PL170169B1 - Artificial membrane beads containing functionally active peptides responsible for fusion as a drug administering system - Google Patents

Artificial membrane beads containing functionally active peptides responsible for fusion as a drug administering system

Info

Publication number
PL170169B1
PL170169B1 PL92296382A PL29638292A PL170169B1 PL 170169 B1 PL170169 B1 PL 170169B1 PL 92296382 A PL92296382 A PL 92296382A PL 29638292 A PL29638292 A PL 29638292A PL 170169 B1 PL170169 B1 PL 170169B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
detergent
fusion
cell
vesicles
drug
Prior art date
Application number
PL92296382A
Other languages
English (en)
Inventor
Reinhard Glueck
Peter Klein
Peter Hermann
Original Assignee
Nika Health Products Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nika Health Products Ltd filed Critical Nika Health Products Ltd
Publication of PL170169B1 publication Critical patent/PL170169B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1277—Processes for preparing; Proliposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6839—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting material from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
    • A61K47/6913—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome the liposome being modified on its surface by an antibody
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Feedback Control In General (AREA)
  • Measurement And Recording Of Electrical Phenomena And Electrical Characteristics Of The Living Body (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Manufacturing Of Micro-Capsules (AREA)
  • Fittings On The Vehicle Exterior For Carrying Loads, And Devices For Holding Or Mounting Articles (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Air Conditioning Control Device (AREA)

Abstract

1. Sposób wytwarzania fosfolipidowych dwuwarstwowych pecherzyków z peptydami fuzyjnymi i ewentualnie innymi komórkowo-specyficznymi markerami na blonie oraz zawierajacych co najmniej jeden lek farmaceutycznie aktywny, obejmujacy nastepujace etapy: a) rozpuszczanie fosfolipidów, korzystnie razem z peptydami fuzyjnymi w obecnosci srodka powierzchniowo czynnego (detergenta), b) dodawanie pozadanego leku lub substancji, c) usuwanie detergenta i tym samym formowanie pecherzyków, d) poddawanie pecherzyków dalszej obróbce w celu osiagniecia przez nie pozadanych rozmiarów, e) dodawanie peptydów fuzyjnych, jesli nie zostaly juz wprowadzone w etapie a) i ewentualnie dodawanie innych komórko-specyficznych markerów, korzystnie w kombinacji ze srodkiem sieciujacym, znamienny tym, ze przy rozpuszczaniu fosfolipidów stosuje sie niejonowy detergent, korzystnie monododecylowy eter glikolu oktaetylenowego, nie reagujacy z hemaglutynina, usuwa sie detergent przez kilkakrotne, co najmniej trzykrotne, zadawanie perelkowym mikronosnikiem polistyrenowym, i doprowadza sie pecherzyki do pozadanej wielkosci na drodze ultrasonifikacji, przy czym peptydy fuzyjne, komórkospecyficzne markery i sub- stancje farmaceutycznie aktywne dobiera sie pod katem doprowadzenia leku do wybranej grupy komórek organizmu pacjenta. (74) Pelnomocnik: Malewska Ewa, EWA MALEWSKA & PARTNERS PL PL PL PL PL PL

