FI111442B - Menetelmä stabiilin, vesipitoisen farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseksi - Google Patents

Description

111442

MENETELMÄ STABIILIN, VESIPITOISEN FARMASEUTTISEN KOOSTUMUKSEN VALMISTAMISEKSI

I. Keksinnön tausta

Keksinnön ala Tämä keksintö koskee menetelmää stabiilin, vesipitoisen farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseksi.

II. Taustan ja asiaan läheisesti liittyvän alan kuvaus

Gamma-interferoni on interferoniperheen jäsen, joka osoittaa viruksia estäviä ja solujen lisääntymistä estäviä ominaisuuksia, jotka ovat tunnusomaisia alfa- ja beta-inter-feroneille (IFN-α ja IFN-β), mutta vastakohtana noille interferoneille se on pH 2 - labiili. Alunperin gamma-interferonia tuotettiin lymfosyyttien mitogeenisen induktion tapahtuessa. Ihmisen gamma-interferonin rekombinantin tuotannon raportoivat ensimmäisen kerran Gray, Goeddel et ai. [Gray et ai., Nature 295, 503 - 508 (1982)] ja se on kohteena US-pa-tenteissa 4 762 791, 4 929 544, 4 727 138 ja 4 925 793.

Grayn ja Goeddelin ihmisen rekombinantti gamma-interferoni tuotettuna E. coli -bakteerissa koostui 146 aminohaposta, jolloin molekyylin N-terminaalinen asema alkoi sekvenssillä CysTyrCys. Myöhemmin on havaittu, että luontainen ihmisen gamma-interferoni (so. interferoni, joka syntyy ihmisen pe-k rifeerisen veren lymfosyyttien mitogeeni-induktiosta ja puh distetaan myöhemmin) on polypeptidi, josta puuttuu CysTyr-Cys-N-pääte, jonka Gray et ai., edellä, osoittivat. Myöhemmin E. coli -bakteerista johdetun ihmisen rekombinantin gamma-interferonin (rhIFN-γ) kiderakenne määritettiin [Ealick et ai., Science 252, 698 - 702 (1991)] osoittaen, että pro-, * teiini esiintyy tiukasti yhteenkietoutuneena ei-kovalent- tisena homodimeerina, jossa kaksi identtistä polypeptidiket-jua ovat suuntautuneet vastakkaiseen suuntaan.

Gamma-interferonin tiedetään osoittavan laajaa valikoimaa biologisia vaikutuksia, mukaan luettuna kasvainten 2 111442 kasvua estävä aktiivisuus, mikrobien kasvua estävä aktiivisuus ja immuunijärjestelmää säätelevä aktiivisuus. Ihmisen rekombinantti IFN-γ (rhifn-γ, Actimmune®, Genentech, Inc., South Francisco, Kalifornia) on kaupallisesti saatavissa immuunijärjestelmää muuntavana lääkkeenä kroonisen granulo-matoosin hoitamiseksi, jolle ovat tunnusomaisia ihon, imusolmukkeiden, maksan, keuhkojen ja luiden ankarat, uusiutuvat infektiot johtuen fagosyytin toimintahäiriöstä [Baeh-ner, R. L., Pediatric Pathol., 10, 143 - 153 (1990]. Gamma-interferonia on myös ehdotettu atooppisen ihottuman hoitamiseksi, joka on yleinen ihon tulehdustauti, jolle ovat tunnusomaisia ankara kutina, kroonisesti uusiutuva taudinkulku, jossa oireet tulevat esiin toistuvin ajanjaksoin, ihovaurioiden selvä kliininen morfologia ja jakautuminen (katso PCT-patenttijulkaisu WO 91/07984, julkaistu 13. kesäkuuta, 1991), verisuoniahtautuman hoitamiseksi, mukaan luettuna uudelleen ahtautumisen hoito verisuonten uudelleen muovauksen ja/tai verisuonikirurgian jälkeen (PCT-patenttijulkaisu WO 90/03189, julkaistu 5. huhtikuuuta, 1990), erilaisten keuhkosairauksien hoitamiseksi, mukaan luettuna hengitys-vaikeusoireyhtymät (RDS) , kuten aikuisen hengitys-vaikeusoireyhtymä (ARDS) ja vastasyntyneen hengitys- vaikeusoireyhtymä, josta käytetään vaihtelevasti nimityksiä idiopaattinen RDS tai hyaliinimembraanitauti [PCT-patentti-julkaisu WO 89/01341 (julkaistu 23. helmikuuta 1989)]. Lisäksi gamma-interferonia on käytetty menestyksellisesti hoidettaessa erilaisa allergioita, kuten astmaa, ja HIV-infek-tiooon liittyviä sairauksia, kuten opportunistisia infektioita, esim. Pneumocystis carinii'n aiheuttamaa keuhkokuumetta, ja vammaan liittyvää verenmyrkytystä.

