PL171023B1 - Sposób wytwarzania nowych induktorów cytokin - Google Patents

Abstract

1. Sposób wytwarzania nowych induktorów cytokin, będących N-podstawionymi pochodnymi związków aminokwasowych o wzorze ogólnym Ri-NH-R2, w którym Ri oznacza rodnik Ci-1-desoksy-2-keto, pochodzący od prostego cukru, oligo- lub niskocząsteczkowego poli-sacharydu, o budowie łańcuchowej lub pierścieniowej, zaś R2 oznacza związany z grupą aminową rodnik aminokwasu lub krótkiego peptydu, w reakcji związku aminokwasowego ze związkiem należącym do kategorii cukrów prowadzonej w podwyższonej temperaturze i ewentualnie pod ciśnieniem, znamienny tym, że jako substraty stosuje się co najmniej jeden aminokwas i/lub krótki peptyd i co najmniej jeden prosty cukier, oligo- i/lub polisacharyd, aminokwas lub krótki peptyd podstawia się przy grupie aminowej prostym cukrem, oligo- lub poli-sacharydem na drodze kondensacji w stężonym roztworze wodnym, ewentualnie z dodatkiem niższego alkoholu i otrzymany N-glikozyd poddaje się przegrupowaniu Amadoriego prowadząc przemianę aż do wystąpienia pomarańczowo-brązowego zabarwienia, po czym całość odparowuje się do sucha pod obniżonym ciśnieniem uzyskując produkt lub mieszaninę produktów o wzorze ogólnym R i-NH-R2, w którym wszystkie symbole mają wyżej podane znaczenie, a następnie - ewentualnie - z mieszaniny poreakcyjnej usuwa się nadmiar produktów wejściowych lub wyodrębnia się produkt końcowy i ewentualnie poddaje się wzbogacaniu chromatograficznemu na sorbentach lub kationitach zbierając frakcje specyficzne, redukujące żelazicyjanek potasowy, przy czym korzystnie pożądane związki wyjściowe stosuje się w postaci ekstraktów z substancji naturalnych lub w postaci mieszanin o tym samym składzie co ekstrakty takich substancji naturalnych.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych induktorów cytokin.

Cytokiny są białkami hormonopodobnymi i odgrywają istotną rolę praktycznie we wszystkich reakcjach immunologicznych oraz procesach regulacyjnych odpowiedzialnych za utrzymanie homeostazy w organizmach żywych.

Badania nad systemami immunologicznymi doprowadziły do wielu cennych odkryć i pozwoliły na opracowanie licznych sposobów wytwarzanie substancji immunotropowych, pochodzenia naturalnego, oraz syntetycznych, w tym otrzymywania metodami inżynierii genetycznej interferonów, które stanowią najcenniejsze dotychczas substancje przydatne w terapii chorób wywoływanych wadami systemów odpornościowych. Niestety, wysoki koszt pozyskiwania oraz ograniczona przyswajalność interferonów podawanych w dawkach terapeutycznych powodują, że i ten specyfik nie spełnia pokładanych w nim nadziei.

Inne znane leki immunoregulacyjne także wykazują szereg niekorzystnych cech, do których najczęściej zaliczyć można: znaczne skomplikowanie technologii ich wytwarzania, a często też toksyczność i wywoływanie niekorzystnych efektów ubocznych.

Obecnie, nieoczekiwanie stwierdzono, że nowymi induktorami cytokin są związki, wytwarzane sposobem według wynalazku.

Sposób wytwarzania nowych induktorów cytokin, będących N-podstawionymi pochodnymi związków aminokwasowych o wzorze ogólnym R1-NH-R2, w którym R1 oznacza rodnik Ct-ł-desoksy-2-keto, pochodzący od prostego cukru, oligo- lub niskocząsteczkowego polisacharydu, o budowie łańcuchowej lub pierścieniowej, zaś R2 oznacza związany z grupą aminową rodnik aminokwasu lub krótkiego peptydu, według wynalazku polega na tym, że jako substraty stosuje się co najmniej jeden aminokwas i/lub krótki peptyd i co najmniej jeden prosty cukier, oligo- i/lub polisacharyd, aminokwas lub krótki peptyd podstawia się przy grupie aminowej prostym cukrem, oligo- lub polisacharydem na drodze kondensacji i otrzymany N-glikozyd poddaje się przegrupowaniu Amadoriego uzyskując produkt o wzorze ogólnym R1-NH-R2, w którym wszystkie symbole mają wyżej podane znaczenie, a następnie - ewentualnie - z mieszaniny poreakcyjnej usuwa się nadmiar produktów wyjściowych lub wyodrębnia się produkt końcowy i ewentualnie poddaje się wzbogacaniu chromatograficznemu na sorbentach lub kationitach zbierając frakcje specyficzne, redukujące żelazicyjanek potasowy, przy czym korzystnie pożądane związki wyjściowe stosuje się w postaci ekstraktów z substancji naturalnych lub w postaci mieszanin o tym samym składzie co ekstrakty takich substancji naturalnych.

W sposobie według wynalazku korzystnymi substratami są cukry proste, oligo- i/lub polisacharydy o konfiguracji D oraz aminokwasy i/lub krótkie peptydy o konfiguracji L. Korzystnie stosuje się jako związek wyjściowy co najmniej jeden prosty cukier należący do grupy obejmującej: glukozę, ksylozę, galaktozę, ramnozę, fruktozę, mannozę, 6-deoksy-glukozę, glukosaminę i galaktozoaminę, a w szczególności mieszaninę zawierającą glukozę, ksylozę, galaktozę, ramnozę i fruktozę. Z kolei, korzystnie także jako związek wyjściowy stosuje się co najmniej jeden aminokwas lub krótki peptyd należący do grupy obejmującej: serynę, glicynę, histydynę, argininę, alaninę, kwas asparginowy, kwas glutaminowy, fenylalaninę, treoninę, cysteinę, cystynę, metioninę, hydroksyprolinę, tryptofan, prolinę, tyrozynę, walinę, izoleucynę, leucynę, lizynę i/lub krótkie peptydy utworzone z wymienionych aminokwasów w dowolnej kombinacji, a w szczególności mieszaninę seryny, glicyny, histydyny, argininy, alaniny, proliny, tyrozyny, waliny, izoleucyny, leucyny i lizyny.

