PL176079B1

PL176079B1 - Trwała wodna kompozycja farmaceutyczna IFN-i sposób wytwarzania trwałej wodnej kompozycji farmaceutycznej IFN-

Info

Publication number: PL176079B1
Application number: PL94311639A
Authority: PL
Inventors: Tue Nguyen
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1993-05-12
Filing date: 1994-05-04
Publication date: 1999-04-30
Also published as: JP4053586B2; PL311639A1; ES2126114T3; EP0697887A1; IL109350A; GR3029286T3; HUT72980A; FI111442B; NO954544L; CN1120724C; ZA942955B; FI955136A0; EP0697887B1; ATE173632T1; TW275585B; CA2159602C; CZ295595A3; JPH08510242A; KR100330325B1; NO320069B1

Abstract

1. Trwala wodna kompozycja farmaceutyczna IFN-? obejmujaca nie poddany uprzednio liofilizacji IFN-?, bufor utrzymujacy pH w zakresie od okolo 4,0 do 6,0, detergent niejonowy i srodek zapewniajacy izotonie, znamienna tym, ze zawiera nie poddany uprzednio liofilizacji ludzki IFN-? w ilosci farmaceutycznie skutecznej, bufor octanowy oraz dodatkowo srodek konserwujacy, wybrany z grupy obejmujacej fenol w ilosci 0,05-0,4% wagowych, alkohol benzylowy w ilosci 0,75-1% wagowych lub haloge- nek benzetoniowy w ilosci 0,002-0,01% wagowych. PL PL PL

Description

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest trwała wodna kompozycja farmaceutyczna i sposób jej wytwarzania. Kompozycja będąca przedmiotem wynalazku zawiera interferon gamma (IFN-y, znany również jako interferon immunologiczny). Przedmiotem wynalazku są zwłaszcza stabilizowane wodne kompozycje farmaceutyczne, zawierające dawki wielokrotne IFN-y w ilości skutecznej farmaceutycznie do wielokrotnego podawania.

IFN-y należy do grupy interferonów; wykazuje on właściwości przeciwwirusowe i antyproliferacyjne, charakterystyczne dla interferonów -a i -β (IFN-α i IFN-β), lecz w przeciwieństwie do nich jest labilny w pH 2. IFN-y wytwarzano początkowo poprzez mitogenną indukcję limfocytów. Rekombinacyjne wytwarzanie ludzkiego IFN-y zostało po raz pierwszy opisane przez Gray, Goeddel i współpracowników [Gray i wsp., Naturę 295, 503-508 (1982)] i jest przedmiotem patentów Stanów Zjednoczonych nr 4 762 791, 4 929 544, 4 727 138 i 4 925 793.

Rekombinacyjny ludzki IFN-y, opisywany przez Gray i Goeddel, wytwarzany przez E. coli, składa się ze 146 aminokwasów, przy czym w końcu N znajduje się sekwencja CysTyrCys. Następnie stwierdzono, że natywny ludzki IFN-y (to znaczy IFN-y wytwarzany poprzez mitogenną indukcję ludzkich limfocytów z krwi obwodowej i następnie oczyszczanie) stanowi polipeptyd pozbawiony końca N o sekwencji CysTyrCys, opisanego przez Gray i wsp., j.w. Niedawno oznaczono strukturę krystaliczną rekombinacyjnego ludzkiego IFN-y, wytwarzanego przez E. coli (rh IFN-y) [Ealic i wsp., Science 252, 698-702 (1991)];

stwierdzono, że białko to stanowi niekowalencyjny homodimer o ciasno splecionych łańcuchach, przy czym te dwa identyczne łańcuchy polipeptydowe zorientowane są w sposób przeciwrównoległy.

