6 állatnál mért átlagértéket, és a standard hiba átlagát jelzi. Mindegyik állatot 24 órával a radionyomjelzök injektálása előtt fertőzték meg.

16. ábra: Céltárgy-háttér (target-to-background [T/B] ) aranyok Te -mel jelzett HP es In -WBC-re nézve, amelyeket amelyeket kimetszett szövetminták direkt radioaktivitás mérésével határoztunk meg, 18 órával az injektálás után. A kis körök valamennyi mérés eredményét mutatják (18 minta 6 állatból), a nagy pedig az átlagot és az átlagos standard hibát a Te -re nézve. A kis négyzetek valamennyi mérés eredményét mutatják (18 minta 6 állatból), a nagy pedig az átlagot és az átlagos standard hibát a In¹¹¹-WBC-re nézve. Mindegyik állatot 24 órával az injektálás előtt fertőzték meg.

17. ábra: Genny-normál izom arányok Tc^99m-rnel jelzett HP és In^1U-WBC-re nézve, amelyeket kimetszett szövetminták direkt radioaktivitás mérésével határoztunk meg, 18 órával az injektálás után. Valamennyi pont 6 állatra vonatkozó átlagértéket és az átlagos standard hibát jelzi. Mindegyik állatot 24 órával az injektálás előtt fertőzték meg.

A továbbiakban a gyulladás, ill. gyulladási hely alatt azokat a körülményeket, ill. előfordulási helyüket értjük, amelyek a páciensben a szövetek sérülésének hatására jönnek létre, tekintet nélkül annak kóroktanára. A szövetkárosodás származhat mikrobális támadástól, autoimmun folyamatoktól, szerv- ill. szövetkilökődéstől, vagy egyéb kölső károsító befolyástól, mint pl. hő, fagy, sugárzó energia, elektromos vagy kémiai ingerlés, vagy mechanikus trauma. Bármi is az ok, és bárhol is legyen a test(b)en, a gyulladásos válasz meglehetősen hasonló. Bonyolult sejtes ill. funkcionális kárelhárító folyamatok rendszeréről van szó, amely magában foglalja a mikrokeringés megváltozását, a különböző testnedvek mozgását, ill. a gyulladás-ellenes sejtek (leukociták) aktivizálódását.

A fertőzés kifejezéssél baktériumok, vírusok, gombák, egysejtűek vagy egyéb mikroorganizmusok invázióját jelezzük. A páciens kifejezés állatokat, köztük emlősöket, különösképpen embert jelöl.

Az agonista kifejezésen e bejelentésben kemotaktikus peptidet értünk, amely kötődik a receptorhoz, és stimulálja annak funkcióját.

Az antagonista kifejezést arra a kemotaktikus peptidre használjuk amely kivédi a receptor ingerlését. Ez olyan peptid amelynek affinitása van a sejtreceptorhoz, és hozzákötödve megvédi a sejtet a reagálástól.

A diagnosztikusán hatásos kifejezést akkor alkalmazzuk egy dózisra, ha a detektálhatóan jelzett kemotaktikus peptid mennyisége elegendő a gyulladás ill. fertőzés helyének detektálására, bármekkora is legyen a háttérzaj.

mennyisége elegendő a gyulladás ill. fertőzés helyének detektálására, bármekkora is legyen a háttérzaj.

Az alkalmazott detektálhatóan jelzett kemotaktikus peptid mennyisége különböző megfontolások mint pl. a páciens kora, neme, a károsodás kitérjedtsége stb.

- szerint változhat. Figyelembe kell venni az esetleges ellenjavallatokat valamint egyéb változókat is, s az adagolást orvosnak kell irányítania. Az adagok kb. 0,01 gg/kg-tól kb. 2000 gg/kg-ig változhatnak, előnyösen 0,1 gg/kg-tól kb. 1000 gg/kg-ig.

A terminálisán módosított kemotaktikus peptid kifejezés többek között olyan molekulákat jelent, amelyek az alabbi általános képlettel írhatók le:

X - Y - Leu - Phe - [ Z] _n - W ahol:

X jelentése egy amino-védöcsoport

Y jelentése egy aminosav-maradék

Z egy távtartó (spacer) szekvencia n jelentése 0 vagy 1, és

W jelentése jelző vagy kapcsoló szubsztituens

Az X csoport bármelyik lehet az erre a célra szokásosan használatos védöcsoportok közül. Az alábbi sematikus diagram néhány hasznos szintetikus eljárást mutat be, amelyekkel amino-védöcsoportok kapcsolhatók a kemotaktikus peptidekhez.

R—NH

Ο

Met-Leu-Phe N-termínálisának módosítása |

R—O NH—Met-Leu—Phe

H—Met-Leu—Phe

O

Met-Leu-Phe - TFA (R-O)₂P—NH—Met—Leu—Phe

NH—Met—Leu—Phe

NH—Met—Leu—Phe

R—N

I

Met-Leu—Phe

S

NH—Met—Leu—Phe

a. 1. RNCO, Et ₃N, DMF; 2. H₃O⁺

b. 1. ROCOCI, EtgN, DMF; 2. H₃O⁺ a 1. RCOCI, Et₃N, DMF; 2. HgO*

d. 1. RSOjCI, Et₃N, DMF; 2. H _a0*

e. 1, 1-pirazol-l-karboxamid-hidroklorid, Et ₃N, DMF; 2. H gO* t. RNCS, Et ₃N, DMF; 2. H₃O*

g. 1.(RO)2POCI,Et₃N,DMF;2.H₃O⁺ h- 2,5-dimetoxi-tetrahidrofurán, NaOAc, AcOH

Leghelyesebb, ha az N-terminális védqcsoportot a lánc egy egységeként, és nem a kemotaktikus peptidtől (KP) távtartóval elválasztott terjedelmes csoportként képzeljük el. Valószínű, hogy a védőcsoport mindkét egysége kölcsönhatásba kerül a receptorral szférikus, elektrosztatikus, ill.hidrofób effektusok révén. Ebből következik, hogy a védőcsoport összetétele nagymértékben meghatározza a KP aktivitását. E feltételezést az az észlelés is alátámasztja, hogy higy egy n-butil-karbamáttal védett KP mintegy tízszer kevésbé aktív egy n-butil-karbamiddal védettnél. E két védőcsoport alifás oldalláncai azonosak, azonban különböző kötésszögekkel, rotációs fokokkal ill.elektrosztatikus sajátságokkal rendelkeznek.

A karbamát (uretán) védöcsoportot karbamid típusúra cserélve az N-terminális alakja nagy valószínűséggel megváltozik. A karbamidcsoportnak mások a kötésszögei, és kisebb a rotációs szabadsága, mivel a karbonil-csoport - nitrogén kötés körül kisebb a rotáció, mint a karbonil-csoport - oxigén kötés körül.

E hatásoknak szerepük lehet a KP receptorhoz való általános illeszkedésben.

A KP N-terminálisának elektrosztatikus viselkedése ugyancsak megváltozik a karbamid-csoport beépítésének hatására. E változások a receptorral való hidrogénkötéses kölcsönhatások módosulásához vezethetnek.

A karbamid-csoport mérete nem különbözik lényegesen a karbamátétól. A gátolt rotáció azonban megakadályozhatja bizonyos konformációk kialakulását, ami jelentősen befolyásolhatja a receptorhoz való illeszkedést, mivel ez inkább a csoport alakjának, semmint a méretének függvénye. Egy KP N-terminálisának karbamát helyett karbamiddal való védelmére az a legracionálisabb ok, hogy a karbamid-csoport a körülmények széles tartományában stabilisabb a karbamátnál.

Ez teszi lehetővé pl., hogy erősen savas körülmények között kémiai átalakításokat hajthassunk végre a C-terminálisnál lévő kapcsoló egységen.

A heteroatomot tartalmazó karbamid típusú védöcsoportokra (tiokarbamidok, szulfonamidok, foszfonamidok, guanidinek, szulfonil-karbamidok) ugyancsak vonatkozik a találmány.

Az irodalomból számos más amino-védöcsoport ismert, mint pl. a t.-butil-oxi-karbonil, acetil, benzil-oxi-karbonil, formil, tioformil, cianoamidin és metoxikarbonil.

Hatásos kemotaktikus ágensek (úgy agonisták, mind antagonisták) nyerhetők amino-terminálisukat izobutil-oxikarbonil-csoporttal ill. C₃-C₆ alkil-(elágazó vagy ciklikus)karbamoil csoporttal védve.

A kemotaktikus peptidekhez használható védöcsoportokat alább soroljuk fel. A védöcsoportok szintézise az alábbi műben található: Protecting Groups in Organic Synthesis; John Wiley & Sons: New York, 1981; 6. fejezet.

a. Karbamá tok

Ciklopropil-metil-karbamát

1- metil-ciklopropil-karbamát

Diizopropil-metil-karbamát

2- metil-tioetil-karbamát

1,1-dimetil-propinil-karbamát

t.-Amil-karbamát

Ciklopentil-karbamát

Ciklohexil-karbamát

9-fluorenil-metil-karbamát

1-adamantil-karbamát

1, l-dimetil-2,2,2-triklóretil-karbamát

2,2,2-triklóretil-karbamát

1-metil-(1-fenil-etil)-karbamát

2, 4-diklór-benzil-karbamát

b. Karboxamidok és a megfelelő tiokarboxamidok

Tiofén-karboxamid

Adamantil-karboxamid

4-bróm-butanoil-karboxamid

Cinnamoil-karboxamid

Nikotinoil-karboxamid

c. Karbamidok, a megfelelő tiokarbamidok, és a megfelelő ciano-guanidin származékok

Benzil-karbamid

2,4-difluor-fenil-karbamid

1-naftil-karbamid

Fenil-karbamid

Difenil-karbamid

Propil-karbamid

Héterőkarbamidok

d. Szulfonamidok

Benzolszulfonamid

Dimetoxi-benzolszulfonamid

Toluolszulfonamid

Benzil-szulfonamid

Trifluor-metil-szulfonamid

e. Főszfonamidók

Benzol-foszfonamid • ·

Dimetoxi-benzol-foszfonamid

Toluol-fos zfonamid

Benzil-foszfonamid

Trifluor-metil-foszfonamid

A találmány egyik előnyös megvalósítási módja szerint X jelentése R³ - C = R⁴

I ahol R³ jelentése hidrogén, alkil-, alkenil-, alkinil-, alkoxi-, aralkoxi-, ill. amino-csoport, R⁴ jelentése pedig kalkogén, előnyösen oxigén vagy kén.

Ha R jelentese alkil, ez előnyösen 1-6 szénatomos, még előnyösebben 3-6 szénatomos mint pl. metil, etil, propil, butil, pentil, hexil, ill. ezek izomerjei, mint izopropil, izobutil, szék.-butil, tere.-butil, neopentil, 2-etil-butil, stb. Az izobutil és a tere.-butil csoportok a legelőnyösebbek.

Ha R³ jelentése alkenil, ez előnyösen 2-6 szénatomos, még előnyösebben 2-4 szénatomos mint pl. etenil, propenil, butenil, pentenil, hexenil, ill. ezek izomerjei, mint izopropenil, izobutenil, szék.-butenil, tere.-butenil, neopentenil, 2-etil-butenil, stb.

. ,

Ha R jelentese alkinil, ez előnyösen 2-6 szénatomos, még előnyösebben 2-4 szénatomos mint pl. etinil, propinil, butinil, pentinil, hexinil, ill. ezek izomerjei, mint izopropinil, izobutinil, szék.-butinil, tere.-bútinil, neopentinil, 2-etil-butinil, stb.

Ha R³ jelentése alkoxi, ez előnyösen 1-6 szénatomos, még előnyösebben 3-6 szénatomos mint pl. metoxi, etoxi, propoxi, butoxi, pentoxi, hexoxi, ill. ezek izomerjei.

Ha R³ jelentése aralkoxi, ez előnyösen benzil-oxi: φ-ΟΗ₂-Ο-, ahol a fenil-csoport (φ) lehet szubsztituált vagy szubsztituálatlan.

Ha R³ jelentése amino-csoport, ez előnyösen -N(H)R⁵ szerkezetű, ahol R⁵ jelentése hidrogén, alkil-, cikloalkil-, vagy aril-csoport.

Ha R⁵ jelentése alkil, ez előnyösen 1-4 szénatomos, még előnyösebben 3-4 szénatomos mint pl. metil, etil, propil, butil, ill. ezek izomerjei, mint izopropil, izobutil, szek.butil, tere.-butil.

Ha R⁵ jelentése cikloalkil vagy aril, ez előnyösen ciklopentil, ciklohexil, adamantil, fenil, vagy difenil, amely csoportok lehetnek szubsztituáltak vagy s zubsztituálatlanok.

A fenti általános képletben Y jelentése aminosav-maradék, ami bármely, a célnak megfelelő csoport lehet. A találmány egyik előnyös megvalósítási módja szerint Y jelentése

II —NH-CH-C—

Aahol

R¹ jelentése benzil, alkil, vagy — CH2 — CH2 — R² — CH3 és

	0	0
2 . Ί	11	II
R jelentese —S—	—s— • II · o	—S— vagy —0—

Ha R¹ jelentése alkil, ez előnyösen 1-6 szénatomos, még előnyösebben 3-4 szénatomos mint pl. metil, etil, propil, butil, pentil, hexil, ill. ezek izomerjei, mint izopropil, izobutil, szék.-butil, tere.-butil, neopentil, 2-etil-butil, stb.

A találmány egy másik előnyös megvalósítási módja szerint Y jelentése 4-amino-tetrahidroprán-4-karbonsav (Thp). A Thp-Leu-Phe-OMe tetrapeptid analóg kemoattraktáns a humán neutrofilekre nézve, de nem serkenti a szuperoxid termelést.

A fenti általános képletben (21.old.) Z jelentése bármilyen hosszúságú távtartó szekvencia, amely n 0 vagy 1 jelentésétől függően van vagy nincs jelen a molekulában. Z jelentése előnyösen alifás diamin vagy [ R⁶] m, ahol R⁶ jelentése aminosav-maradék, m pedig 1 vagy annál nagyobb egész szám, előnyösen 1-3. Z lehet alifás diamin és [ R⁶] m kombinációja is .

Ha Z jelentése alifás diamin, ez előnyösen 1-6 szénatomos lehet, mint pl. metilén-diamin, etlén-diamin, propiléndiamin, tetrametilén-diamin, pentametilén-diamin, és hexametilén-diamin. Még előnyösebben Z jelentése 4-6 szénatomos alifás diamin, mint pl. tetrametilén-diamin (más néven kadaverin), pentametilén-diamin (más néven putreszcin, a továbbiakban Pu), és hexametilén-diamin.

Ha Z jelentése [ R⁶] _m, ez m értékétől függően egy vagy több aminosav-maradékot jelenthet. Két vagy több aminosav-maradék esetében ezek lehetnek azonosak vagy különbözőek. A spacer szekvencia aminosavjai a szakemberek által ismert, természetes ill. nem természetes aminosavak közül kerülhetnek ki. R ekként lehet egyedül vagy kombinációban arginin, glutaminsav, lizin, aszparaginsav, valin cisztein, leucin, izoleucin, norleucin, metionin, hisztidin, prolin, triptofán, tirozin, aszparagin, glutamin, szerin, treonin, alanin glicin, vagy fenilalanin. A találmány szerint a távtartó szekvenciában előnyösen használható egyedül vagy kombinációban a norleucin, tirozin, aszparaginsav, lizin, leucin, és fenilalanin.

Mint fentebb jeleztük W jelentése jelző vagy kapcsoló szubsztituens. W olyan csoport, amellyel a jelen találmány szerinti kemotaktikus peptidek detektálhatóan jelezhetők. A detektálhatóan jelezhető kifejezés azt jelenti, hogy a kemotaktikus peptidhez egy diagnosztikusán detektálható címke kapcsolódik.

Számos címke és jezési módszer ismeretes. A találmány szerinti célra használhatók pl. radioaktív ill. paramágneses izotópok, valamint pozitron emissziós tomográfiával (PÉT) leképezhető vegyületek. A szakemberek számára egyéb, a találmány szerinti kemotaktikus peptidekhez illeszkedő címkék is ismertek, vagy egyszerűen kik!sérletezhetők. E címkéknek a kemotaktikus peptidekhez való kapcsolása általánosan ismert módszerekkel történhet.

• · • · · · · · · • · · « · · ·· · ··· <·«

Az in vivő diagnosztikus leképezés során a rendelkezésre álló detektáló műszer milyensége alapvetően befolyásolja a radionuklid kiválasztását. Természetesen olyan bomlástípusú radionuklidot kell választani, amely a rendelkezésre álló eszkpzzel detektálható. A találmány szerinti vizsgálatokban bármely ismert leképezési ill. vizualizálási módszer felhasználható.

Az in vivő diagnosztikában használt radionuklidok kiválasztásának másik fontos tényezője a felezési idő hossza. Ennek elég hosszúnak kell lennie ahhoz, hogy a peptid még akkor is detektálható maradjon, amikor a célszövet felvette a maximális mennyiséget, de elég rövid ahhoz, hogy a szöveteket érő káros sugárzás minimalizálható legyen. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, az in vivő leképezéshez használt radionuklid nem bocsát ki részecskéket, de nagyszámú 140-200 keV energiájú fotont bocsát ki, amelyek közönséges gamma kamerákkal könnyen detektálhatok.

Az in vivő diagnózisokhoz a radionuklidokat direkt vagy indirekt módon átmeneti funkciós csoportok segítségével kapcsolhatjuk a kemotaktikus peptidekhez. A fémion típusú radionuklidoknak a kemotaktikus peptidekhez kapcsolására gyakran használt átmeneti funkciós csoportok a kelátképzök pl. a dietilén-triamin-pentaecetsav (DTPA), (Hnatowich, D.J., Int. J. Appl. Radiat. Isot., 33: 327-332, [ 1982] ), és az etilén-diamin-tetraecetsav (EDTA). A Te izotópnak a peptidekhez kötésére használható kelátképzö csoportok pl. a dioxim ligandumok (1), funkcionalizált ciklámok (2), N₂S₂ ligandumok (3), és az N₃S ligandumok (4).

• · 9 · «

• ·ν · • · A

Reaktív tiol csoportokat lizinhez iminotiolán (5) csoporton keresztül kapcsolhatunk, tiol csoportok pedig egy vagy több cisztein maradékot tartalmazó peptidek előállításával kapcsolhatók a peptidekhez.

Az alábbi

Tc^99tn, I¹²³,

fémionok köthetők a kemotaktikus peptidekhez: In¹¹¹, ,131 97 „67 „67 , 1 25 „ 68 ,72 „89 , _.2O1

I , Ru , Cu , Ga , I , Ga , As , Zr , es Ti alkalmazható az In¹¹¹ és a Te⁹⁹.

Előnyösen

Az Inⁱⁿ-gyel jelzett kemotaktikus peptidek hatékony ágensek a patkányokban található gyulladásos gócok külső leképezésére (Fiscman, A.J., J. Muci. Med. 32: 483-491 [1991]). Az In^m gyel jelzett peptidek csekély biológiai felezési ideje (t_1/2:

67,9 h) korlátozza használhatóságukat a leképezésben. A kemotaktikus peptidek jelzéséhez ideális radionuklidnak tekinthető a Te , mivel fizikai felezési ideje rövid, specifikus aktivitása magas, leképezési tulajdonságai kiválóak, ára alacsony, és könnyen hozzáférhető. Bár számos technika használható a Tc^m-rnel történő jelzéshez, de a hidrazino-nikotinamid-csoport (HYNIC) különösen ígéretesnek látszik. A hidrazino-nikotinsav aktív szukcinimidil-észtere (SHNH) sikerrel használható a proteinekben található lizin epszilon amino csoportok származék-képzésére. Ha ez utóbbiakat Te(V) atomtörzseket tartalmazó egyszerű

9 m komplexekkel, pl. Te -glukoheptonáttal inkubáljuk, kvantitatív jelzést kapunk (Abrams, M.J., et.al., J. Nucl. Med. 31: 2022-2028 [ 1990]).

A makromolekulák Te -mel történő jelzése három alapvető módszerrel történhet: direkt jelzés, bifunkciós kelátok alkalmazása, ill. jelzés preformált kelátokal. Jelenleg preferált módszer a HYNIC (SHNH) kapcsolóelem alkalmazása egy ún. átmeneti ligandumban. Ez úgy keletkezik, hogy a pertechnetát iont egy kelátképzö prekurzor jelenlétében

9 m redukáljuk, így kapjuk a bomlékony Te -prekurzor komplexet, amely azután reagál a bifunkcionálisan módosított kemotaktikus peptid fém-megkötő csoportjával, így jön létre a

QQm QC)_m

Te -CP konjugátum. Mint fentebb már említettük, a Te glukoheptonát mellékligandum használható az SHNH csoporttal módosított proteinek radioaktív jelzésére (Schwartz, D.A., et.al., Bioconjugate Chem. 2: 333-336 [ 1991] ) . Megjegyzendő, hogy a 90%-nál nagyobb radioaktív jelzés eléréséhez 60 perces inkubáció és 25 mCi/mg-nál nagyobb specifikus aktivitás szükséges. A tricin nevű polihidroxi-aminosav még könnyebben és hatékonyabban használható jelzéshordozó SHNH-val módosított polipeptidek és proteinek Te -mel történő jelzésére.