Zgodnie z obecnym wynalazkiem wskazane reakcje prowadzi się w podwyższonej temperaturze, korzystnie powyżej 60°C, ewentualnie pod ciśnieniem, w stężonym roztworze wodnym, ewentualnie z dodatkiem niższego alkoholu, aż do wystąpienia pomarańczowo-brązowego zabarwienia, po czym całość odparowuje się do sucha pod obniżonym ciśnieniem i ewentualnie poddaje wzbogacaniu chromatograficznemu na sorbentach lub kationitach zbierając frakcje specyficzne, redukujące żelazicyjanek potasowy. Gdy stosowany jako substrat aminokwas lub

171 023 peptyd jest związkiem dwukarboksylowym stosuje się dodatkowo kwaśny węglan sodu w stosunku równomolowym względem wziętych do reakcji dwukarboksylowych aminokwasów i/lub peptydów. Korzystnie substraty cukrowe i aminokwasowe stosuje się w stosunku molowym

2:1 do 1:1, korzystnie w stosunku 1,5:1.

Szczególnie korzystnie, wskazanym reakcjom poddaje się mieszaninę cukrów prostych oraz mieszaninę aminokwasów o składzie i wzajemnych stosunkach molowych pomiędzy składnikami, właściwych bioaktywnym ekstraktom torfowym, ewentualnie z dodatkiem pierwiastków śladowych w ilości właściwej takim ekstraktom.

Związki wytwarzane sposobem według wynalazku mają cenne właściwości farmaceutyczne i mogą stanowić składnik aktywny kompozycji farmaceutycznych.

Związki wytwarzane sposobem według wynalazku mogą także znajdować zastosowanie w kosmetyce.

Stwierdzono, że wiązania chemiczne i strukturalna charakterystyka związków wytwarzanych sposobem według wynalazku są odpowiedzialne za ich biologiczną aktywność tak, że indywidualny charakter Rodników R1 i R2 nie mają decydującego znaczenia. Stwierdzono, jednak, że choć wszystkie związki mają zadowalającą aktywność biologiczną, silniejszy wpływ na jej poziom ma część aminokwasowa niż cukrowa.

W sposobie według wynalazku, obie podstawowe reakcje zachodzą stosunkowo łatwo, produkt pośredni jednak podlega hydrolizie, konieczny jest zatem nadmiar jednego z reagentów. Z kolei produkt przegrupowania Amadoriego jest stosunkowo mało podatny na, ale jednocześnie względnie szybko podlega destrukcji. Stąd zasadniczo proces według wynalazku przerywa się w momencie wystąpienia zabarwienia mieszaniny reakcyjnej, które świadczy o obecności produktów degradacji związków, które uległy już przegrupowaniu Amadoriego. Taka mieszanina poreakcyjna wykazuje zadowalający poziom aktywności biologicznej, bowiem proces rozpadu pożądanych związków nie jest jeszcze zaawansowany. Aktywność biologiczna otrzymywanych produktów oznaczana jest metodami opisanymi w dalszej części opisu.

Wynalazek bliżej objaśniają następujące przykłady realizacji służące ilustracji wynalazku.

Przykład I. W kolbce wyparki rotacyjnej, o pojemności 25 ml, zanurzonej w łaźni wodnej umieszczono:

1,47 g 00,0 1 M) ) kwasu L-glutaminowego

0,84 g 1M)NaHCO₃

0,91 g D-ghikozy

0,91 g gaaaktozy oazz

3,00 ml wody redestyoowanej.

Mieszaninę ogrzano do 80°C, odparowano pod obniżonym ciśnieniem odbierając 1,5 ml skroplonej wody, a następnie pod ciśnieniem atmosferycznym ogrzewano w temperaturze 80-85°C przez 120 minut do wystąpienia pomarańczowego zabarwienia roztworu. Następnie mieszaninę odparowano do sucha pod obniżonym ciśnieniem. Otrzymano pomarańczową substancję, dającą się łatwo sproszkować po wysuszeniu. Substancję tę zachowano do badań biologicznych oznaczając ją symbolem D-10.

Przykład II. W kolbce wyparki rotacyjnej, o pojemności 25 ml, zanurzonej w łaźni wodnej umieszczono:

1,33 g M) kwam Ltaspaaaginowego

0,84 g (0,1 1 M) NHICOs

0,91 g D-glu^l^i^i^y

0,91 g gataktozy oazz

3,00 ml wody redestylowanej.

Mieszaninę ogrzano do 80°C (mieszając całość przez rotację), odparowano pod obniżonym ciśnieniem odbierając 1,5 ml skroplonej wody, a następnie pod ciśnieniem atmosferycznym ogrzewano w temperaturze 80-85°C do wystąpienia jasno-pomarańczowego zabarwienia roztworu, co nastąpiło po około 60 minutach. Następnie pod zmniejszonym ciśnieniem mieszaninę reakcyjną odparowano do sucha. Otrzymano żółto-pomarańczową substancję, dającą się spro171023 szkować po wysuszeniu. Substancję tę zachowano do badań biologicznych oznaczając ją symbolem D-ll.

Przykład III. W kolbce wyparki rotacyjnej, o pojemności 25 ml, zanurzonej w łaźni wodnej umieszczono:

1,05 g (0,01 Mt) kwasu L-seryny

0,91 g D-glukozy

0,91 g gal^ctozy oraz

2,50 ml wody redestyoowanej.

Mieszaninę ogrzewano w łaźni o temperaturze 85-92°C z jednoczesnym mieszaniem (przez rotację). Po około 100 minutach ogrzewania roztwór zabarwił się na kolor pomarańczowy. Zmniejszono ciśnienie i całość odparowano do sucha. Produkt tworzył na ściankach kolbki pomarańczową przezroczystą warstwę. Po zeskrobaniu ze ścianek dał się łatwo sproszkować. Otrzymaną substancję zachowano do badań biologicznych oznaczając ją symbolem D-12.

Przykład IV. W kolbce wyparki rotacyjnej, zanurzonej w łaźni wodnej umieszczono:

0,66 g (0,005 Mt) kwasu D-asparaginowego

0,42 g (0,005 Mt) NaHCO₃

0,45 g D-gl ukoz.y

0,45 g cJ:lla^ίtz^^y oraz,

3,00 ml wody rcdestylowancj.

Mieszaninę ogrzano do 80°C, a następnie odparowano pod obniżonym ciśnieniem zbierając 1,5 ml wody, po czym pod ciśnieniem atmosferycznym kontynuowano ogrzewanie w temperaturze 85°C. Po około 60 minutach ogrzewania i wystąpieniu pomarańczowego zabarwienia roztworu obniżono ciśnienie i odparowano roztwór do sucha. Pod koniec odparowywania wprowadzono dwa razy po 10 ml odwodnionego alkoholu, za każdym razem odparowując całkowicie w celu usunięcia resztkowej wilgoci. Suchą substancję sproszkowano. Zachowano ją do dalszych badań oznaczając ją symbolem D-13.