Wiadomo, że IFN-y wykazuje szeroki zakres aktywności biologicznej: m.in. działa przeciwnowotworowo, przeciwbakteryjnie i immunoregulacyjnie. Rekombinacyjny ludzki IFN-y (rh IFN-y, Actimmune®, Genentech, Inc., South San Francisko, California) jest dostępny w handlu jako lek immunomodulacyjny do leczenia przewlekłych chorób ziaminiakowych, charakteryzujących się ciężkimi, nawracającymi zakażeniami skóry, węzłów chłonnych, wątroby, płuc i kości, spowodowanymi dysfunkcją fagocytów [Baehner, R.L., Pediatrie Pathol., 10, 143-153 (1990)]. Proponowano również zastosowanie IFN-y w leczeniu atopowego zapalenia skóry, pospolitej choroby zapalnej skóry, cechującej się silnym świądem nawracającym przebiegiem z częstymi okresami pogorszenia, charakterystyczną morfologią kliniczną i rozmieszczeniem uszkodzeń skóry (por. Publikacja PCT nr WO 91/07984, opublikowana 13 czerwca 1991), w terapii zwężenia naczyń włączając w to nawrót zwężenia naczyń po angioplastyce i/lub zabiegu chirurgicznym na naczyniach krwionośnych (Publikacja PCT nr WO 90/03189, opublikowana 5 kwietnia 1990), różnych chorób płuc, w tym zespołu zaburzeń oddechowych, (RDS), zarówno zaburzeń oddechowych dorosłych (ARDS), jak i noworodków, określanego jako idiopatyczny RDS lub choroba błon szklistych (Publikacja PCT nr WO 89/01341, opublikowana 23 lutego 1989). IFN-y stosowano ponadto z powodzeniem do leczenia różnych postaci alergii, np. dychawicy oskrzelowej, schorzeń związanych z zakażeniem HIV, jak np. zakażenia oportunistyczne, np. zapalenie płuc wywołane przez Pneumocystis carinii, oraz posocznicy pourazowej.

W opisie patentowym Stanów Zjednoczonych nr 5 151 265, wydanym 29 września 1992, opisano trwałe w postaci płynnej preparaty farmaceutyczne, zawierające nieliofilizowany IFN-y w ilości skutecznej wraz z buforem, zdolnym do utrzymywania wartości pH w zakresie 4,0-6,0, środek stabilizujący, taki jak mannit, oraz detergent niejonowy.

Znany, dostępny w handlu płynny preparat IFN-y (Actimmune®, rhuIFN-y, Genentech, Inc.), stanowi jałowy, przejrzysty, bezbarwny roztwór, nie zawierający środków konserwujących, pakowany w fiolki, zawierające jednorazową dawkę do wstrzyknięcia podskórnego. Fiolka 0,5 ml (Actimmune® zawiera 100 μg (3 miliony U, aktywność swoista: 30 milionów U/mg IFN-y-1b w 20 mg mannitu, 0,36 mg bursztynianu sodowego, 0,05 mg polisorbatu 20, i jałową wodę do wstrzyknięć. Ponieważ preparat nie zawiera środków konserwujących, fiolki przeznaczone są do jednorazowego użytku; zawierają one pojedynczą dawkę terapeutyczną i po otwarciu fiolki niewykorzystaną ilość leku należy wyrzucić.

Przy stosowaniu leku ze wskazań wymagających wielokrotnego jego podawania, jak np. w leczeniu atopowego zapalenia skóry lub gruczolakoraka nerki, korzystne byłoby, gdyby były dostępne trwałe w postaci płynnej farmaceutyczne kompozycje, zawierające dawki wielokrotne IFN-y, w których IFN-y zachowywałby aktywność biologiczną i fizyczną trwałość przez długi czas, pod warunkiem przechowywania go w zalecanych warunkach. Takie kompozycje powinny zawierać, korzystnie, IFN-y w ilości do około 30-krotnej skutecznej ilości terapeutycznej w danym zastosowaniu leczniczym, i zachowywać trwałość przez co najmniej 14 dni po pierwszym podaniu leku. Jednakże wytworzenie takich wielodawkowych preparatów nie jest sprawą prostą.

Białka, w przeciwieństwie do leków tradycyjnych (organicznych lub nieorganicznych), mają duże wymiary cząsteczek. Dla ich biologicznej aktywności istotne jest, aby przynajmniej konformacja rdzennej sekwencji aminokwasowej pozostała nie zmieniona. Ponadto, ponieważ białka zawierają liczne grupy funkcyjne, np. różne łańcuchy boczne, przyłączone do aminokwasów wchodzących w skład sekwencji, w tym samym czasie może zachodzić wiele reakcji degradacji. O ile istnieją liczne możliwe szlaki degradacji, których energia aktywacji może być różna, to profil degradacji zmienia się w znaczący sposób w zależności od temperatury.