Description

Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania fosfolipidowych dwuwarstwowych pęcherzyków z peptydami fuzyjnymi na błonie, stanowiących nowy układ podawania leków, a w szczególności pęcherzyków mających na swej powierzchni cząsteczki peptydów i innych białek specyficznych komórkowo. Cząsteczka peptydu fuzyjnego może mieć postać peptydu syntetycznego lub oczyszczonego bądź też może stanowić część glikoproteiny wchodzącej w skład kolców cząsteczki wirusa z otoczką, przykładowo hemaglutyniny, takiej jak hemaglutynina wirusa grypy, wirusa paragrypy lub wirusa Lasu Semliki (Semliki Forest). Białkiem komórkowo-specyficznym może być przeciwciało IgG, przykładowo przeciwciało CD4.
Przy podawaniu leku musi on zwykle przejść z miejsca podania do komory plazmowej i dlatego sposób podawania może mieć ważny wpływ na profil farmakokinetyczny leku w obiegu utrojowym. I tak, podawanie doustne - choć dogodne - powoduje, że lek rozpoczyna oddziaływać stosunkowo powoli i nie można być całkowicie pewnym wyniku, z uwagi na niepewność co do osiągnięcia optymalnego poziomu leku w plazmie. Przeciwnie, przy podawaniu w zastrzykach dożylnie, szybko i dokładnie ustala się poziom leku w obiegu ustrojowym, kosztem pewnego bólu i niedogodności dla pacjenta. Jednakże, nawet wówczas, gdy lek jest wstrzyknięty bezpośrednio do układu obiegu ustrojowego, związek pomiędzy podaną dawką a poziomem leku i czasem jego dotarcia do miejsca docelowego oddziaływania, nie należy do prostych. Te parametry ustalająsię w złożonej i często konkurencyjnej sieci przebiegów, które prowadząbądź to do akumulacji aktywnych cząstek leku w docelowym miejscu, bądź tez - do inaktywacji i wydalenia leku. Przebiegi te obejmująbiotransformację w wątrobie i innych tkankach, wydzielanie przez nerki lub z żółcią, wychwytywanie leku przez ustalone lub cyrkulujące komórki lub makrofagi oraz przechodzenie leku pasywne lub pośrednie przez błony stanowiące bariery (Creasy, W.A. (1979): Drug disposition in Humans, Oxford University Press, New York).
W ostatnich latach rozpowszechnione było zainteresowanie perspektywami dobroczynnego wpływania na dystrybucję i metabolizm leków przez stosowanie różnego rodzaju nośników lub układów dostarczania leków. Układy te zaprojektowano w celu kontrolowania co najmniej jednego z następujących parametrów (Juliano, R.R. (1975), Can. J. Physiol. Pharmaco 56, 683-690):
a) szybkości wprowadzania leku do określonego obszaru organizmu,
b) dystrybucji i lokalizacji leku w obrębie organizmu,
c) trwałość lub szybkości metabolizmu leku.
Podstawowym udoskonaleniem w dziedzinie kontrolowanych układów dostarczania leków było opracowanie lipozomów, które po raz pierwszy opisał Bangkam et al. (Bangkam, A.D., Standish, M.M. i Watkins, J.C. (1965), J.Mol.Biol, 13,238-252). Dziś w literaturze spotkać można bogate opisy korzyści, jakie osiąga się przez wprowadzanie określonego leku w lipozomach. Korzyści te można streścić następująco:
1. Lipozomy mogą przenikać przez biomemberany i mogą ułatwiać transport leków przez nieprzepuszczalne zazwyczaj dla nich bariery. W szczególności lipozomy ułatwiają penetrację związków zamkniętych w nich jak w kapsułkach do wnętrza komórek.
2. Lipozomy można zaprojektować tak, aby wchodziły w interakcje z określonymi tkankami zwiększając selektywność leku i zmniejszając jego toksyczność.
170 169
3. Farmakokinetyka leku może być korzystnie modyfikowana przez lipozomy poprzez modulowanie uwalniania, dystrybucji i usuwania leku z cyrkulacji ustrojowej.
4. Leki chemicznie i metabolicznie niestabilne mogą być chronione przez lipozymy przed deaktywacją.
Leki o spodziewanym istotnym znaczeniu terapeutycznym mogą być w ten sposób zabezpieczone, bowiem związki zamknięte w lipozomowych kapsułkach przejawiają zmodyfikowane właściwości, przynajmniej in vitro, w porównaniu z właściwościami czystej substancji. Niestety, początkowe nadzieje na rewolucyjnie nowe podejście do chemoterapii nie zostały w pełni potwierdzone przez dane eksperymentalne (Fildes, F.J.T. (1981), Liposomes, From physical structure to therapeutic applications. Knight (ed.), Elsevier/North-Holland Biomedical Press).
Lepsze wyniki przy wykorzystaniu lipozomów jako wektorów mogą być osiągnięte przez utarczowanie lipozomów specyficznymi białkami. Jeśli substancje zamknięte w lipozomach miałyby być skuteczniej dostarczone do wybranych organów lub tkanek, te techniki modyfikujące winny być zaprojektowane tak, aby możliwe było uniknięcie akumulacji lipozomów w niepożądanych miejscach (tym samym obniżenie toksyczności) oraz optymalizacja dostarczania ich do wybranych specyficznych komórek (tym samym zwiększanie pożądanego skutku).
Kilka prac badawczych oparto na wykorzystaniu powlekania lipozomów zagregowanymi immunoglobulinami w celu optymalizacji dostarczania do komórek fagocytamych (Ismail, G., Boxer, L.A. i Bachner, R.L. (1979), Pediatr. Res., 13, 769-773 /Pinkelstein, M.C., Khun, S.H., Schieren, H., Weissmann, G. i Haffstein, S (1980): Liposomer and Immunobiology (Tom, B.H. i Six, H.R. eds) 255-270. Elsevier / North-Holland Publishing Co., Amsterdam).
Dalsze udoskonalenie opisane zostało przez Gregoriadis i Neerunjun (175), Biochem. Biophys. Res. Commun., 65, 537-544, w którym utarczowanie lipozomów zwiększano przez asocjację z komórkowo-specyficznymi przeciwciałami IgG. Wchłanianie lipozomów było 3 do 25-krotnie podwyższone, gdy różnym liniom komórek prezentowano lipozomy zasocjowane z immunoglobulinami IgG wytworzonymi przeciwko tym szczególnym liniom komórek. Jednakże wykorzystane techniki wykazały, że lipozomy tak utarczowane traciły zdolność zlania się z błoną komórkową, co uniemożliwiało skuteczne dostarczanie leków do komórek. (Leserman, L., Weinstein. J.N., Blumenthal, R., Sharrow, S.O. i Texy, W.D., (1979), J. Immunol. 122, 585-591).
Większym udoskonaleniem produkcji układów dostarczania leków było utarczowanie lipozomów białkami wirusowymi: błony lipozomowe były rekonstytuowane białkami, takimi jak hemaglutynina wirusa grypy (Almeida, J.D., Brand, C.M., Edwards, D.C. i Heath, T.P. (1975), Lancet 2, 899-901). Skuteczność i specyficzność wczesnych oddziaływań wirusa z komórkami gospodarza (adsorpcja, penetracja) może być nadana nośnikom lipozomowym przez włączenie odpowiedniego białka wirusowego do błon lipozomowych. Faktycznie, włączenie białek tworzących kolce wirusa Sendai do lipozomowych dwuwarstwowych błon powodowało co najmniej 100-krotny wzrost wchłaniania przez fragment A mysich komórek L toksyny błonicy w porównaniu z lipozomami zawierającymi fragment A bez białek tworzących kolce (Uehida, T., Kim, J., Yamaizumi, M., Miyahe, Y. i Okada, Y. (1979). Celi. Biol. 80, 10-20).
Główną wadę powyższych metod stanowi brak całkowicie aktywnych peptydów hemaglutyniny wirusa grypy, odpowiedzialnych za fuzję. Wirusy grypy A wnikają do komórek ich gospodarza przez fuzję z ich błoną komórkową. Po przyłączeniu się do powierzchni komórki, cząsteczki wirusów wnikają do środka i ulegają przetransportowaniu do endosomów i lizozymów. Kwasowe środowisko w tych organellach aktywuje fuzję pomiędzy błonami wirusa i komórki. Korzyść jaka wynika z fuzji pęcherzyka z komórką przy niskim pH polega na tym, że zawartość pęcherzyka, po wniknięciu, uwalniana jest do cytoplazmy komórek (pH w endosomie wynosi około 5,2). Odkrycie tej indukowanej przez niskie pH fuzji glikoprotein wirusa grypy wywołało liczne próby opracowania efektywnych układów dostarczania leków z lipozomami utarczowanymi hemaglutyniną wirusa grypy.
Kawasaki, K. et al. (Biochemica et Biophysica Acta, (1983), 733, 286-290) stosowali rekonstytuowane pęcherzyki z glikoproteinami hemaglutyniny grypy w fosfatylocholinie z żółtka jaja kurzego/znakowanej spinowo fosfatydylocholinie/cholesterolu (molowy stosunek
170 169
1,6 : 0,4 : 1). Preparaty o właściwym (1:44 i 1:105 mol/mol) stosunku białek do tłuszczowców (lipidów) zawierały pęcherzyki o średnicy 100-300 nm i cechowały się dużą gęstością kolców na powierzchni, miały jednak kilka wad:
1) Z uwagi na wysoką zawartość cholesterolu i resztek detergentów wykazują obniżoną endocytozę przez komórki fagocytame. Sami Kawasaki et al. donosili o 66% aktywności, lecz według nowszych doniesień według udoskonalonych metod testowych, aktywność wynosi jedynie 1%o (!) po 7 minutach (porównaj przykład X, poniżej). Można próbować to wyjaśniać faktem, że stosowany przez Kawasaki et al. Triton X-100 częściowo reaguje z hemaglutyniną i nie ulega całkowitemu usunięciu w wyniku dializy.