Przykład V. W celu otrzymania - na drodze syntetycznej - odpowiednika biologicznie aktywnej frakcji pewnego ekstraktu torfu naturalnego, w kolbce wyparki rotacyjnej umieszczono:

20,4 mg	L^^.strrj/ny/
35,8 mg	L-giicyny
35,8 mg	L-histydyny
132,0 mg	L-argininy
180,0 mg	L-alaniny
360,0 mg	L^^f^^Tliniy
216,0 mg	L-tyrozyny
160,0 mg	L-waHny
68,0 mg	L--izoleucy ny
72,0 mg	L^-leucyny
780,0 mg	L-lizyny
2000,0 mg	D-glukozy
1000,0 mg	D-k.sylozy
400,0 mg	galaktozy
100,0 mg	D-ramnozy
100,0 mg	D-fruktozy oraz
6,0 ml	wody redesttyowanej

Całość mieszano przez rotację i ogrzewano pod obniżonym ciśnieniem przez 45 minut, przy czym temperatura łaźni wodnej wzrastała w tym czasie od 77°C do 86°C. W trakcie tego ogrzewania oddestylowano około 3 ml wody i uzyskano całkowite rozpuszczenie substratów.

Następnie otrzymany roztwór ogrzewano pod ciśnieniem atmosferycznym w temperaturze 85-86°C przez około 30 minut. W tym czasie roztwór szybko zabarwił się na kolor czerwonobrunatny. Obniżono ciśnienie i ogrzewano nadal w temperaturze 84°C z jednoczesnym odparowywaniem rozpuszczalnika. Pod koniec odparowywania dwa razy wprowadzono po 15 ml

171 023 odwodnionego etanolu i całość za każdym razem odparowano do sucha. Kolbkę z produktem umieszczono na 18 godzin w eksykatorze nad chlorkiem wapnia, a następnie sproszkowano. Otrzymano 4,5 g suchej substancji, którą oznaczono symbolem EK2-S. 4 g tego produktu rozpuszczono w 20 ml wody destylowanej i wprowadzono do kolumny chromatograficznej o wymiarach 25 mm x 330 m wypełnionej sorbentem AMBERLIT XAD-2, analytical grade i eluowano wodą destylowaną z prędkością 0,4 ml/min. Zbierano frakcje o objętości 10 ml, w sumie - 450 ml.

Frakcje o kolejnych numerach 11 do 13, które dawały z pewnym opóźnieniem reakcję barwną z żelazicyjankiem potasu, połączono i odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Reakcja redukcji żelazicyjanku potwierdziła obecność w produkcie związków, które uległy przegrupowaniu Amadoriego. Zebraną suchą substancję zachowano do badań biologicznych i oznaczono ją symbolem EK2-S-11.

Przykład VI. W kolbce wyparki rotacyjnej zanurzonej w łaźni wodnej umieszczono: 1,33 g (0,01 Mi) kwasu L-asparaginowego

0,84 g (0,01 M)NiHCO₃

10,00 g dekstranu hydrolizowanego o średnim wagowo ciężarze cząsteczkowym 3000 daltonów oraz

10,0 ml wody redestylowanej.

Całość ogrzewano pod zmniejszonym ciśnieniem przy temperaturze 70°C do zupełnego rozpuszczenia, oddestylowując w tym czasie około 3 ml wody (czas ogrzewania wynosił około 30 minut). Kolbkę z roztworem (pod luźnym przykryciem) umieszczono w sterylizatorze parowym i ogrzewano pod ciśnieniem przy temperaturze 121°C przez 40 minut. Po ostudzeniu, żółto-pomarańczowy roztwór rozcieńczono dodając 15 ml wody, sklarowano przez odwirowanie i wysuszono w suszarce rozpyłowej (rozpylanie dyszowe, temperatura powietrza wlotowego 160°C, powietrza odlotowego 85°C). Otrzymano 10,5 g jasno-beżowego proszku łatwo rozpuszczalnego w wodzie. Obecność w produkcie związków, które przeszły przegrupowanie Amadoriego potwierdzono testem redukcji żelazicyjanku potasowego oraz chromatograficznie. W testach biologicznych opisanych w dalszej części opisu otrzymana substancja wykazywała aktywność immunotropową taką jak analogiczne produkty otrzymane z substratów monocukrowych.

Przykład VII. W kolbce stożkowej umieszczono:

5,0 g dekstranu o wagowo-średnim ciężarze cząsteczkowym około 5000 daltonów

1,1 g L-proliny oraz

4,0 πύ wody redestylowanej.

Całość doprowadzono do jednorodnej postaci przez mieszanie, po czym naczynie z roztworem umieszczono w sterylizatorze parowym i ogrzewano pod ciśnieniem w temperaturze 110°C przez 45 minut. Otrzymany przezroczysty pomarańczowy syrop rozcieńczono dodając 20 ml wody redestylowanej i odwirowano do sklarowania. Następnie wysuszono rozpyłowo. Otrzymano 5,3 g proszku łatwo rozpuszczalnego w wodzie. Oznaczona aktywność immunotropową zbliżona była do poprzednich prób.

Celem określenia aktywności biologicznej, immunotropowej, związków wytwarzanych sposobem według wynalazku, wykonano następujące oznaczenia:

1. Odsetek spel nocytów two rząeych rozety E - metode Bdąha i Dardenne (Ce 11. Immunol. 3. 1-16, 1972),

2. Ilość splpcocytów produkujących przeciwciała hemolityczne typu IgM - metodą Jernego w modyfikacji Mishella i Duttona (J. Exp. Med. 126,423-442, 1967) oraz

3. Miano przeciwciał ZemaglutacyjcycZ 19S+7S i 7S - metodą Adlera (J. Immunol. 95, 26-38, 39-47, 1965) przy użyciu mikropłytek (J. Immunopharmacol. 4, 43-52, 1982).

Do badań użyto myszy rmmunizowacych szczepu wsobnego Balb/c obu płci w wieku 8-10 tygodni. Myszy immunizuje się przez dootrzewnowe podanie 0,2 ml 10% zawiesiny erytrocytów owcy SRBC, tj. 4 x 10⁸ komórek. W tym celu erytrocyty poddaje się utrwaleniu w sterylnym płynie Alsevera, którego skład jest następujący:

glukoza cytrynian sodu chlorek sodu kwas cytrynowy woda destylowana

2,05 0,8 0,42 0,05 ad 100,0 ml.