J ' Stabiilit, nestemäiset farmaseuttiset koostumukset, jotka sisältävät tehokkaan määrän kylmäkuivaamatonta gamma-interferonia sekä puskurin, joka kykenee ylläpitämään pH:n arvossa 4,0 - 6,0, stabiloimisaineen, kuten mannitolin, ja 3 111442 ei-ioniaktiivisen detergentin, on julkaistu US-patentissa 5 151 265, julkaistu 29. syyskuuta, 1992.

Tunnettu kaupallinen nestemäinen gamma-interfe- ronivalmiste (Actimmune® rhuIFN-y-lb, Genentech, Inc.) on steriili, kirkas, väritön, säilöntäaineeton liuos, joka on täytetty yhden annoksen lasipulloon ihonalaista ruisketta varten. Kukin 0,5 ml:n lasipullo Actimmunea sisältää 100 yg (3 milj. U, spesifinen aktiivisuus 30 milj. U/mg) IFN-y-lb:tä formuloituna 20 mg:aan mannitolia, 0,36 mg:aan nat-riumsukkinaattia, 0,05 mg:aan polysorbaatti 20:ta ja steriiliin veteen ruisketta varten. Koska valmisteet eivät sisällä säilöntäainetta, ne on tarkoitettu yhden kerran käyttöä varten sisältäen yhden hoitoannoksen ja käyttämätön määrä kokonaisuudessaan täytyy hylätä.

Tiettyjä indikaatioita varten, jotka vaativat pitkäaikaista käyttöä käsittäen toistuvan lääkkeen antamisen, kuten atooppisen ihottuman tai munuaissyövän hoito, olisi toivottavaa kehittää stabiileja, nestemäisiä farmaseuttisia koostumuksia, jotka sisältävät moninkertaisia annoksia gamma-interferonia ja joissa gamma-interferoni säilyttää biologisen aktiivisuuden ja fysikaalisen stabiilisuuden pitkän aikaa suositelluissa varastointiolosuhteissa. Tällaisten koostumusten pitäisi sisältää edullisesti enintään noin 30-kertaa hoidollisesti tehokas määrä gamma-interferonia aiot-tua hoidollista käyttöä varten ja pysyä stabiilina vähintään noin 14 päivän ajan ensimmäisen käytön jälkeen. Tällaisten moniannosvalmisteiden valmistaminen ei kuitenkaan ole ollenkaan suoraviivaista.

Proteiinit, toisin kuin traditionaaliset (orgaaniset tai epäorgaaniset) lääkkeet, ovat suuria kooltaan. Biologisen aktiivisuuden kannalta on oleellista, että ainakin niiden aminohappojen ydinsekvenssi säilyy ennallaan konformaa-tion eheyden kannalta. Lisäksi koska proteiineilla on monta funktionaalista ryhmää, kuten erilaiset sivuketjut niiden rakenneosa-aminohapoista, on olemassa mahdollisuus, että ta- 4 111442 pahtuu monta hajotusreaktiota saman ajan puitteissa. Jos esiintyy tällaisia moninkertaisia hajotusreaktiosarjoja, joilla on ehkä erilaiset aktivoitumisenergiat, niin on todennäköistä, että hajotusprofiili vaihtelee huomattavasti lämpötilan mukaan.

Tällaisen monimutkaisuuden tuloksena proteiinit ovat usein epästabiileja ja kun ne hajoavat, niiden hajomisme-kanismin määrittäminen ja niiden hajoamisprofiilin karakterisointi, mukaan luettuna nopeutta rajoittavan reaktion identifiointi, ovat myös äärimmäisen monimutkaisia. Useinkaan ei ole suoraviivaista keinoa kemiallisen identiteetin määrittämiseksi ja hajoamistuotteiden määrän mittaamiseksi. Yleensä täyteaineilla on merkittävä vaikutus proteiinien stabiilisuuteen sekä fysikaaliselta että biokemialliselta kannalta ja aktiivisuusmääritysten kannalta ja niiden huolellinen valinta on formulointimallin tärkeä ja vaikea näkökohta.

Edellä esitetyt ongelmat koskevat erityisesti gamma-interferonia, joka on noin 15 000 D:n proteiini, jota edustaa noin 143 (146) aminohapon ketju ja jonka tiedetään olevan tunnetusti lämmönkestämätön ja taipuvainen kasautumiseen ja proteolyyttiseen hajoamiseen [Wetzel, R. L., et ai., "Unfolding and Inactivation" lähteessä Protein Design and the Development of New Therapeutics and Vaccines, toim. Hook, J.

I,· B. and Poste, G., Plenum Publishing Corp., 1990, sivu 79,;

Mulkerrin, M. G. ja Wetzel, R., Biochemistry 28, 6556 (1989) ] .