A tricin, a trisz(hidroximetil)-metil-glicin és analógjai segítségével vizes oldatban, pH 6-8 között, ón-klorid redukálószer jelenlétében, spontán módon alkíthatók ki a Tc^m tartalmú prekurzorok. A Tc-tricin mellékligandum kialakulásának analízise ITLC-SG csíkokon végezhető, hasonlóan a Te -glukoheptonát analízishez. Az eredeti TcSn kolloid mennyiségének meghatározásához sóoldatot, a pertechnetát mennyiségének meghatározásához az oldószerfrontban pedig metil-etil-ketont használhatunk. A Tctricin oldatok (36 mg/ml prekurzor, 50 gg/ml ón-klorid, pH 6,0) segítségével a Tc^m-glukoheptonát esetében alkalmazotthoz hasonló körülmények között, szobahőmérsékleten percek alatt az SHNH-val módosított IgG 90%-nál nagyobb jelzése érhető el. Ezen túlmenően a fenti oldatokkal a jelzett körülmények között 150 mCi/mg protein specifikus aktivitás érhető el, a Tc^m-glukoheptonáttal összehasonlítva. A magas specifikus aktivitású, kvantitatív radioaktív jelzés használata még fontosabb az SHNH-val módosított kismolekulák, pl. kemotaktikus peptidek esetében.

A HYNIC-el módosított peptidek jelzése az alábbi általános folyamat szerint mehet végbe:

Frissen készült Tc^mO₄ (30mCi/ml) oldatot adunk keverés közben azonos térfogatú frissen készült Sn/tricin oldathoz (72 mg/ml tricin, pH 7,0-7,2, 100pg/ml SnCl₂.H₂O) . A Tc^mtricin termelését 1x8 cm-es ITLC-SG csíkok segítségével határozzuk meg, sóoldatot, ill. metil-etil-ketont használva a kolloid, ill. a pertechnetát mennyiségének meghatározására. A Tc^m-tricint azonnal a peptid-oldathoz adjuk. Egy 1 mg/ml töménységű peptid, pl. iBOC-MLF-HYNIC-hidrazon oldat úgy állítható elő, hogy 1 mg pepiidet oldunk 600 μΐ etanolban, majd ehhez 4 00 μΐ enyhén savas vizet adunk. Az elegyet 30 percig állni hagyjuk, ezalatt a hidrazon védöcsoport lehasad, majd 1:10 arányban hígítjuk pH 5,2-es acetát pufferrel. A Tc^m-peptid konjugátum 100 μΐ Tc^m-tricin és 15 μΐ peptid oldat összekeverésével állítható elő. Egy órás inkubálás után

9m · a Te -tnem kitermeleset 1x8 cm-es ITLC-SG csíkok segítségével határozzuk meg, 25 tömeg%-os konyhasóoldatot használva eluensként, ekkor a Tc^99m-peptid a starton marad, minden egyéb az oldószefronttal eluálódik.

Példák a megfelelő kemotaktikus peptidekre, az oltalmi kör korlátozása nélkül:

N-For-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys-DTPA

N-For-Met-Leu-Phe-Pu-DTPA

N-For-Nle-Leu-Phe-Lys-DTPA

N-For-Nle-Leu-Phe-Lys(NH₂) -DTPA

N-For-Met-Leu-Phe-Lys-DTPA

N-For-Nle-Leu-Phe-(D)Lys(NH₂) -DTPA N-Ac-Nle-Leu-Phe-Lys(NH₂) -DTPA N-karbobenzoxi-Met-Leu-PheOMe

IBOC-Met(szulfoxid)-Leu-Phe-Lys(NH₂) IBOC-NLe-Leu-Phe-Lys(NH₂)

N-For-Met(szulfoxid)-Leu-Phe-DTPA-Lys

N-For-Met(szulfoxid)-Leu-Phe-N-DTPA-Lys

N-Izobutil-karbamid-Met-Leu-Phe-karboxilát

Izobutil-oxi-karbonil-Met-Leu-Phe-N-DTPA-Lys

N-For-(D)Met-Leu-Phe-Lys(NH₂) , szolvatált BOC-Nle-Leu-Phe-Lys, szolvatált

N-For-Met(szulfoxid)-Leu-Phe-Lys(NH₂) , szolvatált N-For-Met(szulfon)-Leu-Phe-Lys (NH₂) , szolvatált N-Karbamil-Met-Leu-Phe-Lys(NH₂) , szolvatált

N-Trimetil-acetil-Met-Leu-Phe-Lys(NH₂) , szolvatált Izobutil-oxi-karbonil-Met-Leu-Phe-Lys(NH₂) , szolvatált;

N-For-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-N^s-DTPA-Lys

Izopropil-karbamid-Met-Leu-Phe-Lys-SHNH-Boc

Izopropil-karbamid-Met-Leu-Phe-n-propil-diaminAsp-SHNH HBr

Izopropil-karbamid-Met-Leu-Phe-Lys-Asp-SHNH HBr

Izopropil-karbamid-Met-Leu-Phe-Lys-SHNH HBr

N-Fenil-karbamid-Met-Leu-Phe

Izopropi1-karbamid-Met-Leu-Phe-propán-diamin-SHNH

N-n-Buti1-tiokarbamid-Met-Leu-Phe

N-n-Butil-karbamid-Phe-Leu-Phe-Leu-Phe

N-Izopropil-karbamid-Phe-Leu-Phe-Leu-Phe-COOH iBOC-Met-Leu-Phe-COOH iBOC-Met-Leu-Phe-[ amido-(propil-amido)-karboxi(propil-karboxi)] -(amido-propanol-SPNH)-észter

N-Izobutil-karbamid-Met-Leu-Phe-karboxilát

N-n-Propil-karbamid-Met-Leu-Phe

N-t-Butil-karbamid-Met-Leu-Phe

N-n-Butil-karbamid-Met-Leu-Phe iBOC-Met-Leu-Phe-(amido-etoxi-etil-[ 3-amido] -6propenal-hidrazon)-piridin

N-iBOC-Me t-Leu-Phe-SPNH-1ioés ztér

N-Izopropil-karbamid-Met-Leu-Phe

N-iBOC-Met-Leu-Phe-propilén-diamin-SPNH

Ciklohexil-karbamid-Met-Leu-Phe-COOH

N-n-Butil-karbamát-Met-Leu-Phe-metilészter

N-iBOC-Met-Leu-Phe-metilészter

N-Metil-karbamát-Met-Leu-Phe-metilészter N-Adamantil-karbamid-Met-Leu-Phe N-Cinnamoil-Met-Leu-Phe p-Tolil-karbamid-Met-Leu-Phe m-Tolil-karbamid-Met-Leu-Phe N-Cinnamoil-Phe-Leu-Phe-Leu-Phe

Azon túlmenően, hogy a találmány szerinti módszerrel jellemezhető a gyulladás ill. a fertőzés helye, a módszer arra is alkalmas, hogy a gyulladás folyamatát kövessük a páciensben. Ekként megmérve a gyulladási helyek számának ill. méretének növekedését ill. csökkenését, megítélhető, hogy egy adott kezelés, melyet a fertőzésnek, ill. a gyulladást keltő egyéb tényezőnek, vagy magának a gyulladásnak a meggyógyífására alkalmazunk, hatásos-e vagy sem.

A találmány szerinti megoldás arra is felhasználható, hogy egy adott helyen lévő gyulladás mögöttes okát felderítsük. Ekkor a feltételezhetően gyulladásos betegségben szenvedő páciensnek először egy kemotaktikus peptid diagnosztikusán hatásos mennyiségét adjuk az előbbiek szerint, majd fotografikus leképezést alkalmazunk a gyulladási helyek meghatározására.

A találmány szerinti eljárásban alkalmazott kemotaktikus peptidek lehetnek agonisták vagy anagonisták. Néha egy adott peptid mindkét szerepet betöltheti, az alkalmazott koncentráció függvényében.

Az iBOC-MLFK ill. 1B0C-MLFK-DTPA peptidek in vitro antagonizálják a szabad gyököknek a ForMLF által a neutrofilekböl kiváltott felszabadulását, éppúgy, mint az aktivált neutrofileknek a vaszkuláris endoteliális sejtekhez való tapadását. Az antagonista aktivitás megmarad akkor is, ha a peptid C-terminálisát In^L11-et kapcsoló DTPA-val módosítjuk. A peptidek nem mutatnak agonista aktivitást. In vivő vizsgálatot folytattunk az agonista peptid, a ForNle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys-DTPA (ForNleLFNleYK-DTPA), és az iBOC-MLFK-DTPA összehasonlítására. Az Inⁿⁱ-gyel jelzett peptidek gyorsan összegyűlnek a fertőzés helyén. A lokalizációt gamma-kamerás leképezéssel és a szöveti biodisztribúció vizsgálatával is bizonyítottuk. A két peptid közti fö különbség az, hogy az agonista olyan területeken lokalizálódik mint a tüdő, a lép, a csontvelő, jelezve a sejtaktivitást és határait, míg az antagonista peptid esetében nincs ilyen effektus. Az agonista peptid a fehérvérsejtek számának átmeneti csökkenését idézi elő (neutropénia), míg az antagonista peptid esetében nincs szignifikáns hatás. Az eredmények megfelelnek az agonistáktól ill. antagonistáktól elvárható hatásoknak. Az agonista peptid 5 órán keresztül mutat javuló cél/háttér arányt, míg az antagonista legfeljebb 1 óráig mutat aktivitást. Ez arra utal, hogy a nagyobb kötődési affinitás melyet az agonista peptid mutat, jobb cél/háttér aránnyal, valamint egyéb terapeutikus előnyökkel is járhat. Ezek az eredmények azért is érdekesek, mivel eddig nem volt ismert, van-e egyáltalán az antagonistáknak leképezési kapacitásuk. Ez a képességük a szakemberek számára sem volt nyilvánvaló, ill. a szakirodalomból ismert, mivel fennállt annak a lehetősége, hogy a kötődéshez és a leképezéshez agonistán keresztüli aktiválásra van szükség. Kísérleteink bizonyították, hogy ez nincs így.

.

A BOC-Phe-Leu-Phe-Leu-Phe antagonista peptid gátolja a neutrofilek által vezérelt lizoszomális enzimkibocsátást. Az egyéb uretán típusú N-terminális védöcsoportok (metoxikarbonil, ill. karbobenzil-oxi) nem antagonistákká, hanem inkább agonistákká változtatják a peptideket. Az iBOC Nterminális védöcsoport ugyancsak megfelelő egy antagonista pepiidhez, egy e csoporttal védett peptid, melynek Cterminálisa DTPA-val van módosítva, megőrzi megfelelő biológiai aktivitását.

A találmány szerinti új felismerés, hogy a betegséggel összefüggő neutrofil funkciók, mint az endotéliumhoz való adhézió, ill. a szabad gyökök kibocsátása gátolható az iBOCMKFK antagonistával. Ez a peptid ín vivő ugyancsak lokalizálja a betegség helyeit, ráadásul ezt a fehérvérsejtek számának megváltoztatása nélkül teszi. Konzisztens eredmények kaphatók egy adhéziós-kaszkád blokkoló antagonista peptid, és más potenciális antagonisták alkalmazásával terápiás és diagnosztikai célra gyulladásos/fertözéses betegségek esetében.

Ugyancsak a találmány tárgyát képezi a Leu ill. Phe csoportok helyettesítése a fenti általános képletú vegyületekben.

a. Leucin

A leucint dipropil-glicinnel (Dpg) helyettesítve olyan analógot nyerhetünk, amely kemoattraktánsként viselkedik a humán neutrofilekre nézve. Az előállított és tesztelt peptid a For-Met-Dpg-Phe-OH volt.

1-amino-ciklohexán -karbonsav-csoportra (Acc^ö) cserélve a leucint, olyan anlógot kapunk, amely hatékonyan indukálja a lizozom felszabadulását a nyúl neutrofilekben, képlete: Met-Acc⁶-Phe-OH.

b. Fenilalanin

A fenilalanint z-dehidro-fenilalaninnal (z-Phe) helyettesítve olyan analógot nyerhetünk, amely stimulálja a szuperoxid termelést a nyúl neutrofilekben. A vizsgált analóg a For-Met-Leu-z-Phe-OMe.

A peptidváz módosításához szükséges aminosav-cseréket az alábbi irodalmi helyeken írják le:

a) metionin helyettesítése 4-amino-tetrahidro-tiopirán-4karbonsavval: Torrini et al. , Indián Journal of Peptide Protein Rés. 38: 495-504 (1991);

b) diizopropil-glicin és 1-amino-ciklohexán-karbonsav, mint leucin-helyettesítök: Dentino et al., The J. of Bioi. Chem. 28: 18460-68 (1991);

c) a fenilalaninnak z-dehidrofenilalaninnal való helyettesítését Chauhan et al., Tetrahedron 44: 2359-66 (1988) alapján végeztük.

d) fenilalanin helyettesítése 2-amino-indán-2-karbonsavval: Gavuzzo et al., Indián Journal of Peptide Protein Rés. 37: 268-76 (1991); és

e) fenilalanin helyettesítése anilino-glicinnel Kraus et al., European J. of Med. Chem. 27: 19-26 (1992).

A találmány egy másik kivitelezési módja szerint a kemotaktikus peptidek terapeutikusan konjugálhatók, s igy felhasználhatók terapeutikus ágenseknek a gyulladási ill. fertőzési helyekre juttatására. A terapeutikusan konjugált kifejezés azt jelenti, hogy a kemotaktikus peptid egy terapeutikus ágenssel van összekapcsolva. Ekként a terapeutikus ágensek közvetlenül a gyulladás fentebb jelzett okozóihoz, pl. egy fertőzött szervhez vagy egy tumorhoz ill. közvetlenül a gyulladási folyamat komponenseihez irányíthatók. A gyulladások kezelésére használható ágensek pl. a szteroid ill. nemszteroid természetű gyulladásgátlók. Számos nemszteroid természetű gyulladásgátló gátolja a posztaglandin szintézist.

A találmány szerinti módszerrel a kemotaktikus peptidekhez kapcsolhatók pl. gyógyszerek, radioizotópok, lektinek, toxinok, ill. antimikrobiális ágensek. Terápiás dózisnak a terápiásán hatékony mennyiséget nevezzük, amely szakember számára könnyen meghatározható. A dózis függ a páciens korától, egészségi állapotától, súlyától, az esetleges konkurrens kezelés fajtájától, a kezelés gyakoriságától, és attól, hogy milyen hatást, pl. gyulladásgátlót vagy antibakteriálisat akarunk-e elérni.

A lektinek leggyakrabban növényekből származó proteinek, amelyek cukrokhoz kötődnek, számos lektin képes a sejteket agglutinálni, némelyek pedig stimulálják a limfocitákat. A ricin egy toxikus lektin, amelyet terapeutikusan akként hasznosítanak, hogy a toxicitásért felelős alfa-láncát egy olyan antitesthez kötik, amely képes arra, hogy a toxikus hatású anyagot egy specifikus helyre szállítsa. A találmány egyik megvalósítási módja szerint a fenti peptidet egy kemotaktikus pepiidhez kapcsoljuk.

A toxinok növények, állatok, ill. mikroorganizmusok által termelt mérgező anyagok, amelyek megfelelően nagy dózisban akár halálosak is lehetnek. A diftériatoxinnak, amelyet a Corynebacterium diphteriae termel, különböző alfa ill. béta alegységei vannak. A toxikus komponensek kemotaktikus peptidekhez kapcsolhatók, és így specifikusan a gyulladásos ill. fertőzéses válasz helyére juttathatók.

A találmány szerinti eljárásssal a kemotaktikus peptidekhez kapcsolhatók pl. az alábbi, terapeutikus célra használható

és

A találmány szerinti eljárásokban az olyan anyagokat nevezzük antimikroboális szereknek, amelyek gátolják a fertőző miroorganizmusok mint pl. baktérimok, vírusok, gombák, ill. paraziták szaporodását (Goodman, A.G. et. al., 1985 supra) , s a szakemberek előtt jól ismertek.

A találmány szerint a kemotaktikus peptidekhez kapcsolható egyéb terapeutikus ágensek, ill. specifikus antitestek ugyancsak ismertek, ill. könnyen felderíthetők.

A leképezésre alkalmas, ill. terapeutikusan konjugált kemotaktikus peptideket tartalmazó, parenterális alkalmazásra szolgáló készítmények lehetnek steril vizes ill. nemvizes oldatok, szuszpenziók és emulziók. A nemvizes oldószerek lehetnek pl. polietilén-glikol, polipropilén-glikol, növényi olajok, mint pl. olívaolaj, és injektálható észterk, pl. etil-oleát. A vizes hordozó a víz mellett lehet alkoholos/vizes oldat, konyhasóoldat, különböző pufferek, sóoldatok, Ringer féle dextróz- ill. laktóz oldat, dextróz/NaCl, vagy fixált olajok. Az intravénás hordozók folyékony tápoldatok lehetnek, ill. a Ringer féle dextrózoldaton alapuló feltöltöanyagok és hasonlók. Konzerválószerek ill. egyéb adalékanyagok is alkalmazhatók, mint pl. mikrobaellenes szerek, anti-oxidánsok, kelátképzö ágesek, és inért gázok. (Remington ’s Pharmateutical Science, 16th ed., Mac. Eds. 1980).

A találmány szerinti leképező- ill. terapeutikusan konjugált kemotaktikus peptidek bármely, a célnak megfelelő módon alkalmazhatók. A parenterális adminisztráció magában foglalja pl. a szubkután, intravénás, intramuszkuláris,

intraperitoneális,	transzdermális, ill. bukkális alkalmazást.
Alternatívan, ill.	párhuzamosan szájon át történő adagolást
is alkalmazhatunk.	A detektálhatóan jelzett, leképezésre

alkalmas kemotaktikus peptidek esetében előnyös az intravénás alkalmazás. A kemotaktikus peptidek alkalmazhatók egyetlen labdacsban, ill. graduális, előnyösen intravénás perfúzióban, amelynél perisztaltikus szerkezetek alkalmazhatók a gradáció előidézésére.

A találmány alkalmazható gyulladások, ill. fertőzések detektálására a test legkülönbözőbb helyein, pl. de nem korlátozódva ezekre, izomban, érfalakban, a hasban, ill. a medencében, csontokban, ízületekben, ill. a csontvelőben. A találmány hasznosítható számos, mikroorganizmusok által okozott fertőzés, ill. az e fertőzések, vagy traumák, ill. autoimmun folyamatok által okozott, gyulladások detektálásában.

A találmány ugyancsak hasznosítható a gyulladások vagy fertőzések elleni terápia hatásosságának, ill. az ezekre adott reakciónak a kiértékelésében.

A fenti leírás általánosságban tárgyalja a találmányt. Az alábbi speciális példák a teljesebb megértést szolgálják, illusztrációként, de nem korlátozva a találmány terjedelmét.

1. példa

Kísérleti bakteriális fertőzések gócainak leképezése

Az N-For-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys kemotaktikus pepiidet szintetizáltuk az ismert standard szilárdfázisú módszerrel. (Merrifield, R.B., J. Am. Chem. Soc. 75:2149-2154 (1963); Stewart, J.M., and Young, J.D., Solid Phase Peptide Synthesis, W.II. Freeman & Company,

San Francisco, CA (1969)). A C-terminális lizin epszilon-amino csoportját DTPA-val módosítottuk, gyűrűs anhidrid alkalmazásával. Az eredeti, ill.a DTPA-val módosított peptid EC_5o értéke csaknem azonos, kb. 10⁹ ₍ ami azt jelzi, hogy a DTPA-val történt módosítás nem befolyásolta a peptid biológiai aktivitását. (Valamennyi vizsgált peptidde.l hasonló eredményeket kaptunk.) Ez igen meglepő eredmény, hiszen azt lehetne gondolni, hogy egy olyan nagymértékben negatív csoport, mint a DTPA bevitele jelentősen megváltoztatja egy ilyen kis peptid tulajdonságait. A peptid könnyen ellátható In¹¹¹ radioaktív jelzéssel.

Hat Sprague-Dawley patkányt 10^H élő E. coli bal combjukba injektálásával megfertőztünk. 24 órával ezután kb. 100 pCi aktvitást hordozó jelzett peptidet , ( kb. 5-10 μρ) , injektáltunk az állatokba.

A gamma kamerával készített sorozatfelvételekböl kiviláglik, hogy a radioaktivitás akkumulálódási csúscsa a gyulladás helyén 1 óra múlva következik be, a céltárgy/háttér arány ekkor kb. 4,0. 2 óra múltán az aktivitás szintje csökkent, a sérülés már alig volt észrevehető.

A fenti eredmények megalapozzák a találmány szerinti új ágens hasznosíthatóságát a gyulladási gócok leképezésében, egy állati fertőzéses modell esetében.

2. példa

A leukocita-kötődés biodisztribúciója, és a kemotaktikus peptidek bioaktivitása

Leukocita-kötödés: Négy DTPA-val konjugált kemotaktikus peptid humán neutrofilekhez való kötődését vizsgáltuk kompetitív kötödésvizsgálattal . Ennek során [ H³] For-MLF peptid lett helyettesítve jelzetlen peptid növekvő koncentrációival (Babior, B.m. et al., J. Cián. Invest. 52: 741 [1973]). Az eredmények az 1. ábrán láthatók. A vizsgálatban összehasonlítóként három, DTPA-val nem módosított peptidet használtunk.

SÓD termelés: Négy DTPA-val konjugált kemotaktikus peptidet vizsgáltunk a humán neutrofilek szuperoxid termelésének serkentése szempontjából (Pike, M.C. et al., Methods in Enzymol. 162: 236 [ 1988] ) . Az eredmények a 2. ábrán láthatók. A vizsgálatban MLF-et használtunk összehasonlításra.

Tn vivő neutropénia: Két DTPA-val konjugált kemotaktikus peptidet adagoltunk patkányoknak a szokásos leképező dózisnál tízszer nagyobb mennyiségben. A perifériás vért összegyűjtöttük (a farokvénából), 5 perccel az injektálás előtt, majd 1,2,5,10,15, és 30 perccel utána. Egyetlen vizsgált állatban sem tapasztaltuk a neutropénia indukcióját.