Do tak przygotowanego sterylnego płynu Alsevera wprowadza się pobraną w jałowy sposób krew owcy w stosunku 1:1 i pozostawia na co najmniej trzy doby w temperaturze +4°C. Ustabilizowane w ten sposób erytrocyty pobiera się sterylną pipetą i wprowadza z kolei do zbuforowanego roztworu fizjologicznego PBS celem odpłukania. Erytrocyty płucze się w PBS dwukrotnie, wirując przez 10 min. przy 2000 obr/min. Z odpłukanych krwinek sporządza się 10% zawiesinę w PBS, która służy do immunizacji myszy.

Badaną substancję podaje się czterokrotnie dootrzewnowo lub doustnie po 0,2 ml/mysz, przy czym pierwszą dawkę podaje się na 2 godziny przed immunizacją myszy SRBC, a trzy kolejne w odstępach 24-godzinnych.

Badaną substancję podaje się w dawkach dobowych 10 mg/kg, 1 mg/kg, 0,1 mg/kg i 0,01 mg/kg masy ciała.

Grupę kontrolną stanowią myszy immunizowane otrzymujące dawki 0,2 ml PBS/mysz w tych samych nietrwałych czasowych. Każda grupa zarówno doświadczalna jak i kontrolna liczy 8-12 myszy.

W czwartym lub dziesiątym dniu (oznaczanie przeciwciał typu 7S) po immunizacji mysz lekko usypia się eterem, skrwawia przez ekstyrpację gałki ocznej. Wypływającą krew zbiera się do probówki. Następnie po przerwaniu rdzenia, pobiera się śledzionę. Krew służy do otrzymania surowicy w celu oznaczenia przeciwciał hamaglutynacyjnych typu 19S+7S i 7S, natomiast ze śledziony uzyskuje się komórki służące do określenia odsetka rozet E i aktywności hemolitycznej. W tym celu śledzionę myszy rozdrabnia się, a uzyskane komórki zawiesza się w około 2 ml płynu Hanksa o temperaturze +4°C i następnie nawarstwia się na 9% mieszaninę Ficoll-Uropolona o gęstości 1,077. Nawarstwione splenocyty wiruje się przez 15 minut przy 3000 obr./min. w temperaturze +4°C. Po odwirowaniu interfazy kożuszek splenocytów przenosi się do płynu Hanksa o temperaturze +4°C i dwukrotnie płucze się przez wirowanie 7-10 minut przy 1800 obr./min. Następnie sporządza się zawiesinę w płynie Hanksa taką, że w 1 ml płynu Hanksa jest 1 χ 10⁶ komórek. Dla każdej próby określa się procent splenocytów martwych pr/z^^. zabarwienie kropli badanej zawiesiny splenocytów kroplą wykonanego ex tempore barwnika składającego się z 4 części 0,2% błękitu trypanu i 1 części 4,25% NaCl. Pod mikroskopem ustala się na 100 komórek odsetek splenocytów martwych, którymi są komórki granatowe - komórki błyszczące są komórkami żywymi. Obecność komórek martwych w ilości powyżej 10% dyskwalifikuje próbę do dalszych badań. Wszystkie czynności z komórkami przeprowadza się w sterylnym silikonowym szkle laboratoryjnym umieszczonym w kąpieli lodowej.

Przykład VIII. W pierwszym teście biologicznym ustalono wpływ substancji badanych na ilość splenocytów produkujących przeciwciała hemolityczne (PFC-IgM). Test przeprowadzono w następujący sposób: Do 0,5 ml 0,5% roztworu agarozy umieszczonego w probówce w łaźni wodnej o temperaturze 45°C dodawano 0,1 ml 10% zawiesiny SRBC. Następnie dodawano 0,1 ml zawiesiny komórek śledziony (o gęstości 1 x 10⁶). Całość szybko miesza się i wylewa na szkiełka podstawowe, uprzednio naagarozowane, po czym inkubuje się w cieplarce o temperaturze 37°C przez 2 godziny. Następnie próby zalewa się komplementem świnki morskiej rozcieńczonym 1:20 na kolejne dwie godziny. Po inkubacji badanych prób z komplementem odczytuje się ilość łysinek (PFC - plaque forming cells) przeliczając na 1 x 10⁶ splenocytów. Każdą próbę wykonuje się dwukrotnie.

Najsilniejsze działanie potęgujące odpowiedź na SRBC, wyrażającą się wzrostem ilości splenocytów produkujących hemolizyny IgM (PFC) obserwowano po podaniu substancji D-11 z przykładu II, w dawce 0,1 mg/kg - 119%. Dziesięciokrotne zwiększenie dawki dobowej powoduje zmniejszenie działania potęgującego ilość PFC (53%).

Substancja D-12 z przykładu III, najsilniejsze działanie (wzrost o 58%) wykazuje w dawce 1,0 mg/kg.

SubstancjaEK2-S-11 z przykładu V, najsilniejsze działanie w tym teście wykazała w dawce

0,1 mg/kg (wzrost o 65%). Dziesięciokrotne zwiększenie dawki zmniejsza nieznacznie (do 52%) działanie potęgujące ilość PFC.

Substancja D-13 z przykładu IV, w dawce 1 mg/kg powodowała wzrost o 40%. Dziesięciokrotne zwiększenie dawki powodowało obniżenie efektu - wzrost o 14%.

Przykład IX. Miano przeciwciał hemaglutynacyjnych 19S+7S i +7S metodą hemaglutynacji czynnej oznaczono dla związków wytwarzanych sposobem według wynalazku w kolejnym teście biologicznym.

W celu określenia poziomu przeciwciał typu 19S-IgM pobierano surowicę mysią po 4 dniach od immunizacji SRBC, a typu 7S - IgG po 10 dniach od immunizacji SRBC. U myszy immunizowanych SRBC po czterech dniach występuje maksimum miana przeciwciał anty-SRBC typu 19S-IgM, natomiast po 10 dniach od wprowadzenia antygenu przeważają przeciwciała 7S czyli IgG.

A. Oznaczanie miana przeciwciał hemaglutynacyjnych typu 19S + 7S.

Próbki pobranej krwi odwirowuje się przez 30 min. przy 3500 obr./min. Następnie z każdej próby zbiera się uzyskaną w ten sposób surowicę. Otrzymane surowice umieszcza się w łaźni wodnej o temperaturze 56°C na 30 minut w celu inaktywacji dopełniacza. Następnie wykonuje się szereg rozcieńczeń badanych surowic od 1:1 do 1:4096 przy użyciu mikrotitratora i mikropłytek w kształcie litery U i o pojemności 250 gl. Po sporządzeniu rozcieńczeń badanych surowic inkubuje się je przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie dodaje się po 1 kropli 1% zawiesiny SRBC a zbuforowanym roztworze soli fizjologicznej (PBS) i inkubuje się przez kolejne 2 godziny w temperaturze 37°C, po czym badane próby umieszcza się w temperaturze 4°C. Wynik odczytuje się na drugi dzień. Za miano surowicy badanej przyjmuje się największe z jej rozcieńczeń, które jeszcze powoduje hamaglutynację, o czym świadczy pierścień na dnie zagłębienia. Wynikiem ujemnym jest zbity guziczek na dnie zagłębienia.