2) Aby przebadać szczegółowo rolę składników błony wirusowej konieczne jest istnienie możliwości manipulowania tymi składnikami. Dla tych celów potrzebnajest metoda wydzielania i rekonstytucji wirusowych białek tworzących ich kolce, prowadząca do wytwarzania zrekonstruowanych wirozomów z pełnąbiologiczną zdolnością do fuzji. Pomimo wysiłków Kawasaki et al. rekonstytucja otoczek wirusa grypy, przejawiających pełną zdolność do fuzji biologicznej nie została dotychczas opisana.
3) Nie można wykazać przyłączenia utarczowanych lipozomów - zawierających farmaceutycznie aktywne leki - do określonych komórek w organizmie.
Większość innych sposobów wykorzystywanych do rekonstytucji otoczek wirusowych opartych jest na rozpuszczaniu błony wirusowej za pomocą detergenta i następnie - po sedymentacji wewnętrznych wirusowych białek i materiału genetycznego - usunięciu detergenta z supematantu. Detergenty o wysokim stężeniu krytycznym micelli (cząstek koloidalnych), takie jak oktyloglukozyd, można usuwać skutecznie na drodze dializy. Rekonstytucja z wykorzystaniem oktyloglukozydu opisana została w odniesieniu do wirusa Lasu Semliki (Semliki Forest) - SFV (Helenius, A., Sarvas, M. i Simons, K. (1981), Eur. J. Biochem. 116, 27-35), wirusa zapalenia jamy gębowej u bydła - VSV (Eidelman, O., Schlegel, R., Tralka, T.S. i Blumenthal,
R. (1984), J. Biol. Chem. 259,4622-4628), wirusa grypy (Huang, R.T.C., Wahu, K., Klenk, H.D. i Rou, R. (1980), Virology, 104, 294-302) oraz wirusa Sendai (Harmsen, M.D., Wilschut, J., Scherphof, G., Hulstaert, C. i Hoekstra, D. (1985), Eur. J. Biochem., 149, 591-599). Jednakże w żadnym z wymienionych przypadków nie były wytworzone prawidłowo zrekonstytuowane otoczki wirusów. Dla przykładu, wirozomy otrzymane z wirusa SFV cechowały się stosunkiem białek do lipidów różnym od tego stosunku występującego w błonie wirusowej, a wirozomy wytwarzane z wirusa VSV nie przejawiały zdolności do fuzji biologicznej.
Inny sposób opisany w literaturze polegał na odłączeniu kolców wirusowych od cząsteczek wirusa za pomocą bromelainy. Odzyskiwana w tym sposobie hemaglutynina była przyłączana do lipozomów (Doms, R., Helenius, A. i White, J. (1985), J. Biol. Chem., 260 (5) 2973-2981). Podstawową wadą tego sposobu jest ograniczona biologiczna aktywność takich pęcherzyków będąca następstwem rozszczepienia pod wpływem bromelainy.
Stosując opisane wyżej znane rozwiązania w praktyce, okazało się, że dotychczasowe fosfolipidowe dwuwarstwowe pęcherzyki z peptydami fuzyjnymi i ewentualnie innymi komórkowospecyficznymi markerami na błonie nie mogąbyć stosowanejako efektywny układ podawania leków, bowiem peptydy fuzyjne nie wykazują dostatecznej zdolności do fuzji biologicznej, na skutek czego pęcherzyki nie mogą wnikać do wnętrza komórek docelowych.
Tak więc problem techniczny leżący u podłoża obecnego wynalazku polega na otrzymaniu pęcherzyków, które mogątransportować pożądane leki lub substancje farmakologicznie aktywne do określonych komórek, takich jak makrofagi, komórki helpery T4, komórki mózgowe lub inne komórki wybranych organów, które następnie są całkowicie przyłączane do tych komórek, wchłaniane na drodze fagocytozy lub endocytozy tak, aby bezpośrednio po endocytozie dostarczyć lek do cytoplazmy wybranej pożądanej komórki.
Rozwiązanie tego problemu technicznego osiągnięto zgodnie z wynalazkiem przez otrzymanie wirozomów hemaglutyninowych z wirusów, w postaci fosfolipidowych dwuwarstwowych pęcherzyków zawierających komórkospecyficzne markery na swej błonie, stanowiących otoczkę co najmniej jednej, zawartej w nich substancji farmaceutycznie aktywnej, cechujących
170 169 się tym, że komórko-specyficzne markery mają co najmniej 90% aktywności biologicznej wyznaczanej metodą Luescher'a i Glueck'a, Antiviral Research 14,39-50. Korzystnie zawartość cholesterolu w błonie (membranie) pęcherzyków jest niższa niż 10%, korzystnie nizsza niż 2% wagowo a/lub zawartość detergenta w błonie (membranie) jest niższa niż 10, korzystnie niższa niż 1 ppmld, a średnica pęcherzyka jest mniejsza niż 100 nm, korzystnie około 80 nm. Do komórkospecyficznych markerów należy co najmniej jedno - korzystnie monoklonalne, przeciwciało. Komórko-specyficzne markery wybrane są z grupy obejmującej trimer lub monomer hemaglutyniny, jedną lub obie jej podjednostki otrzymane w wyniku rozszczepienia, glikopeptydy HA1 i HA2, peptyd odpowiedzialny za fuzję wyizolowany ze źródeł naturalnych, syntetyczny “peptyd odpowiedzialny za fuzję”. Korzystnie, hemaglutynina pochodzi z co najmniej jednego źródła, z grupy obejmującej wirusa grypy, korzystnie podtypu A-H1N1, rhabdowirusa, wirusa paragrypy i togawirusa. Korzystnie również, komórko-specyficzne markery obejmują co najmniej jeden peptyd odpowiedzialny za fuzję w formie sekwencji aminokwasów, przy czym co najmniej jeden koniec tej sekwencji tworzy co najmniej jedna grupa cysternowa, korzystnie trzy grupy cysteinowe.
W pęcherzykach takich fosfolipid pochodzi od co najmniej jednego przedstawiciela grupy obejmującej wirus grypy, korzystnie podtypu A-H1N1, rhabdowirus, wirus paragrypy i togawirus w połączeniu z 2 do 100-krotną, korzystnie 5 do 15-krotną ilością fosfatydylocholiny. Korzystnie, fosfolipid w błonie stanowi w 70 do 95°/o wagowo fosfatydylocholina, a w 5 do 30%, korzystnie 10 do 20% wagowo - fosfatydyloetanolamina, oraz że do błony przyłączone jest 5 do 10%, korzystnie 6 do 8% wagowo czynnika sieciującego i co najmniej jeden komórkospecyficzny peptyd fozyjny.
W toku prowadzonych badań nieoczekiwanie okazało się, że poprzez dobór detergenta, a następnie jego dokładne usunięcie w fazie tworzenia pęcherzyków uzyskano opisane wyżej pęcherzyki z nieuszczuplonąaktywnościąbiologicznąpeptydów fuzyjnych i markerów komórkowo-specyficznych.
Sposób wytwarzania fosfolipidowych dwuwarstwowych pęcherzyków z peptydami fuzyjnymi i ewentualnie innymi komórkowo-specyficznymi markerami na błonie oraz zawierających co najmniej jeden lek farmaceutycznie aktywny, obejmujący następujące etapy: a) rozpuszczanie fosfolipidów, korzystnie razem z peptydami fuzyjnymi w obecności środka powierzchniowo czynnego (detergenta), b) dodawanie pożądanego leku lub substancji, c) usuwanie detergenta i tym samym formowanie pęcherzyków, d) poddawanie pęcherzyków dalszej obróbce w celu osiągnięcia przez nie pożądanych rozmiarów, e) dodawanie peptydów fuzyjnych, jeśli nie zostały już wprowadzone w etapie a) i ewentualnie dodawanie innych komórko-specyficznych markerów, korzystnie w kombinacji ze środkiem sieciującym, według wynalazku polega na tym, że przy rozpuszczaniu fosfolipidów stosuje się niejonowy detergent, korzystnie monododecylowy eter glikolu oktaetylenowego, nie reagujący z hemaglutyniną, usuwa się detergent przez kilkakrotne, co najmniej trzykrotne, zadawanie perełkowym mikronośnikiem polistyrenowym i doprowadza się pęcherzyki do pożądanej wielkości na drodze ultrasonifikacji, przy czym peptydy fuzyjne, komórkospecyficzne markery i substancje farmaceutycznie aktywne dobiera się pod kątem doprowadzenia leku do wybranej grupy komórek organizmu pacjenta.
Korzystnie w sposobie według wynalazku stosuje się mikronośnik, który na mokro ma ziarna odpowiadające wielkością sitom o 62 do 387 otworów/cm2 (20-50 mesh) i korzystnie czterokrotnie powtarza się zadawanie tym mikronośnikiem z jednoczesnym wytrząsaniem mechanicznym, a ultrasonifikację prowadzi się do osiągnięcia przez pęcherzyki średnicy od 50 do 100 nm.
Korzystnie, stosuje się roztwór detergenta o stężeniu od 10 do 250, korzystnie pomiędzy 80 a 120 pmoli, a usuwanie detergenta z roztworu prowadzi się przez zastosowanie 1 do 2, korzystnie około 1,5 g perełkowego mikronośnika polistyrenowego na 100 mg detergenta.
Korzystnie, stosuje się peptydy fuzyjne z grupy obejmującej trimer lub monomer hemaglutyniny, jedną lub obie jej podjednostki otrzymane w wyniku rozszczepienia, glikopeptydy HA1 i HA2, peptyd odpowiedzialny za fuzję wyizolowany ze źródeł naturalnych, syntetyczny “peptyd odpowiedzialny za fuzję”.
1710169
Korzystnie, sposobem według wynalazku wytwarza się pęcherzyki zawierające co najmniej jedno - korzystnie monoklonalne, przeciwciało jako komórkospecyficzny marker, stosując korzystnie środek sieciujący, z którym przeciwciało tojest związane w taki sposób, że pozostaje nadal całkowicie biologicznie aktywne.
Korzystnie, stosując hemaglutyninę jako peptyd fuzyjny wybiera się hemaglutyninę pochodzącą z co najmniej jednego źródła z grupy obejmującej wirusa grypy, korzystnie podtypu A-H1N1, rhabdowirusa, wirusa paragrypy i togawirusa.
Korzystnie, stosuje się peptyd fuzyjny obejmujący co najmniej jeden peptyd odpowiedzialny za fuzję w formie sekwencji aminokwasów, przy czym co najmniej jeden koniec tej sekwencji tworzy co najmniej jedna grupa cysternowa, korzystnie trzy grupy cysteinowe.