Yhteenveto keksinnöstä

Keksintö koskee menetelmää, jonka avulla aikaan saadaan stabiileja, vesipitoisia, farmaseuttisia koostumuksia, . jotka sisältävät farmaseuttisesti tehokkaan määrän gamma- interferonia, jota ei ole saatettu aikaisemmin kylmä-kuivaukseen, asetaattipuskurin, joka ylläpitää pH-arvon vaihtelualueella noin 4,0 - 6,0, ei-ioniaktiivisen deter- gentin, isotoonisuusaineen ja säilöntäaineen, joka on välit- 111442

O

tu fenolista, bentsyylialkoholista ja bentsetoniumhalidista, esim. -kloridista. Gamma-interferoni on läsnä edullisesti moninkertaisina annoksina ja säilyttää biologisen aktiivisuutensa ja fysikaalisen stabiilisuutensa ilman pakas-• tusta, edullisesti 2-8 °C:n lämpötilassa, vähintään noin kahden viikon ajan.

Keksintö kohdistuu menetelmään, jolle on olennaista se, että menetelmässä käytetään farmaseuttisesti tehokas määrä gamma-interferonia (IFN-γ), jota ei ole aikaisemmin saatettu kylmäkuivaukseen, siihen lisätään asetaattipusku-ria, joka ylläpitää pH-arvon alueella 4,0 - 6,0, ei-ioniak-tiivista detergenttia, isotoonisuusainetta ja säilöntäainetta, joka on valittu ryhmästä, joka koostuu fenolista, bentsyylialkoholista ja bentsetoniumhalidista.

Keksinnön mukaisesti valmistettua koostumusta annetaan potilaalle edullisimmin keuhkojen sisäisesti, jolloin hoidon tarpeessa olevalle potilaalle annetaan sisäänhengi-tyksen avulla aerosolihiukkasia, jotka sisältävät farmaseuttisesti tehokkaan määrän gamma-interferonia, jota ei ole saatettu aikaisemmin kylmäkuivaukseen, asetaattipuskurin, joka ylläpitää pH-arvon alueella noin 4,0 - 6,0, ei- ioniaktiivisen detergentin, isotoonisuusaineen ja säilöntäaineen, . joka on valittu fenolista, bentsyylialkoholista ja -bentsetoniumhalidista, jolloin hiukkasten koko on riittävän pieni tehden mahdolliseksi niiden tunkeutumisen keuhkorakkuloihin ja sieltä potilaan verivirtaan.

Lyhyt kuvaus piirroksista

Kuva 1 esittää erilaisten säilöntäaineiden vaikutusta rhuIFN-y:n (Actimmune®, Genentech, Inc., South Francisco, Kalifornia) biologiseen aktiivisuuteen säilöntäaineettomas-sa, nestemäisessä farmaseuttisessa koostumuksessa 25 °C:n lämpötilassa.

Kuvat 2A ja 2B esittävät fenolisäilöntäaineen eri konsentraatioiden vaikutusta rhuIFN-y:n biologiseen aktiivi- 6 111442 suuteen nestemäisessä farmaseuttisessa koostumuksessa 25 °C:n lämpötilassa.

Kuva 3 esittää bentsyylialkoholin (määrä 0,9 %) vaikutusta rhuIFN-y:n biologiseen aktiivisuuteen nestemäisissä valmisteissa, jotka sisältävät 1 mM sukkinaattia ja 5 mM sukkinaattia 25 °C:n lämpötilassa.

Kuva 4 esittää fenolisäilöntäaineen (määrä 0,4 %) vaikutusta 25 °C:n lämpötilassa rhuIFN-γιη biologiseen aktiivisuuteen nestemäisissä, farmaseuttisissa koostumukissa, jotka sisältävät 5 mM sukkinaattia ja 1 mM sukkinaattia.

Kuva 5 esittää fenolin vaikutusta rhuIFN-γιη biologiseen aktiivisuuteen valmisteessa, joka sisältää 1 mM sukkinaattia verrattuna valmisteeseen, joka sisältää 10 mM ase-taattia, 25 °C:n lämpötilassa.