Do obliczeń statystycznych podaje się 1-krotność wzrostu rozcieńczenia surowicy w badanej dawce substancji poddawanej testowaniu w stosunku do grupy kontrolnej.

Substancja D-11 z przykładu II, w dawce 1 mg/kg zwiększała 2,57 razy miano IgM. Dziesięciokrotne zwiększenie dawki powodowało wzrost efektu stymulującego w stosunku do kontroli do 3,5 razy.

Substancja D-12 z przykładu III, wykazywała słabsze działanie potencjalizujące produkcję przeciwciał IgM. W dawce 0,1 mg/kg miano IgM zwiększane było dwukrotnie, zaś w dawce 1 mg/kg zwiększenie 1,4-krotne.

Substancja EK2-S-II z przykładu V wykazywała najsilniejsze działanie zwiększające miano IgM w dawce 0,1 mg/kg (x 4,3). Dziesięciokrotne zwiększenie dawki powodowało obniżenie obserwowanego efektu stymulującego (x 3,5).

Substancja D-13 z przykładu IV, w dawce 1 mg/kg wykazywała 3-krotne podwyższenie miana IgM. Dziesięciokrotne zwiększenie dawki powodowało spadek stymulacji do x 1,5.

B. Oznaczenie miana przeciwciał hemaglutynacyjnych typu 7S - IgG.

Badane inaktywowane surowice łączy się w stosunku 1:1 z 0,1 M roztworem 2-merkaptoetanolu i inkubuje się przez 30 minut w temperaturze 37°C. Pod wpływem 2-merkaptoetanolu dochodzi do zniszczenia immunoglobulin typu 19S (IgM), natomiast immunoglobuliny 7S (IgG) są niewrażliwe na działanie 2-merkaptoetanolu. Po 30 minutach inkubacji reakcję redukcji przerywa się przez ochłodzenie (temperatura.4°C przez 15 minut). Następnie sporządza się szereg rozcieńczeń jak przy oznaczaniu miana przeciwciał typu 19S, łączy się te rozcieńczone roztwory z 1% zawiesiną SRBC i po 2 godzinach inkubacji w 37°C umieszcza się próby w temperaturze 4°C. Wynik odczytuje się na drugi dzień przyjmując kryteria określania miana hemaglutynacji jak powyżej. Równolegle przeprowadza się ślepą próbę, która stanowi połączenie 1% zawiesiny SRBC z PBS w stosunku 1:1.

Substancja D-11 z przykładu II, wykazywała najsilniejsze działanie potęgujące wytwarzanie przeciwciał IgG w dawce 1 mg/kg x 3,16. Dziesięciokrotne zwiększenie dawki powoduje, że działanie potęgujące wynosi tylko x 2,2.

171 023

Substancja D-12 z przykładu III, w dawce 0,1 mg/kg stymuluje produkcję IgG 1,3 razy a w dawce 10 mg/kg - 1,5 razy.

Substancja EK2-S-II z przykładu V, w dawce 0,1 mg/kg stymuluje produkcję IGG 1,9 razy a w dawce 1,0 mg/kg 2,89 razy w stosunku do kontroli.

Wyniki badań dla poszczególnych partii związków wytwarzanych sposobem według wynalazku, dotyczące ich wpływu na oznaczane wskaźniki odpowiedzi immunologicznej należy poddać ocenie statystycznej testem T-Studenta przy α=0,05. Należy porównywać otrzymane wyniki badań dla poszczególnych dawek z wynikami badań równolegle przeprowadzonych dla grupy kontrolnej. Uwaga ta odnosi się do wszystkich testów biologicznych.

Przykład X. Grupa nowych związków biologicznie aktywnych, otrzymanych w przykładach I-V poddana była również testowi, w którym określa się odsetek splenocytów tworzących rozety E. Test przeprowadzano w następujący sposób:

Do 550 pl płynu Hanksa dodaje się 250 pl 1 % zawiesiny SRBC oraz 250 pl zawiesiny badanych komórek o koncentracji 1 x 10⁶/ml. Następnie każdą próbkę inkubuje się w łaźni wodnej z wytrząsarką przez 15 minut w temperaturze 37°C, po czym przenosi się do temperatury 4°C na 20 godzin. Odsetek splenocytów tworzących rozety E z SRBc odczytuje się po zabarwieniu zawiesiny 1 -3 kroplami 1 % fioletu krystalicznego. Każdą próbę odczytuje się trzykrotnie licząc każdorazowo 400 splenocytów. Za rozetę uznaje się splenocyt otoczony co najmniej 3 erytrocytami.

Do obliczeń statystycznych podaje się procent wzrostu splenocytów z rozetami E w badanej dawce testowanej substancji w porównaniu do grupy kontrolnej.

Najsilniejsze działanie stymulujące zdolność tworzenia rozet E wykazały w przeprowadzonych badaniach substancje D-11 (63%) i EK-S-11 (70%) w dawkach 1,0 mg/kg. W dawkach dziesięć razy mniejszych wartości te obniżają się odpowiednio do 45% i 57%.

Substancja D-12, w dawce 1,0 mg/kg potęguje zdolność tworzenia rozet E o 22% w stosunku do kontroli, a w dawce dziesięć razy większej o 29%.

Substancja D-13 przejawia maksymalne działanie przy dawce 1 mg/kg wzrost o 58%. Zwiększenie dawki powoduje nieznaczny spadek stymulacji.

Przykład XI. Konwencjonalne testy biologiczne pozwalają na wykazanie biologicznej aktywności badanych związków w stosunku do organizmów zwierzęcych. W odniesieniu do odpowiedzi immunologicznej ograniczenie badań do prób na zwierzętach nie jest właściwe, ponieważ system immunologiczny człowieka w wielu aspektach jest odmienny od systemu immunologicznego zwierząt doświadczalnych. Przejawia się to w obserwacji, że preparaty wykazujące brak aktywności immunologicznej w modelach zwierzęcych dająbardzo pozytywną reakcję immunologiczną ochotników.

Zdolność związków wytwarzanych sposobem według wynalazku do indukowania cytokin, między innymi interferonu i czynnika nekrozy komórek nowotworowych, wykazano w biotestach opartych na materiale ludzkim, zwłaszcza na kulturach leukocytów ludzkich z krwi obwodowej.