W sposobie według wynalazku stosuje się fosfolipidy pochodzące od co najmniej jednego przedstawiciela z grupy obejmującej wirus grypy, korzystnie podtypu A-H1N1, rhabdowirus, wirus paragrypy i togawirus w połączeniu z 2 do 100-krotną, korzystnie 5 do 15-krotną ilością fosfatydylocholiny.
Korzystnie stosuje się fosfolipidy zawierające 70 do 95% wagowo fosfatydylocholiny i 5 do 30%, korzystnie 10 do 20% wagowo - fosfatydyloetanolaminy; 5 do 10%, korzystnie 6 do 8% wagowo czynnika sieciującego, korzystnie pochodnej sulfosukcynimidylu, co najmniej jeden peptyd fuzyjny i co najmniej jedno komórko specyficzne przeciwciało związane ze środkiem sieciującym.
Korzystnie sposobem według wynalazku wytwarza się pęcherzyki wypełnione co najmniej jedną substancją wybraną z grupy obejmującej siarczan dekstranu, dimer rybonukleazy, dimer lizozymu, imidazolo-karboksyamid, hydroksy-mocznik, adriplastin, endoxan, fluoro-uracil, colchicine.
Zgodnie z obecnym wynalazkiem w sposobie wytwarzania pożądanych pęcherzyków, szczególnie przystosowanych do fagocytozy, szczególnie krytyczne znaczenie mają następujące etapy:
1. rozpuszczenie jednego lub dwóch fosfolipidów w niejonowym detergencie,
2. tworzenie pęcherzyków na drodze usuwania detergenta na perełkowym mikronośniku polistyrenowym, który na mokro ma ziarna odpowiadające wielkością sitom o 62 do 387 otworów/cm2 (20-50 mesh),
3. wykonywanie określonego ruchu mechanicznego podczas usuwania detergenta,
4. osiąganie pożądanej średnicy pęcherzyków (50-100 nm) metodą ultrasonifikacji.
Realizując sposób według wynalazku otrzymuje się - odmiennie niż w znanym stanie techniki
- fosfolipidowe dwuwarstwowe pęcherzyki z peptydami fuzyjnymi oraz ewentualnie komórkowospecyficznymi markerami, o zachowanej niemal całkowicie aktywności biologicznej, co zapewnia, że stanowią one doskonały, efektywny układ podawania leków do wybranych komórek docelowych.
Zgodnie z powyższym wirozomy z hemaglutyniny wirusów, według wynalazku zawierają lipozom idealny z punktu widzenia endocytozy oraz całkowicie aktywny biologicznie marker komórko-specyficzny, korzystnie glikoproteinę hemaglutyniny wirusa lub jej pochodną lub syntetyczny peptyd zdolny do indukowania natychmiastowej fuzji wskazanego wirozomu po endocytozie przez pożądane komórki.
W innym przykładzie realizacji obecnego wynalazku odpowiedni czynnik sieciujący, ulegający adsorbcji do specyficznego lipozomu, wykorzystuje się w mieszaninie z specyficznym przeciwciałem, skierowanym do odpowiadającego mu receptora w wybranej komórce dla wyindukowania mechanizmu endocytozy, połączonym z czynnikiem sieciującym w taki sposób aby została zachowana jego nieuszczuplona biologiczna aktywność.
W jeszcze dalszym przykładzie realizacji, obecny wynalazek dotyczy sposobu prowadzącego do wytworzenia pęcherzyków, w których część fosfolipidowa stanowi w 70 - 95% fosfatydylocholina i w 5-30% wagowo - inny fosfolipid, taki jak fosfatydyloetanolamina. Zawartość cholesterolu korzystnie wynosi poniżej 1%.
Istotną cechą omawianych pęcherzyków do dostarczania leków jest to, że mają one na powierzchni wymienione aktywne wirusowe glikoproteiny lub ich pochodne i biologicznie aktywne specyficzne przeciwciała zdolne do przyłączenia się do wybranych pożądanych
170 169 komórek, podlegające wchłonięciu przez te komórki na drodze fagocytozy lub endocytozy i indukujące natychmiastową fuzję tych pęcherzyków z wewnętrznymi błonami cytoplazmowymi oraz uwalniające zawartość wirozomu do cytoplazmy tych komórek. Dzięki zachowującym zgodnie z wynalazkiem pełną aktywność peptydom odpowiedzialnym za fuzje leki uwalniane są bezpośrednio po fagocytozie, co pozwala uniknąć niepożądanie długiego okresu przebywania w endocytozomach, mogącego być przyczyną niespecyficznej degradacji substancji farmaceutycznych wprowadzanych w pęcherzykach z hemaglutyniny wirusów sposobem według wynalazku. Przy pH 5, odpowiedzialne za fuzję peptydy pochodzące z wirusa grypy, na powierzchni pęcherzyków podlegają aktywacji w taki sam sposób jak żywe wirusy grypy. Zawartość pęcherzyków jest uwalniana do cytoplazmy jak to ma miejsce z nukleoproteinami uwalnianymi w przypadku wirusa grypy.
Określenie “lipozom” odnosi się do dwuwarstewkowych fosfolipidów o średniej wielkości, otrzymanych na drodze kontrolowanego procesu usuwania detergenta. Wielkość pęcherzyka utwozonego początkowo na skutek usuwania detergenta, zależy od tego detergenta i użytego fosfolipidu, a w niektórych wypadkach także od sposobu i szybkości usuwania detergenta.
Zgodnie z wynalazkiem stosuje się niejonowy i niereagujący z hemaglutyniną detergent.
Detergent ten usuwa się stosując wielokrotnie “perełkowy mikronośnik” polistyrenowy. Określenie to wskazuje na mikroperełkową postać nośnika polistyrenowego, będącego żywicą hydrofobowąo dużym powinowactwie do wybranego niejonowego detergenta. Takajego postać cechuje się dużym rozwinięciem powierzchni ułatwiającym adsorbcję detergenta. Perełkowy mikronośnik polistyrenowy spełnia podwójną funkcję. Zgodnie ze swoją naturą chemiczną adsorbuje detergent. Dodatkowo oddziaływuje mechanicznie: powtarzając wielokrotnie zadawanie takim nośnikiem roztworu fosfolipidów z jednoczesnym wytrząsaniem mechanicznym, zgodnie z obecnym wynalazkiem doprowadza się do usunięcia detergenta także i z wnętrza pęcherzyków. Na skutek tarcia o perełki mikronośnika tworzące się pęcherzyki fosfolipidowe ulegają wielokrotnemu rozrywaniu z uwolnianiem zawartego w nich roztworu, co umożliwia wychwycenie dalszych ilości detergenta przez mikronośnik, tak że całkowita jego zawartość w wytwarzanych finalnie pęcherzykach ulega obniżeniu do ilości poniżej 0,25% wagowych (10 ppmld) korzystnie poniżej 1 ppmld, tj. do ilości niewykrywalnych metodami analitycznymi.
Stosując wskazany łagodny detergent oraz podane warunki jego usuwania zachowuje się pełną aktywność biologiczną peptydów odpowiedzialnych za fuzję i markerów komórkowospecyficznych.
Określenie “peptyd odpowiedzialny za fuzję” odnosi się do glikoprotein tworzących kolce wirusa, zawierających peptyd odpowiedzialny za fuzję. W jednym z przykładów realizacji obecnego wynalazku pod tym określeniem rozumie się kompletny trimer hemaglutyniny tworzący kolce powierzchniowe wirusa lub jeden monomer lub jedną albo obie podjednostki powstałe w wyniku rozpadu - glikopeptydów HA1 i HA2, zawierające funkcyjny peptyd odpowiedzialny za fuzję. W innym przykładzie realizacji wynalazku termin ten odnosi się do peptydu odpowiedzialnego za fuzję jako takiego, wyizolowanego lub wytworzonego metodą syntetyczną. W szczególnie korzystnym przykładzie realizacji obecnego wynalazku te polipeptydy zawierające peptyd odpowiedzialny za fuzję określa się jako hemaglutyniny grypowe, zwłaszcza należące do podtypu A-H1N1.
Określenie “czynnik sieciujący” oznacza cząsteczkę heterofunkcjonalną zdolną do przyłączenia się do powierzchni pęcherzyków wytwarzanych sposobem według wynalazku i zdolną przyłączyć polipeptydy. W korzystnym przykładzie realizacji wynalazku cząsteczką taką jest dwufunkcyjna cząsteczka organiczna zawierająca grupę karboksylową i grupę tiolową, a zwłaszcza S-pochodna sulfosukcynimidylu taka jak S-4-(p-maleinimidofenylo)-maślan, S-octan, S-2-(m-azydo-o-nitrobenzamido)etylo-1,3'-dwutiopropionian, S-6-(4'-azydo-2'-nitrofenyloamino)heksanian, S-(4-azydofenylodwutio)propionian, S-2(p-azydosalicylamido)etylo-1,3' -dwutiopropionian, S-2-(biotynamido)-etylo-1,3'-dwutiopropionian, S-6-(biotynamido)heksa- nian, S-3-(4-hydroksyfenylo)propionian, S-(4-jodoacetylo)aminobenzoesan, S-4-(N-maleimidometylo)cykloheksano-1-karboksylan, chlorowodorek S-2,(2,5,5^’^^tr^i^^t^;y^<^;p;y^o^^I^^1-oksylu.
170 169
Określenie “komórko-specyficzne” białko lub marker odnosi się do białka zdolnego do połączenia się z czynnikiem sieciującym na powierzchni pęcherzyka oraz do połączenia się z receptorem komórek indukującym mechanizm endocytozy.
Poniższe przykłady i rysunki ilustrują wynalazek:
Przykład I. Wytwarzanie pęcherzyków z syntetycznych błon z fosfatydylocholiny z funkcjonalnie czynnymi wirusowymi peptydami odpowiedzialnymi za fuzję w trimerze hemaglutyniny wirusa grypy, zawierających siarczan dekstranu jako lek przeciwwirusowy.
Rysunek fig. 1 ilustruje zasadę postępowania. Graficznie, w postaci okręgów przedstawiono ciekłe roztwory lub zawiesiny, a w postaci kwadratów stałe aglomeraty lub osady. Generalnie:
Roztwór buforu fuzyjnego (FB) zawierający 2700 mg części stałych i zawiesinę hemaglutyniny (HA) zawierającą 46 mg HA oraz 31,1 pmola wirusowych fosfolipidów (VPL) zmieszano i poddano ultraodwirowaniu (UC1). Otrzymany aglomerat rozpuszczono w roztworze III zawierającym bufor fuzyjny FB i monododecylowy eter glikolu oktaetylenowego OEG jako łagodny detergent. W wyniku kolejnego ułtraodwirowania (UC2) otrzymano supernatant IV, zawierający FB, HA, VPL i OEG. Do roztworu tego dodano lek przeciwwirusowy - siarczan dekstranu (DS) otrzymując roztwór V. W międzyczasie roztwór fosfatydylocholiny (PC) roztwór VI poddano suszeniu próżniowemu w obrotowej kolbie okrągłodennej wytwarzając cienką warstwę PC na wewnętrznej powierzchni tej kolby, do której następnie wprowadzono roztwór V, otrzymując roztwór VII. Roztwór VII trzykrotnie zadano perełkowym mikronośnikiem polistyrenowym (PBM) w celu usunięcia detergenta OEG otrzymując roztwór VIII, w którym na drodze ultrasonifikacji (US) wytwarza się pęcherzyki (VES) żądanej wielkości. Otrzymanązawiesinę IX rozcieńczono roztworem NaCl X otrzymując zawiesinę leku (DR).
Bardziej szczegółowo:
Przygotowano roztwór buforu fuzyjnego (I) o następującym składzie: 7,9 mg NaCl/ml, 4,4 mg/ml dwuwodzianu cytrynianu trójsodowego, 2,1 mg/ml 2-jednowodzianu kwasu morfolinoetanosulfonowego (MES) i 1,2 mg/ml kwasu N-hydroksyetylo-piperazino-N'-2-etanosulfonowego w wodzie H2O (pH doprowadzonym do 7,2 IN roztworem NaOH).
Wirus grypy (linia A/Shanghai/16/89(H3N2)) namnażano w kosmówkowo-owodniowych zarodkachjaj kurzych, hodowlę oczyszczano dwukrotnie na drodze ultrawirowania w gradiencie sacharozy, sposobem opisanym przez Skehel i Schild w 1971 r. (Virology 44, 396-408). Oczyszczona zawiesina wirionów grypy (II) zawierała 266 pg hemaglutyniny wirusa grypy w mililitrze oraz ogółem 31,1 pmola wirusowych fosfolipidów, które oznaczono w następujący sposób:
Fosfolipidy wirusowe ekstrahowano według Folch'a et al. (Folch, J., Lees, M. i Sloane,
S. G.H. (1957), J. Biol. Chem. 226,497-509). W celu analizy fosfolipidów niższą fazę organiczną odparowano a pozostałość albo poddawano oznaczaniu fosforanów (wg. Chen, P.S., Toribara,
T. Y. i Werner, H. (1956), Anal. Chem. 28, 1756-1758), albo rozpuszczano w niewielkiej objętości mieszaniny chloroform-metanol w celu przeprowadzenia następnie analizy fosfolipidów metodą chromatografii cienkowarstwowej. Stosowano płytki żelu krzemionkowego (Merck) i rozwijano układem rozpuszczalników chloroform - metanol - kwas octowy - woda w stosunkach objętościowych 25:15:4:2. Poszczególne fosfolipidy były wizualizowane przez wystawienie na działanie jodu a następnie identyfikowano na podstawie wartości ich RF (przez porównanie z próbkami referencyjnymi). Białko oznaczano zmodyfikowaną metodą Lowry'ego (Peterson, G.L. (1977) Anal. Biochem. 83, 346-356).
173 ml roztworu II zmieszano z takąsamąobjętościąopisanego wcześniej roztworu buforu fuzyjnego I. To rozcieńczenie wirusa grypy przekształcano w aglomerat metodą ultrawirowania przy 100 000 x g przez 10 minut.
15,3 ml roztworu detergenta zawierającego 54 mg/ml (=100 pmoli/ml) monododecylowego eteru glikolu oktaetylenowego (OEG) w wskazanym wyżej roztworze buforu fuzyjnego dodano do aglomeratu wirusa grypy. To odpowiada 18 pg = 33,3 nmole OEG na 1 pg aglomeratu. Po 10 minutach, aglomerat uległ całkowitemu rozpuszczeniu. Roztwór poddano ultraodwirowaniu przy 100 000 x g przez 1 godzinę. 3 000 mg wysuszonego leku przeciwwirusowego siarczanu
170 169 dekstranu (Lueschr, M. i Glueck, R., Antiviral Research 14, 39-50) dodano do otrzymanego supematantu IV zawierającego rozpuszczony trimer hemaglutyniny grypy i nieistotne pozostałości neuraminidazy oraz inne składniki tworząc łącznie roztwór V.
Fosfatydylocholinę (SIGMA) rozpuszczono w mieszaninie chloroformu i metanolu w stosunku 2:1 do stężenia 10 mg/ml. 28 ml tego roztworu VI ostrożnie odparowano stosując próżnię w wyparce obrotowej, tak że wytworzono cienką warstwę fosfolipidu o łącznej masie 280 mg na wewnętrznej ściance kolby okrągłodennej.
Roztwór V dodano następnie do warstwy fosfolipidów w kolbie okrągłodennej. Po wytrząsaniu przez minimum 15 minut i całkowitym rozpuszczeniu fosfatydylocholiny otrzymany roztwór VII przeniesiono do pojemnika szklanego wraz z 4,8 g perełkowego mikronośnika polistyrenowego PBM, który na mokro ma ziarna odpowiadające wielkością sitom o 97 do 387 otworów/cm2 (25-50 mesh).
Pojemnik następnie wytrząsano w taki sposób, że zawartość przesuwała się dwukrotnie na sekundę z jednego jego końca na drugi. Godzinę później zawiesinę odciągnięto za pomocą cienkiej pipety i przeniesiono do nowego pojemnika zawierającego 2,4 g perełkowego mikronośnika polistyrenowego tych samych rozmiarów. Kolumnę wytrząsano przez 3 0 minut. T akie postępowanie powtórzono dwa razy. Po ostatnim etapie otrzymany roztwór VIII oddzielono od nośnika, utrwalono w kąpieli wodnej i poddano ultrasonifikacji (za pomocą urządzenia Bransonic, Branson Europe BV, częstotliwość 50 kHz ± 10%). Dziesięciosekundowy wstrząs naddźwiękowy powtórzono dwukrotnie, po przerwach 10 sekundowych każda, otrzymując średniej wielkości pęcherzyki o średnicy około 50- 100 nm. Końcowy roztwór IX rozcieńczono następnie 1:100 fizjologicznym roztworem NaCl X.
Przykład II. Wytwarzanie pęcherzyków z błon syntetycznych zawierających jako lek przeciwwirusowe przeciwciała zaadsorbowane w trimerach hemaglutyniny wirusa grypy i monoklonalne przeciwciała CD4.
Pęcherzyki wytwarzano w sposób opisany w przykładzie I, z następującą modyfikacją: zamiast 10 mg jedynie 9 mg fosfatydylocholiny i dodatkowo 1 mg fosfatydyloetanolaminy (kefaliny) na ml rozpuszczono w mieszaninie 2:1 chloroformu i metanolu.
Po wytworzeniu pęcherzyków hemaglutyninowych jak w przykładzie I, do roztworu dodano 20 mg maślanu sulfosukcynimidylo-4-(N-maleimidofenylo)owego (SMPB jako czynnika sieciującego rozpuszczonego w 2 ml wody. Po jednogodzinnym łagodnym wytrząsaniu w temperaturze pokojowej pęcherzyki zaglomerowano na drodze ultrawirowania przez 10 minut przy 100 000 x g.
ml Anty-Leu (Becton & Dickinson) dodano do aglomeratu. Ponownie przeprowadzony w postać zawiesiny materiał ostrożnie wytrząsano przez kilka sekund co 5 minut przez godzinę w temperaturze pokojowej. W końcu materiał zaglomerowano ponownie (w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał) przez ultraodwirowanie przy 100 000 x g przez 10 minut. Pęcherzyki następnie ponownie przeprowadzono w formę zawiesiny w 1500 ml roztworu fizjologicznego NaCl.
Przykład III. Powtórzono postępowanie jak w przykładzie II z następującymi modyfikacjami:
Zamiast siarczanu dekstranu do roztworu IV (porównaj przykład I) dodano po 1000 mg imidazolikarboksamidu i hydroksy-mocznika (środków farmaceutycznych skutecznych przeciwko melanomom według Brunner'a i Nagel'a, Springerverlag, wydanie drugie, Intemistische Krebstherapie, str. 93 (1979)).
Po dodaniu czynnika sieciującego i dalszym postępowaniu zgodnie z przykładem II, do roztworu pęcherzyków VES dodano 1 mg monokłonalnego przeciwciała (albo R 24 według opisu Houghton, A.N. et al. (185), Proc. Nat. Ac. Sc. Vol. 82, str. 1242, albo 0,5 mg L55 + 0,5 mg L72 według opisu Irick, R.S. et al., Lancet (1989) str. 786-787) otrzymując kompozycje odpowiadającą 1000 dawkom ludzkim o następującym składzie mg hemaglutyniny,
250 mg fosfotydylocholiny, mg fosfatydyloetanoloaminy (kefaliny),
170 169 mg czynnika sieciującego (Sulfo-SMPB), mg przeciwciała monoklonalnego,
1000 mg imidazolokarboksamidu
1000 mg hydroksy-mocznika.
Wymienione środki farmaceutyczne, dotychczas tradycyjnymi metodami podawania stosowano w dawkach ilościowo pięciokrotnie wyższych, co oznacza, ze powyższa mieszanina wystarczyłaby na jedynie 200 dawek ludzkich.
Przykład IV. Powtórzono postępowanie jak w przykładzie II z następującymi modyfikacjami:
Zamiast siarczaniu dekstranu, do roztworu IV (porównaj przykład I) dodano po 1000 mg co najmniej jednego z następujących środków farmaceutycznych: adriplastin, endoxan, fluorouracil (według opisu Nrunner'a i Nagel'a Intemistiche Krebstherapie, Springerverlag, wydanie drugie, str. 309, 1979) i colchicine (SIGMA).
Po dodaniu środka sieciującego i prowadzeniu dalszego postępowania w sposób opisany w przykładzie II, do roztworu pęcherzyków VES dodano 1 mg przeciwciała monoklonalnego JDB1 (według opisu Strelkauskas, A.J., Cancer-Immunol Immunother. Vol. 23, str. 31, 1986) otrzymując mieszaninę o następującym składzie stanowiąca 1000 ludzkich dawek przeciwko rakom piersi:
mg hemaglutyniny,
250 mg fosfatydylocholiny, mg fosfatydyloetanolaminy, mg czynnika sieciującego (Sulfo-SMPB), mg przeciwciała monoklonalnego,
1000 mg farmaceutyku adriplastin,
1000 mg farmaceutyki endoxan,
1000 mg farmaceutyku fluoro-uracil.
Przykład V. Powtórzono postępowanie jak opisano w przykładach I i II z następującymi modyfikacjami:
Zamiast trimerów hemaglutyniny grypy wykorzystano monomery z peptydami odpowiedzialnymi za fuzję. Monomer hemaglutyniny-2 z peptydem odpowiedzialnym za fuzję otrzymano przez rozerwanie mostków S-H na drodze redukcji D4-dwutiotreitolem (DTT, SIGMA) i następujący po tym rozdział od peptydu hemaglutynin-1-owego metodą chromatografu żelowej (sephadex G 50) przy pH 6. Zawiesina oczyszczonego monomeru hemaglutyniny-2 zawierała 180 pg monomerów z peptydem fuzyjnym.
Przykład VI. Powtórzono postępowanie opisane w przykładzie II z następującymi modyfikacjami:
Zamiast trimerów hemaglutyniny grypy wykorzystano surowy peptyd odpowiedzialny za fuzję. Peptyd odpowiedzialny za fuzję z hemaglutyniny wirusa grypy wykorzystano do wytworzenia syntetycznych pęcherzyków membranowych na drodze syntezy chemicznej. Do użycia kwalifikuje się każda spośród sekwencji aminokwasów przedstawionych na rysunku fig. 2. Układ co najmniej jednej, korzystnie trzech grup cysternowych na jednym końcu odpowiedniej sekwencji aminokwasów okazał się przydatny dla aktywności fuzyjnej.
Stężenie roztworu każdego z tych syntetycznych peptydów fuzyjnych wynosiło 4 pg/ml.
Pęcherzyki zawierające jeden z wyżej wskazanych peptydów fuzyjnych otrzymano w następujący sposób:
Sporządzono roztwór w mieszaninie 2:1 chloroformu i metanolu zawierający 9 mg fosfatydylocholiny i 1 mg fosfatydyloetanoloaminy w każdym mililitrze. 28 ml tego roztworu ostrożnie odparowano pod próżnią w wyparce obrotowej uzyskując cienką warstewkę fosfolipidowąna wewnętrznej powierzchni kolby okrągłodennej.
g siarczaniu dekstranu rozpuszczono w 15,3 ml roztworu detergenta zawierającego 100 pmoli monododecylowego eteru glikolu octaetylenowego w 1 ml buforu fuzyjnego. Roztwór ten wprowadzono do kolby okrągłodennej, którą uprzednio pokryto od wewnątrz warstewką
170 169 fosfolipidów. Po wytrząsaniu przez co najmniej 15 minut i całkowitym rozpuszczeniu warstwy fosfolipidowej roztwór przeniesiono do pojemnika szklanego z 4,8 g perełkowego mikronośnika polistyrenowego, który na mokro ma ziarna odpowiadające wielkością sitom o 97 do 387 otworów/cm2 (25-50 mesh).
Następnie pojemnik wstrząsano tak, że jego zawartość przesuwała się dwa razy na sekundę z jednego końca pojemnika na drugi. Po godzinie zawiesinę odpipetowano cienką pipetą i przeniesiono do nowego pojemnika z 2,4 g perełkowego mikronośnika polistyrenowego tej samej wielkości. Ten pojemnik wytrząsano przez 30 min. Takie postępowanie powtórzono dwukrotnie. Po ostatnim etapie otrzymany roztwór oddzielono od nośnika, utrwalono w kąpieli wodnej i poddano ultrasonifikacji przy użyciu urządzenia Bransonic, Branson Europę BV, częstotliwość 50 kHz ± 10%. Dziesięciosekundowe wstrząsy naddźwiękowe powtórzono dwukrotnie po przerwach trwających po 10 sekund, otrzymując pęcherzyki średniej wielkości, o średnicy około 50-100 nm.
Roztwór 20 mg sulfo-SMPB (Pierce) w 2 ml wody dodano do otrzymanej zawiesiny. Całość łagodnie wytrząsano przez godzinę w temperaturze pokojowej, po czym zagregowano pęcherzyki przez 15 minutowe ultraodwirowanie przy 100 000 x g.
Do zagregowanych pęcherzyków dodano 2 ml roztworu syntetycznego peptydu odpowiedzialnego za fuzję. Materiał ponownie przeprowadzono w postać zawiesiny i ostrożnie wytrząsano w temperaturze pokojowej po kilka sekund co 5 minut przez godzinę. W końcu materiał ponownie zaglomerowano (w celu usunięcia niezwiązanego peptydu fuzyjnego) na drodze ułtraodwirowania przy 100 000 x g przez 10 minut. Cząstki zaglomerowane przeprowadzono w postaci zawiesiny dodając 200 ml fizjologicznego roztworu NaCl.
Przykład VII. Powtórzono postępowanie opisane w przykładzie VI z następującymi modyfikacjami:
Do aglomeratu pęcherzyków dodano 2 ml roztworu zawierającego 2 pg syntetycznego peptydu fuzyjnego i 2 ml roztworu zawierającego 100 pg Anty-Leu 3A. Przeprowadzona w postać zawiesiny mieszanina poddawana była ostrożnemu wytrząsaniu w temperaturze pokojowej po kilka sekund co 5 minut przez godzinę. W końcu materiał ponownie zaglomerowano (w celu usunięcia niezwiązanych peptydów fuzyjnych i komórkospecyficznych) na drodze ułtraodwirowania przy 100 000 x g przez 10 minut. Aglomerat przeprowadzono ponownie w postać zawiesiny dodając 200 ml fizjologicznego roztworu NaCl.
Przykład VIII. Postępując jak w przykładach od I do IV wytworzono pęcherzyki z peptydami odpowiedzialnymi za fuzję lub hemaglutymnąwirusów paragrypy, togawirusów lub rhabdowirusów.
a) Rhabdowirus wścieklizny (Rhabdovirus rabies) namnazano w ludzkich komórkach diploidalnych. Zebrane hodowle (supematanty) zawierające 107 wirusów wścieklizny w ml oczyszczono i zatężono w gradiencie sacharozy przez ultraodwirowanie. Zawiesina oczyszczonych wirusów wścieklizny zawierała 210 pg hemaglutyniny wirusa wścieklizny w ml. Przetwarzano ją dalej w sposób podany w przykładzie I.
b) Wirus paragrypy typu III namnażano w kosmówkowo-owodniowych zarodkach kurzych i oczyszczano dwukrotnie przez ultraodwirowanie w gradiencie sacharozy jak w przykładzie I. Oczyszczona zawiesina wirionów paragrypy zawierała 245 p g hemaglutyniny wirusa paragrypy w ml i była przetwarzana według przykładu I.
c) Togawirus różyczki (togavirus rubella) namnażano w ludzkich komórkach diploidalnych i oczyszczano w sposób opisany wyżej w punkcie a). Oczyszczona zawiesina wirionów wirusa różyczki zawierała 205 pg hemaglutyniny wirusa różyczki w ml i przetwarzana była według przykładu I.
Przykład IX. Leki przeciwwirusowe przygotowano w sposób opisany w przykładzie I. Myszom SCID rekonstytuowanym immunologicznie przy pomocy ludzkich PBL podawano przez 14 dni dimer rybonukleazy przez 10 dni alternatywnie jedynie roztwór buforu fosforanowego (ślepa próba), siarczan dekstranu lub dimer rybonukleazy (otrzymany jak w przykładzie I zgłoszenia PCT/US/90/00141) w trzech różnych dawkach, siarczan dekstranu w lipozomach
170 169 lub dimer rybonukleazy w lipozomach (dwa ostatnie preparaty wytworzone jak w przykładzie I obecnego zgłoszenia). Podawanie leków rozpoczęto w tym samym momencie co zakażenie wirusem HTV-1iiib w dawce odpowiadającej 100 TCID50. Myszy biorące udział w doświadczeniach zabito w celu ustalenia postępu infekcji (wyodrębnienie wirusa i wykrywania prowirusowych sekwencji metodąPCR) w 2,4 i 6 tygodni od zakażenia wirusem. Zebrano wyniki badań wskazujące procent zwierząt w każdej badanej grupie z których można było wyizolować wirusa:
roztwór buforu fosforanowego (ślepa próba) 80% dimer rybonukleazy 0,001 mg/kg 92% dimer rybonukleazy 0,1 mg/kg 30% dimer rybonukleazy 10,0 mg/kg 63% siarczan dekstranu 10 mg/kg 33% siarczan dekstranu 10 mg/kg w lipozomach 14% dimer rybonukleazy w lipozomach 25%
Uzyskane wyniki wskazują, że większość myszy SCID rekonstytuowanych ludzkim PBL, którym podawano badane substancje chroniona była przed infekcją, która następowała 12 godzin po wstrzyknięciu 0,1 mg/kg dimeru rybonukleazy, 10 mg/kg siarczanu dekstranu, lipozomów zawieraj ących dimer rybonukleazy i lipozomów zawieraj ących siarczan dekstranu. Ochrona była marginalna przy podawaniu dimeru rybonukleazy w dawce 10,0 mg/kg, co może być spowodowane tym, że w wyższych dawkach dimer rybonukleazy działa immunosupresyjnie. Nie zaobserwowano działania ochronnego dimeru rybonukleazy w dawce 0,001 mg/kg. Jednakże przy zastosowaniu dimeru rybonukleazy w lipozomach według wynalazku skuteczność wzrosła z 63% do 25% pomimo wysokiej dawki. Dalszej poprawy oczekiwać można po zastosowaniu dawki optymalnej w lipozomach.
Takie same obserwacje poczyniono gdy myszy ze źle funkcjonującymi graftami ludzkich PBL pod koniec eksperymentu wyłączono z analizy, chociaż wynika z analizy poziomu ludzkich immunoglobulin i wyników otrzymanych metodą PCR z zastosowaniem β-globiny, że podawanie albo dimeru rybonukleazy w lipozomach albo siarczaniu dekstranu w lipozomach kolidowało z przetrwaniem komórek ludzkich. Wykluczenie myszy SCID z ludzkim PBL na podstawie ludzkich funkcji pozwala na rozróżnienie pomiędzy działaniem przeciwwirusowym a aktywnością immunomodulacyjną.
Przykład X. W próbie fuzji opisanej przez Luescher'a i Glueck'a (1990 (Antiviral Research 14, 39-50) pęcherzyki wytworzone jak w przykładzie I powyżej porównano z rekonstytuowanymi pęcherzykami grypy wytworzonymi sposobem podanym przez Kawasaki et al. pod względem aktywności fuzji z modelowymi membranami:
Na rysunku fig. 3 przedstawiono kinetykę przywrócenia fluorescencji wirusa grypy znakowanego R18 za pomocą DOPC-cholesterolowych lipozomów. Wzrost fluorescencji wyrażono w % FDQ, obliczonych według Luescher'a i Glueck'a (porównaj wyżej).
Początkowa szybkość fuzji została obliczona ze stycznych do krzywych fuzji w czasie 0, gdy fuzja jest zapoczątkowywana (linia kropkowana na rysunku fig. 3). Krzywa 2 odpowiada aktywności fuzji pęcherzyków otrzymanych sposobem Kawasaki et al.