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus

Yrittäessään tuottaa moniannos-IFN-y-valmistetta, jossa jäljellä olevat farmaseuttisesti tehokkaat IFN-y-an-nokset säilyvät ja pysyvät sopivina hoidollista käyttöä varten pitkän aikaa ensimmäisen käytön jälkeen, tämän keksinnön keksijät havaitsivat, että monet tunnetuista, farmaseuttisesti hyväksyttävistä säilöntäaineista eivät ole yhteensopivia muiden aineosien kanssa, joita käytetään tavanomaisesti nestemäisissä farmaseuttisissa IFN-y-valmisteissa ja että tämä yhteensopimattomuus tuottaa tulokseksi stabiilisuuden : ; dramaattisen vähenemisen. Erityisesti he havaitsivat, että erilaisten hoidollisesti hyväksyttävien säilöntäaineiden lisääminen teki kaupallisen, nestemäisen farmaseuttisen IFN-γ-valmisteen (Actimmune®, Genentech, Inc.) epästabiiliksi, mistä seurasi kasautumien muodostuminen ja biologisen aktiivisuuden häviö. Tämä keksintö on menestyksellisen tutkimuk-·.' sen tulos tuottaen menetelmän gamma-interferonin stabiilin, säilöntäainetta sisältävän, vesipitoisen farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseksi. Tässä patenttihakemuksessa termejä "gamma-interferoni", "interferoni-gamma" ja "IFN-γ" käytetään vaihtovuoroisesti ja ne viittaavat vaihtelevasti 7 111442 kaikkiin (ihmisen ja ei-humaanisen eläimen) IFN-y:n muotoihin, joiden tiedetään olevan biologisesti aktiivisia hyväksytyissä IFN-y-määrityksissä, jollaisia ovat viruksen replikaation estäminen sopivassa solulinjassa (ihmisen IFN-< γ:η tapauksessa enkefalomyokardiitin aiheuttavan viruksen replikaation estäminen ihmisen keuhkosyövän solulinjassa A549), luokan II antigeenien induktio, lämmön labiilisuus, muut viruksia estävät, kasvainten kasvua estävät ja immuunijärjestelmää säätelevät määritykset tai sellaisten vasta-aineiden neutralointi, jotka ovat immunoreaktiivisia IFN-γ:η suhteen, mutta ei IFN-a:n ja IFN-h:n suhteen, ja mainittujen termien on tarkoitus sisältää IFN-γ valmiissa muodossa, pro-, met- tai des(1-3)-muodossa (jota kutsutaan myös nimellä desCysTyrCys-IGN-γ), riippumatta siitä, onko gamma-interferoni saatu luonnollisesta lähteestä, syntetisoitu kemiallisesti tai tuoetttu yhdistelmä-DNA-teknologian avulla. Ihmisen rekombinantin IFN-γ:n (rhuIFN-γ) valmistuksen täydellinen kuvaus, mukaan luettuna sen cDNA ja aminohapposekvenssit, on esitetty edellä lainatuissa US-patenteissa, kuten esimerkiksi US-patentissa 4 762 791. Ihmisen rekombi-nantti IFN-γ, josta puuttuu Cys-Tyr-CYs, mukaan luettuna eri tavoin katkaistut johdannaiset, on julkaistu esimerkiksi eurooppalaisessa patenttijulkaisussa 146 354. Ei-humaaniset eläimen interferonit, mukaan luettuna IFN-γ, on julkaistu esimerkiksi eurooppalaisessa patenttijulkaisussa 88 622.

Termi sisältää tällaisten luontaisten (villin tyypin) interferonien eri tavoin glykosyloituneet muodot ja muut muunnelmat ja johdannaiset, riippumatta siitä, tunnetaanko ne alalla vai tulevatko ne saataville tulevaisuudessa. Esimerkkejä tällaisista muunnelmista ovat alleelit ja suunnatun muta-geneesin tuotteet, joissa jäännöksiä on poistettu, lisätty ja/tai korvattu (katso esim. eurooppalainen patenttijulkaisu 146 354, johon on viitattu edellä). Gamma-interferonilla tiedetään olevan kapea vaihtelualue isännän suhteen, joten pitäisi käyttää gamma-interferonia, joka on hoidettavan 8 111442 eläimen suhteen homologinen. Ihmisen hoidossa käytetään edullisesti sekvenssin desCysTyrCys-muunnelmaa, joka on esitetty US-patentissa 4 717 138 ja sen vastineessa, EP 77 670, ja mahdollisesti C-päätteistä muunnelmaa, josta viimeiset neljä aminohappojäännöstä on poistettu translaation jälkeen tapahtuvassa prosessissa.

Farmakologisessa mielessä tämän keksinnön yhteydessä termi "hoidollisesti tehokas määrä" gamma-interferonia viittaa määrään, joka on tehokas sellaisen patologisen tilan estämisessä tai hoidossa, jonka hoitamiseksi gamma-interferoni on tehokas. Esimerkkejä tällaisista tiloista ilman rajoitusta ovat erilaiset kasvaimet, mikrobi-infektiot, krooninen granulomatoosi, atooppinen ihottuma, verisuoniahtautu-ma, mukaan luettuna verisuonen uudelleen ahtautumisen hoito verisuonen uudelleen muovauksen ja/tai verisuonikirurgian jälkeen, hengitysvaikeusoireyhtymät (RDS), kuten aikuisen hengitysvaikeusoireyhtymä (ARDS) ja vastasyntyneen hengitys-vaikeusoireyhtymä, josta käytetään vaihtelevasti nimityksiä idiopaattinen RDS tai hyaliinimembraanitauti, allergiat, esim. astma, ja HIV-infektiooon liittyvät sairaudet, kuten opportunistiset infektiot, esim. Pneumocystis carinii'n aiheuttama keuhkokuume, tuberkuloosi jne.