Metodyka badań pozwalających na ocenę wpływu badanych związków wytworzonych sposobem według wynalazku na system immunologiczny człowieka przedstawiona jest poniżej:

A. Próba cytotoksyczności.

Cytotoksyczność badanych związków oznacza się przy użyciu komórek ludzkiego nowotworu płuc adenocarcinoma linii A549 (włączonej do American Type Culture Collection pod numerem ATCC CCL 185). Monowarstwę komórek trypsynizuje się. Zawiesiny o stężeniu 2 x 10⁵ komórek/ml w modyfikowanej pożywce Eagle'a DMeM (Dulbecco's-modyfied Eagle's minimum essential medium) z dodatkiem 10% surowicy cielęcej (CS) miesza się z różnymi dawkami badanych substancji, nanosi się na plastikowe mikropłytki i inkubuje przez 48 godzin w temperaturze 37°C. Wyznaczana dawka CD50 oznacza minimalne stężenie badanego związku, które powoduje zniszczenie 50% hodowli komórkowej, mierzone przez zabarwienie 0,015% roztworem czerwieni neutralnej w DMEM.

B. Indukowanie cytokin.

171 023

Leukocyty od zdrowych dawców krwi otrzymuje się z Rejonowych Stacji Krwiodawstwa. Przeprowadza się lizę erytrocytów stosując NHąCl zgodnie z metodą Cantella i wsp. (Cantell, K., Hirvonen, S., Kauppinen, H. L.: Production and partial purification of Human Tnmnn. Interferon, Meth. Enzymol., 119, 54, 19861. Leukocyty krwi obwodowej (PBL) pochodzące od jednego dawcy, w stężeniu około 8 x 10⁶ leukocytów/ml w pożywce RPMI 1640 z dodatkiem l0%o surowicy płodowej cielęcej (FCS), L-glutaminy i antybiotyków stosuje się we wszystkich oznaczeniach. Wszystkie partie FCS poddawane są uprzedniemu testowi. Wykluczone jest wykorzystanie mitogenicznych surowic FCS do przygotowania zawiesin leukocytów. Do tak przygotowanych hodowli leukocytów ludzkich wprowadza się badany induktor cytokin. Jako induktor referencyjny stosuje się fitohemaglutyninę (PHA) produkcji Pharmacia Fine Chemicals oraz LPS z E. Coli 0111 :B4 produkcji Difco Laboratories. Hodowle PBL z dodatkiem induktorów inkubuje się w atmosferze powietrza z dodatkiem 5% CO2 w 37°C przez 20 godzin a następnie odwirowuje się je. Supernatanty zbiera się do oznaczeń i przechowuje w temperaturze 4°C. W supernatantach, w przeciągu jednego tygodnia, oznacza się interferon IFN i czynnik nekrozy nowotworów TNF.

C. Oznaczanie interferonu IFN.

Przygotowuje się konfluentne monowarstwy komórek linii nowotworowej A549 na mikropłytkach stosując DMEM z dodatkiem 10% CS, L-glutaminy i antybiotyków (100 jednostek/ml penicyliny i 100 gg/ml streptomycyny). Próbki interferonu w odpowiednich rozcieńczeniach dodaje się do przygotowanych preparatów linii A549 i poddaje inkubacji w temperaturze 37°C przez 20 godzin w atmosferze powietrza z dodatkiem 5% CO2. Komórki przemywa się następnie i traktuje wirusem encephalomyo cardititis (EMCV). Miano IFN wyznacza się jako rozcieńczenie próbki IFN, które redukuje o 50% cytopatogeniczny efekt obecności wirusa po 48 godzinach inkubacji. Metodę MTT (bromek 3-[4,5-dwumetylotiazol-2-yl]-2,5-dwufenylotetrazoliowy) opracowaną przez Hansen, M. B., Nielsen, S. E. i Berg, K.: Re-examination and Further Development of a Precise and Rapid Dye Method for Measuring Cell Growth/Cell Kill, J. Immuno. Meth., 1989, 119, 203-210) wykorzystuje się w celu dokonania pomiaru miana komórek zabitych w scanerze ELISA. We wszystkich próbach wykorzystuje się laboratoryjne standardy interferonów: rekombinantowy ludzki IFN- (Genentech Inc., USA, aktywność właściwa 2 x 10⁸ U/ml) naturalny ludzki leukocytowy IFN-α (3 x 10⁶ IU/ML) oraz IFN- (2 x 10⁶ IU/ml) otrzymany od dr K. Cantella, Helsinki, Finlandia.

D. Oznaczanie czynnika nekrozy nowotworów (TNF).

Cytotoksyczną aktywność TNF mierzy się na komórkach linii L-929 metodą Filcka i Gifforda (Flick, D. A., Gifford, G. E.: Comparison of in Vitro Cell Cytotoxic Assays for Tumor Necrosis Factor, J. Immunol. Meth. 68, 167, 1984).

Próbki badane i roztwór aktynomycyny D dodaje się do jednowarstwowej hodowli komórek. Po inkubacji w temperaturze 37°C przez 20 godzin hodowle barwi się fioletem krystalicznym i oznacza się efekt toksyczny. Ilość powodująca destrukcję około 50% komórek w hodowli określonajest jako jedna jednostka aktywności TNF. Przez porównanie z preparatem TNF-α (Genentech Inc., USA) ustalono, żejednajednostkaprzyjęta z obecnym teście odpowiada 100-200 pg/ml TNF.

E. Próby neutralizacji cytokin.

Stosuje się następujące przeciw-surowice: króliczą przeciw-ludzkiemu TNF-α partia 2958-40 i króliczą przeciw-ludzkiemu IFN- -partia 2891-56 (Genentech Inc., USA), baranią przeciw-ludzkim IFN-α i baranią przeciw-ludzkiemu IFN- (otrzymane od dr K. Cantella, Finlandia). Preparaty zawierające cytokiny traktuje się przeciw-surowicami rozcieńczonymi w stosunku 1:200 w pożywce do prowadzenia hodowli a następnie inkubuje się w temperaturze pokojowej przez godzinę. Po inkubacji oznacza się - w wyżej opisany sposób - aktywność IFN lub TNF jaką można jeszcze po tym czasie zaobserwować.

Zastosowano pięć różnych partii ludzkich leukocytów krwi obwodowej (PBL) otrzymanych z krwi zdrowych dawców krwi, oznaczonych od L1 do L5.

171 023

Stwierdzono, że w prowadzonych oznaczeniach optymalne stężenie PBL wynosiło 8 x 10⁶ komórek/ml pożywki (RMPI 1640 z dodatkiem 10% surowicy płodowej cielęcej i antybiotyków).