Claims (10)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sposób wytwarzania fosfolipidowych dwuwarstwowych pęcherzyków z peptydami fuzyjnymi i ewentualnie innymi komórkowo-specyficznymi markerami na błonie oraz zawierających co najmniej jeden lek farmaceutycznie aktywny, obejmujący następujące etapy:
    a) rozpuszczanie fosfolipidów, korzystnie razem z peptydami fuzyjnymi w obecności środka powierzchniowo czynnego (detergenta), b) dodawanie pożądanego leku lub substancji, c) usuwanie detergenta i tym samym formowanie pęcherzyków, d) poddawanie pęcherzyków dalszej obróbce w celu osiągnięcia przez nie pożądanych rozmiarów, e) dodawanie peptydów fuzyjnych, jeśli nie zostały już wprowadzone w etapie a) i ewentualnie dodawanie innych komórko-specyficznych markerów, korzystnie w kombinacji ze środkiem sieciującym, znamienny tym, że przy rozpuszczaniu fosfolipidów stosuje się niejonowy detergent, korzystnie monododecylowy eter glikolu oktaetylenowego, nie reagujący z hemaglutyniną, usuwa się detergent przez kilka-krotne, co najmniej trzykrotne, zadawanie perełkowym mikronośnikiem polistyrenowym, i doprowadza się pęcherzyki do pożądanej wielkości na drodze ultrasonifikacji, przy czym peptydy fuzyjne, komórkospecyficzne markery i substancje farmaceutycznie aktywne dobiera się pod kątem doprowadzenia leku do wybranej grupy komórek organizmu pacjenta.
  2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się mikronośnik, który na mokro ma korzystnie ziarna odpowiadające wielkością sitom o 62 do 387 otworów/cm2 (20-50 mesh) i korzystnie czterokrotnie powtarza się zadawanie tym mikronośnikiem z jednoczesnym wytrząsaniem mechanicznym, a ultrasonifikację prowadzi się do osiągnięcia przez pęcherzyki średnicy od 50 do 100 nm.
  3. 3. Sposób według zastrz. 1 lub 2, znamienny tym, że stosuje się roztwór detergenta o stężeniu od 10 do 250, korzystnie pomiędzy 80 a 120 gmoli, a usuwanie detergenta z roztworu prowadzi się przez zastosowanie 1 do 2, korzystnie około 1,5 g perełkowego mikronośnika polistyrenowego na 100 mg detergenta.
  4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się peptydy fuzyjne z grupy obejmującej trimer lub monomer hemaglutyniny, jedną lub obie jej podjednostki otrzymane w wyniku rozszczepienia, glikopeptydy HA1 i HA2, peptyd odpowiedzialny za fuzję wyizolowany ze źródeł naturalnych, syntetyczny “peptyd odpowiedzialny za fuzję”.
  5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako komórkospecyficzny marker wprowadza się co najmniej jedno - korzystnie monoklonalne, przeciwciało, korzystnie stosując środek sieciujący, z którym przeciwciało to jest związane w taki sposób, że pozostaje nadal całkowicie biologicznie aktywny.
  6. 6. Sposób według zastrz. 1 albo 4, znamienny tym, że stosując hemaglutyninę jako peptyd fuzyjny wybiera się hemaglutyninę pochodzącą z co najmniej jednego źródła z grupy obejmującej wirusa grupy, korzystnie podtypu A-HiNi, rhabdowirusa, wirusa paragrypy i togawirusa.
  7. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się peptyd fuzyjny obejmujący co najmniej jeden peptyd odpowiedzialny za fuzję w formie sekwencji aminokwasów, przy czym co najmniej jeden koniec tej sekwencji tworzy co najmniej jedna grupa cysteinowa, korzystnie trzy grupy cysternowe.
  8. 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się fosfolipidy pochodzące od co najmniej jednego przedstawiciela z grupy obejmującej wirus grypy, korzystnie podtypu A-H1N1, rhabdowirus, wirus paragrypy i togawirus w połączeniu z 2 do 100-krotną, korzystnie 5 do 15-krotną ilością fosfatydylocholiny.
  9. 9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się fosfolipidy zawierające 70 do 95% wagowo fosfatydylocholiny i 5 do 30%, korzystnie 10 do 20% wagowo - fosfatydyloetano17O 169 laminy; 5 do 10%, korzystnie 6 do 8% wagowo czynnika sieciującego, korzystnie pochodnej sulfosukcynimidylu, co najmniej jeden peptyd fUzyjny i co najmniej jedno komórkospecyficzne przeciwciało związane ze środkiem sieciującym.
  10. 10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wytwarza się pęcherzyki wypełnione co naj mniej j edną substancj ą wybraną z grupy obej muj ącej siarczan dekstranu, dimer rybonukleazy, dimer lizozymu, imidazolo-karboksamid, hydroksy-mocznik, adriplastin, endoxan, fluorouracil, colchicine.
PL92296382A 1991-02-02 1992-01-17 Artificial membrane beads containing functionally active peptides responsible for fusion as a drug administering system PL170169B1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP91101414A EP0497997B1 (en) 1991-02-02 1991-02-02 Synthetic membrane vesicles containing functionally active fusion peptides as drug delivery systems
PCT/EP1992/000089 WO1992013525A1 (en) 1991-02-02 1992-01-17 Synthetic membrane vesicles containing functionally active fusion peptides as drug delivery systems