3-5. példák

E példák azt mutatják hogy az izobutil-oxi-karbonil-metionilleucil-fenilalanil-N-dietilén-triamin-pentaacetil-1 izin (iBOC-MLFK-DTPA) antagonistája a For-MLF által előidézett neutrofil aktiválásnak amely a gyulladási gócokban lokalizálódik. E lokalizáció a fehér vérsejtek számának megváltozása nélkül játszódik le.

3. példa

Izolált humán neutrofileket (2,5xl0⁵) előzetesen inkubáltunk μΜ iBOC-MLFK-DTPA-val, a 10 nM Fof-MLF által, 2,8 μΜ luminol mint kiegészítő ágens, jelenlétében kiváltott szabadgyök-függő kemolumineszcencia vizsgálatánál. Az adott reakciókörülmények között a válasz teljesen gátolt volt. Egy újabb mérésből kiderült az is, hogy a gátlás dózisfüggő: IC₅₀ 0,2 μΜ.

4. példa

Az antagonista iBOC-MLFK-DTPA pepiidet összehasonlítottuk az agonista formi1-norleucil-leucil-fenilalanil-norleuciltirozil-lizin-DTPA (ForNleYK-DTPA) agonista peptiddel, nyúlban kiváltott gócos gyulladási modellben. A gyulladást a 2-3 kg-os nyulak hátsó lábában E. coli-val idéztük elő. A folyamatot a 100B példában mutatjuk be. 24 óra után a nyulak egyik csoportját (n=3) az agonista (ForNleYK-DTPA) peptiddel, míg egy ugyanolyan egyedszámú csoportot az antagonista iBOCMLFK-DTPA peptiddel kezeltünk. A peptidek In¹¹¹-gyel voltak jelezve, a specifikus aktivitás kb. 400 μθί/μρ peptid volt. Valamennyi nyulat elaltattuk Ketamin-Xilazinnal, és 100 μθί ill. 0,25 μρ peptidet injektáltunk a fülük külső vénáján keresztül. A következő paramétereket mértük az 5., 15., 30., és a 60.percben: a fehér vérsejtek száma, az egész test radioaktív leképezése, a 60. percben pedig leöltük az állatokat a biodisztribúció meghatározására. Az agonista peptid a fehér vérsejtek számának átmeneti csökkenését idézte elő, míg az antagonista peptid nem. A gyulladási góc helye már 10 perccel bármelyik peptid injektálása után detektálható volt. A biodisztrbúció során az agonista peptid jobban feldúsult a lépben és a májban mint az antagonista. Mindkét peptid gyorsan akkumulálódott a vesében. Az antagonista peptid vér-szintje kissé magasabb volt, ami e peptid hosszak biológiai felezési idejére utalhat. A fertőzött izmokban a peptidek aránya 4:1 és 7:1 között volt, ami szignifikáns feldúsulást jelez a fertőzés helyén. Az agonista peptid esetében a céltárgy/háttér arány 5 órán keresztül emelkedett, míg az antagonistánál 1 óra után érte el a maximumot. Ez az agonista nagyobb kötődési affinitására utalhat. Az előzőek azt mutatják, hogy egy antagonista kemotaktikus peptid gyorsan lokalizálódik a gyulladási gócokban, és ezért jól használható a gyulladt ill. fertőzött helyek diagnosztikus leképezésében. Az adatokból továbbá az is következik, hogy az ilyen antagonista peptidek potenciálisan használhatók a megfelelő specifikus receptorokat érintő betegségek kezelésében.

5. példa

A nem konjugált iBOC-MLFK pepiidet vizsgáltuk egy neutrofilendoteliális sejt adhéziós tesztben. A vizsgálatban 5karboxi-fluoreszceinnel jelzett neutrofileket (5xl0⁵) , 48 mélyedéses vizsgálólapra helyezünk, amelynek mélyedései emberi összefolyó köldökvéna endoteliális sejtjeit tartalmazzák. Az iBOC-MLFK peptidet 10 μΜ koncentrációban adagoltuk, 10 perccel a neutrofilek 30 nM ForMLF-el való stimulálását megelőzően. A százalékos adhéziót a meg nem tapadt neutrofilek 25 perc inkubálás után való kimosásával határoztuk meg. A fenti peptid e koncentrációban 66%-ban gátolja az adhéziót. Ezután a 0,1 és 3,0 μΜ közti koncentrációkat vizsgáltuk. A peptid dózisfüggö módon gátolja az adhéziót, IC₅₀ kb. 14 μΜ. Az adhézió gátlása csökkentheti a leukociták beszűrödését a beteg területre, limitálva ezzel a gyulladással együtt járó szövetpusztulást. A fenti adatok antagonisták hasznosíthatóságára az aktivált leukociták megjelenésével járó betegségek kezelésében.

6-98. példák

Az 5. példa szerinti eljárást reprodukáltuk, további találmány szerinti peptidekkel. Az eredményeket az I. táblázat mutatja, ahol MPA jelentése mieloperoxidáz, a jel azt jelenti, hogy 30 μΜ koncenrációban nincs hatás, a +jel pedig azt jelenti, hogy pozitív effektus észlelhető, végül az N.T. rövidítés jelentése nem tesztelt.

Sejtbiológiai adatok

J41 1 'Φ P φ Ό Ή •H C *5 Ν Ο < '0 tr 9 Tj Ur \ cy (0

3.1

.68

I

5-17

6.7 Ν=2

20

1

12.6

5.1

25.8

6.5 Ν=2

44 - 'φ Ό 4-) -r4 ω Á Ν -d 4. 'Φ C ö σ> r J

1

1

Ό Ο Ο

φ' 'Φ _,- -<0 Η η 0 5 0 r V Ο Λ Ο 0-1 ·Η LÜ S X

«

44 'Φ 4-) Φ Ή 44 |S £ ό 1¾ “Ω tn Φ

ιη οι

00

Γ-*

ΓΩ

m ιη

1

m

Γιη

<η

1

ΟΟ

ιη σ\ <Ν

ί

Λ! «β — •Ö JÍ η |i2 C 5 2 :Ο 0 - ? Ν >, Ö> U υ* m <β ρ)

t

t

I

I

I

ι

un ο

1

1

1

1

t

un ο

ω Ό) 5 ΙΟ -Ρ ο Orj *ω

m Xt

ΓΟΟ

ο ο Λ

SO ιη

\Ο

οο Γ-

<Ν I Ο Ο V

Ο οί

τΓ

00 Μ;

ο 00 Λ

οο οο

Γιη

II ζ Γ9 1 <υ ΤΓ

Szekvencia

Ul s 1 •H ε φ φ 44 1 1-----1 -H N 0 •U 1 s

[14 »q S 1 Ό -H ε φ x Cl Φ ^4 1 Ή •Η 4-) α φ ε φ Ό Φ 1

Leu-Ala-SHNH-BOC

<υ X Cl 1 3 V U «4 X 0ύ S ρ

1X4 ι-Ί [14 1 Ό Η ε φ XJ 0 φ 44 1 I—1 Η 04 0 μ 04 0 Ν Η Ζ

Ü ·γ4 υ s ω Γ—1 1 υ Q

Ν (Vinil-karbamát)-MLF

[14 S I Ό •Η ε φ ο φ 44 0 Ή 4-) 1 Η ·<—1 Ο. 0 Μ 04 I Ζ

[14 S I Ό •Η ε φ -Q Ο Φ 44 Ο •Η -U 1 <—1 ‘Η , 0 φ [14

LL U S 1 ο ο U-

U►J Q S 1 Ο S 4J

Ü- υ £ CJ < 1 Ο S -Μ

1 [14 d [14 >-q [14 1 Ό •Η ε φ .0 Μ φ 33 44 2 ι ac rH σι •Η 1 Ű4 Φ 0 >1 kJ Ρ 04 ί 0 φ Ν > Μ J

Fo rmi1-MLF-Lys-SHNH

Példa

vő

Γ*

00

ο

ο

-

(Ν

m

τΤ

ιη

Ό

Γ-

00

Ch

ω '(ti 4J (Ö

4-> >ι (—I ο

ΛΙ Ο

4-> ιυ τ) <ϋ

-Ρ

Ν '(Ü ι—I Λ '01 4-)

1-4 <ϋ •Η

Cn

Ό <—4

Ο •Η Π 4-* •η

Φ ω

--— -U υι Ό ·Η •Η Ν Ο ϋ. '(1) σ e x: 8 trt

7 z 'T Γ-’

20.2

1

Γm

04

E-* Z

1

O m Λ

>30

• 0 cn A

0 m A

λ: x '<d Ό Ρ •Η (0 <*=j N ·Η Í '0 C 9 x O S 12 Ö>rj OJ y

Tt O O

1

1

OS en o

un

cn Γ-

• 1

—

co Π) 4>s '<ü a. co u s 0 r ? p X) U Cú -H LÜ S X

04 04'

un 04

04 04*

Tt

x 4-> ω . CS •0 * 0 =1· |s s1 ó w tn nj

Ό .04*

un r-'

o un 1 un

un Uj Γ-

VO un

CA

1

H Z

1

1

1

1

X '<d 5s Ά 2 :0 °r? 'J > σ> O ω tp <cJ üJ

1

1

1

un o o

<

(

o o A

r-

0 0 Λ

0 0 A

0 0 A

04

m '<D IO 4-) o :O (j

CA un

OO

un en

Tt o

m

O-

o o Λ

—

un 06

TT

CA

un Tf

Szekvencia

IX X IX X X 0 -<-4 E (Ű X L4 l—1 A CL O M CL O N 4 z z

[X4 XI 2 1 1—1 Ή 1-4 3 [xi

•k 1 u in U C 1 S 1 τί -H £ cd X <0 X 1 t—1 •H CL o M Cl o N M

tu +1 S 1 i—1 •H O £ fd d d •H υ 1 z

1 X s 1 Ό •H £ ftí XI μ (Ú Xí 1 r—( •H CL O 1 P 0 CL M Ο Ό N -H -H x: I 0J 2 k! 1 0) S X

IX u s 1 r—1 o M Cl -H CL

u Ή d Í>1

X z X w 1 w >4 X X X Σ Ό •r4 E d X fÜ X <—1 •H X a X z

X z X ω ω X X X Σ X •rl Ε a! X 14 aj 12 •—1 •r-l CL O 11 ω

CL to < ω >4 X (14 X Σ X •rl E rö X Cl al 12 «—1 —1 CL 0 Μ X CU Z 1 X rí U)

1 cl >-4 S 1 T5 •r4 X e z <0 X 44 ω 44 1 a) β a: -h 1 ε r—1 ftí •Η -H CL Ό 0 1 C4 d ex v(d 1 CL •Η O 1 H S CL

X z 1 X tn ω c-4 1 S &. 1 CO Ό << Η 1 E C OJ -r4 Λ Ε Le a! efl -H V Ό 1 1 r-1 r~1 Ή Ή 0. 0. 0 ο 44 44 aj a 1 1 Η q

Példa

O 04

04

C4 04

m Oi

Tt 04

Un 04

Ό CM

t- 04

00 04

O 04

O ΟΊ

cn

*01dhatósági problémák '<0

4J <Ö 4->

>1

I------1 o m +j aj N '<tí r—I Λ '<d 4-1 o

4-4 rd τ!

<ú •r4 «1 Ή

Cd Ό «—I o Ή n 4-J •1—1 (D CO

--— '(ü P * w Ό -Η •h c *5 NO**. Ό tT - x φ 9 TJ -Urj rtl	1	7.82	1	N.T.		>30	>30	>30		Ό		1	I
* Oj Ό P •η ω «5« N ·Η *< 'φ CÍ τ) &> a	.013	i	II z +	2.2		N.T.	+ (variable)	N.T.	\o	1	1	N.T.	N.T.	9'0	CN
V)' '<0 M w 0 s 0 r V Q Λ O fi -r| Üj S ü							.4 pH5
Λ? '<Ü -P VI •O * 0 =t |iS !? ő ω tn <U	N.T.	14.5	61	1	1	10-30	| 5-6	3-3.5	0 Λ	o		N.T.	N.T.	N.T.	N.T.
•rt — 0 X w <Ö :O 0 S $ >, tn O w tp <e új	C-4		1	>100	.35			<	+	1	1	1	0	+	+
</) •<ü X! 10 44 0 •O u	.03	2.5	.02	1.9	Γ-	0.15-5	| 0.15-5	0.6-22	0.12	20	4.5	>10	>10		0 1
Szekvencia	i-Propil-karbamid-MLF- Lys-SHNH-BOC	í-Propil-karbamid-FLFLF- Lys-SHNH	IX ÍÖ X <L> X Σ Ό ·*—1 ε Tj X íÜ Λ4 <—1 •H C <D Ψ4 Z z	£14 X Σ Ό •H E ÍÜ XI L fó Λ4 ,—1 •H X X o> z X X O CQ 1—l 1 Xf W Ή >i O kJ	X 2 X ω 1 ω >1 1 tu h4 s 1 r—1 •H g P 0 ÍJ-I	íboc-MLF-SPNH	5C z CL. tz> l 0 X J s i o' 2 •r4	íboc-MLF-S-SPNH	ΤΊ C 0 Λί Ό -P íö X -P Ή Q d X 1 Ul XI s 1 υ 2 • r—I	íboc-MLFK	< Cl. H Q < u. J S o' 2 •H	Trimetil-acetil-MLFK	N-karbamil-MLFK	For-M(02)-LFK	For-M(0)-LFK
Példa	32	ΓΠ	34	35	36	37	38	39	O Ν’		42	43	44	45	46

• · táblázat (folytatás)

O -P <tí Ό •H <0 • rH tn Ό <—ι o Ή Χί 4-» •m (D ω

-- '01 P w -ο -H -H C«< Ν O Ό) tT 9 <rt

1

1

1

1

VO

4.5

6.3

1

3.9

2.5

1.3

• 1

< '(Ű '0 P •H W N -H =L '(PC*

P Z

P z

P z

P z

+

+

1

4

P z

P z

P z

4

Γ' o o

Zí o

-T o 1 +

V)’ '«J M '01 M W u é 0 r? Ο Λ O Λ ή ω S X

Λί 'í0 -P w . cS •o O =t •SiS !? á w Cn ol

P Z

P Z

H Z

P z

P z

P z

P z

P z

un

un

P z:

II z r~ \Ő

X '·» « * W i Ό :O O ° £ >, tnO w Cn oi (jj

4

1

ι

c

00 cn

oo un

4

4

4

4

P z

‘4

ω '<D X? T>-§_ io 4-1 o 5ω λ in

4

t

< o-

i e-·

TT cn

m

un r-

cn o

o A

m

cn

un

*\D O o 1 un CN O ö

Γ**· o o ó

ÍN

Szekvencia

LL u 1 0) z ú o ff) 4-1

iaí u. u t § 1 Uh O Uh

id U_) 1 0J z u o ff) •H

Uu 1 o s ü o ff) Ή

o s o o u 1 u. J s 4 o o o <u S

<υ s o o o 1 m Σ o o ff) c

0) s o o o 1 UL Σ ó o tn - rH

X o 1 ul u Σ ó o ff) •H

<υ s o o ω 1 ul u S N m o

uu _J S U o ff) 4-1

UL u u z ü o ff) 4->

UL -1 § uií _) Q ül o o ff) 4->

Lu _) S u- O UL

Ul U s u O U<

ω C Uj Pl S 1 V •H £ GJ Λ P Oj Λ4 1 -H U- Oh <2 o t Ρ Um X 0 5 £ 2

Példa

OO Μ-

Os

O un

un

CN un

m un

TT un

un un

s£> un

run

oo un

Os un

o so

o

Oldhatósági problémák

-k

Sejtbiológiai adatok

441 >Φ Ρ » ω Ό ·Η *5 •Η C Ν Ο 3. 'Φ t? ► £ <ΰ $ Ό Prj Φ	1	6.3	2.5		21.5	9.4	4.4	2.2	m	15.4	1.6 .44	>30	1	1	I
Ρ '<ΰ Ό -Ρ •η ω *2 Ν ·Η ίί, 'Φ C τί & jj * > ω	.333	1	1	-Ο ο W * Μ +	Ν.Τ.	Ρ Ζ	i	1	N.T.	P Z	t	1		Ν.Τ.	.02/.05
μ' tJS '«J Μ η 0 Α °r? Ο Λ Ο PL, -Η HJ ζ; α
ρ 'Φ Ρ ιη Ό § 3. $ :ο tn ' •3 Α <ϋ β Ν :Ρ μ ο ω Un Φ	90 Ν=1	4.8 Ν=1	7 ζ Ο\	0.58	3.5	οο	5.0	0.63	2.8	5.4	0.48	100 N=1	30 N=1	1	1 1
44 'φ |i2F 1 2 ο ο S ,'/ >< tn Ο Ό U' π) UJ		1	1	1	1	ι		1	1		1	001 <		1	.15/.15
C0 ό> τόΊ ιο +-> σ :O(j		3.4	1.2	0.34	1.5	3.3	</9	0.2	2.5	2.25	0.25	8 91	2.3	. 1	.05/.02
Szekvencia	Izopropil-karbamid-MLF Α2 Multimer	N-metil-karbamid-MLF	N-etil-karbamid-MLF	N-butil-karbamid-MLF	Izobutil-karbamid-MLF	fa fa S I Ό Ή ε (0 Λ Ν 1 Γ—I •Η 4-1 Ρ CQ 4J	ti Pl 5 1 •ü •H 6 Φ P P Φ 44 O Ή P 1 i—1 •H P Z Λ 1 S 1 z	N-butil-karbamid-FLFLF	fa fa S 1 n Ή ε οι Λ Μ (0 A! 1 •—1 Η fa ο s-ι fa 1 Z	Izopropil-karbamid-MLF	Uj Pl Uj P Uj 1 Tj •H £ Φ P P Φ 44 1 f—1 •H Ql» 0 P £b 0 N H	CQ k*1 Pl 1 Új Pl S 1 Ό •H ε <0 p P Φ 44 1 ι—1 •H O P Λ 0 N H	1 Uj P Pl 'Φ S P 1 Φ Ό O -Η Φ ε ι Φ c X) Ή μ e Φ φ 44 -H 1 Ό r—1 1 Ή Η Pí ·Η ο α Ρ 0 Ρ4 Ρ ο α Ν 1 Μ Ρ	Uj Ρ S I Ό •Η ε φ XI Ρ φ 44 1 <—1 Η X Φ Ρ Ο <—1 44 •Η Ο	N-fenil-karbamid-MLF
Példa	62	63	64	65	99	67	68	69	70	Γ-	72	73	74	75	76

táblázat(folytatás)

Sejtbiológiai adatok

--— '05 p κ co Ό -H -H C Ν O Ό) tr * 3 ÍJ < eh! ol

12.6

OO OO

9’6

>100

OO

8.6 N=2

>100

Γ9

1

1

4.5

> 100 N=2

> 100 N=2

II z 0 en A

rX '<0 Ό 4J •H W Μ »«d ii. 'Φ c * τΐ & J

1

1

1

1

1

1

1

1

7 z 5 0 V

+

m O O

t

co '01 '<Ü 3 to — U ó 0 r? O jQU & -a tn S

Ad '01 -P CO •ü § 3. 5 Ό tn - 8 v <a s

II z Ό (SÍ

7 z Cd m

7 z o ΓΊ

7 z o t'

7 z Γ4

7 z r~

7 z o o A

Ό cn

1

1

1

cd

un CN

Tt TT

Ό ed

Λ! 2221 *9 :O O ° j >, tfU w tn <« [D

t

1

1

1

1

1

t

0 V

0

II z *r 1 D r-

1

1

i

1

tn Ό) *5 iO 4J o go * w

OO

Γ4

Λ dl ♦ .*

Tied

O\

Cd

cn Ó cn

o Cd

II z Ό 1 0 r-

II z 0 V

ő V

Cs O

un

Γ- Cd

un un

(0 a O c OJ > Pí d) N ω

In Hl s 1 Ό Ή e <ö ,Q M Hí Pl 1 —1 rd N C Φ P 1 Z

ín Pl s 1 r“d rd o N c (1) p 1 z

[n Pl S 1 ι—1 •a rí -H E (Ö 1 <—1 -H P 0 CQ 1 c

Cn P S 1 ι—1 H N <P S

In Ul s 1 f—1 •H •H g 01 C 0 Ud 1—| d N C0 1 >—1 •H -P 2 CŰ 1 G

Benzolszulfonamidil-MLF

In hd s II co s 1 Ί5 •H ε 05 1 ι—1 •rd P •rd -P d ed o N IH

ín Pl s 1 •H s <Ö 1 <—1 Ή g a 4-> P P 0 N ta

In xi 2 1 -H ε 05 Xi P 05 Ad 1—1 rd α Φ Ψ4 P Ό r—1 A^ 1 ΈΓ 1 % 1 z

ín hd s 1 Ί5 rd ε 05 Λ) Μ 05 Ad r—1 •rd N C Φ Λ 1 rd X 0 P Φ s 1 Cb

p-Toluol-karbamid-MLF

In Pl s 1 n •H E (Ö P a <ö P! 1 1--------1 0 3 r—I 0 Π 1 ε

Lu Pl 1 Ό H ε d Λ i-l nj 1—1 2 N Ά ’—1 H C Φ Ψ4 z z

1 d •H -H 1—1 O N <Ü •H P 1 0 X 0 1 CN 1 •H X 0 Xi μ o5 4d ín 1 hd s

ín XI s 1 X •H Ό •rd 1—1 O N (ti •rd -P 1 •rd X O Xi μ o5 Ad 1

Hí Ό Ή 'Φ Ch

ΓΓ-

OO Γ-

CN r-

o 00

OO

Cd 00

cn oo

^7· 00

UN 00

0 00

ΓΟΟ

OO 00

CN 00

O CN

CN

ω

4-1 (Ο -Ρ >1

I------1 ο

M-d

-Ρ (Ú Ν 'CÚ ι—I X) 'CÖ Ρ

Λ!