Na skutek swej złożonej budowy białka są często niestabilne; jeżeli zachodzi ich degradacja, określenie jej mechanizmu i charakterystyki profilu, w tym oznaczenie stałej ograniczającej reakcję, jest również niezwykle złożone. Niejednokrotnie nie ma bezpośredniego

176 079 sposobu identyfikacji chemicznej i pomiaru ilości produktów degradacji. Ogólnie rzecz biorąc, zarobki mają istotny wpływ na trwałość białek, zarówno fizyczną jak i biochemiczną, i na wyniki testów aktywności, tak więc ich dobór jest niezwykle ważny i trudny przy wytwarzaniu nowych preparatów.

Wymienione powyżej problemy dotyczą w szczególności IFN-y, który stanowi białko o ciężarze cząsteczkowym 15000 D, utworzone z sekwencji około 143 (146) aminokwasów, o których wiadomo, że są termolabilne i łatwo ulegają agregacji i degradacji proteolitycznej [Wetzel, R.L. i wsp., Unfolding and Inactivation w: Protein Design and the Development of New Therapeutics and Vaccines, wyd. Hook J.B. i Poste, G., Plenum Publishing Corp., 1990, str. 79; Mulkerrin, M.G. i Wetzel, R. Biochemistry 28, 6556 (1989)].

Wynalazek dotyczy trwałej wodnej kompozycji farmaceutycznej obejmującej IFN-y, nie poddany uprzednio liofilizacji i bufor utrzymujący pH w zakresie od 4,0 do 6,0, detergent niejonowy i środek zapewniający izotonię, charakteryzującej się tym, że zawiera nie poddany uprzednio liofilizacji ludzki IFN-y w ilości farmaceutycznie skutecznej, bufor octanowy oraz dodatkowo środek konserwujący, wybrany z grupy obejmującej fenol w ilości 0,05-0,4%, alkohol benzylowy w ilości 0,75-1% wagowych lub halogenek benzetoniowy w ilości 0,002-0,01% wagowych.

Korzystnie ludzki IFN-y stanowi desCysTyrCys-IFN-y, bardziej korzystnie taki desCysTyrCys-IFN-y, którego cztery C-końcowe aminokwasy poddano delecji.

Kompozycja według wynalazku zawiera korzystnie IFN-y o aktywności swoistej co najmniej 2 x 10⁷ U/mg.

Korzystnie środek konserwujący zawarty w kompozycji według wynalazku stanowi fenol lub alkohol benzylowy.

IFN-y zachowuje swą aktywność biologiczną i trwałość fizyczną bez konieczności zamrażania, to znaczy w temperaturze 2-8°C, przez około 2 tygodnie.

Kompozycję farmaceutyczną według wynalazku w ilości takiej, która odpowiada co najmniej jednej terapeutycznie skutecznej dawce IFN-y można umieszczać w pojemniku. Ewentualnie w pojemniku można umieszczać od 2 do 30 terapeutycznie skutecznych dawek. Pojemnikiem tym może być butelka lub fiolka, albo przyrząd zawierający płynną kompozycję farmaceutyczną, umożliwiający jej podawanie; przyrząd taki stanowić może np. strzykawka, pojemnik aerozolowy lub strzykawka bezigłowa itp.

Innym aspektem wynalazku jest sposób wytwarzania trwałej wodnej kompozycji farmaceutycznej zawierającej IFN-y, charakteryzujący się tym, że łączy się nie liofilizowany uprzednio ludzki IFN-y z wodą, buforem octanowym, utrzymującym pH w zakresie od około 4,0 do około 6,0, detergentem niejonowym, środkiem zapewniającym izotonię i środkiem konserwującym, dobranym z grupy obejmującej fenol w ilości 0,05-0,4%, alkohol benzylowy w ilości 0,75-1% wagowych lub halogenek benzetoniowy w ilości 0,002-0,01% wagowych.

Kompozycję według wynalazku można podawać pacjentowi, wymagającemu takiego leczenia, dooskrzelowo za pomocą inhalacji w postaci cząstek aerozolu zawierających farmaceutycznie skuteczną ilość IFN-y i nie poddanego uprzednio liofilizacji, bufor octanowy utrzymujący pH w zakresie od 4,0-6,0, detergent niejonowy, środek zapewniający izotonię i środek konserwujący, dobrany z grupy, do której należy fenol, alkohol benzylowy i halogenek benzetoniowy, przy czym wielkość cząsteczek jest dostatecznie mała dla umożliwienia ich penetracji do pęcherzyków płucnych, a stamtąd przeniknięcia do krwioobiegu pacjenta.