Termi "farmaseuttinen koostumus" viittaa valmisteisiin, jotka ovat sellaisessa muodossa, että ne tekevät mah-: . dolliseksi aktiivisten aineiden biologisen aktiivisuuden yk siselitteisen tehokkuuden ja jotka eivät sisällä ylimääräisiä aineosia, jotka ovat myrkyllisiä kohteelle, jolle koostumus annetaan.

"Farmaseuttisesti hyväksyttävät" täyteaineet (kantajat, lisäaineet) ovat aineita, joita voidaan antaa kohtuullisessa määrin kohteena olevalle nisäkkäälle käytetyn aktii-visen aineen tehokkaan annoksen tuottamiseksi.

IFN-γ "säilyttää biologisen aktiivisuutensa" farmaseuttisessa koostumuksessa, jos biologinen aktiivisuus annettuna ajankohtana on noin 20 %:n sisällä biologisesta ak- 9 111442 tiivisuudesta, joka ilmeni farmaseuttinen koostumuksen val-mistushetkellä määritettynä standardimaisen IFN-y:n bio-aktiivisuusmäärityksen avulla, kuten esimerkiksi antiviraa-lisen A549-biomäärityksen avulla.

, IFN-γ "säilyttää fysikaalisen stabiilisuutensa" nes temäisessä farmaseuttisessa koostumuksessa, jos se ei osoita merkkejä kasautumisesta tarkasteltaessa sitä silmämääräisesti tai mitattuna kokoekskluusio-HPLC-menetelmän avulla.

pH-arvon vaihtelualue 4,0 - 6,0 on kuvattu aikaisemmin optimaalisena IFN-y:n stabiilisuuden kannalta vesiliuoksessa. Lisäksi on osoitettu, että varastoitaessa valmisteita noin 5 °C:n lämpötilassa tai sitä suuremmassa lämpötilassa, nestemäisillä, säilöntäaineettomilla valmisteilla, jotka sisältävät aikaisemmin kylmäkuivaamatonta rhuIFN-y:aa, on huomattavasti parempi stabiilisuus kuin kylmäkuivatuilla rhuIFN-Y-valmisteilla ja erityisesti, että nestemäisissä valmisteissa kasautuman muodostuminen on huomattavasti vähäisempää (katso esim. US-patentti 5 152 265, julkaistu 29. syyskuuta, 1992).

Nyt on havaittu, että säilöntäaineen (antimikrobisen aineen) lisääminen IFN-y.n nestemäiseen valmisteeseen, jossa pH-arvoa ylläpitää sukkinaattipuskuri, tuottaa tulokseksi ei-toivotun kasautumien muodostumisen ja proteiini osoittaa nopeata aktiivisuuden häviötä tällaisissa liuoksissa. Yri- : tettäessään nimetä syitä säilöntäainetta sisältävien liuos- • « ten vähäisempään stabiilisuuteen, tämän keksinnön keksijät ovat havainneet, että kasautumien muodostuminen ei johtunut gamma-interferonin ja käytettyjen säilöntäaineiden yhteensopimattomuudesta, vaan pikemminkin sen aiheutti sukkinaatti-puskurin ja tutkittavien säilöntäaineiden samanaikainen läs-näolo. Vaikka kasautumien muodostumisen pohjalla olevien reaktioiden täsmällistä luonnetta ei ole tiedetty eikä hajoamistuotteita ole eristetty, yllättäen havaittiin, että hajoaminen voitiin välttää ja valmistaa stabiileja, vesipitoisia farmaseuttisia koostumuksia korvaamalla sukkinaattipus- 10 111442 kuri asetaattipuskurilla, joka kykenee ylläpitämään pH-arvoa halutulla vaihtelualueella.