Ο Ρ Φ Ό

ÍÖ

Ή <ΰ Ή tn Ό ι ο •Η X! Ρ •π

Q) ω

----sr— '<« 44 _ tO Ό ·Η «5 •Η C Ν 0 <D Cn . ί , 8 (Π	J	911	I	1.5	» 1	I----------------------------------------------------------------------- i- problémák	1
λ: UÖ Ό 4-> *5 -η ω ΙΊ ·Η SÍ. 'Φ C £ Μ	II z +		II Z 1		rJ II z Tf Ό O	tn '(Ö m Ό P (0 Xl TS 1--------1 Q	7 z CN xo
'Φ PS '<0 Η (0 ο ό Ο Γ ? Ο Χ> Ο ω -η ω S 32
'<0 Ρ ω 22 Ο 3. !? ό £ w Cn <«	1	XO CN	O un	00 cn O	Tf II z Ch	t
32 'Ό „ _ - ρ S 32 <0 S :Ο Η ^- X 32 C i •β ο ο ° Ν >. tn U OT cn <ο qj	o o Λ o	«	1	1	o o Λ	1	Ch CN
m -Φ 5 ΙΟ * Ρ ο i°<5 Wpj	Ό	un \O	CN Tf	<N o o	Ό CN	Ch un	CTx
Szekvencia	1 o X o H ti P Pl 1 S C\1 1 1 c Ή -H X xs o -a XI ή Ρ 0 fÖ N 32 <Ö 1 -H sr P	X Pl s 1 n· •r-1 £ <ö 1 1--------1 • rd 0 P Ψ4 <Ö c l !------1	Új XI ω Uj --4 £ ω XI m n: rü Z 34 Qj ι ω ^4 c •r-4 -1-4 a e O nj Μ ·γ4 a τι Ο ι N C •r4 'fd 1 P Z 0 —- M Z ÍX	fxj Pl ÍX Pl IX 1 ι—1 •rd o e Φ c c •rd u 1 z	Uj i-q 5 1 •rd 6 (0 X) μ (0 1 1-------1 •rd <—1 r—| Φ 1 s 1 z	ki á 1 G •H Ό H •G aj P Cn Z	IX Pl s 1 Ό •rd £ <Ö Xi P <0 22 1 O P Ό •rd n 1 z
Példa	r-4 Ch	cn Ch	Tt Ch	un Ch	o Ch	rCx	00 Ch

99. példa

Met-Leu-Phe hidrokloridot szintetizáltunk klasszikus folyadékfázisú szintézissel (Bodansky, M. and Bodansky, A., 1984, The Pactice of Peptide Synthesis , Springer Verlag, New York). A készen is beszerezhető izocianátokat az Aldrich cégtől szereztük be, azon esetekben ahol ez nem volt lehetséges a jól ismert reakciót alkalmaztuk a megfelelő aminnal, és triphos reagenssel (Aldrich). Valamennyi H¹ NMR spektrumot Bruker 30 Mhz-es készülékkel vettük fel, DMSO d⁶-ban, ill. MeOH d^J-ban, TMS belső standard használata mellett.

Az N-terminálisukon karbamid-csoporttal védett peptidek a szokásos módon, jó kitermeléssel állíthatók elő, a szabad aminocsoportot tartalmazó peptidek és a megfelelő izocianátok reakciójával. Az N-n-butil-N¹-metionil-leucil-fenilalanilkarbamid szintézise pl. a következöképppen zajlik le: 1,0 g Met-Leu-Phe-hidrokloridot (2,2 mmól) szuszpendálunk 10 ml száraz DMF-ben, és 2,2 ekv. (0,70 ml, 5,0 mmól) száraz trietilamint adunk az elegyhez, majd 1,25 ekv. (0,31 ml, 2,8 mmól) nbutil-izocianátot adagolunk. A reakcióelegyet 16 órán át keverjük szobahőmérsékleten, majd a DMF-et vákuumban lepároljuk. A maradékot 1 ml metanolban oldjuk, majd 15 ml 1 N HCl-t adagolunk erélyes keverés mellett. A kicsapódó fehér anyagot szűrjük (0,81 g, 71%), vízzel mossuk, majd éjszakán át vákuumban szárítjuk. FAB MS számított (a C₂₅H_4CN₄O₅S összegképletből számolva), azonos a találttal: 509 (M+l).

Ή NMR (MeOH, d⁶):ő 8.12 (d, J=8 Hz., 1H), 8.01 (d,

J = 8 Hz., 1H), 7.21 (m, 5H), 4.62 (m, 1H), 4.30 (m, 1H), 4.25 (m, 1H), 3.17 (m, 4H), 2.45 (t, J=7Hz, 2H), 1.95 (τη, 1H), 1.77 (m, 2H), 1.40 (m, 6H), .92 (m, 9H)

100. példa

A példa bemutatja, hogy Tc^m-mel jelzett kemotaktikus peptidanalógok hatásos ágensek gyulladások gócpontjainak külső leképezésére.

Négy hidrazino-nikotinamiddal (HYNIC) módosított kemotaktikus peptid-analógot szintetizáltunk, az alábbi szekvenciával:

For-NleLFK-HYNIC (HP1), For-MLFK-HYNIC (HP2),

MLFNH(CH₂)₆NH-HYNIC (HP3), és Fór MLF-(D)K-HYNIC (HP4), és in vitro körülmények között vizsgáltuk bioaktivitásukat és receptorkötődésüket.

Anyagok és módszerek

Peptid-szlntézis és jellemzés

A N-For-Norleucil-Leucil-Fenilalanil-Lizin-NH₂, N-ForMetionil-Leucil-Fenilalanil-Lizin, N-For-Metionil-LeucilFenilalanil-diamino-hexil-amid, és N-For-Norleucil-LeucilFenilalanil-D-Lizin-NH₂ peptideket szintetizáltuk, majd tisztítottuk a szokásos standard szilárd fázisú technikával (Merrifield, R.B., J. Am. Chem. Soc. /5:2149-2154 (1963); Stewart, J.M., and Young, J.D., SolidPhase Peptide Synthesis, W.H. Freeman & Company,

San Francisco, CA [ 1969] ), A.J. Fischman leírása szerint (J. Nucl. Med. 32: 483-491 [ 1991] ) . Valamennyi reagenst a lehető legnagyobb tisztaságban, kereskedelmi forrásból szereztük be. A hidrazino-nikotinamiddal történő kapcsolást az alábbiakban a HP3 peptid példáján mutatjuk be.

186 mg N-For-Met-Leu-Phe-diamino-hexil-amidot 2 ml dimetilformamidhoz (DMF), és 60 μΐ diizopropli-etil-aminhoz adunk, majd 154 mg szukcinamidil-6-tBOC-hidrazino-piridin-3karbonsavat adunk az elegyhez (Abrams, M.J., et.al., J. Nucl. Med. 31 : 2022-2028 [ 1990] ) 1 ml DMF-ben oldva. A keverék megsárgul és a peptid hamarosan feloldódik. 2 óra múlva a reakcióelegyhez éter-petroléter keveréket adunk, majd a felülúszót elválasztjuk. Az olajos maradékhoz vizet adva szilárd anyag válik ki. Ezt 5%-os nátrium-hidrogén-karbonát oldattal, vízzel és etil-acetáttal mossuk, így 183 mg terméket kapunk. A tBOC védocsoportot a nyerstermék 15 perces, 20 °C-on, 0,1 ml p-krezolt tartalmazó 5 ml trifluorecetsavval (TFA) történő kevertetésével hasítjuk le. Hosszabb savas kezelés a melléktermékek mennyiségének növekedését idézi elő. A TFA-t rotációs bepárlóval lepároljuk, majd a maradékhoz étert adunk a szabad peptid kicsapására. A terméket fordított fázisú HPLC-vel tisztítjuk, egy 2,5 x 50 cm-es Whatman ODS-3 oszlopon, eluensként acetonitril gradienst alkalmazva 0,1 TFA-ban. A fő komponenst tartalmazó frakciókat egyesítjük, majd az oldószer lepárlásával kapjuk a kívánt terméket. A peptideket UV spektroszkópiával, tömegspektroszkópiával, valamint aminosav analízissel j ellemeztük.

Sejtpreparálás

Poloimorfonukleáris leukocitákat (PMN) izoláltunk emberi vérből 3%-os dextrán oldatbam (Pharmacia, Nutley, NJ) végrehajtott szedimentációval, amit Lymphoprep segítségével (Organon Teknika, Durham, NC) végzett gradiens centrifugálás követett. A sejtpreparátumok több mint 95% PMN-t tartalmaztak, a Wright szerint megfestett sejtek fénymikroszkóps becslése alapján.

For-MLF receptorkötődési vizsgálat

Az N-formil-metionil-leucil-fenilalanin (For-MLF) , N-formilnorleucil-leucil-fenilalanin (For-NleLF), és N-formilnorleucil-leucil-fenilalanil-norleucil-tirozil-lizin (ForNleLFNleYK) a Sigma (St. Louis, MO) terméke. A For-ML[ F (60 Ci/mmól) New England Nuclear, Boston, MA) gyártmány.

x 10⁵ db., egészséges önkéntesektől nyert humán PMN-t inkubáltunk sótartalmú foszfátpuf ferben ( 1-7 mM KH₂PO₄, 8.0 mM Na₂HPO₄, 0.117 M NaCl, 0.15 mM CaCl₂₎ 0.5 mM MgCI₂,<?5'. 1.0 mM

PMFS pH 7,4, inkubációs puffer), 24 °C-on, 45 percig, (teljes térfogat: 0,15 ml) különböző koncentrációjú módosított peptidek jelenlétében ill. hiányában, valamint 15 nM ForML[ H^J] F jelenlétében (Deuel, T.F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 75(7):4584-4587 (1981); Fischman, A.J., etal., J. Nucl. Med. 32:483491 (1991); Pike M.C., etal., Methods Enzymol. 162:236-245 (1988)).

Ezt kővetően a sejteket üvegrost-lemezeken (Whatman GF/C;

Whatman, INC., Clifton, NJ) szűrtük, majd 20 ml jéghideg inkubációs pufferrel mostuk. A szűröket szcintillációs edényekbe helyezzük, 10 ml Safety-Solve-val (Research Products International Corp., Mt. prospect, IL), majd a radioaktivitást folyadékszcintillációs spektroszkópiával mérjük. A specifikus kötődést mint a teljes kötődés és a nemspecifikus kötődés különbségét határoztuk meg. A nemspecifikus kötődés a maradék kötött radioaktivitásból határozható meg, 10 μΜ jelzetlen For-MLF jelenlétében. A nemspecifikus kötődés a teljes kötődés kb. 10%-a.

Abból a célból, hogy meghatározzuk a Tc^m-mel történt radioaktív jelzésnek a kötődési affinitásra gyakorolt hatását, az alábbi mérést végeztük: Izolált humán PMN-kat (2xl0⁶ sejtet) inkubáltunk HBBS/BSA-ban, 4 °C-on, 60 percig, a For-NleLFNleYK peptid, ill. a megfelelő jelzetlen peptid különböző koncentrációinak jelenlétében ill. hiányában, és a

9 m

Te -mel jelzett peptid fix mennyiségének jelenlétében, 0,15 ml teljes térfogatban. Az inkubáció után a sejtszuszpenzió jól megkevert 0,1 ml-es alikvot részét 0,2 ml HBBS/BSA:Lymphoprep (1:1) fölé rétegeztük egy 0,4 ml-es mikrocentrifuga csőben, és 4 percig centrifugáltuk 15000 rpmen(Microfuge E, Beckman, Columbia, MD). A csöveket folyékony nitrogénben lefagyasztottuk, és a pelyhes sejt-csapadékot izoláltuk. A radioaktivitást gamma számlálással határoztuk meg. A nemspecifikus kötődés a maradék kötött radioaktivitásból határozható meg, 5 μΜ For-NleLFNleYK peptid, ill. a megfelelő jelzetlen peptid jelenlétében. A nemspecifikus kötődés a teljes kötődés kb. 10%-a.

A szuperoxid termelés vizsgálata

A vizsgálatban használt forbol-mirisztát-acetát (PMA), valamint a cytochalasin B a Sigma (St. Louis, MO) terméke. A szuperoxid kibocsátást a ferricitokróm C szuperoxid dizmutázzal gátolható redukciójának követésével vizsgáltuk, extinciós koefficiens: 29,5 mmól/l/cm. Izolált emberi neutrofileket inkubáltunk Hank féle egyensúlyi sóoldattal (HBSS) (GIBCO,Grand Island, NY). A méréseket az alábbi esetekben végeztük: HBSS önmagában, ill. peptidek (HP1, HP2, HP3, HP4, For-Nle-LF, For-MLF vagy For-Nle-LFNleYK) lnM-tól 1 μΜ-ig terjedő koncentrációi mellett, 10 μΜ cytochalasin B jelenlétében, 50 μg/ml szuperoxid dizmutáz jelen- ill. távollétében, 37 °C-on, 10 percig. A ferricitokróm C redukcióját spektrofotometriával mértük.

A HYNIC-el módosított peptidek jelzése Tc^m-mel

A Tc^m pertechnetát (Mo/Tc^m-generátor) , és az ónglükoheptonát (Glucoscan) a New England Nuclear (Boston, MA) cég terméke. A Tc^99m-glükoheptonátot a hidrazinonikotinamiddal konjugált peptidek radioaktív jelzéséhez szükséges Te(V) oxidációs számú atomok biztosítására

9 m használtuk. A liofilizált anyagot kb. 2,5 ml Te pertechnetát 0,9%-os NaCl-dal készült oldatához adtuk. A végső radioaktív koncentráció 5-10 mCi/ml volt, a termék radiokémiái tisztaságát instant szilikagél vékonyrétegkromatográfiával határoztuk meg (ITLC-sg), mozgó fázisként acetont és 0,9%-os NaCI oldatot használva.

A kemotaktikus peptid-analógokat az alábbi módon jeleztük Te -mel: Kb. 0,2 mg peptidet 50 μΐ dimetil-szulfoxidban oldottunk, majd az oldatot 0,1 mg/ml végső koncentrációra hígítottuk 0,1 M pH 5,2-es acetát pufferrel. 0,5 ml peptidoldatot tiszta kémcsőbe helyeztünk és 0,5 ml Tc^99mglükoheptonátot adtunk hozzá. Az elegyet gyorsan kevertettük, és szobahőmérséleten 1 óráig állni hagytuk. A radiokémiái tisztaságot ITLC-sg módszerrel,az alábbi háromféle oldószerrendszerben határoztuk meg: aceton, 0,9 Náci, ill.aceton-viz 9 : 1.

9 m

A Te -mel jelzett peptid-analogokat fordított fázisú HPLCvel analizáljuk kétféle rendszerben: Az A rendszerben Beckman C₁₈ fordított fázisú oszlopot használtunk (5μ, 4,5 x 46 mm, Beckman, Columbia, MD), az alábbi eluenssel: A oldat: 5% acetonitril 50 mmól acetátban, pH 5,2; B oldat: 50% acetonitril 50 mmól acetátban, pH 5,2; gradiens: 0% B-től 100% B-ig, 20 perc alatt, átfolyási sebesség: 2 ml/perc.

A B rendszreben Vydac C₁₈ fordított fázisú oszlopot alkalmaztunk (300 Angström, 5μ, 4,5 mm x 25 cm, Vydac), az alabbi eluensekkel: A oldat: 0,1% trifluorecetsav-víz; B oldat: 0,1% trifluorecetsav-acetonitril, gradiens: 0% B-töl 100% B-ig, 10 perc alatt, átfolyási sebesség: 2 ml/perc. Az UV abszorpciót Miiton-Roy/LDC átfolyó spektrofotométerrel mértük, a radioaktivitást pedig Beckman 170 készülékkel (Beckman, Columbia, MD). Mindkét detektor kimenő jeleit kétcsatornás intergrátorral rögzítettük és analizáltuk (Waters Model 746 Data Modulé, Waters, Marlboro, MA).

A specifikus aktivitás maximalizálása

A kemotaktikus peptidek farmakológiai dózisainak adagolásával

9 m együttjáró neutropénikus effektusok elkerülesere a Te -mel jelzett kemotaktikus peptidek specifikus aktivitását akként

9 m maximalizáltuk, hogy a leképezéshez elegendő mennyiségű Te izotópot tartalmazó peptid végső tömege jóval az aktiválás ismert EC₅₀ koncentrációja (kb. 20 nM) alatt maradt.

9m - Egy Te generátor 5 órával a megelőző elúció után eluálódott egy kísérletben, amely a Te arányának minimalizálását célozta, úgy, hogy közben fennmaradjon a 300 mCi-nél nagyobb Te elucio. A Te tömeget, es a Te es a Te aranyat generátor-kinetikai egyenletekből számítottuk ki, felhasználva az alkalmazott Mo/Tc^m generátor ismert adatait. A Tc^m-glükoheptonátot (GH) a fentebb leírtak szerint állítottuk elő. Kb. 180 μg kemotaktikus peptidet (molekulatömeg: 720), felodottunk 50 μΐ DMSO-ban, és 100 μρ/ml végső térfogatra hígítottuk 0,1 M pH 5,2-es acetát pufferrel. A peptid oldat alikvot részeiből sorozat hígításokat készítettünk, így egy 2-80 μρ/ιηΐ-ίρ terjedő koncentráció-sorozatot kaptunk. A peptidek jelzését 0,5 ml acetát pufferben oldott Tc^m-GH-nak a peptidek egyenlő térfogatához való adagolásával valósítottuk meg. Az oldatot erélyesen kevertettük, és szobahőmérsékleten 1 óráig inkubáltuk. A peptid-jelzés mértékét ITLC-sg módszerrel határoztuk meg az alábbi három oldószer-rendszerben: aceton; 0,9% NaCl; aceton/víz 9 : 1. A radioaktívan jelzett peptidek specifikus aktivitását az alábbi egyenletből határoztuk meg: %RCY x mCi (jelenlévő)/peptid [ μΜ] x 100.

In vivő vizsgálatok

Három vizsgálatot végeztünk állatokban: A) A radioaktívan jelzett peptidek egészséges állatokban történő eloszlásának vizsgálatára valamennyi analóggal biodisztribúciós vizsgálatokat folytattunk; B) A radioaktívan jelzett peptid analógok gyulladásos gócokban való lokalizálódási képességének meghatározására szövet-radioaktivitási vizsgálatokat végeztünk E. coli-val fertőzött patkányokon; és C) A radioaktivan jelzett peptidek fertőzéseket leképező képességének kiértékelésére gamma kamerás leképezéseket végeztünk E. coli-val fertőzött patkányokon.

A. Biodisztribúció normális patkányokban normális hím Sprague-Dawley patkányból álló csoportokat (súlyuk kb. 150 g, Charles River Breeding Laboratories, Burlington, MA), hatos csoportokba osztottunk. Mindegyik vizsgált peptidböl kb. 5 pCi aktivitást hordozo Tc^m-mel jelzett peptidet injektáltunk az egyes állatokba, a biodisztribúció meghatározására, 5, 30, 60, és 120 perccel az injektálást követően. (Az egyes értékeket 6 állaton végzett mérésekből határoztuk meg, mindegyik peptid esetében, mindegyik időpontban.) Az alábbi szervek: vérminták, szív, tüdő, máj, epe, gyomor, vese, GI traktus, vázizomzat, herék, és csontok súlyát megmértük, radioaktivitását pedig egy edényes típusú gamma számlálóval (LKB model #1282, Wallac Oy, Finland) határoztuk meg. A radioaktív bomlás korrigálására az injektált dózisok alikvot részeinél párhuzamos részecskeszámlálást végeztünk.

B. Vizsgálatok fertőzött patkányokkal

E. coli egyedi klinikai izolátumát használtuk gócos fertőzés kiváltására. A baktériumokat éjszakán át inkubáltuk triptikus szójás agar táptalajon, 37 °C-on, majd az egyes kolóniákt steril 0,9%-os NaCl oldattal hígítottuk. így zavaros szuszpenziót kaptunk, amely kb. 2 x 10 mikroorganizmust tartalmazott milliliterenként. Hím Sprague-Dawley patkányokat (súlyuk kb. 150 g, Charles River Breeding Laboratories, Burlington, MA), ketaminnal érzéstelenítettünk, majd bal hátsó combjukba 0,1 ml kb.2 x 10 mikroorganizmust tartalmazó szuszpenziót injektáltunk.

órával a fertőzés után a jelentősen felduzzadt combú

9 rn állatokba kb. 5 μθι (3 pmol) Te -mel jelzett pepiidet injektáltunk az oldalsó farokvénán keresztül. Az injektálás után 30 ill. 120 perccel 5-5 állatból álló csoportokat lenyakazással megöltünk. A szövetmintavétel, radioaktivitásmérés, és a számítások menete megegyezik a fentebb leírtakkal.