Krótki opis rysunków

Na fig. 1 przedstawiono wpływ różnych środków konserwujących na bioaktywność rhuIFN-y (Actimmune®, Genentech, Inc., South San Francisko, California), w niekonserwowanej płynnej kompozycji farmaceutycznej, w temperaturze 25°C.

Na fig. 2A i 2B przedstawiono wpływ fenolu, dodanego jako środek konserwujący, w różnym stężeniu, na bioaktywność rhuIFN-y w płynnej kompozycji farmaceutycznej, w temperaturze 25°C.

176 079

Na fig. 3 przedstawiono wpływ 0,9% alkoholu benzylowego na bioaktywność rhuIFN-y w płynnych kompozycjach farmaceutycznych, zawierających, odpowiednio, mM bursztynianu i 5 mM bursztynianu, w temperaturze 25°C.

Na fig. 4 przedstawiono wpływ 0,4% fenolu, dodanego jako środek konserwujący, w temperaturze 25°C, na bioaktywność rhuIFN-y w płynnych kompozycjach farmaceutycznych, zawierających, odpowiednio, 5 mM bursztynianu i 1 mM bursztynianu, w temperaturze 25°C.

Na fig. 5 przedstawiono wpływ fenolu na bioaktywność rhuIFN-y w preparacie zawierającym 1 mM bursztynianu w porównaniu z preparatem zawierającym 10 mM octanu, w temperaturze 25°C.

Prowadząc badania nad opracowaniem kompozycji IFN-y, zawierającej dawkę wielokrotną, w której pozostający w opakowaniu IFN-y (w ilości odpowiadającej terapeutycznie skutecznej dawce lub dawkom) jest zakonserwowany i nadaje się do zastosowania leczniczego przez pewien czas od podania pierwszej dawki leku, autorzy niniejszego wynalazku stwierdzili, że wiele znanych farmaceutycznie dopuszczalnych środków konserwujących nie nadaje się do zastosowania z innymi składnikami stosowanymi zwykle do wytwarzania płynnych preparatów farmaceutycznych IFN-y, i że wynikiem tej niezgodności jest dramatyczny spadek jego trwałości. W szczególności stwierdzili oni, że dodanie pewnych, dopuszczalnych farmaceutycznie środków konserwujących, powoduje nietrwałość dostępnych w handlu płynnych preparatów farmaceutycznych IFN-y (Actimmune®, Genentech, Inc.), powodując tworzenie się agregatów i spadek aktywności biologicznej.

Niniejszy wynalazek jest wynikiem uwieńczonych sukcesem badań nad wytworzeniem trwałego, zawierającego środki konserwujące wodnego preparatu farmaceutycznego IFN-y, W rozumieniu niniejszego opisu terminy gamma interferon, interferon gamma i IFN-y używane są zamiennie i odnoszą się do wszelkich postaci IFN-y (pochodzenia ludzkiego lub zwierzęcego), o których wiadomo, że wykazują aktywność biologiczną w ogólnie uznawanych testach IFN-y, takich jak hamowanie replikacji wirusowej w odpowiedniej linii komórkowej (dla ludzkiego IFN-y - hamowanie replikacji wirusa zapalenia mózgu i mięśnia sercowego myszy w linii komórkowej A549 ludzkich komórek raka płuc), indukcja antygenów klasy II, termolabilność, inne testy przeciwwirusowe, przeciwnowotworowe lub immunoregulacyjne, lub neutralizacja przeciwciał, wykazujących immunoreaktywności na IFN-y (lecz nie wykazujących immunoreaktywności na IFN-α i/?); termin ten oznacza IFN-y w postaci dojrzałej, w postaci pro, met lub des (l-3)(zwanej również desCysTyrCys-IFN-y), niezależnie od tego, czy IFN-y uzyskano ze źródeł naturalnych, wytworzono poprzez syntezę chemiczną, czy też stosując techniki rekombinacyjnej technologii DNA.