Ensimmäisessä kokeessa tutkittiin erilaisten säilöntäaineiden vaikutusta rhuIFN-y:n biologiseen aktiivisuuteen Actimmune'ssa (rhlFN-y-lb, Genentech, Inc.)· IFN-γ dia-lysoitiin mielenkiinnon kohteena olevaan puskuriin. IFN-y:n konsentraatio säädettiin 0,2 mg:aan/ml. Säilöntäaineet lisättiin ja sekoitettiin, kunnes ne olivat liuenneet. Siirrettiin 1 ml:n näytteet 3 ml;n Tyypin I lasipulloihin, joita varastoitiin 5 °C:n ja 25 °C:n lämpötilassa. Jaksottain valittiin lasipullot (yksi lasipullo/ajankohta/varastointiläm-pötila) ja analysoitiin. Analyyseihin sisältyivät SDS-PAGE, ELISA, antiviraalinen A549-biomääritys [katso esim. julkaisu Fish, E. N. et ai., Drug Design and Delivery 2, 191 - 206 (1988)] ja harvemmin toistuvasti käänteisfaasi-HPLC, ioni-vaihto- ja kokoekskluusiokromatografia. Vain biologista aktiivisuutta ja SDS-PAGE:a koskevat tiedot selostetaan, koska ne ovat herkimmät muutosten heijastamisessa. Todelliset kokeelliset tiedot, jotka esitetään, saatiin 25 °C:n lämpötilassa (joudutetut stabiilisuustutkimukset), koska 5 °C:n lämpötilassa muutosten huomaaminen olisi vaatinut merkittävästi pitemmän ajan.

Kuten kuvassa 1 on esitetty, kun säilöntäaineena lisättiin 1 % bentsyylialkoholia tai 0,4 % fenolia, se aiheutin ti IFN-y:n biologisen aktiivisuuden dramaattisen vähenemisen 25 °C:n lämpötilassa verrattuna säilöntäaineettomaan kontrolliin ja valmisteisiin, jotka sisälsivät kaksi eri bentse-toniumkloridin konsentraatiota.

Kuva 2A esittää fenolin eri konsentraatioiden vaikutusta rhuIFN-y:n (Actimmune®, Genentech, Inc.) biologiseen aktiivisuuteen nestemäisessä valmisteessa 25 °C:n lämpötilassa. Vaikka IFN-γ:n biologinen aktiivisuus oli tyydyttävä liuoksissa, joissa säilöntäaineena käytettiin 0,1 % ja 0,2 % fenolia, kasautumien muodostuminen lisääntyi näissä liuok- 11 111442 sissa tutkittuna natriumdodekyylisulfaattipolyakryyliamidi-geelielektroforeesin (SDS-PAGE) avulla (kuva 2B).

Kuva 3 esittää bentsyylialkoholin (määrä 0,9 %) vaikutusta rhuIFN-y:n biologiseen aktiivisuuteen 25 °C:n lämpö-* tilassa valmisteissa, jotka on puskuroitu 1 mM sukkinaatilla ja 5 mM sukkinaatilla. Tosiasia, että bioaktiivisuuden häviö on pienempi valmisteissa, jotka sisältävät pienemmän kon-sentraation sukkinaattia, näyttää osoittavan, että suk-kinaattipuskurin läsnäolo on ainakin osittain syynä stabii-lisuusongelmiin, jotka tavattiin säilöntäainetta sisältävissä rhuIFN-y-liuoksissa. Tätä johtopäätöstä tukevat tulokset, jotka on esitetty kuvassa 4. IFN-y:n biologisen aktiivisuuden häviö oli vähemmän dramaatttista vesiliuoksissa, joiden pH:ta pidettiin arvossa 5,0 1 mM sukkinaatin avulla kuin liuoksissa, jotka sisälsivät 5 mM sukkinaattia.

Fenolin (määrä 0,4 %) vaikutus rhuIFN-y:n biologiseen aktiivisuuteen tutkittiin sitten nestemäisissä valmisteissa, jotka sisälsivät 1 mM sukkinaattipuskuria ja 10 mM asetaat-tipuskuria vastaavasti. Kuten kuvassa 5 on esitetty, asetaa-tilla puskuroidun liuoksen stabiilisuus, arvioituna IFN-y:n biologisen aktiivisuuden avulla, oli oleellisesti sama kuin säilöntäaineettomilla kontrolliliuoksilla, jotka oli puskuroitu sukkinaatilla ja asetaatilla vastaavasti, eikä kasautumia havaittu silmämääräisen arvioinnin tai SDS-PAGE-elekt- ·' roforeesin avulla.

• * * Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetut farmaseuttiset koostumukset sisältävät: a) gamma-interferonin, jota ei ole aikaisemmin saatettu kylmäkuivaukseen; b) astetaattipuskurin, joka kykenee ylläpitämään pH-arvoa välillä noin 4-6 (proteiinin maksimaalisen stabiili-suuden pH-vaihtelualue liuoksessa); c) ei-ioniaktiivisen detergentin ensisijaisesti proteiinin stabiloimiseksi sekoittamisen aiheuttamaa kasautumista vastaan; 12 111442 d) isotoonisuusaineen; e) säilöntäaineen, joka on valittu ryhmästä, joka koostuu fenolista, bentsyylialkoholista ja bentsetoniumhali-dista, esim. -kloridista, ja f) vettä.