W wyniku inkubacji hodowli PBL z nowymi preparatami poddawanymi badaniu oznaczonymi poniżej w tabeli 1 numerami I-XII, zaobserwowano syntezę IFN i TNF. Obserwowane reakcje zależne były od dawki badanego preparatu w granicach 3-100 gg/ml, co potwierdzają wyniki przedstawione w tabeli 2, poniżej. Badane preparaty nie były cytotoksycznr we wskazanych dawkach. Dla wszystkich oznaczeń przeprowadzono ślepą próbę pozytywną i negatywną. Negatywna ślepa próba polegała na oznaczeniu ilości cytokin (IFN i TNF) wytworzonych spontanicznie bez dodawania jakiegokolwiek zewnętrznego stymulatora. Pozytywna ślepa próba polegała na oznaczeniu ilości cytokin wytworzonych w odpowiedzi na obecność znanego induktora cytokin. W doświadczeniach stosowano fitohemaglutaniaę (PHA, produkcji Pharmacia, Szwecja) w dawce 10 gg/ml.

Należy podkreślić, że indukowanie cytokin w hodowlach ludzkich leukocytów krwi obwodowej (PBL) otrzymanych od różnych dawców, zazwyczaj zachodzi z różną intensywnością i uzyskiwane wyniki są rozbieżne. Zjawisko to można wyjaśnić genetycznym zróżnicowaniem populacji ludzkiej. Dodatkowo, zaobserwować także można spontaniczne wytwarzanie IFN i TNF przez hodowle PBL. Innymi słowy wśród zdrowych dawców krwi można wyróżnić osoby o silnej reakcji (odpowiedzi immunologicznej), o słabej reakcji oraz takie, które całkiem nie reagują.

Pomimo wskazanych ograniczeń wyniki biotestów wykazują, że PBL (L1 do L5) potraktowane nowymi preparatami I-XII wytwarzały IFN i/lub TNF w ilościach nadających się do ilościowego oznaczania.

Jak wynika z danych zawartych w tabeli 2, w przypadku leukocytów L1 pochodzących od dawcy o silnej odpowiedzi immunologicznej, preparat oznaczony numerem II (zawierający pochodne kwasu L-asparaginowego) okazał się bardziej aktywnym induktorem cytokin niż preparat oznaczony numerem III (zawierający pochodne kwasu D-asparaginowego). Obserwacja ta ma duże znaczenie, ponieważ to właśnie formy L aminokwasów są rozpoznawane przez komórki jako naturalne substraty reakcji biochemicznych.

Ponadto, analizując biologiczną aktywność nowych preparatów, okazuje się, że aminokwasowa część cząsteczki nowych iaduksorów cytokin według wynalazku, ma większe znaczenie niż reszta pochodząca od wyjściowego cukru. Jak wykazują zebrane wyniki, w miejsce prostego cukru występować mogą także polisacharydy (takie jak dekstran - porównaj preparaty X-XII) a reaktywność produktu pozostaje podobna.

Podobnie, porównywalne rezultaty osiąga się, gdy w miejsce prostego aminokwasu użyty zostanie krótki peptyd. Otrzymany produkt w podobny sposób stymuluje leukocyty do wytwarzania cytokin (dane nie przedstawione).

Tabela 1

Lista badanych preparatów

Numer	Związki wyjściowe
I	(D-10)	kwas L-glutaminowy, glukoza galaktoza
U	(D-11)	L-asparaginowy, glukoza, galaktoza
III	(D-13)	kwas D-asparaginowy, glukoza galaktoza
IV	(D-12)	L-seryna, glukoza, galaktoza
V	(EK2-S)	frakcje 11-13
VI	(EK2-S)	frakcje 6-7
VII	(EK2-S)	frakcje 8-10
VIII	(EK2-S)	frakcje 28-34
IX		L-prolina, glukoza
X		L-asparagmowy dekstran (odmiana 1)
XI		kwas L-asparaginowy (odmiana 2)
XII		kwas L-asparaginowy (odmiana 3)

171 023

Wszystkie badane preparaty otrzymano w sposób przedstawiony wyżej w przykładach

I-VII.

Tabela 2.

Aktywność biologiczna oznaczana w teście z zastosowaniem ludzkich leukocytów krwi obwodowej (PBL)

Subst. badana	Dawka pg/ml	IFN (jednostki/ml)	TNF (jednostki /ml)
L1	L2	L3	L4	L5	L1	L2	L3	L4	L5
—1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
Ślepa próba	-	10	<10	<10	20	<10	80	9	27	27	<9
pha	10	100	30	30	60	100	250	80	250	250	250
I	100	100	<10	<10	20	-	250	9	9	160	-
	30	-	-	-	30	-	-	-	-	500	-
	10	30	<10	<10	30	-	80	9	18	160	-
II	100	100	10	<10	10	<10	250	18	18	250	<9
	30	-	-	-	10	<10	-	-	-	250	<9
	10	1000	10	30	10	10	250	50	27	250	<9
	3	-	-	-	10	<10	250	9	18	250	<9
III	100	<10	<10	10	10	<10	-	-	-	250	<9
	30	-	-	-	30	<10	-	-	-	250	<9
	10	<10	<10	<10	10	<10	80	27	18	250	<9
	3	-	-	-	10	<10	-	-	-	80	<9
IV	100	<10	10	10	20	<10	80	60	9	160	<9
	30	-	-	-	20	<10	-	-	-	27	<9
	10	<10	30	<10	20	<10	80	50	18	80	<9
	3	-	-	-	20	<10	-	-	-	80	<9
V	100	30	. <10	<10	60	-	80	50	18	250	-
	30	-	-	-	60	-	-	-	-	80	-
	10	<10	<10	<10	10	-	80	27	9	80	-
	3	-	-	-	10	-	-	-	-	80	-
VI	100	<10	<10	<10	20	-	80	27	18	80	-
	30	-	-	-	10	-	-	-	-	80	-
	10	10	<10	<10	20	-	50	27	18	160
	3	-	-	-	10	-	-	-	-	250	-
VII	100	<10	<10	<10	-	-	80	27	27	-	-
	10	10	<10	<10	-	-	80	27	27	-	-
VIII	100	<10	<10	<10	-	-	80	160	27	-	-
	10	<10	<10	<10	-	-	750	80	27	-	-
IX	100	10	<10	<10	10	-	27	27	18	80	-
	30	-	-	-	20	-	-	-	-	80	-
	10	100	30	<10	20	-	80	27	18	80	-
	3	-	-	-	10	-	-	-	-	50	-
X	100	100	<10	20	20	-	27	27	18	250	-