Pełny opis wytwarzania rekombinacyjnego ludzkiego IFN-y (rhuIFN-y), w tym również jego cDNA i sekwencji aminokwasowych, znajduje się w wyżej cytowanych opisach patentowych Stanów Zjednoczonych, jak np opis patentowy Stanów Zjednoczonych nr 4 762 791. Rekombinacyjny ludzki IFN-y, pozbawiony końca CysTyrCys, i ewentualnie formy pozbawione pewnych innych podstawników, opisano np. w Europejskiej Publikacji Patentowej nr 146 364. Interferony zwierzęce, w tym IFN-y, opisano np. w publikacji europejskiej nr 88 622. Termin ten oznacza różne formy glikozylowane, inne odmiany i pochodne takich interferonów natywnych (typu dzikiego), które są znane ze stanu techniki lub zostaną opracowane w przyszłości. Przykłady takich odmian stanowią allele i produkty ukierunkowanej mutagenezy, w której reszty poddaje się delecji, insercji i/lub substytucji (por. np. wzmiankowana powyżej Publikacji Europejska nr 146 354). Wiadomo, że IFN-y wykazuje działanie tylko w wąskiej grupie organizmów - gospodarzy: należy stosować IFN-y homologiczny, tzn. odpowiedni dla gatunku leczonego zwierzęcia. W leczeniu ludzi stosuje się, korzystnie, odmianę desCysTyrCys o sekwencji przedstawionej w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych nr 4 717 138 i odpowiadającym mu opisie patentowym EP 77 670, i ewentualnie odmianę C-końcową, w której cztery ostatnie reszty aminokwasowe poddano delecji w obróbce posttranslacyjnej.

W myśl zasad farmakologii, w kontekście niniejszego wynalazku ilość skuteczna terapeutycznie IFN-y oznacza ilość skuteczną w zapobieganiu lub leczeniu schorzeń, w

176 079 których leczenie IFN-y przynosi efekty. Przykłady takich schorzeń stanowią (lecz nie są one do nich ograniczone) różnego rodzaju nowotwory, zakażenia, przewlekłe choroby ziarniniakowe, stopowe zapalenie skóry, zwężenie naczyń, włączając w to nawrót zwężenia naczyń po angioplastyce i/lub zabiegu chirurgicznym na naczyniach krwionośnych, zespoły zaburzeń oddechowych (RDS), takie jak zespół zaburzeń oddechowych dorosłych (ARDS), i postać noworodkowa, określana jako idiopatyczny RDS lub choroba błon szklistych, alergie, np. dychawica oskrzelowa, oraz schorzenia związane z zakażeniem HIV, jak np. zakażenia oportunistyczne, np. zapalenie płuc wywołane przez Pneumocystis carinii, gruźlica itp.

Termin kompozycja farmaceutyczna oznacza preparat, którego postać zapewnia zachowanie biologicznej aktywności składników czynnych i nie zawierający dodatkowych składników, które byłyby toksyczne dla organizmów, którym jest on podawany.

Zaróbki farmaceutyczne dopuszczalne (rozczynniki, środki dodatkowe) stanowią takie zaróbki, które mogą być zastosowane u ssaków, zapewniając osiągnięcie dawki skutecznej podawanego składnika czynnego.

IFN-y zachowuje swą aktywność biologiczną w kompozycji farmaceutycznej, jeżeli jej aktywność biologiczna w danym czasie wynosi około 20% aktywności biologicznej, którą IFN-y posiadał w momencie wytwarzania kompozycji farmaceutycznej, przy czym aktywność biologiczną IFN-y oznacza się standardowymi testami, takimi np., jak test przeciwwirusowy A549.

IFN-y zachowuje trwałość fizyczną w płynnej kompo zycji farmaceutycznej, jeżeli nie wykazuje oznak agregacji w badaniu wzrokowym, lub przy badaniu metodą HPLC ekskluzyjnej, pozwalającej oddzielić cząstki danej wielkości.

Uprzednio opisywano, że zakres pH wynoszący 4,0-6,0 jest zakresem optymalnym dla trwałości IFN-y w roztworze wodnym.

Następnie wykazano, że przy przechowywaniu w temperaturze 5°C lub wyżej, płynne preparaty pozbawione środków konserwujących, zawierające nie liofilizowany uprzednio rhuIFN-y, w którym pH utrzymywane jest dzięki działaniu bufora bursztynianowego, powoduje niepożądane tworzenie agregatów, i gwałtowny spadek aktywności białka w takich roztworach. Badając przyczyny zmniejszonej trwałości roztworów zawierających środki konserwujące, autorzy niniejszego wynalazku stwierdzili, że tworzenie agregatów nie było spowodowane niezgodnością IFN-y i zastosowanych środków konserwujących, a raczej jednoczesną obecnością bufora bursztynianowego i badanych środków konserwujących. Jakkolwiek natura reakcji powodujących tworzenie agregatów nie jest dokładnie znana i nie wyizolowano produktów degradacji, stwierdzono, że degradacji tej można uniknąć, i że można wytwarzać trwałe wodne preparaty farmaceutyczne, zastępując bufor bursztynianowy buforem octanowym, zdolnym do utrzymywania pH w pożądanym zakresie.