C. Fertőzött nyulak leképezése

Abból a célból, hogy meghatározzuk a radioaktívan jelzett kemotaktikus peptidek felhasználási lehetőségeit a fenti ágensek neutropéniás hatásaira érzékeny állatok esetében, E. coli-val gócosan fertőzött nyulakkal végeztünk vizsgálatokat, melyekben magas specifikus aktivitású Te -mel jelzett kemotaktikus peptideket használtunk. Hat hím, fehér, 2-3 kg tömegű New Zeeland nyulat ketaminnal és xilazinnal (15,0 és

1,5 mg/kg) érzéstelenítettünk és bal hátsó combizmukba kb.2 x 10⁹ mikroorganizmust (E. coli) tartalmazó szuszpenziót injektáltunk. 24 órával a fertőzés után a csúnyán felduzzadt combú nyulakba az oldalsó fülvénán keresztül 600-1000 μϋί

HPLC-vel tisztított, Tc^m-mel jelzett HP2-t injektáltunk (specifikus aktivitás > 10000 mCi/μιηόΙ, a jelzetlen peptidtöl a fentebbiek szerint HPLC-vel elkülönítve). Az állatokat ketaminnal és xilazinnal (15,0 és 1,5 mg/kg) érzéstelenítettük, majd sorozatos szcintigrammokat készítettünk 0 és 3 óra, valamint 16 és 17 óra között az injektálás után, nagylátószögű gamma kamera (Technicare Omega 500, Solon, Ohio) amely nagyfelbontású párhuzamos lyukkollimátoral van ellátva, és egy, a cég által ajánlott számítógéppel van összekapcsolva (Technicare Omega 560, Solon, Ohio). A felvételeket 5 perces időközönként _ Q Q m rögzítettük, 15%-os ablak mellett, amely a Te 140 KeV-os fotocsúcsára volt centrálva. A jelzett peptidek lokalizációjának jellemzésére analizáltuk az érdeklődésre számot tartó régiókat (region of interest, ROI) a fertőzött combokat a másik oldali, fertőzetlen combokkal az idő függvényében összehasonlítva.

Az utolsó felvétel elkészülte után az állatokat pentobarbital túladagolásával megöltük, és az alábbi szervek: vérminták, szív, tüdő, máj, epe, gyomor, vese, GI traktus, velő, normál vázizomzat, fertőzött vázizomzat herék, és csontok súlyát valamint radioaktivitását a fentebbiek szerint megmértük. A radioaktív bomlás korrigálására az injektált dózisok alikvot részeinél szimultán részecskeszámlálást végeztünk. Az eredményeket százalékos injektált dózis/gramm-ban fejeztük ki. A keringésben lévő sejtkötött aktivitás meghatározására a vért centrifugáltuk, a sejteket és a plazmát elkülönítettük. A sejteket 0,9 %-os NaCl-dal mostuk, és mértük a maradék radioaktivitást a sejtekben, ill. a felülúszóban. A fertőzött helyeken lévő sejtkötött aktivitás meghatározására a gennyet kétszer mostuk 0,9 %-os NaCi-dal és mértük a maradék radioaktivitást a sejtekben, ill. a felülúszóban.

Statisztikai módszerek

A biodisztribúciós ill. leképezési vizsgálatok eredményeit a variancia-anlizis (ANOVA) módszerével értékeltük ki, lineáris modellel, amelyben a klasszifikációs változók a szerv és az idő voltak;

%ID/szerv + %ID/szerv = Szerv + Idő + Szerv x Idő.

A peptid-koncentrációk esemény utáni összehasonlítását a Duncan féle új többcsatornás teszttel végeztük (Duncan, D.B., Biometrics, 11: 1-42 [ 1955] ) . Mindegyik F érték első alsó indexe az első klasszifikációs változóra vonatkozó szabadsági fok (n - 1), a második klasszifikációs változó (m - 1), vagy a kölcsönhatás (n - l)x(m - 1). A második alsó index a maradék szabadsági fokok száma (Az észlelések teljes száma nxm). Valamennyi eredményt átlag + átlagos standard hiba (SEM) alakjában adjuk meg.

Eredmények

Peptidszintézis

Mind a négy HYNIC-cel módosított kemotaktikus pepiidet jó termeléssel és tisztaságban kaptuk meg. Az UV elemzés 268 ill. 315 nm-en mutatta a HYNIC csoportra jellemző maximális abszorpciót, mind a négy pepiidnél. A tömegspektroszkópiai és elemanalízis eredmények megegyeznek a konjugált peptidektöl elvárható értékekkel.

A kemotaktikus peptid-analógok biológiai aktivitása

A szuperoxid termelési vizsgálatok eredményei a 3. ábrán láthatók. Azon peptid-koncentrációk amelyek a maximális válasz 50%-át (EC₅₀) produkálják a II. táblázatban láthatók.

A HP2, HP3, és HP4 potenciálja egyenlő vagy nagyobb, mint a For-MLF peptidé (100 nmól). A HP1 potenciálja legalább egy nagyságrenddel kisebb. így a szuperoxid termelési potenciál sorrendje: HP2 > HP3 > HP4 >> HP1.

II. Táblázat

Kemotaktikus peptid-analógok szuperoxid-termelésre és kötődési affinitásra vonatkozó EC₅₀ értékei

Peptid

Szuperoxid termelés nmól

Kötődési affinitás nmól

HP1	500	40
HP2	12	0.18
HP3	40	0.12
HP4	60	0.35
For-MLF	100	20
For-NleLF	320	300
For-NleLFNleYK	100	1

A peptidek hatásossága, amelyet a termelődött szuperoxid anionok maximális mennyiségével definiálunk, valamennyi peptidnél hasonló volt, és 2,07 -3,0 nmól termelt O₂-/10⁶ sejt/10 perc értékek között ingadozott. Egyetlen peptid sem volt hatásosabb a fórból mirisztát acetátnál (PMA), amely egyedülálló aktivátora a PMN leukociták oxidatív széthasadásának, s amelynek alkalmazásakor a maximális érték 22,9 nmól termelt O₂-/10⁶ sejt/10 perc volt, 0,1 μιηόΐ koncentrációban.

A kemotaktikus peptid-analógok kötődése kemoattraktáns receptorokhoz

A 4. ábrán az látható, hogy a HYNIC-el módosított kemotaktikus peptid-analógok gátolják a For-MLF[ H³] F kötődését az intakt humán PMN leukocitákhoz, a szuperoxid termléshez hasonló potenciállal. A kötődés 50%-os gátlásához szükséges peptid-koncentrációkat (EC₅₀) tüntettük fel a II. táblázatban. A HP2, HP3, és HP4 peptidek EC₅₀ értékei hasonlóak a For-NleLFNleYK hexapeptidéhez. Habár a HP1 peptid affinitása a kemoattraktáns receptorhoz kb. 100-szor kisebb mint a többi HYNIC-el módosított kemotaktikus peptid-analógé, de potenciálja csak egy kettes faktorral alacsonyabb mint a For-MLF pepiidé. A For-NleLF tripeptid potenciálja több mint 100-szor alacsonyabb mint hexapeptidé ill. a For-MLF peptidé. így a kemoattraktáns receptorhoz való kötődés sorrendje az • · · · · · • · · · · · • · · · · • · · · · · · alábbi: HP3 > HP2 > HP4 » HP1. A Tc^m-HP2 EC₅₀ értéke < 10 nmól.

A Tc^m jelzésnek a receptorkötödésre való hatásának meghatározására vizsgáltuk a jelzetlen HYNIC-peptidnek a

9m ·

Te -peptrdet helyettesítő képességét a fentebb leírt vizsgálati körülmények között. E kísérletek eredményei azt mutatják, hogy a neutrofilekhez kötött Te -peptid 50%-ának leszorításához szükséges jelzetlen peptid koncentrációja kb. 10-szer magasabb, mint amikor For-MLF[ H³] F peptidet használtunk nyomjelzőnek. A kötődési aktivitásnak ez a növekedése magyarázható azzal ha a radioaktívan jelzett molekulák egynél több peptid egységet tartalmaznak a Tcglükoheptonátra vetítve, s a kötődés kooperatív.

Radioaktív jelzés Tc^m-mel

A Tc^m-mel jelzett peptid és a Tc^m-glükoheptonát Rf értékei a radioaktív jelzés vizsgálatához használt gyors-TLCkromatografiás (instant TLC, ITLC) szilikagél csíkokon a különböző oldószerrendszerekben az alábbiak voltak: 0,9% NaCl - Tc^m-peptid = 0,0 , Tc^m-glükoheptonát = 1,0; aceton __ Cl Q m __ 9 Q ΓΠ

Te -peptrd =1,0 , Te -glükoheptonát = 0,0; és aceton - víz (9:1) - Tc^99rn-peptid = 1,0 , Tc^m-glükoheptonát = 0,0. Ez utóbbi renszer minimalizálja a csúcsok szétterülését, s ezért

9 m jóval keskenyebb, élesebb Te -peptid sávokat eredményez mit

9m a tiszta aceton. Valamennyi Te -peptid készítmény ITLC-je azt mutatta, hogy az inkubáció első órája után a radioaktivitás több mint 90%-a a peptidhez kötődött. A jelzett peptideknek az A rendszerben végrehajtott HPLC vizsgálata során az alábbi főbb csúcsokat kaptuk: Tc^mglükoheptonát, Tc^m-HPl, Tc^m-HP2, Tc^m-HP3, és Tc^m-HP4, a következő retenciós időkkel: 0,3-0,5 , 14,37 , 11,25 , 15,11 , ill. 12,16 perc.

A specifikus aktivitás maximalizálása

A Mo /Te generátor elúciója 456 mCi teljes aktivitást eredményez. A Te teljes mennyisége 3,4 nmól volt, a Te : Tc^m arány 1,53 : 1, a Tc^m ebből számított specifikus aktivitása 134 000 mCi/pmól. A Tc^m-glükoheptonátot (Tc-GH) a fentiek szerint állítottuk elő; a végső radioaktív koncentráció az előállítás időpontjában >150 mCi/ml. A Tc^mGH radiokémiái tisztaságát ITLC-vel határoztuk meg acetonban, ill. 0,9%-os NaCl-ban, értéke >95%.

Az agonista kemotaktikus peptid-analógok farmakológiai hatásosságának érdekében magas specifikus aktivitású radioaktív jelzésre van szükség, hogy az injektált oldatban lévő peptid abszolút mennyisége csökkenthető legyen. Ideális esetben ez a specifikus aktivitás tisztítás nélkül is elérthető. Az 5. ábra összefoglalja a peptid-koncentráció hatását a jelzés kitermelésére. Az adatokból nyilvánvaló, hogy a reakcióelegy végső peptid-koncentrációjának jelentős befolyása van a radiokémiái kitermelésre; 10 gg/ml peptidkoncentráció alatt csak csekély jelzés-kitermelés érhető el. Ha az eredményeket a reakcióelegy peptid/Tc moláris arányához viszonyítva fejezzük ki, láthatóvá válik, hogy ha ez az arány növekszik, a %-os radiokémiái kitermelés is nö, a specifikus aktivitás pedig csökken.

E folyamattal >10 000 mCi/mól specifikus aktivitás elérése is lehetséges, 10 μg/ml peptid-koncentráció alatt azonban a radiokémiái kitermelés jelentősen csökken. Ennél a koncentrációnál már szükség van egy tisztítási lépésre a nem kötött Tc^m eltávolítására. Az elreagálatlan Tc^mglükoheptonát, ill. Tc^mO₄ fordított fázisú Sep-Paks-on végzett kromatográfiával oldható meg. A specifikus aktivitás tovább növelhető az elreagálatlan peptid HPLC-vel történő eltávolításával (B rendszer). Mivel a Te jelzett peptid, a jelzetlen peptid, ill. a Tc^m-glükoheptonát csúcsai e kromatográfiás rendszerben jól elválnak egymástól, a hordozó mentes radioaktivan jelzett peptid izoláható. Ilyen körülmények között a radioaktivan jelzett peptid specifikus aktivitását csak a Tc^m generátor elúciója határolja be.

Tc^99m-mel jelzett kemotaktikus peptidek biodisztribúciója normál patkányokban

9 m

A négy Te -mel jelzett peptid-analog biodisztribúcióját tüntettük fel a III. táblázatban. Valamennyi in vivő kísérletben betegségtünetek nélkül viselték el az állatok a radioaktivan jelzett kemotaktikus peptidek adagolását. A vese, a gyomor, és a Gl-traktus kivételével az idő előrehaladtával valamennyi peptid koncentrációja csökkent a szövetekben.

III.Táblázat

Tc^99n>-mel jelzett kemotaktikus peptid-analógok biodisztribúciója. Az injektált dózis %-a/gramm (átlag + SEM)

Szerv Idő

	(perc)	HP1	HP2	ΙΓΡ3	HP4
vér	5	1.17±0.070	1.18±0.056	1.01 ±0.056	0.78 ±0.046
	30	0.82±0.019	0.67 ±0.036	0.55 ±0.017	0.48±0.052
	60	0.67±0.016	0.57±0.033	0.47 ±0.035	0.36±0.012
	120	0.52±0.010	0.48±0.015	0.39±0.015	0.31 ±0.010
Szív	5	0.75 ±0.045	0.50±0.019	0.72 ±0.089	0.42±0.027
	30	0.50±0.010	0.32±0.016	0.27 ±0.021	0.22±0.024
	60	0.40±0.012	0.28±0.018	0.29 ±0.026	0.20+0.013
	120	0.37 ±0.028	0.26±0.013	0.25 ±0.024	0.16±0.012
Tüdő	5	1.54 ±0.122	0.85 ±0.043	10.65 ±1.473	1.11 ±0.099
	30	0.63 ±0.043	0.78±0.032	8.45±0.818	0.61 ±0.071
	60	0.64 ±0.039	0.46 ±0.030	5.10±0.449	0.49 ±0.026
	120	0.46 ±0.026	0.50±0.025	2.44 ±0.435	0.37±0.027
Máj	5	0.76 ±0.056	0.99±0.023	5.72±0.467	0.74±0.091
	30	0.53±0.012	0.62±0.019	4.81 ±0.205	0.52±0.022
	60	0.45±0.012	0.50±0.022	4.60±0.101	0.51±0.010
	120	0.43±0.016	0.58 ±0.026	4.75 ±0.175	0.46±0.016
Epe	5	0.34±0.014	0.35+0.023	2.27+0.281	0.35+0.041
	30	0.30±0.012	0.39 ±0.045	2.28±0.231	0.27+0.017
	60	0.26 ±0.006	0.25±0.013	3.11 ±0.191	0.32±0.017
	120	0.25 ±0.007	0.29±0.020	3.01 ±0.220	0.27 ±0.009
Vese	5	3.08±0.092	3.30±0.173	1.90±0.199	3.67±0.436
	30	5.13±0.282	4.82±0.246	1.68±0.064	5.22±0.139
	60	5.16±0.115	4.36±0.213	1.63±0.057	5.36±0.178
	120	5.68±0.143	4.17±0.121	1.60±0.030	4.74 ±0.201
Gyomor	5	0.17 ±0.024	0.10±0.004	O.38±O.O53	0.19±0.011
	30	0.12±0.012	0.15±0.010	0.56 ±0.029	0.09 ±0.023
	60	0.15±0.013	0.10±0.005	0.51 ±0.034	0.15±0.017
	120	0.16±0.015	0.11 ±0.011	0.39±0.008	0.15±0.012
GI traktus	5	0.20±0.013	0.25±0.012	0.33 ±0.038	0.16 ±0.005
	30	0.32 ±0.026	0.64±0.074	0.64 ±0.046	0.32±0.039
	60	0.23 ±0.020	0.64 ±0.089	0.70±0.050	0.39±0.030
	120	0.32±0.028	0.72±0.055	0.81 ±0.047	0.41 ±0.035

III. Táblázat (folytatás)

Szerv	Idő (perc)	IIP1	ΙΓΡ2	IIP3	IIP4
Herék	5	0.15±0.010	0.12±0.008	0.12±0.011	0.19±0.006
	30	0.14±0.005	0.11 ±0.003	0.11 ±0.006	0.14±0.015
	60	0.13 ±0.005	0.10±0.006	0.11 ±0.004	0.13±0.008
	120	0.14±0.003	0.10±0.003	0.10±0.005	0.11±0.004
I zom	5	0.32±0.013	0.25 ±0.020	0.23 ±0.015	0.27±0.017
	30	0.22±0.004	0.17±0.018	0.10±0.005	0.17±0.013
	60	0.19 ±0.008	0.14±0.016	0.12±0.012	0.15±0.009
	120	0.20±0.012	0.15±0.014	0.10 ±0.007	0.12±0.006
Csont	5	0.55 ±0.026	0.39±0.011	0.39 ±0.023	0.37 ±0.038
	30	0.41 ±0.009	0.32±0.013	0.26±0.0I7	O.37±O.O19
	60	0.33 ±0.007	0.30±0.020	0.28 ±0.023	0.34±0.009
	120	0.32±0.011	0.28±0.012	0.24±0.017	0.28 ±0.009

A vérben, az ANOVA módszerrel a peptidek (F_{3; 70}=56, 79, p<0, 0001), ill. az idő (F₃₎₇₀= 252,01 , p<0,0001 ) szignifikáns fő hatása mutatható ki, a peptidek és az idő között azonban nincs szignifikáns kölcsönhatás. A peptidek koncentrációsorrendje a vérben az alábbi volt: HP1> HP2> HP3> HP>4 (p< 0,01) . A szív-szövetben az ANOVA szignifikáns fő hatást mutat a peptid (F_{3 64}= 44, 36, p<0, 0001) és az idő (F_{3 64}=98, 06, p<0, 0001) esetében, és itt a peptid-idő kölcsönhatás is szignifikáns (F_{9 64}=36, 9, p<0,001). A tüdőben az ANOVA szignifikáns fő hatást mutat a peptid (F, ₆₅₇₀ = 183,25, p<0, 0001) és az idő (F_{3 65}=24,56, p<0, 0001) esetében, és itt a peptid-idő kölcsönhatás is szignifikáns (F_{9 b5}=13,80 p<0, 0001) . A peptidek koncentrációsorrendje az alábbi volt: HP3>> HP1 = HP4 = HP2 (p< 0,01) . A májban az ANOVA módszerrel a peptid (F₃, ₆₅=10 Ο 0, 0 0 , p<0,0001), ill. az idő (F_3;65= 12,80, p<0,0001) szignifikáns fö hatása mutatható ki, a peptidek és az idő között azonban nincs szignifikáns kölcsönhatás. Éppúgy mint a tüdőben a peptidek koncentrációsorrendje az alábbi volt: ΗΡ3» HP1 = HP4 > HP2 (p< 0,01) . A lépben az ANOVA szignifikáns fő hatást mutat a peptid (F. _fe33=431, 0 0 , p< 0 , 0001 ) , esetében és a peptid-idö kölcsönhatás is szignifikáns (F_{g 63}=4, 64 p<0, 0001) . Ebben a szervben az idő-effektus nem volt szignifikáns. A peptidek koncentrációsorrendje az alábbi volt: HP3>> HP2 = HP4 = HP1 (p< 0,01). A vesében az ANOVA szignifikáns fő hatást mutat a peptid (F_{3 69}= 291,58, p<0, 0001) és az idő (F_3-69=40, 14, p<0, 0001) esetében, és itt a peptid-idö kölcsönhatás is szignifikáns (F_9-69=10, 94, p<0,0001). A peptidek koncentrációsorrendje az alábbi volt: HP4 = HP1 > HP2 » HP3 (p< 0,01). A gyomorban az ANOVA szignifikáns fő hatást mutat a peptid (F_{3 53}= 202,98, p<0, 0001) és az idő (F_{3 53}=3, 10, p<0,05) esetében, és itt a peptid-idö kölcsönhatás is szignifikáns (F_{9 53}=5,56, p<0,0001). A peptidek koncentrációsorrendje az alábbi volt: HP3 > HP4 = HP2 (p< 0,01). A GI traktus esetében az ANOVA szignifikáns fö hatást mutat a peptid (F_{3 52}= 66, 30, p<0,0001 ) és az idő (F_{3 62} ⁼36,32, p<0,0001) esetében, és itt a peptididö kölcsönhatás is szignifikáns (F_{9 62}=5, 56, p<0, 0001) . A peptidek koncentrációsorrendje az alábbi volt: HP3 = HP2 > HP4 = HP1 (p< 0,01) . A herékben az ANOVA szignifikáns fö hatást mutat a peptid (F_{3 67}= 26, 97, p<0, 0001) és az idő (F₃.₆7=14, 94, p<0, 0001) esetében, és itt a peptid-idö kölcsönhatás is szignifikáns (F₉₆₇=477, p<0,0001). A peptidek koncentrációsorrendje az alábbi volt: HP4 = HP1 > HP3 = HP2 (ρ< 0,01) . A vázizomzat esetében az ANOVA módszerrel a peptid (F_3;59=48,70, p<0,0001), ill. az idő (F_3/5g= 97, 69, p<0, 0001) szignifikáns fő hatása mutatható k-i, a peptidek és az idő között azonban nincs szignifikáns kölcsönhatás. A peptidek koncentrációsorrendje az alábbi volt: HP1 > HP2 = HP4 > HP3 (p< 0,01) . A csontokban az ANOVA szignifikáns fö hatást mutat a peptid (F_{3 68}= 30,15, p<0,0001) és az idő (F_{3 6fi}=52, 84, p<0,0001) esetében, és itt a peptid-idö kölcsönhatás is szignifikáns (F_{9 6R}=5, 15 p<0, 0001). A peptidek koncentrációsorrendje az.alábbi volt: HP1 > HP4 = HP2 = HP3 (p< 0,01) .

Tc^99m-mel jelzett kemotaktikus peptidek lokalizációja fertőzött patkányizomban

A IV. táblázatban a Tc^m-rnel jelzett kemotaktikus peptidanalógok szöveti koncentrációit (%ID/gramm) tüntettük fel, normál, ill. fertőzött combizomban.