171 023 dc. tabeli 2

I	2	3	4	5	6	—7	8	9	10 '	Π	12
	30	-	-	-	30	-	-	-	-	80	-
	10	<10	10	<10	30	-	18	50	27	50	-
	3	-	-	-	30	-	-	-	-	250	-
XI	100	<10	10	<10	30	-	18	27	27	50	-
	30	-	-	-	10	-	-	-	-	250
	10	<10	30	<10	10	-	18	80	80	80	-
	3	-	-	-	20	-	-	-	-	750	-
XII	100	<10	<10	<10	10	-	250	50	18	80	-
	30	-	-	-	20	-	-	-	-	80	-
	10	<10	10	<10	10	-	750	27	18	80	-
	3	-	-	-	30	-	-	-	-	160	-

Wszystkie nowe induktory cytokin, otrzymywane sposobem według wynalazku, zilustrowanym dodatkowo za pomocą schematu reakcji, na załączonym rysunku, na którym przedstawiono reakcję prostego cukru z aminokwasem o wzorze ogólnym HNR2 oraz przegrupowanie Amadoriego otrzymanego związku pośredniego prowadzące do otrzymania 1-desoksy-1-NHR2-2-keto-pochodnej wyjściowego związku cukrowego, mogą być stosowane klinicznie jako immunomodulatory w leczeniu zaburzeń immunologicznych w organizmie ludzkim. Dodatkowo, związki te są przydatne jako środki powodujące regenerację tkanek. Należy oczekiwać, że zdolność indukowania cytokin, a zwłaszcza interferonów i czynnika nekrozy nowotworów, rozszerzy wykorzystanie obecnych związków. Preparaty zawierające nowe induktory cytokin otrzymywane sposobem według wynalazku mogą być podawane doustnie, zewnętrznie a także pozajelitowo. Są trwałe przy przechowywaniu w postaci suchej.

Nowe induktory cytokin są nietoksyczne i nie wywołują objawów ubocznych.

171 023

Η_{χ ζ}0Η C-1

H-Ć-0H

H0-Ć-H

H-Ć-0H η

H-tćh₂oh + H₉NR

Η NR, \ /

CH-C-OH HO-Ć-H - H-Ć-DH

H-Ć— .0

REAKCJA

--£>.

Amadoriego

ĆH₂0H

H

H-t-NR

Ć=0

HO-Ć-H

H-Ć-OH H-Ć-OH ĆFUOH

SCHEMAT REAKCJI

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 4,00 zł

Claims (9)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania nowych induktorów cytokin, będących N-podstawionymi pochodnymi związków aminokwasowych o wzorze ogólnym R1-NH-R2, w którym R1 oznacza rodnik Ct-1-desoksy-2-keto, pochodzący od prostego cukru, oligo- lub niskocząsteczkowego poli-sacharydu, o budowie łańcuchowej lub pierścieniowej, zaś R2 oznacza związany z grupą aminową rodnik aminokwasu lub krótkiego peptydu, w reakcji związku aminokwasowego ze związkiem należącym do kategorii cukrów prowadzonej w podwyższonej temperaturze i ewentualnie pod ciśnieniem, znamienny tym, że jako substraty stosuje się co najmniej jeden aminokwas i/lub krótki peptyd i co najmniej jeden prosty cukier, oligo- i/lub polisacharyd, aminokwas lub krótki peptyd podstawia się przy grupie aminowej prostym cukrem, oligo- lub poli-sacharydem na drodze kondensacji w stężonym roztworze wodnym, ewentualnie z dodatkiem niższego alkoholu i otrzymany N-glikozyd poddaje się przegrupowaniu Amadoriego prowadząc przemianę aż do wystąpienia pomarańczowo-brązowego zabarwienia, po czym całość odparowuje się do sucha pod obniżonym ciśnieniem uzyskując produkt lub mieszaninę produktów o wzorze ogólnym R1-NH-R2, w którym wszystkie symbole mają wyżej podane znaczenie, a następnie - ewentualnie - z mieszaniny poreakcyjnej usuwa się nadmiar produktów wyjściowych lub wyodrębnia się produkt końcowy i ewentualnie poddaje się wzbogacaniu chromatograficznemu na sorbentach lub kationitach zbierając frakcje specyficzne, redukujące żelazicyjanek potasowy, przy czym korzystnie pożądane związki wyj ściowe stosuje się w postaci ekstraktów z substancji naturalnych lub w postaci mieszanin o tym samym składzie co ekstrakty takich substancji naturalnych.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako substraty stosuje się cukry proste, oligo- i/lub polisacharydy o konfiguracji D oraz aminokwasy i/lub krótkie peptydy o konfiguracji L.
3. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się jako związek wyjściowy co najmniej jeden prosty cukier należący do grupy obejmującej: glukozę, ksylozę, galaktozę, ramnozę, fruktozę, mannozę, 6-desoksyglukozę, glukosaminę i galaktozoaminę.
4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że stosuje się mieszaninę zawierającą glukozę, ksylozę, galaktozę, ramnozę i fruktozę.
5. 5. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że jako związek wyjściowy stosuje się co najmniej jeden aminokwas lub krótki peptyd należący do grupy obejmującej: serynę, glicynę, histydynę, argininę, alaninę, kwas asparginowy, kwas glutaminowy, fenylalaninę, treomnę, cysteinę, cystynę, metioninę, hydroksyprolinę, tryptofan, prolinę, tyrozynę, walinę, izoleucynę, leucynę, lizynę i/lub krótkie peptydy utworzone z wymienionych aminokwasów w dowolnej kombinacji.
6. 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że stosuje się mieszaninę seryny, glicyny, histydyny, argininy, alaniny, proliny, tyrozyny, waliny, izoleucyny, leucyny i lizyny.
7. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się dodatkowo kwaśny węglan sodu w stosunku równomolowym względem wziętych do reakcji dwukarboksylowych aminokwasów i/lub peptydów.
8. 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się substraty cukrowe i aminokwasowe w stosunku molowym 2:1 do 1:1, korzystnie w stosunku 1,5:1.
9. 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że wskazanym reakcjom poddaje się mieszaninę cukrów prostych o składzie i wzajemnych stosunkach wagowych pomiędzy składnikami, właściwych bioaktywnym ekstraktom torfowym oraz mieszaninę aminokwasów o składzie i wzajemnych stosunkach wagowych pomiędzy składnikami, właściwych takim ekstraktom torfowym, ewentualnie z dodatkiem pierwiastków śladowych w ilości właściwej takim ekstraktom.

   171 023