W pierwszym doświadczeniu badano wpływ różnych środków konserwujących na bioaktywność rhuIFN-y w Actimmune® (rhIFN-y-lb, Genentech, Inc.). IFN-y poddawano dializie do danego bufora. Stężenie EFN-y doprowadzono do 0,2 mg/ml. Następnie dodawano środki konserwujące i roztwór mieszano aż do rozpuszczenia składników. Próbki o objętości 1 ml przenoszono do 3 ml szklanych fiolek typu I, które następnie przechowywano w temperaturze 5 i 25°C. Następnie w równych odstępach czasu pobierano fiolki i poddawano je testom (jedna fiolka/punkt w czasie/temperaturę przechowywania). Testy stanowiły SDS-PAGE, ELISA, biotest przeciwbakteryjny A549 [por. np. Fish, E.N. i wsp. Drug Design and Delivery 2,191-206 - (1988)] i, rzadziej, HPLC z odwróconymi fazami, chromatografia jonowymienna i chromatografia ekskluzyjna, oddzielająca cząstki o określonej wielkości. W dyskusji przedstawiono jedynie wyniki testu bioaktywności i testu SDS-PAGE, ponieważ ściśle odzwierciedlają one zmiany. Przedstawione dane doświadczalne uzyskano w testach prowadzonych w temperaturze 25°C (przyśpieszone badania trwałości), ponieważ w temperaturze 5°C zmiany zachodzą w znacznie dłuższym czasie. Jak to przedstawiono na fig. 1, dodanie 1% alkoholu benzylowego lub 0,1% fenolu jako środka konserwującego powodowało dramatyczny spadek biologicznej aktywności IFN-y w tem176 079 peraturze 25°C w porównaniu z próbką kontrolną, nie zawierającą środka konserwującego, i z preparatami zawierającymi chlorek benzetoniowy w dwóch różnych stężeniach.

Figura 2A ukazuje wpływ różnego stężenia fenolu na biologiczną aktywność rhuIFN-y Actimmune®, Genentech, Inc.) w preparacie płynnym w temperaturze 25°C. Jakkolwiek bioaktywność IFN-y była wystarczająca w roztworach konserwowanych, odpowiednio, 0,1% i 0,2% fenolem, w roztworach tych stwierdzano zwiększone stężenie agregatów, stosując test SDS-PAGE (elektroforeza na żelu poliakryloamidowym z zastosowaniem soli sodowej siarczanu dodecylowego) (Fig. 2B).

Figura 3 przedstawia wpływ 0,9% alkoholu benzylowego na bioaktywność rhuIFN-y w temperaturze 25°C w preparatach buforowanych, odpowiednio, 1 mM bursztynianu i 5 mM bursztynianu. Fakt, że spadek bioaktywności był mniejszy w preparatach zawierających bursztynian w niższym stężeniu wskazuje, że obecność bufora bursztynianowego jest przynajmniej częściowo odpowiedzialna za problemy z trwałością konserwowanych roztworów rhuIFN-y. Wniosek ten potwierdzają wyniki przedstawione na fig. 4. Spadek aktywności biologicznej IFN-y był mniejszy w wodnych roztworach, których pH było utrzymywane na poziomie 5,0 za pomocą 1 mM bursztynianu, niż w roztworach zawierających 5 mM bursztynianu.

Wpływ 0,4% fenolu na bioaktywność rhuIFN-y badano następnie w preparatach płynnych, zawierających, odpowiednio, 1 mM bufor bursztynianowy i 10 mM bufor octanowy. Jak pokazano na fig. 5 trwałość roztworu buforowanego octanem, oceniana poprzez pomiar biologicznej aktywności IFN-y, była w zasadzie taka sama, jak niekonserwowanych roztworów kontrolnych, buforowanych, odpowiednio, bursztynianem i octanem; w badaniu wzrokowym i badaniu metodą SDS-PAGE nie wykrywano obecności agregatów.

Kompozycja według wynalazku zawiera:

a) IFN-y, nie poddany uprzednio liofilizacji

b) bufor octanowy zdolny do utrzymywania pH w zakresie od około 4,0 do około 6,0 (zakres pH zapewniający największą trwałość białka w roztworze)

c) detergent niejonowy (zabezpieczający białko przed agregacją spowodowaną wstrząsaniem) .

d) środek konserwujący, dobrany z grupy, do której należy fenol, alkohol benzylowy i halogenek benzetoniowy, np. chlorek, i

e) wodę.