IV. táblázat

Tc^99ra-mel jelzett kemotaktikus peptid-analbgok szöveti koncentrációja , normál, ill. fertőzött patkány-izomban. (%ID/gramm)

Szövet	IDŐ (perc)	HP1	PEPTID
HP2	HP3	HP4
Normál	30	0.16±0.009	0.1110.003	0.0510.009	0.1310.007
	120	0.1010.006	0.0710.004	0.05+0.005	0.13101025
Fertőzött	30	0.3910.013	0.2810.013	0.11+0.007	0.4210.049
	-120	0.2110.008	0.1610.007	0.1010.004	0.3210.019

I

Az ANOVA szignifikáns fö hatást mutat a peptid (F_{3 25}= 56, 51 , p<0,0001) és az idő (F_{3 25}=59, 45 p<0, 0001) esetében, és a peptid-idö kölcsönhatás is szignifikáns (F_{9 25}=6,74 p<0,005). A normál izomban a HP1 (p<0,01) és a HP2 (p<0,05) koncentráöciója csökken az időben, míg a HP3 és a HP4 koncentrációja változatlan maradt. 30 perccel az injektálás után a HP1 koncentrációja a normál izomban nagyobb volt (p<0,01) mint a többi peptidé, a HP2 koncentrációja pedig nagyobb (p<0,01) mint a HP3-é. A 120. percben a HP4 koncentrációja a normál izomban nagyobb volt (p<0,01) mint , a HP2-é és a HP3-é; a HP1 koncentrációja pedig nagyobb (p<0,01) mint a HP3-é.

A fertőzött izomban a HP1 (p<0,01), a HP2 (p<0,01), és a HP4 (p<0,05) koncentráöciója csökken az időben, míg a HP3 (amelynek mindkét esetben legalacsonyabb volt az akkumulációs szintje) koncentrációja változatlan maradt. 30 perccel az injektálás után a HP1 és a HP4 koncentrációja nagyobb volt (p<0,01) mint a HP2-é és a HP3-é; a HP2 koncentrációja pedig nagyobb (p<0,01) mint a HP3-é. A 120. percben a HP4 koncentrációja a fertőzött izomban nagyobb volt (p<0,01) mint a HPl-é a HP2-é és a HP3-é; a HP1 koncentrációja pedig nagyobb (p<0,01) mint a HP3-é.

A 6. ábrán a cél-háttér (target-to-background, T/B) arányt tüntettük fel (%ID/gramm fertőzött izom / %ID/gramm normál izom). Az ANOVA szignifikáns fö hatást mutat a peptid (F₃.₂₂=5, 87, p<0.005) esetében. Az idő, ill. az idö-peptid kölcsönhatás esetében nem volt szignifikáns effektus. A HP4 T/B aránya szignifikánsan nagyobb volt mint a HP2-é (p<0,05), a HPl-é (p<0,01), és a HP3-é (p<0.01). így a HP4 nemcsak a legnagyobb abszolút koncentrációt mutatja a fertőzött szövetben, de a T/B arány is ez esetben a legnagyobb mindkét injektálás utáni időpontban. Ezzel ellentétben a HP3 peptid koncentrációja a fertőzött izomban, valamint T/B aránya is a legalacsonyabb.

A gyulladási gócok leképezése nyulakban

A nyulakban, közvetlenül az injektálás után, a Tc^m-HP4 magas szintje volt detektálható a tüdőben, a májban, és a lépben. A tüdőbéli aktivitás csökkent az idővel, és 1-3 órával az injektálás után a radioaktivitás gócponti akkumulációja volt tapasztalhatóa fertőzött combban. 4 órával az injektálás után a T/B arány kb. 4:1 volt. 16 órával az injektálás után (7. ábra) az átlagos T/B arány az egész beteg területen 10:l-re emelkedett, a gócponti részen pedig >20:1 volt. Ezen túlmenően, a későbbi időpontokban (>4 óra) bzonyos akkumuláció volt tapasztalható a belekben. A keringésben található maradék sejtkötött radioaktivitás aránya 16 órával az injektálás után kb. 25% volt. Ezzel ellentétben, a genny frakcionálásából kimutatható, hogy a radioaktivitás kb. 90%-a fehér vérsejtekhez kötődik.

A 8. ábrán a 17 órával az injektálás után, közvetlen számlálással mérhető szöveti koncentrációkat (%ID/gramm) összegeztük. A legnagyobb koncentrációk sorrendje az alábbi volt: lép >tüdö >máj = vese (p< 0,01). A 9. ábrán a T/B arányokat (%ID/gramm fertőzött izom vagy genny / %ID/gramm ellenidali normál izom) tüntettük fel. Az átlagos T/B arány a genny, ill. a fertőzött izmok esetében 25,78:1 (maximum

48,54:1, és minimum 8,84:1), ill. 14,17:1 (maximum 25,64:1, és minimum 4,78:1) volt.

A fentebb leírtak demonstrálják, hogy a HYNIC-cel módosított kemotaktikus peptid-analógok könnyen jelezhetök Tc^99rn-mel. Magas aktivitás érhető el Te-(V) oxidációs számú atomforrásként Tc^m-glükoheptonátot használva. Továbbá az is kiderült, hogy a Tc^99m-mel jelzett peptidek hatásos ágensek a fertőzési gócok külső leképezésére a comb mély-fertozéses kísérleti modellben.

A négy szintetizált HYNIC peptid közül háromnak (HP2, HP3,és HP4) a receptorkötödésre vonatkozó EC₅₀ értéke hasonló a ForNle-LFNleYK hexapeptidéhez, míg a HP1 megfelelő értéke a ForMLF-é közelében van egy 2-es faktoron belül. Valamennyi HYNIC konjugált peptid affinitása nagyobb a kemoattraktáns receptorhoz mint a For-MLF-nek. A receptorkötödési potenciál sorrendje az alábbi volt: HP3 >HP2 >HP4 >For-Nle-LFNleYK >For-MLF >HP1 >For-NleLF. A nor-leucint metioninnal helyettesítve, a kapott For-MLF alkalmazása 10-15-szörös csökkenést eredményez a receptorkötödési affinitásban. A Cterminális Lys-HYNIC-cel való további módosítása azonban a receptorkötódés további növekedését eredményezi.

A szuperoxid-termelésre vonatkozó EC₅₀ érték a HP2, HP3, és a HP4 esetében 2-8-szorosára növekszik a hexapaptiddel, ill. a For-MLF-el összehasonlítva. A For-NleLF potenciálja háromszor kisebb mint a For-MLF-é. Ellentétben a HPl-nek a ForNleLFhez képest megnövekedett receptorkötő képességével, a szuperoxid-termelésre vonatkozó EC₅₀ érték ez esetben 5-ször nagyobb mint a For-Nle-LFNleYK hexapeptidé ill. a For-MLF-é.

Ha a fenti adatokat a peptid-receptor kölcsönhatás javasolt modelljét figyelembevéve értelmezzük, ezek azt sugallják, hogy a negyedik aminosav-maradék HYNIC-cel történő módosítása konformációs változásokat eredményez amelyek úgy a receptorkötödést, mind a szuperoxid-termelést befolyásolják. A legmeglepőbb eredményt a 2. pozícióban lévő Nle-nak metioninnal való helyettesítésekor kaptuk, amely a For-MLFnél 15-ször, a hexapeptidnél pedig 300-szor nagyobb értéket adott a receptorkötődésre vonatkozó EC₅₀ értékre, és több mint 10-szer nagyobbat az aktiválásra vonatkozó EC₅₀ értékre. Ez az eredmény részben szignifikáns, minthogy az eddig ismertetett kemotaktikus peptidek esetében az ilyn helyettesítéseknek csak minimális hatása volt. A 4-es helyzetben lévő D-Lys-nek L-Lys-nel való helyettesítése, amely a receptorkötödésnél kétszeres, az aktiválásnál pedig ötszörös növekedést erdményez az EC₅₀ értékben, szintén alátámasztja a fenti hipotézist. Az 1,6 diamino hexánnak e pozícióban L-Lys-re cserélése csak kis csökkenést eredményez a kötődésre, és 3-4-szeres növekedést az aktiválásra vonatkozó EC₅₀ értékben. A HYNIC-cel konjugált peptidek θ m

Te -mel való jelzése látható növekedést eredményez az affinitásban. A Te -HYNIC-peptidekkel végzett kísérletek azt mutatják, hogy az a jelzetlen peptid koncentráció, ami ahhoz szükséges, hogy a neutrofilekhez kötött Te -mel jelzett peptid 50%-át leszorítsa, 210-szer nagyobb, mint amikor

ForMLf H ] F-et használtak nyomjelzőként. Ez a növekedés a kötődésben megmagyarázható, ha a radioaktívan jelzett molekulák több mint egy peptid egységet tartalmaznak a Tcglükoheptonátra vetítve, és a kötődés kooperatív. Hasonló növekedésről számoltak be tetramer kemotaktikus peptidanalógok esetében (Kraus, J.L., et. al., Biochím. Biophys. Rés. Comm. 124: 945-949 [ 1984] ) . A vizsgálatok a C-terminális irányú változtatások erőteljes hatására utalnak.

A vizsgálatokból kitűnik, hogy azon túl, hogy a fertőzések leképezésénél kiválóan használható radiofarmakonok, a HYNIC peptidek modellvegyületként szolgálhatnak a For-MLF peptidek receptorkötödését kisérő molekuláris kölcsönhatások jobb megvilágításához.

A HYNIC-cel módosított kemotaktikus peptid-analógok specifikus aktivitásának maximalizálásakor a figyelem fókuszába elsődlegesen a radionuklidok forrása, azaz a Mo /Te radionuklid eluátuma, ill. az azzal való manipuláció került. A magas specifikus aktivitású Tegeztermelésében rejlő potenciális probléma a hosszú élettartamú Te felépülése (alapállapot, t_1/2 kb. 10⁵ év) . Mivel a Mo bomlásainak 87%-aban, és a Te bomlásainak 100%-aban a Te közvetlenül keletkezik, a radioaktív jelzési reakció befejezéséhez mindig rendelkezésre áll a hordozó bizonyos mennyisége. Könnyen előállíthatok 10000 mCi/pmól-nál nagyobb • 9 9 m specifikus aktivitású Te -mel jelzett kemotaktikus peptidanalógok, de szükséges a jelzett peptidek Sep-Pak-on való elvalasztasa a többi Te tartalmú anyagtól.

9 m

Amennyiben a Te forrás optimalizálása mellett a radioaktivan jelzett peptid kromatográfiás tisztításának körülményeit is optimalizáljuk, még magasabb specifikus aktivitás érhető el. Megfelelő HPLC rendszer alkalmazásával a Tc^m-mel jelzett peptid, a jelzetlen peptid, ill. a Tc^mglükoheptonát csúcsai jól elválaszthatók, s a hordozómentes jelzett peptid izolálható. Ilyen körülmények között a jelzett peptid specifikus aktivitását csak a Tc^m generátor specifikus aktivitása határolja be. így a Tc^m elméleti specifikus aktivitásából számítva a Tc^m-rnel jelzett, HYNICcel módosított kemotaktikus peptid-analógok maximális specifikus aktivitása kb. 500 000 mCi/qmól. Habár a specifikus aktivitás e szintjének elérése a mindennepi gyakorlatban valószínűtlen, lehetséges a jelzéshez használt Te -glükoheptonáthoz hasonló specifikus aktivitású jelzett peptidek előállítása. Mivel >100 000 mCi/μιηόΙ specifikus aktivitású Tc^m-glükoheptonát előállítása rutinszerűen megoldható, ilyen specifikus aktivitású peptidek is előállíthatok HPLC-s tisztítás alkalmazásával.

Mivel a HYNIC-glükoheptonát ligandum csak két helyet tud elfoglalni a technécium atom koordinációs szférájában, igen valószínű, hogy a jelzett termék további csoportokat is tartalmaz. Úgy tűnik, hogy ezt a szerepet a glükoheptonát játssza, mint ko-ligandum. A kemotaktikus peptidek csekély molekulatömege miatt a technéciumos jelzésnél használt koligandum alapvető hatással lehet e molekulák biodisztribúciójára. E lehetőség kiértékelésére megmértük a Te -mel jelzett HP2, ill. 4 különböző koligandum (glukarát, glükoheptonát, mannitol, ill. glükózamin) segítségével jelzett HP3 biodisztribúcióját. A különböző ligandumokkal végrehajtott radioaktív jelzés menete azonos volt a glükoheptonátnál leírtakkal. A radioaktívan jelzett peptidek HPLC analízise valamennyi esetben egyetlen csúcsot mutatott. A 10. ábrán e preparátumok közül háromnak a megoszlását (%ID/gramm) tüntettük fel, 6 különböző szervben (vér, tüdő, máj, epe, vese, és a Gl-traktus), az injektálás utáni 4 különböző időpontban. Ámbár kisebb különbségek a biodisztribúcióban legtöbb szövetnél észlelhetők voltak, a legnagyobb különbségek (p<0,01) a tüdő esetében voltak észlelhetők (glükarát, glükoheptonát > mannitol >> glükózamin); a többi szervnél a sorrend az alábbiak szerint alakult: máj (glükarát, glükoheptonát, mannitol >> glükózamin); vese (mannitol > glükarát, glükoheptonát, glükózamin); epe ( glükarát >> glükoheptonát, mannitol >> glükózamin); és a Gl-traktus ( glükarát, glükózamin >> glükoheptonát >> mannitol). Hasonló eredményeket kaptunk a HP2 esetében is.

Az irodalomban több beszámoló is található radioaktivan jelzett kemotaktikus peptidek felhasználásáról a fertőzésleképezési kísérletekben (Fischman, A.J., J. Nucl. Med. 32:483-491 (1991); McAfee, J.G., et al., Sémin. Nucl. Med. 74:83-106 (1984); Thakur,

M.L., et al., Sémin. Nucl. Med. 74:107-117 (1984); Zogbhi, S.S., et al.,J.

Nucl. Med. 22:p.32 [ 1981] ) .Az ezeknek a kísérleteknek az idején rendelkezésre álló radioaktív jelzési módszerekkel azonban csak viszonylag alacsony specifikus aktivitású ágensek voltak nyerhetők, így a leképezéshez viszonylag nagyobb farmakológiai mennyiségű peptid volt szükséges. Ezek a peptid-dózisok nyulakban jelentős tranziens neutropéniát okoztak. (O'Flaherty, J.T., et al., J. Immunoi. 118:1586-1589 [ 1977] ) . A találmány szerinti jelzési technikákkal ez a lehetséges kedvezőtlen hatás teljesen kizárható. A nyulakban, amelyek különösen érzékenyek a kemotaktikus peptidek által okozott neutropéniás effektusokra, a HPLC-vel tisztított Tc^mHP4 az injektálás után egy órán belül lokalizálódik az E.

coli fertőzés gócaiban, a maximális T/B arányt pedig a 15. órában éri el.

A radioaktív jelzés HYNIC-es módszere egyedülálló és hatásos eszköz arra, hogy különösen magas specifikus aktivitású Tc^mmel jelzett peptideket és proteineket állíthassunk elő.

Az elérhető magas specifikus aktivitások lehetővé teszik, hogy a leképezési kísérletekben használt peptid koncentrációk jelentősen alatta maradjanak a neutropéniás válasz EC₅₀ értékének. Egy SEP-PAK-kal tisztított pepiidből (kb. 10 000 mCi/nmól) pl. egy 20 mCi aktivitást tartalmazó injektált dózis kb. 2 nmól peptidet tartalmaz. Ezt azt jelenti, hogy egy 70 kg-os páciens esetében az ijektált dózis < 30 pmól/kg. Rhesus majmokkal végzett kísérletekre alapozva ez a mennyiség jóval a szignifikáns neutropéniát előidéző dózis alatt van. HPLC-s tisztítás alkalmazásával ez a biztonsági határérték 10-szeresére növelhető.

101. Példa

Ez a példa azt mutatja be, hogy a radioaktívan jelzett agonista kemotaktikus peptid-analógok hatásos ágensei a gyulladási helyek leképezésének a majmokban. Magas specifikus aktivitású radioaktív jelzést alkalmazva e reagensek neutropéniás hatása elkerülhető.

Kiértékeltük a kemotaktikus peptid-analógok in vivő biológiai tulajdonságait, biodisztribúcióját, és gyulladás leképezési tulajdonságait az embertől eltérő főemlősökkel végzett kísérletekben. Vizsgáltuk a neutropéniás válasz dózisfüggését normál Rhesus majmokban. Egy Tc^m-mel jelzett, hidrazino85 nikotinamiddal módosított kemotaktikus peptid-analógot használtunk a biodisztribúció és a gyulladás-leképezés tanulmányozására majmokban.

Az egészséges állatokkal lefolytatott vizsgálatok megmutatták, hogy a peptidek tisztán dózisfüggő neutropéniát indukálnak az állatokban. A leukociták számának csökkenése majdnem közvetlenül az injektálás után bekövetkezik, majd ez a szám gyorsan visszaáll az eredeti értékre. Nem volt szignifikáns effektus detektálható a differenciális fehérvérsejtszám, a vérnyomás, a pulzus, ill. a légzésgyakoriság tekintetében. A legalacsonyabb alkalmazott peptid-dózisnál (10 ng/kg) a neutrofilek számának csökkenése minimális volt. A HYNIC-cel módosított peptideket kiváló termeléssel és tisztasággal állítottuk elő, biológiai aktivitásuk hasonló volt a természetes peptidéhez, és könnyen jelezhetök voltak 20 000 mCi/μιηόΙ specifikus aktivitással. Amikor gócos steril gyulladást hordozó majmokba kb. 0,5 mCi (<2,0 ng/kg) jelzett pepiidet injektáltunk, hasonló disztribúciós képet kaptunk, mint a radioaktívan jelzett fehér vérsejtek használatakor, neutropénia pedig nem volt tapasztalható. Három órával az injektálás után a gyulladás helye igen jól látható volt, kb. 3:1 T/B arány mellett.

Anyagok

Az N-Formil-metionil-leucil-fenilalanin (For-MLF),az NFormil-norleucil-leucil-fenilalani1-norleucil-tirozil-lizin (For-NleLFNleYK), a forbol-mirisztát acetát (PMA), és a cytochalasin B Sigma (St. Louis, MO) gyártmány.

A ForML[ H³] F-et (60 Ci/mmól), és a Tc^99,n-et (Mo/Tc' generátor), a New England Nuclear-tól (Boston, MA) szereztük be. A Hank féle egyensúlyi sóoldat a GIBCO (Grand Island, NY) cég terméke.

Peptid szintézis és jellemzés

Az N-formil-metionil-leucil-fenilalanin-lizint és az Nformil-norleucil-leucil-fenilalanil-norleucil-tirozi1-lizilDTPA-t a szilárd fázisú szintézis ismert módszereivel állítottuk elő, ill. tisztítottuk (Merrifield, R. B.

J. Am. Chem. Soc. 15; 2149-2154 (1963); Stewart, J.M., etal., Solid Phase

Peptide Synthesis, W.H. Freeman & Company, San Francisco, CA (1969)) amint azt fentebb leírtuk (Fischman, A.J., et, al., J. Nucl. Med. 32: 483-491 [ 1991] ) . A nikotinil hidrazinnal módosított N-For-Met-Leu-Phe-Lys-HYNIC kemotaktikus peptid-analógot az alábbiak szerint szintetizáltuk.

ml, 60 μΐ diizopropil-etil-amint tartalmazó dimetilformamidban (DMF) oldott 154 mg ( mmól) szukcinamidil-6tBOC-hirazino-piridin-3-karbonsavat adtunk 186 mg ( mmól) N-For-Met-Leu-Phe-Lys 2 ml DMF-el készült szuszpenziójához. A peptid gyorsan feloldódott, az oldathoz 2 óra múlva éter/petrolétert adtunk. A felső réteg elválasztása után a maradékhoz vizet adva szilárd anyag vált ki. Ezt 5%-os nátrium-hidrogén-karbonát oldattal, vízzel, majd etilacetáttal mostuk. 183 mg nyersterméket kaptunk. A védöcsoportot 1 ml p-krezolt tartalmazó 5 ml trifluorecetsavban (TFA), 20 °C-on, 15 percig tartó kevertetéssel távolítottuk el. A TFA-t rotációs bepárlón eltávolítottuk, majd étert adagoltunk a szabad peptid kicsapására. A terméket fordított fázisú HPLC-vel tisztítottuk, egy 2,5 x 50 cm Whatman ODS-3 oszlopon, eluensként acetonitrilt használva, 0,1%-ig terjedő TFA gradienssel. A fő komponenseket tartalmazó frakciókat összegyűjtöttük, s az oldószer eltávolítása után a kívánt terméket kaptuk.

A végtermék tisztaságát TLC-vel, HPLC-vel, UV- ill. tömegspektroszkópiával, és aminosav-analízissel vizsgáltuk. A humán PMN leukocitákon lévő kemoattraktáns receptorokhoz való kötődésre, ill. a szuperoxid termelésre vonatkozó EC₅₀ értékek meghatározását az alábbiakban írtak szerint végeztük: Pike, M.C., and Snyderman, R., Methods Enzymol. 162:236-245 (1988);

Pike, M.C., et al., Blood 67:909-913 (1986); és Fischman, A.J., et al., J.

Nucl. Med. 32:483-491 (1991).

Radioaktív jelzés Tc^m-mel

A kemotaktikus peptid-analógok farmakológiai dózisainak adagolását kísérő neutropéniás effektusok elkerülésére a HYNIC származékot olyan körülmények között jeleztük Te -mel, amelyek lehetővé tették a specifikus aktivitás maximalizálását. Magas specifikus aktivitást elérve a Te⁹' leképező dózisánál, az injektált peptid tömege jóval az EC_S0 érték (kb. 20nmól) alatt maradhat.