Ei-ioniaktiiviset detergentit (pinta-aktiiviset aineet) voivat olla esimerkiksi polysorbaatteja [esim. po-lysorbaatti (Tween) 20, 80, jne] tai poloksameereja (esim.

poloksameeri 188). Ei-ioniaktiivisten pinta-aktiivisten aineiden käyttö tekee mahdolliseksi sen, että valmiste voidaan saattaa leikkauspintarasitusten kohteeksi aiheuttamatta proteiinin denaturoitumista. Lisäksi tällaista pinta-aktiivista ainetta sisältäviä valmisteita voidaan käyttää aerosolilait-teissa, kuten laitteissa, joita käytetään annosteltaessa lääkettä keuhkoihin ja neulattomissa suihkuinjektoreissa (katso esim. EP-patentti 257 956).

Isotoonisuusaineet ovat läsnä tämän keksinnön nestemäisten koostumusten isotoonisuudeh varmistamiseksi ja niihin sisältyvät polyhydriset sokerialkoholit, edullisesti trihydriset tai korkeammat sokerialkoholit, kuten glyserii-ni, erytritoli, arabitoli, ksylitoli, sorbitoli ja mannito- li. Näitä sokerialkoholeja voidaan käyttää yksin tai yhdistelmänä. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää natriumkloridia tai muita sopiva epäorgaanisia suoloja liuosten muuttamisek-:: si isotoonisiksi.

• · I

Asetaattipuskuri voi olla esimerkiksi etikkahappo-natriumasetaattiseos, etikkahappo-natriumhydroksidiseos jne.

Tämän keksinnön nestemäisen valmisteen pH-arvo puskuroidaan vaihtelualueelle noin 4,0 - 6,0, edullisesti 4,5 - 5,5, ja edullisimmin arvoon noin 5.

.* Säilöntäaineet, fenoli, bentsyylialkoholi ja bentse- toniumhalidit, esim. -kloridi, ovat tunnettuja antimikrobi-sia aineita.

Edullisessa suoritusmuodossa tämän keksinnön nestemäinen farmaseuttinen koostumus sisältää seuraavat aineosat: 13 111442 IFN-γ 0,1 - 2,0 mg/ml

natriumasetaatti (pH-arvo 5,0) 5 - 100 mM

Tween 20 0,1 - 0,01 paino-% fenoli 0,05 - 0,4 paino-% mannitoli 5 paino-% vettä ruisketta varten, USP 100 %:iin saakka jolloin prosenttimäärät perustuvat koostumuksen painoon. Fenoli voidaan korvata 0,5 - 1,0 paino-%:11a bentsyy-lialkoholia ja mannitoli voidaan korvata 0,9 paino-%:11a natriumkloridia.

Edullisimmin koostumukset sisältävät: IFN-γ 0,1 - 1,0 mg/ml

natriumasetaatti (pH-arvo 5,0) 10 mM

Tween 20 0,01 paino-% fenoli 0,2 % mannitoli 5 %.

Fenoli voidaan korvata 0,75 paino-%:11a bentsyylial-koholia ja mannitoli 0,9 paino-%:11a natriumkloridia.

Säilöntäainetta sisältävät nestemäiset valmisteet sisältävät edullisesti IFN-γ:n hoidollisen tehokkaan määrän moninkertaisia annoksia. Ottaen huomioon tämän polypeptidin kapea vaihtelualue isännän suhteen ihmispotilaiden hoitamiseksi edullisia ovat nestemäiset valmisteet, jotka sisältävät ihmisen gamma-interferonia, edullisemmin luontaisen sek-: venssin omaavaa ihmisen gamma-interferonia. Biologisen vas teen muuntajana IFN-γ käynnistää laajan valikoiman aktiivisia vaikutuksia laajaan valikoimaan solutyyppejä ihmisellä ja erilaisilla ei-humaanisilla nisäkäslajeilla. Hoidollisesti tehokas annos vaihtelee tietysti riippuen sellaisista tekijöistä kuin hoidettavasta patologisesta tilasta (mukaan V luettuna estäminen), potilaan iästä, painosta, yleisestä lääketieteellisestä tilasta, lääketieteellisestä menneisyydestä jne ja sen määrittäminen kuuluu hoitavan lääkärin taitoihin. Tehokas annos on yleensä vaihtelualueella noin 0,001 - 1,0 mg/kg, edullisemmin noin 0,01 - 1 mg/kg, edullisimmin 14 111442 noin 0,01 - 0,1 mg/kg. Tällaisissa valmisteissa huIFN-γ osoittaa edullisesti spesifistä aktiivisuutta, joka on suuruusluokaltaan noin 2 x 107 U/mg proteiinia tai suurempi testattuna A549-soluilla enkefalomyokardiitti-virusta vastaan. Pitäisi olla ymmärrettävää, että endotok-siinikontaminaatio tulisi pitää minimaalisesti turvallisella tasolla, esimerkiksi sen tulisi olla alle 5 ng/mg proteiinia. Lisäksi annettavaksi ihmiselle nestemäisten valmisteiden pitäisi täyttää vaatimukset, jotka koskevat steriili-syyttä, pyrogeenisyyttä, yleistä turvallisuutta ja puhtautta, kuten FDA Office and Bilogics -standardit edellyttävät .