Detergentami niejonowymi (środkami powierzchniowo czynnymi) mogą być np. polisorbaty (np. polisorbat (Tween) 20, 80 itd.) lub polioksamery (np. polioksamer 199). Zastosowanie niejonowych środków powierzchniowo czynnych umożliwia poddanie powierzchni kompozycji działaniu sił poprzecznych nacisku bez powodowania denaturacji białka. Ponadto, kompozycję zawi erającą środek powierzchniowo czynny, można stosować w przyrządach aerozolowych, używanych np. przy dooskrzelowym podawaniu leku, np. w strzykawkach bezigłowych (por. np. EP 257 956).

Środek zapewniający izotonię dodaje się do osiągnięcia izotonii płynnych kompozycji według niniejszego wynalazku; środek taki mogą stanowić alkohole wielowodorotlenowe, trójwodorotlenowe lub wyższe, takie jak gliceryna, eretryt, arabit, ksylit, sorbit i mannit. Te alkohole wielowodorotlenowe mogą być stosowane pojedynczo lub w połączeniach. Zamiast nich dla zapewnienia izotonii roztworu można stosować chlorek sodowy lub inne odpowiednie sole nieorganiczne.

Bufor octanowy może stanowić, na przykład, mieszanina kwasu octowego i octanu sodowego, mieszanina kwasu octowego i wodorotlenku sodowego, itp. pH płynnego preparatu według niniejszego wynalakzu jest buforowane w zakresie od około 4,0 do około 6,0, korzystnie 4,5 do 5,5, najkorzystniej około pH 5.

Środki konserwujące, fenol, alkohol benzylowy i halogenki benzetoniowe np. chlorek, są znanymi środkami przeciwbakteiyjnymi.

Konserwowana płynna kompozycja według wynalazku może zawierać dawki wielokrotne terapeutycznie skutecznej ilości IFN-y. Ponieważ polipeptyd ten wykazuje swoje działanie tylko w wąskiej grupie organizmów - gospodarzy, w leczeniu ludzi stosowana jest

176 079 płynna kompozycja zawierająca ludzki IFN-y, korzystniej, ludzki IFN-y o sekwencji natywnej. Jako modyfikator odpowiedzi biologicznej, IFN-y wykazuje różnorodne działanie na wiele rodzajów komórek, zarówno u ludzi, jak i u licznych innych gatunków ssaków. Dawka terapeutycznie skuteczna jest oczywiście różna w zależności od takich czynników, jak schorzenie, które leczymy (lub któremu zapobiegamy), wiek pacjenta, masa ciała, stan ogólny, wywiad chorobowy itd.: określenie takiej dawki pozostaje w zakresie kompetencji lekarza praktyka. Dawka skuteczna ogólnie mieści się w zakresie od około 0,001 do około 1,0 mg/kg albo około 0,01-1 mg/kg, albo około 0,01-0,1 mg/kg. W takich preparatach rhuIFN-y wykazuje aktywność swoistą rzędu około 2 x 10⁷ U/mg białka lub większą przy zastosowaniu testu na komórkach A549 przeciwko wirusowi zapalenia mózgu i mięśnia sercowego myszy. Należy starać się, aby zanieczyszczenie endotoksynami było jak najmniejsze i utrzymywane na poziomie bezpiecznym, tzn. na przykład, poniżej 0,5 ng/mg białka. Ponadto, płynna kompozycja według wynalazku przeznaczona do podawania ludziom, musi spełniać wymagania co do jałowości, pirogenności, bezpieczeństwa ogólnego i czystości, zgodnie z normami biura FDA i Biologics.

Kompozycję według wynalazku podaje się, poprzez wielokrotne wstrzyknięcia dożylne (i.v.), podskórne (s.c.) lub domięśniowe, lub jako preparaty aerozolowe, odpowiednie do podawania donosowego lub dooskrzelowego (podawanie dooskrzelowe por. no. EP257 956).

W leczeniu pacjentów z przewlekłą chorobą ziarniniakową zalecane dawkowanie wynosi 50 #g/m² (1,5 miliona U/m²) u pacjentów, których powierzchnia ciała jest większa, niż 0,5 m², i 1,5 «g/kg/dawkę u pacjentów, których powiezccłmia ciała jest równa lub mniejsza, niż 0,5 m. Zaiecasię \ykonnywłani5 wstnykenię5 poekkóenie tzzyraty wtygodmu.