A Mo^9J/Tc^99m generátor elúciója (5 órával egy előző elúció után) 500 mCi teljes aktivitást eredményez. A Te teljes

9 9m zz <

tömegét, valamint a Te : Te aranyat Lamson es mtsai módszerével számítottuk ki (J. Nucl. Med. 7:639-641 [ 1975] ) . Egy tipikus elúció során a Te teljes mennyisége kb. 3 nmól , a Te _ 99m : Te arány pedig kb. 1,5 : 1 volt, a Te

9m specifikus aktivitása pedig > 100 000 ιηΟί/μιηόΙ. A hidrazinonikotinamiddal konjugált peptid radioaktív jelzésére a Te(V) oxidációs állapotú atomok biztosításához szükséges Te glükoheptonátot (Tc-GH) ón-glükoheptonátból (Glucosan, DuPont) állítottuk elő (Pike, M.C., et. al., Blood 67: 909913 [ 1986] ) Kb. 2,5 ml sóoldatban oldott Tc^m-pertechnetátot adtunk a liofilizált anyaghoz. A végső radioaktív koncentráció az előállítás időpontjában 150 mCi/ml. A termék radiokémiái tisztaságát ITLC-vel határoztuk meg acetonban, ill. 0,9%-os NaCl-ban, értéke >95%.

Kb. 180 μς For-Met-Leu-Phe-NH-(CH₂) _b-NH-HYNIC (molekulatömeg:720) kemotaktikus peptidet feloldottunk 50 μΐ DMSO-ban, majd 10 μρ/ιηΐ végső koncentrációra hígítottuk 0,1 N

5,2 pH-jú acetát pufferrel. A peptid-oldat fél ml-ét tiszta üvegedénybe helyeztük és 0,5 ml Tc^m-glükoheptonátot adtunk hozzá. Az elegyet erőteljesen kevertettük, és egy órán át szobahőmérsékleten állni hagytuk. A peptid-jelzés terjedelmét TLC-sg módszerrel vizsgáltuk három különböző oldószerrendszerben: aceton, sóoldat, ill. aceton/víz 9:1. A Tc^m-mel jelzett peptidet fordított fázisú HPLC-vel tisztítottuk, C₁₈ oszlop (5 μ, 4,5 x 46 mm, Beckman, Columbia, MD) és két komponensei gradiens alkalmazásával . Az elúciós körülmények az alábbiak voltak: A oldószer - 5% acetonitril 50 mmól acetátban, pH 5,2; B oldószer - 50% acetonitril 50 mmól acetátban, pH 5,2; gradiens:0%-tól 100%B 20 perc alatt;

sebesség: 2ml/perc. A jelzett peptid specifikus aktivitását az alábbi módon számítottuk ki: (% visszanyerés x jelenlévő mCi)/(peptid mmól x 100).

Állati modellek

Négy hím Rhesus majmot (egyenként kb.10 kg súlyúak) kezeltünk a ForNleLFNleYK-DTPA peptid négy dózisával (10 000; 1000;

100; és 10 ng/kg) amelyet 0,2 ml nem pirogén sóoldatban oldottunk. Valamennyi állatot mind a 4 féle dózissal kezeltük, egy hét pihenési időt hagyva a különböző dózisszintek között. Az állatokat ketamin/xilazinnal érzéstelenítettük, és 0,5 ml-es vénás vérmintákat gyűjtöttünk 80 percen keresztül. Minden kísérlet 4 injekcióból állt: hordozó, peptid, peptid, hordozó. Az alap-vérmintákat 15, ill. 5 perccel az injektálás előtt vettük, majd mintát vettü nk az injektálás után 0,25, 0,5, 1, 3, 5, 10, és 20 perccel.

A 20. percben vett minta levételét azonnal követte a következő injektálás. A vérnyomást, a pulzust, és a légzés gyakoriságát az egész kísérlet alatt figyelemmel kísértük. A fehérvérsejtszámot (CBC), a differenciális fehérvérsejtszámot, a vörös vértestek számát, és a tömörített sejttérfogatot minden vérmintánál meghatároztuk. Ezen túlmenően megfigyeltük az állatok megjelenését, aktivitását, élelmiszerfogyasztását, és megmértük súlyukat. A 11. ábrán a kísérlet lefolyásának sematikus ábrázolását láthatjuk.

A leképezési kísérletekhez két felnőtt, nőstény, kb. 10 kg súlyú Rhesus majmot használtunk. Mivel ezek az állatok előzetesen más radiofarmakonokkal folytatott leképezési kísérletekben is résztvettek, számos intramuszkuláris injekciót kaptak a jobb hátsó combjukba az anesztézia indukciója alatt.

Ezek az injekciók jelentős mértékű steril gyulladást okoztak.

Leképezés

Enyhe ketaminos anesztéziában (5,5 mg/kg), a láb vénáján keresztül intravénásán kb. 0,5 mCi Tc^m-mel jelzett peptidet (<2,0 ng/kg) injektáltunk. A radioaktivan jelzett peptidek injektálása után 5 perccel, 30 perccel, 1 órával és 19 órával az állatokat ketaminnal és xilazinnal (15,0 és 1,5 mg/kg) érzéstelenítettük, majd egész test szcintigrammokat készítettünk, nagylátószögű gamma kamera segítségével, amely nagyfelbontású párhuzamos lyuk-kollimátoral volt ellátva, és egy, a cég által ajánlott számítógéppel volt összekapcsolva (Technicare Gemini 700, Technicare Omega 560, Solon, Ohio). A felvételeket 10 cm/perces sebességgel rögzítettük, 15%-os ablak mellett, amely a Te 140 KeV-os fotocsúcsára volt centrálva. Az injektálás előtt 5 perccel, valamint 1, 3, 5, és 15 perccel utána 0,5 ml-es vérmintákat gyűjtöttünk, és meghatároztuk a vérsejtek számát (CBC). Körülhatároltuk az érdeklődésre számot tartó régiókat: az egész állat, a kardiális véredények,a tüdő, a máj, a lép a vese, az emésztőszervek, a csont, a normál ill. a gyulladt izom; kiszámítottuk a beütés sűrűség (CPM/pixel) értékeit. Az eredményeket szövet-vér arány formájában (% ID/gramm), ill. céltárgy-háttér arány formájában (a gyulladt combokat a másik oldali, normál combokkal összehasonlítva) adtuk meg.

Statisztikai módszerek

A leképezési vizsgálatok eredményeit statisztikailag a variancia analízis Duncan féle többcsatornás módszerével értékeltük ki (Duncan D.B., Biometrics 11: 1-42 [ 1955] ) .

Eredmények

A HYNIC-cel módosított kemotaktikus peptidet jó termeléssel és tisztaságban kaptuk meg. A végtermék a TLC ill. HPLC analízis szerint egységesnek mutatkozott. Az UV elemzés 268 ill. 315 nm-en mutatta a maximális abszorpciót. A tömegspektroszkópia 671 m/z értéket adott. Az aminosavanalizis eredményei megegyeztek a várt értékekkel (Met-1,00, Leu-1,00, Phe 0,97, Lys-1,00) . A radioaktivan jelzett peptid specifikus aktivitása a HPLC-s tisztítás után >20 000 mCi/pmól volt. A humán PMN leukociták kemoattraktáns receptoraihoz való kötődésre, ill. a szuperoxid termelésre vonatkozó vizsgálatok 2,0 ill. 20 nmól EC₅₀ értéket szolgáltattak.

A 12. ábrán látható, hogy a ForNleLFNleYK-DPTA tisztán dózisfüggö neutropéniás választ indukál a majmokban. A két legnagyobb peptid-dózis (10 000 és 1000 ng/kg) esetében a leukociták száma a kontroll kb. 40%-ára csökkent, csaknem közvetlenül az injektálás után, majd a kontroll 60-80%-ig emelkedett a második peptid-adagolás idejére. A második peptid injektálás után a ez az érték ismét a kontroll 40-50% ára csökken. A legmagasabb dózisnál a leukociták száma visszaáll a kontroll 80%-ára a második hordozó injektálás idejére, majd a vizsgálat végére - 80 perccel az első hordozó injektálás után - eléri a kontroll 90%-át. Az 1000 ng/kg-os dózis esetében a leukociták száma a második hordozó injektálás idejére áll vissza a kontroll 90%-ára, és a vizsgálat végére visszatér az alapállapotba. A 100 ng/kg-os dózis esetén a leukociták száma a kontroll kb. 70%-ára csökkent, csaknem közvetlenül az injektálás után, majd visszaáll az alapállapotra a második peptid-adagolás idejére. A második hordozó adagolás idejére ugyancsak erre a szintre tér vissza a leukociták száma. A legkisebb (10 ng/kg)dózis esetén a leukociták száma csak kismértékben csökken, és mindegyik peptid adagolás után három percen belül visszaáll az alapállapotra.

Egyetlen állat sem mutatott betegségre utaló jeleket semelyik peptid-dózis adagolása után sem. Nem volt szignifikáns hatás tapasztalható a differenciális fehérvérsejtszám, a vérnyomás, a pulzus, ill. a légzésgyakoriság terén.

A 13. ábrán elölről, ill. hátulról készült felvételek láthatók egy majomról, 3 ill. 15 órával kb 1,0 mCi aktivitású g _m ·

Te -mel jelzett peptid adagolása után. A korábban készült képen magas radioaktív koncentráció volt tapasztalható a tüdőben, a májban, az epében és a csontokban, összhangban a fehérvérsejtekhez való kötődéssel. Ugyancsak magas volt a radioaktív koncentráció a vesékben és a hólyagban.

Alacsonyabb koncentrációk voltak detektálhatok az izmokban és a Gl traktusban. Ebben az időpontban a gyulladási hely jól vizualizálható volt (T/B kb. 3:1). Ennél a peptid-dózisnál nem volt szignifikáns effektus tapasztalható a fehérvérsejtek számában.

A későbbi leképezési időpontban a tüdöbéli aktivitás csökkent, de a többi szervben viszonylag állandó maradt a radioaktivitás eloszlása. 15 órával az injektálás után a gyulladási helyen jelentősen csökkent a radioaktivitás akkumulációja. Mindkét leképezési időben hasonló eloszlási kép volt tapasztalható a másik állatnál is.

E kísérlet alátámasztja, hogy a nyulakhoz hasonlóan (0' Flaherty, J.T., et al., J. Immunoi. 118: 1586-1589 [ 1977] ) az agonista kemotaktikus peptidek szignifikáns tranziens neutropéniát váltanak ki a majmokban. 10 ng/kg peptid dózis esetén azonban ez a hatás nem szignifikáns. Kezdetben előfordulhat az aktivált neutrofilek számának minimális változása, amint ezt a pulmonáris aktivitás időbeli csökkenésénél megjegyeztük. Amikor majmok lágy, steril gyulladásos sérüléseibe jelzett, HYNIC-cel módosított kemotaktikus peptidet injektáltunk a biodisztribúció alakulása igen hasonló volt a radioaktívan jelzett fehér vérsejtek esetében kialakulthoz, a gyulladásos gócok pedig 3 órával az injektálás után könnyen detektálhatok voltak, kb. 3:1 céltárgy-háttér arány mellett. Igen magas specifikus aktivitású (>20 000 mCi/μιηόΙ) radioaktív jelzés alkalmazásával a peptid tömege egy radiofarmakon leképezési dózisában a neutropéniás reakciót kiváltó szint alá szorítható; a fenti aktivitás esetén 0,5 mCi aktivitás injektálása egy 10 kg-os állatba < 2 ng/kg peptid-dózisnak felel meg. Feltéve, hogy a vér tömege a teljes testtömeg 8%a, és a hematokrit értéke 50%, ez a peptid dózis 60 pmól kezdeti keringési koncentrációt eredményez, amely több mint két nagyságrenddel alatta van a receptor aktiválás EC₅₀ étékének. Amint az várható is, ez a peptid dózis nincs hatással a perifériális leukociták szintjére.

A példa alátámasztja, hogy a radioaktivan jelzett kemotaktikus peptid-analógok olan állatokban is hatásos gyulladás leképező ágensek, amelyek érzékenyek e peptidek neutropéniás hatására. Hasonló eredmmények adódtak, amikor ezen peptidek fertőzés leképezési tulajdonságait nyulakban tanulmányozták (Babich, J.W., et al., [ közlésre előkészítve] ) .

Ámbár a steril gyulladási helyek 3 órával az injektálás után kiválóan láthatóak voltak, a céltárgy-háttér arány drámaian lecsökkent 12 órával az injektálás után. Ez az eredmény jelentősen különbözik attól, amelyet E. coli fertözéses gócok vizsgálatakor kaptunk nyulakban, ugyanis ekkor a T/B arány három órával az injektálás után 3:1 volt, a 12 órában pedig a 20:1 értéket is elérte. E különbségre magyarázatot adhat a szövetkárosodás mértékének különbözősége, ill. a bakteriális fertőzés és a steril gyulladás közti különbség. Ha a jövőbeli vizsgálatok bebizonyítják ezt a különbséget a szövetkárosodások kinetikájában, a reagensek hasznosíthatósága jelentősen megnő, mivel lehetővé teszik a különbségtételt a fertőzések ill. a steril gyulladások között.

102. Példa *3 m

Ebben a példában összehasonlítjuk, ill szembeállítjuk a Te mel jelzett agonista kemotaktikus peptid-analógok, valamint a konvencionális Inⁱⁿ-gyel jelzett leukociták fertőzés lokalizálási tulajdonságait egy akut bakteriális fertőzés állati modelljében.

A kemotaktikus peptidek neutropéniás hatásaira való közismert érzékenységük miatt a kísérletekhez nyulakat választottunk.

E. coli-val fertőzött nyulakban hasonlítottuk össze a Tc^mmel jelzett For-Met-Leu-Phe-Lys-hidrazino-nikotinamid (Tc^mHP) és az In¹¹¹-gyel jelzett leukociták (In¹¹¹-WBC) biodisztribúcióját és fertőzés leképezési tulajdonságait. 6 állatból álló csoportokat injektáltunk 1 mCi Tc^m-HP-vel, plusz 0.05 mCi In¹¹¹-WBC-kel, és sorozatos szcintigrammokat készítettünk az injektálás utáni 3. és 6. óra között és a 18. órában. A végső felvétel elkészülte után az állatokat megöltük, és meghatároztuk a biodisztribúciót.

A Tc^99m-HP és az Inⁿⁱ-gyel jelzett leukociták biodisztribúciója valmennyi leképezési időben hasonló volt, a fertőzési helyek pedig mindkét radiofarmakonnal jól láthatóak voltak. A céltárgy (fertőzött izom) és a háttér (ellenoldali normál izom) aránya (T/B) 3,38 + 0,46, 3,80 + 0,37, valamint 10,875 + 1,44 volt a Tc^m-HP-re, ill. 1,71 + 0,04, 1,81 + 0,26, valamint 3,79 + 0, 83 volt az In¹¹¹-WBC-k-re nézve az injektálás után 3, 6, ill. 18 órával. Az átlagos T/B arány (azaz a két radiofarmakon T/B arányának hányadosa) 2,99 +

1,88 volt, és egyetlen arányszám sem volt kisebb 1-nél. A direkt szöveti mérésekből számított T/B értékek jelentősen magasabbak voltak a Tc^m-HP, mint az Inⁱⁿ-WBC-k esetében (33,6:1 versus 8,1:1 p<0,01). Ezek a különbségek elsősorban a

9 m

Te -HP megnövekedett abszolút akkumulációjának tulajdoníthatók (0,102% ID/g versus 0,024% ID/g, p< 0,01), a fertőzött izomban, inkább, mint akkumulációs különbségnek a normál vázizomzatban.

Az eredmények azt jelzik,hogy az a tény hogy a Tc^m-HP nagyobb vagy egyenlő céltárgy-háttér arányokat ad mint amelyek a In¹¹¹-WBC-kkel elérhetőek, legvalószínűbben a fertőzés helyén való megnövekedett abszolút akkumulációnak tulajdonítható.

Anyagok és módszerek

Valamennyi szervetlen só a Fischer Scientific Co. terméke. Az ITLC-silica gélkromatográfiás csíkokat a Gelman Laboratoriestól (Ann arbor, MI) szereztük be. Az In^U1-oxin Amersham Inc. (Arlington Heights, IL) gyártmány. Az ón-glükoheptonát készleteket (Glucosan), és a Mo/Tc^m generátort a Du Pont cég radiofarmakológiai részlegétől (Billerica, MA) vásároltuk. Az összes többi említett reagensből a legjobb elérhető kereskedelmi minőséget használtuk.

Peptidszintézis

Az N-For-Met-Leu-Phe-Lys peptidet a szokásos szilárdfázisú technikákkal szintetizáltuk és tisztítottuk. E peptid nikotinil-hidrazinos konjugátumát { N-For-Met-Leu-Phe- (Nepszilon-HYNIC)-Lys (HP), Babich, J.W. és mtsai. leírása szerint állítottuk elő (J.Nucl. Med. 33:910 [ 1992] )} . A terméket fordított fázisú HPLC-vel tisztítottuk egy 2,5 x 50 cm-es Whatman ODS-3 oszlopon, eluensként acetonitril gradienst alkalmazva 0,1%-os TFA-ban. A peptidet UV- ill.

tömegspektroszkópiával, ill. aminosav-analízissel jellemeztük.

HYNIC-cel módosított kemotaktikus peptidek jelzése Tc^m-mel

9 m

A Te ' -glükoheptonátot a hidrazino-nikotinamiddal (Abrams, M.J., et. al., J. Nucl. Med. 31 :2022-2028 [ 1990] ) konjugált peptidek radioaktív jelzéséhez szükséges Te(V) oxidációs számú atomok biztosítására használtuk. A liofilizált anyagot

Q q rr kb. 2,5 ml Te -pertechnetát 0,9%-os NaCl-dal készült oldatához adtuk. A végső radioaktív koncentráció 100 mCi/ml volt, a termék radiokémiái tisztaságát instant szilikagél vékonyrétegkromatográfiával határoztuk meg (ITLC-sg), mozgó fázisként acetont és 0,9%-os NaCl oldatot használva.

A kemotaktikus peptid-analógokat az alábbi módon jeleztük Tc^m-mel: 5 μΐ, 1 mg/ml koncentrációjú peptid-oldatot tiszta kémcsőbe helyeztünk. 500 μΐ, 0,1 M, pH 5,2-es acetát puffért, majd 500 μΐ Tc^m-glükoheptonátot adtunk hozzá. Az elegyet gyorsan kevertettük, és szobahőmérséleten 1 óráig állni hagytuk. A radiokémiái tisztaságot fordított fázisú HPLC-vel analizáltuk (oszlop: 300 Angström, 5μ, 4,5 mm x 25 cm, Vydac) az alábbi elúciós rendszerben: A oldószer: 0,1% trifluor-ecetsav vízben B oldószer: 0,1% trifluor-ecetsav acetonitrilben; gradiens: 0% B-töl 100% B-ig, 10 perc alatt, átfolyási sebesség: 2 ml/perc. Az UV abszorpciót MiltonRoy/LDC átfolyó spektrofotométerrel mértük (Boca Raton, FL), a radioaktivitást pedig Beckman 170 készülékkel (Beckman, Columbia, MD). Mindkét detektor kimenő jeleit kétcsatornás integrátorral rögzítettük és analizáltuk (Waters Model 746 Data Modulé, Waters, Marlboro, MA).

___ Q Ο rri C) C) η-|

A Te -HP injektálható oldatait a Te '-HP-nek a jelzetlen HPtöl a fenti kromatográfiás rendszerrel történő elválasztásával állítottuk elő. A peptid oldatot enyhén felmelegítettük, és nitrogénáramban szárítottuk. A maradékot izotóniás sóoldatban oldottuk fel az injektáláshoz. Az injektátum egy mintáját HPLC-vel analizáltuk.

In¹¹¹ -gyei jelzett leukociták

Ötven ml heparinizált teljes vért, amelyet egy, a fentebbiek szerint megfertőzött nyúltól vettünk le, 1:1 arányban hígítottunk hetastarch-al (Hespan , DuPont, Wilmington, DE). Az In¹¹¹-gyel jelzett leukocitákat McAfee, J.G., et.al., J. Nucl. Med. 21: 1059-1068 (1980), és McAfee, J.G., et.al., Sémin. Nucl. Med.14:83-106 módszere szerint állítottuk elő, az alábbi módosításokkal: Leukocitákban gazdag plazmát (leukocita rich plasma, LRP) izoláltunk, a nyúlból vett vért 45 percig szedimentáltatva. Az LRP-t 5 percig 450 g-n centrifugáltuk, majd a fehér vérsejtekből álló csapadékot 10 ml sóoldatban reszuszpendáltuk, majd 60 percig állni hagytuk. Keverés közben 500 μθί In^1L1-et adagoltunk az elegyhez, majd 60 percig inkubáltuk 37 °C-on, váltakozó keverés mellett. A sejteket hagytuk leülepedni, majd a csapadékot piatelet szegény plazmában (PPP) reszuszpendáltuk, 5 percig 450 g-n centrifugáltuk, majd ismét reszuszpendáltuk piatelet szegény plazmában injektálási célra. A sejtjelzés hatékonyságát az első, a jelző közegtől való elválasztást kővető PPP-s mosás után a sejtekhez kötve maradt aktivitás, és a kezdetben a sejtcsapadékhoz adott Inⁿⁱ-oxin %-os arányából számítottuk ki .