Valmisteet annetaan edullisesti potilaalla toistuvina laskimonsisäisinä (i.v.), ihonalaisina (s.c.) ja lihaksensisäisinä (i.m.) ruiskeina, tai aerosolivalmisteina, jotka ovat sopivia lääkkeen vapauttamiseksi nenänsisäisesti tai keuhkojen sisäisesti (lääkkeen vapauttamiseksi keuhkojen sisäisesti, katso EP-patentti 257 956).

Kroonista granulomatoosia sairastavien potilaiden hoitamiseksi suositeltu annos on 50 pg/m2 (1,5 milj. U/m2) potilaiden tapauksessa, joiden kehon pinta-ala on suurempi kuin 0,5 m2, ja 1,5 pg/kg/annos potilaiden tapauksessa, joiden kehon pinta-ala on 0,5 m2 tai pienempi. Ruiske suositellaan annettavaksi ihonalaisesti kolme kertaa viikossa.

\\ Vaikeata vammaa sairastavien potilaiden infektion ja kuolleisuuden vähentämiseksi annos, jossa on 100 pg rhuIFN-gammaa, voidaan antaa ihonalaisesti kerran päivässä. Infektioihin, joita voidaan estää tai hoitaa tällä tavoin, sisältyvät keuhkokuume, bakteerien esiintyminen veressä, vat-sansisäinen tai rintakehänsisäinen infektio, suuri haavain-.* fektio, vektikuliitti/aivokalvontulehdus jne.

Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä valmistetut stabiilit, vesipitoiset koostumukset sisällytetään edullisesti lasipulloihin sisältäen enintään noin' 30 IFN-y:n hoidollisesti tehokasta annosta. IFN-y:n biologinen aktiivisuus 15 111442 säilyy edullisesti noin 20 %:n sisällä biologisesta aktiivisuudesta, joka ilmeni lääkkeen ensimmäisen käytön ajankohtana, vähintään noin '14 päivää, edullisemmin vähintään noin 200 päivää ensimmäisen käytön jälkeen.

Kaikki lainaukset patenttimäärittelyssä ja niissä lainatut viitteet liitetään tähän nimenomaisesti viittauksena.

Vaikka edellä esitetty viittaa erityisiin edullisiin suoritusmuotoihin, on ymmärrettävää, että tämä keksintö ei ole niin rajoitettu. Alan ammattimiehille tulee mieleen, että erilaisia muunnelmia voidaan tehdä julkaistuihin suoritusmuotoihin poikkeamatta keksinnön yleisestä käsitteestä. Kaikki tällaiset muunnelmat on tarkoitettu tämän keksinnön piiriin sisältyviksi.

• < • · < ’ #

Claims (11)

111442

1. Menetelmä stabiilin, vesipitoisen farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että menetelmässä käytetään farmaseuttisesti tehokas määrä gamma-interferonia (IFN-γ), jota ei ole aikaisemmin saatettu kylmäkuivaukseen, siihen lisätään asetaattipuskuria, joka ylläpitää pH-arvon alueella 4,0 - 6,0, ei-ioniaktiivista detergenttia, isotoonisuusainetta ja säilöntäainetta, joka on valittu ryhmästä, joka koostuu fenolista, bentsyylialkoho-lista ja/tai bentsetoniumhalidista.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että siinä käytettävä IFN-γ on ihmisen IFN-γ.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että siinä käytettävä IFN-γ on desCysTyrCys-IFN-γ.

4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että siinä käytettävä IFN-γ on desCys-TyrCys-IFN-γ, josta puuttuu neljä C-päätteen aminohappoa.

5. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että siinä käytettävän IFN-γ:n spesifinen aktiivisuus on vähintään 2x10 U/mg.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmään lisätään vähintään kaksi hoidollisesti tehokasta annosta ihmisen gamma-interferonia. 17 111442

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmään lisätään 2-30 hoidollisesti tehokasta annosta ihmisen gamma-interferonia. A

8. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmässä käytettävä ei-ioniaktiivinen detergentti on polysorbaatti.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmässä käytettävä isotoonisuusaine on polyhydrinen sokerialkoholi.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmässä käytettävä polyhydrinen sokerialkoholi on mannitoli.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmässä käytettävä säilöntäaine on fenoli tai bentsyylialkoholi. • * i « • m 111442