W celu zapobiegania zakażeniom i zmniejszenia śmiertelności u chorych po ciężkich urazach podawać można dawkę 100 μg rhuIFN-y podskórnie jeden raz dziennie. Do zakażeń, którym można zapobiegać lub leczyć je tym sposobem, należą: zapalenie płuc, bakteriemia, zakażenia śródbrzuszne lub toczące się wewnątrz klatki piersiowej, ciężkie zakażenia przyranne, vec-Siculitis/zapalenie opon mózgowych, itd.

Trwała wodna kompozycja według niniejszego wynalazku może być pakowana w fiolki, zawierające do około 30 terapeutycznie skutecznych dawek IFN-y. Bioaktywność IFN-y, utrzymuje się wtedy w zakresie wynoszącym około 20% bioaktywności w momencie pierwszego podania, przez co najmniej około 14 dni. Skutecznie, przez co najmniej około 200 dni po pierwszym podaniu.

Wynalazek został zilustrowany następującymi przykładami.

Przykład I. Trwała wodna kompozycja farmaceutyczna zawiera następujące składniki:

IFN-y 0,1-2,0 mg/ml octan sodowy (pH 5,0) 5-100 mM

Tween 20 0,1-0,01% wagowo mannit 5% wagowo woda do wstrzyknięć, USP do 100% przy czym odsetki podano w odniesieniu do masy kompozycji. Fenol można zastąpić 0,5-1,0% wagowo alkoholu benzylowego, a zamiast mannitu zastosować 0,9% wagowo chlorku sodowego.

Przykład II.

IFN-y 0,1-1,0 mg/ml octan sodowy (pH 5,0) 10 mM

Tween 20 0,01% wagowo mannit 5% wagowo

Fenol można zastąpić 0,75 wagowo alkoholu benzylowego, a zamiast mannitu zastosować 0,9% wagowo chlorku sodowego.

176 079

Przykład III. Wykonanie trwałej wodnej kompozycji farmaceutycznej według wynalazku polega na tym, że:

nieliofilizowany uprzednio IFN-y łączy się z wodą doprowadzając stężenie IFN-y do około 0,1-2,0 mg/ml, a następnie roztwór ten łączy się z buforem octanowym utrzymującym pH roztworu w zakresie od około 4,0 do 6,0.

Tak otrzymany roztwór łączy się z detergentem niejonowym, środkiem zapewniającym izotonię i środkiem konserwującym, którym może być fenol, alkohol benzylowy i halogenek benzetoniowy.

Claims

1. Trwała wodna kompozycja farmaceutyczna IFN-y obejmująca nie poddany uprzednio liofilizacji IFN-y, bufor utrzymujący pH w zakresie od około 4,0 do 6,0, detergent niejonowy i środek zapewniający izotonię, znamienna tym, że zawiera nie poddany uprzednio liofilizacji ludzki IFN-y w ilości farmaceutycznie skutecznej, bufor octanowy oraz dodatkowo środek konserwujący, wybrany z grupy obejmującej fenol w ilości 0,05-0,4% wagowych, alkohol benzylowy w ilości 0,75-1% wagowych lub halogenek benzetoniowy w ilości 0,002-0,01% wagowych.

2. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że ludzki IFN-y stanowi desCysTyrCys-lFN-y.

3. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że ludzki IFN-y stanowi desCys-TyrCys-IFN-y, którego cztery C-końcowe aminokwasy poddano delecji.

4. Kompozycja według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera IFN-y o aktywności swoistej co najmniej 2 x 10⁷ U/mg.

5. Kompozycja według zastrz. 4, znamienna tym, że środek konserwujący stanowi fenol lub alkohol benzylowy.

6. Sposób wytwarzania trwałej wodnej kompozycji farmaceutycznej IFN-y zawierającej nie poddany uprzednio liofilizacji IFN-y, znamienny tym, że łączy się nie poddany uprzednio liofilizacji ludzki IFN-y z wodą, buforem octanowym, utrzymującym pH w zakresie od około 4,0 do około 6,0, detergentem niejonowym, środkiem zapewniającym izotonię i środkiem konserwującym, dobranym z grupy obejmującej fenol w ilości 0,05-0,4% wagowych, alkohol benzylowy w ilości 0,75-1% wagowych lub halogenek benzetoniowy w ilości 0,002-0,01% wagowych.