Fertőzési modell

Valamennyi vizsgálatban fehér, 2,2-3,0 kg súlyú, hím, New Zeeland nyulakat használtunk. E. coli egyedi klinikai izolátumát éjszakán át inkubáltuk triptikus szójás agar táptalajon, majd az egyes kolóniákt steril normál NaCl oldattal hígítottuk. így zavaros szuszpenziót kaptunk, amely kb. 1 x 10¹¹ mikroorganizmust tartalmazott 0,5 milliliterenként (ezt spektrofotométerrel határoztuk meg).A baktérium szuszpenzió 0,5 ml-ét mélyen a nyulak bal hátsó combjába injektáltuk.

órával a fertőzés után a jelentősen felduzzadt combú állatokba radiofarmakonokat injektáltunk az oldalsó fülvénán keresztül. Hat állatot injektáltunk 1 mCi Tc^m-HP (>5000 mCi/μιηόΙ) és 0.05 mCi Inⁿⁱ-gyel jelzett fehérvérsejt keverékével.

Leképezés

A radioaktivan jelzett peptidek injektálása után 3, 6, ill.

órával az állatokat ketaminnal és xilazinnal (15,0 és 1,5 mg/kg) érzéstelenítettük, majd elölről egész test szcintigrammokat készítettünk, nagylátószögű gamma kamera segítségével, amely nagyfelbontású párhuzamos lyukkollimátoral volt ellátva, és egy, a cég által ajánlott

100 számítógéppel volt összekapcsolva (Technicare Gemini 700, Technicare Omega 560, Solon, Ohio) . A Tc^m-re, ill. az In¹¹¹re vonatkozó leképezéseket párhuzamosan végeztük, duális foton módszerrel, 15%-os ablak mellett, amely a Tc^m 140 KeVos, valamint az In¹¹¹ 247 KeV-os fotocsúcsára volt centrálva. Az injektálás után 3 és 6 órával két leképezési sorozatot készítettünk, 5 perc/felvétel idöbeállítással. 18 órával az injektálás után a felvételi időt 10 percre nyújtottuk.Körülhatároltuk az érdeklődésre számot tartó régiókat: a fertőzött ill. az ellenoldali normál izom (háttér). Az eredményeket céltárgy-háttér arány formájában (a gyulladt combokat a másik oldali, normál combokkal összehasonlítva) adtuk meg.

Közvetlen mintavétel a szövetekből

Az utolsó felvételek elkészítése után az állatokat nátriumpentobarbitál túladagolásával megöltük, és meghatároztuk a biodisztribúciót. Mintákat vettünk az alábbi szervekből és szövetekből: vér, szív, tüdő, máj, epe, gyomor, vese, mellékvese, GI traktus, vázizomzat, herék, csontok és csontvelő, normál és fertőzött izom, valamint genny, súlyukat megmértük, radioaktivitásukat pedig egy edényes típusú gamma számlálóval (LKB model #1282, Wallac Oy, Finland) határoztuk meg. A radioaktív bomlás korrigálására és az egyes szervekben lévő radioaktív koncentrációnak, mint az összes beadott radioaktivitás részének kiszámítása céljából az injektált dózisok alikvot részeinél párhuzamos részecskeszámlálást

101 végeztünk. Az eredményeket a fertőzött és a normál izom ill. a genny és a normál izom százalékos injektált dózis per gramm (%ID/gramm) arányával fejeztük ki.

A keringésben lévő radioaktivitás természetének valamint a fertőzés helyének meghatározására a vér- és gennymintákat Lymphoprepen végrehajtott gradiens centrifugálással frakcionáltuk. A plazmát ezután tovább frakcionáltuk egy Sephadex G-100 oszlopon (1,0 x 25 cm), pH 7,4-es PBS-el eluálva. Az oszlopot Inⁱⁿ-IgG-vel, Inⁱⁿ-F (ab ' ) ₂~vel, I¹²⁵z 9 9 m humán albuminnal és Te -DTPA-val kalibráltuk.

Fantomvizsgálatok

E vizsgálatok célja az volt, hogy meghatározzuk a 174 KeV-os In¹¹¹ fotonok keresztáramlását a Te¹ ablakba, ill. a 140 KeVos Te fotonok ataramlasat az In ablakba. Röviden, ugyanakkor amikor az állatokat injektáltuk, In¹¹¹ és Te⁵⁹” mintákat az injektátummal azonos arányban 250 ml sóoldattal kevertünk össze standard infúziós zsákokban. Ezeket a fantomokat 5 cm-re helyeztük el a leképezési táblától, és mindkét ablakon át felvételt készítettünk. Körülhatároltuk az érdeklődésre számot tartó régiókat mindegyik zsáknál, kiszámítottuk a keresztáramlási faktorokat, és ezekkel korrigáltuk a Tc^m és az In¹¹¹ felvételeket.

Statisztikai módszerek

A leképezési és a biodisztribúciós vizsgálatok eredményeit statisztikailag a variancia analízis Duncan féle többcsatornás módszerével értékeltük ki (Duncan D.B.,

102

Biometrics 11: 1-42 [ 1955] ) . A leképezési adatok kiértékelésére a kétutas ANOVA módszer lineáris modelljét használtuk, kiásszifikációs változóként az injektálás óta eltelt időt, ill. a radiofarmakont (Tc^m-HP, ill. In^1L1-gyel jelzett fehérvérsejtek) alkalmaztuk. T/B = Idő +

Radiofarmakon + Idő x Radiofarmakon. A biodisztribúciós adatok kiértékelésére a kétutas ANOVA módszer lineáris modelljét használtuk, klasszifikációs változóként a szervet, ill. a radiofarmakont alkalmaztuk. %ID/gramm = Szerv + Radiofarmakon + Szerv x Radiofarmakon. Ezen túlmenően a Tc^m HP-nél, ill. In^U1-gyel jelzett fehérvérsejteknél tapasztalható céltárgy-háttér arányt is összehasonlítottuk lineáris regresszióval. Valamennyi eredményt átlag ±. SEM alakban fejeztük ki.

Eredmények

Peptidszintézis

A HYNIC-cel módosított kemotaktikus peptidet jó termeléssel és tisztaságban kaptuk meg. Az UV elemzés 268 ill. 315 nm-en mutatta a maximális abszorpciót. A tömegspektroszkópia és az aminosav-analizis eredményei megegyeztek a várt értékekkel (Met-1,00, Leu-1,00, Phe 0,97, Lys-1,00).

Rádiófarmakonok

A végtermék a TLC ill. HPLC analízise bizonyította, hogy a radioaktivitás több mint 90%-a 1 óra inkubáció után a

103 peptidekhez kötődött. A tisztítatlan Tc^m-HP specifikus aktivitása a számítások szerint >3000 mCi/μιηόΙ . A fentebb leírt tisztítási eljárás alkalmazásával a specifikus aktivitás értéke 10000 τηΟί/μιηόΙ fölé nő.

Az e kísérletekben használt Inⁿⁱ-es leukocita jelzési módszer kb. 70%-os jelzési hatékonyságot eredményez tisztítás előtt, a végső radiokémiái tisztaság pedig >95%.

Fantomvízsgálatok

E vizsgálatok azt jelzik, hogy 3 órával a radiofarmakonok injektálása után a Te ablakban detektált fotonok 5%-a az In¹¹¹-töl származik. 18 órával az injektálás után a Te ablakban detektált fotonok 17%-a származik az In¹¹¹-töl. Mindkét leképezési időpontban az In¹¹¹ ablakban detektált fotonok 2%-a származik a Tc^m-től. Ezekkel az átcsúszási értékekkel valamennyi leképezési adatot korrigáltuk.

Leképezés

A 14. ábrán a fenti módon korrigált, elölről készült z zz zz· zz 5 3lTl felvételek lathatok egy nyulrol, 6 ill. 18 oraval Te -HP és Inⁿⁱ-gyel jelzett fehérvérsejtek együttes injektálása után. A két radiofarmakon biodisztribúcioja mindkét leképezési időben majdnem azonos volt. Mindkét radiofarmakonból nagy koncentráció volt detektálható a tüdőben, a májban, az epében és a vesében. Mindkét nyomjelző koncentráció alacsony volt az izmokban és a GI traktusban.

104

A leképezési adatokból kitűnik, hogy a Tc^m-HP jelentős mértékben akkumulálódik a fertőzési helyeken, úgy 6, mind 18 órával az injektálás után. Mindkét ágens esetén a T/B arány jelentősen nőtt az idővel (p< 0,01) . Mindkét leképezési időben a Te -HP-re jelentősen nagyobb (p< 0,01), mint az In^11L-gyel jelzett fehérvérsejtek esetében. A 15. ábrán összegeztük mindkét radiofarmakonra vonatkozóan a céltárgyháttér arányt. 6 órával az injektálás után a Tc^m-HP esetében tapasztalható T/B arány azonos volt az In^ul-gyel jelzett fehérvérsejteknél 18 óra után mérhetövel. Az T/B arányok átlaga (Tc^m-HP/In¹¹¹-FVS) 2, 99 + 1, 88 volt, egyetlen érték sem volt 1-nél kisebb.

Közvetlen mintavétel a szövetekből

A Tc^m-HP ill. az In¹¹¹-gyel jelzett fehérvérsejtek biodisztribúcióját (%ID/g) közvetlen szöveti radioaktivitás mérésekkel határoztuk meg, ezek eredményeit mutatja az V. táblázat.

• ·

V. Táblázat: Tcm-HP ill. az In111 -gyei jelzett fehérvérsejtek biodisztribúciója nyúlban (%ID/g, átlag ± SEM)
Szerv	Tcm-HP	In111 -FVS-ek
Vér		0.127±0.029
0.037 ±0.003
Szív	0.043 ±0.005	0.024 ±0.004
Tüdő	0.192±0.037	0.120±0.007
Máj	0.207±0.013	0.148±0.020
Epe	0.601 ±0.025	2.080±0.237
Vese	0.136±0.021	0.086±0.016
Mellékvese	0.103±0.018	0.139±0.026
Gyomor	0.050 ±0.008	0.013±0.003
GI-traktus	0.047±0.005	0.018±0.004
Herék	0.018±0.001	0.028±0.003
Izom	0.003±0.001	0.004±0.001
Velő	0.159±0.013	0.358±0.107
Csont	0.033 ±0.004	0.039±0.007
Fertőzött izom	0.101 ±0.008	0.024 ±0.002
Genny	0.188±0.034	0.035 ±0.008

Erre az időre már jelentős különbségek alakultak ki a két nyomjelző koncentrációja között a különböző szövetekben. A Tc^99ir-mel jelzett kemotaktikus peptid nagyobb feldúsulást mutatott a fertőzött izmokban (p< 0,01), a gennyben (p< 0,01), a szívben (p< 0,05), a májban (p< 0,05), a gyomorban (p< 0,01), és a Gl-traktusban (p< 0,01) . Az In¹¹¹gyel jelzett fehérversejtekből a vérben (p< 0,05), az epében

106 (ρ< 0,01), és a herékben volt több található. Nem volt szignifikáns különbség tapasztalható a normál vázizomzat, a csontok, a csontvelő,a tüdő, a mellékvese, ill. a vese esetében.

A vér-frakcionálás eredményei mindkét időpontban azt mutatták, hogy a keringő Tc^m radioaktivitásnak mindössze kb. 15%-a volt a leukocitákhoz kötve, míg az In¹¹¹-böl származó radioaktivitásnak több mint 80%-a a fehérvérsejtekhez kötődött. Mindkét radionuklid csak igen kis mértékben (< 2%) kötődött vörös vértestekhez. Az előzőekkel ellentétben, a genny frakcionálásából kitűnt, hogy úgy a

9m 111

Te -bői, mind az In -bői szármázó radioaktivitás kb. 90%-a a fehérvérsejtekhez kötődött. A plazma oszlopkromatográfiája

9 m azt mutatta, hogy a feherversejtekhez nem kötött Te radioaktivitás több mint 95%-a egy 150 000 molekulatömegű IgG frakcióval eluálódik; a szabad peptid elúciós helyzetében (Rf értékénél) nem volt radioaktivitás detektálható. Az oszlopról a radioaktivitás töb mint 90%-a eluálódik.

A 16. ábrán a fertőzött izomban és a normál izomban

QŰm 1 1 1 meghatározható Te -HP ill. In -FVS arányokat tüntettük fel, amelyeket az izommetszeteken végrehajtott közvetlen radioaktivitásméréssel határoztunk meg, 18 órával az injektálás után. Az átlagos fertőzött izom/normál izom arány jóval magasab volt a Te -HP mint az In -FVS-ek esetében (33,6 : 1 ill. 8,1 : 1, p< 0,01). Ez a különség inkább a fertőzött izmokban tapasztalható abszolút akkumuláció eltérésével magyarázható (Tc^m-HP: 0.102% ID/g, In¹¹¹-FVS-ek: 0,024% ID/g), mint az akkumulációs különbségekkel a normál izmokban (Tc^m-HP: 0.003% ID/g, In^-FVS-ek: 0,004% ID/g).

Regressziós analízissel nem lehetett szignifikáns korrelációt

107 kimutatni Tc^m-HP és az Inⁱⁿ-FVS-ek akkumulációja között (r² = 0,076) .

A 17. ábrán a genny és az ellenkező oldali normál izom radioaktivitásának arányát tüntettük fel, 18 órával az injektálás után. Az átlagos genny/normál izom arány

61.8 + 11,05 volt a Tc^m-HP-re, és 9,32 + 2,50 az In^-gyel jelzett fehérvérsejtekre nézve (p< 0,01) . A Tc^m-HP nagyobb akkumulációja a gennyben (0,188 + 0,034 % ID/g), összehasonlítva az In¹¹¹-FVS-eknél mérhető értékkel (0,035 + 0,008 % ID/g) volt a Tc^m-nél tapasztalható magasabb T/B arány fő oka.

A fenti példából kitűnik, hogy a Tc^99m-mel jelzett kemotaktikus peptidek jobb leképezőszerei a bakteriális fertőzéseknek nyulakban, mint az In^U1-gyel jelzett fehérvérsejtek. A Tc^99m-mel jelzett kemotaktikus peptidek akkumulációjának abszolút szintje (%ID/g) a fertőzött izomban, ill. a gennyben nagyobb volt mint az In¹¹'-gyel jelzett fehérvérsejteké. Ezen túlmenően a céltárgy-háttér arany is nagyobb Te -HP esetében, valamennyi leképezési időben. Az, hogy a 6 órával az injektálás után a Tc^99m-HP esetében tapasztalható T/B arány azonos volt az In^1U-gyel jelzett fehérvérsejteknél 18 óra után mérhetővel, azt jelzi, hogy a Te -mel jelzett kemotaktikus peptidek a fertőzések leképezésének gyors alternatíváját kínálják. Mivel a normál izmokban való különbség elhanyagolható volt, a Te -HP-nek az In^11L-FVS-eknél· jobb T/B aránya elsősorban a peptid nagyobb koncentrációjának tulajdonítható a fertőzési helyeken.

A találmány kiterjed a fentebb ismertetett elvi alapokon, a gyakorlatban jártas szakemberek által, az igénypontok keretei

108 között végrehajtható valamennyi változtatásra ill.

módosításra.

Claims (6)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Detektálhatóan jelzett kemotaktikus peptid

   X - Y - Leu - Phe - [ Z] _n - W ahol :

   X jelentése az alábbi amino-védöcsoport

   3 4

   R —C==R

   I ahol R lehet hidrogén, alkil-, alkenil-, alkinil-, alkoxi-, aralkoxi vagy amino-csoport, és R⁴ jelentése oxigén vagy kén,

   Y jelentése aminosav-maradék,

   Z jelentése távtartó (spacer) szekvencia 1-6 szénatomos alifás diaminok, [ R⁶] _m, és ezek keverékei, ahol R⁶ jelentése aminosav-maradék, m pedig 1 vagy annál nagyobb egész szám, n jelentése 0 vagy 1, és

   W egy alábbi szerkezetű jelző vagy kapcsoló szubsztituens:

   - [ K] _v - M¹ ahol:

   K jelentése DTPA, EDTA, vagy HYNIC, v értéke 1, és

   ..1 . _Ί , /· -r 111 m 99m ,

   M jelentese In vagy Te ; es amely kemotaktikus peptid döntően a fertőzés vagy gyulladás helyén gyűlik össze, és nem akkumulálódik a nem fertőzött vagy gyulladt helyeken.

   110

   2. Az 1. Phe, vagy . igénypont Nle. s zerinti . peptid, ahol Y jelentése Met, 3. A 2. igénypont szerinti peptid, ahol K jelentése HYNIC. 4 . A 3 . igénypont szerinti peptid, ahol a W csoport egy további L csoportot is tartalmaz, melynek j elentése mellékligandum. 5. A 4. igénypont szerinti peptid, ahol a mellékligandum

   glükoheptonát, tricin, vagy egy további peptid-egység lehet.
2. 6. Az 5. igénypont szerinti peptid, ahol a további peptidegység jelentése

   X - Y - Leu - Phe - [ Z] _n - W ahol W egy alábbi szerkezetű jelző vagy kapcsoló szubsztituens:

   - [ K] _v - M¹ ahol :

   K jelentése HYNIC v érétéke 1, és

   M¹ jelentése egy diagnosztikusán detektálható cimke.
3. 7. Parenterálisan alkalmazható gyógyászati készítmény, amely az 1. igénypont szerinti peptidet tartalmazza.

   111
4. 8. Egy kemotaktikus peptid az alábbiak közül:

   N-For-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-Lys-DTPA N-For-Met-Leu-Phe-Pu-DTPA

   N-For-Nle-Leu-Phe-Lys-DTPA

   N-For-Nle-Leu-Phe-Lys(NH₂) -DTPA

   N-For-Met-Leu-Phe-Lys-DTPA

   N-For-Nle-Leu-Phe- (D)Lys (NH₂) -DTPA N-Ac-Nle-Leu-Phe-Lys(NH₂) -DTPA N-karbobenzoxi-Met-Leu-PheOMe

   IBOC-Met(szulfoxid)-Leu-Phe-Lys(NH₂)

   IBOC-NLe-Leu-Phe-Lys(NH₂)

   N-For-Met(szulfoxid)-Leu-Phe-DTPA-Lys

   N-For-Met(szulfoxid)-Leu-Phe-N-DTPA-Lys

   N-Izobutil-karbamid-Met-Leu-Phe-karboxilát

   Izobutil-oxi-karbonil-Met-Leu-Phe-N-DTPA-Lys N-For-(D)Met-Leu-Phe-Lys(NH₂) , szolvatált BOC-Nle-Leu-Phe-Lys, szolvatált

   N-For-Met(szulfoxid)-Leu-Phe-Lys(NH₂) , szolvatált N-For-Met(szulfon)-Leu-Phe-Lys(NH₂) , szolvatált N-Karbamil-Met-Leu-Phe-Lys (NH₂) , szolvatált N-Trimetil-acetil-Met-Leu-Phe-Lys(NH₂) , szolvatált Izobutil-oxi-karbonil-Met-Leu-Phe-Lys(NH₂) , szolvatált;

   N-For-Nle-Leu-Phe-Nle-Tyr-N^s-DTPA-Lys

   N-Adamantil-karbamid-Met-Leu-Phe

   N-Cinnamoil-Met-Leu-Phe p-Tolil-karbamid-Met-Leu-Phe m-Tolil-karbamid-Met-Leu-Phe

   112

   N-Cinnamoil-Phe-Leu-Phe-Leu-Phe amely kemotaktikus peptid döntően a fertőzés vagy gyulladás helyén gyűlik össze, és nem akkumulálódik a nem fertőzött vagy gyulladt helyeken.

   címke egy

   10 .

   A 9.

   igénypont szerinti radioaktív izotóp.

   peptid, ahol detektálható _T 111

   In vagy igénypont szerinti Tc^m.

   peptid, ahol radioaktív izotóp

   A 9.

   igénypont szerinti peptid, ahol detektálható címke egy paramágneses izotóp, vagy vegyület, amely leképezhető a PÉT módszerrel.
5. 12. Gyógyászati készítmény, amely az alábbi kemotaktikus peptidet tartalmazza:

   X - Y - Leu - Phe -[ Z] _n - [ T] _α ahol:

   X jelentése az alábbi aminovédő csoport

   3 4

   R —C==R

   I ahol R³ lehet hidrogén, alkil-, alkenil-, alkinil-,

   ζ] alkoxi-, aralkoxi vagy amino-csoport, és R jelentése oxigén vagy kén,

   Y jelentése aminosav-maradék,

   Z jelentése távtartó (spacer) szekvencia 1-6 szénatomos alifás diaminok, [ R⁶] _m, és ezek • « • · keverékei, ahol R⁶ jelentése aminosav-maradék, m pedig 1 vagy annál nagyobb egész szám, n jelentése 0 vagy 1, és

   T jelentése terapeutikus ágens, és a jelentése 0 vagy 1;

   amely kemotaktikus peptid döntően a fertőzés vagy gyulladás helyén gyűlik össze, és nem akkumulálódik a nem fertőzött vagy gyulladt helyeken.
6. 13. A 12. igénypont szerinti gyógyászati készítmény ahol a jelentése 1 és T az alábbi csoportok egy tagja: drogok, lektinek, toxinok, antimikrobiális ágensek, valamint az alábbi szerkezetű anyag:

   - [ K] _v - [ Μ²] _μ ahol:

   K jelentése köztes funkciós csoport,

   V érétéke 0 vagy 1, és

   M jelentése terapeutikus radioizotop, és μ jelentése 0 vagy 1.

   igénypont szerinti gyógyászati érétéke 0.

   igénypont szerinti gyógyászati jelentése egy az alábbiak közül:

   I¹²³, I¹³¹, Y^5:, Cu⁶⁷, Bi²¹⁷, At²¹¹, Pb²¹², Se⁴⁷,

   Sm¹⁵³ és Pd^lc&.

   készítmény ahol v készítmény ahol M „ 186 „ 188 _πΚ105

   Re , Re , Rh ,