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PL170169B1 true PL170169B1 (en) 1996-10-31

Family

ID=8206362

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL29638291A PL296382A1 (en) 1991-02-02 1991-01-17 Artificial membrane beads containing functionally active peptides responsible for fusion as a drug administering system
PL92296382A PL170169B1 (en) 1991-02-02 1992-01-17 Artificial membrane beads containing functionally active peptides responsible for fusion as a drug administering system

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL29638291A PL296382A1 (en) 1991-02-02 1991-01-17 Artificial membrane beads containing functionally active peptides responsible for fusion as a drug administering system

Country Status (22)

Country Link
US (1) US6040167A (pl)
EP (1) EP0497997B1 (pl)
JP (1) JP3404037B2 (pl)
KR (1) KR100205693B1 (pl)
AT (1) ATE125154T1 (pl)
AU (1) AU657730B2 (pl)
BG (1) BG61215B1 (pl)
BR (1) BR9204116A (pl)
CA (1) CA2079685C (pl)
DE (1) DE69111414T2 (pl)
DK (1) DK0497997T3 (pl)
ES (1) ES2077086T3 (pl)
FI (1) FI109969B (pl)
GE (1) GEP20002229B (pl)
GR (1) GR3017490T3 (pl)
HK (1) HK56696A (pl)
HU (1) HU215533B (pl)
NO (1) NO306194B1 (pl)
PL (2) PL296382A1 (pl)
RO (1) RO114736B1 (pl)
RU (1) RU2125868C1 (pl)
WO (1) WO1992013525A1 (pl)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69116144T2 (de) * 1991-02-14 1996-05-09 Baxter Int Bindung substratspezifischer affinitätssubstanzen an liposomen
US5603872A (en) * 1991-02-14 1997-02-18 Baxter International Inc. Method of binding recognizing substances to liposomes
US5879656A (en) * 1993-10-26 1999-03-09 Thomas Jefferson University Methods of treating metastatic colorectal cancer with ST receptor binding compounds
US7097839B1 (en) 1993-10-26 2006-08-29 Thomas Jefferson University ST receptor binding compounds and methods of using the same
EP0762870B1 (en) * 1994-05-31 2002-09-11 INEX Pharmaceutical Corp. Virosome-mediated intracellular delivery of therapeutic agents
US6861053B1 (en) * 1999-08-11 2005-03-01 Cedars-Sinai Medical Center Methods of diagnosing or treating irritable bowel syndrome and other disorders caused by small intestinal bacterial overgrowth
US5908777A (en) * 1995-06-23 1999-06-01 University Of Pittsburgh Lipidic vector for nucleic acid delivery
WO1997004748A2 (en) * 1995-08-01 1997-02-13 Advanced Therapies, Inc. Enhanced artificial viral envelopes for cellular delivery of therapeutic substances
HUP9901790A3 (en) * 1996-05-08 2010-11-29 Nika Health Products Ltd Cationic virosomes as transfer system for genetic material
US7148324B1 (en) 1998-12-14 2006-12-12 Dendreon Corporation Compositions and methods for enhancement of major histocompatibility complex class I restricted antigen presentation
NZ512807A (en) * 1998-12-14 2003-10-31 Dendreon Corp Compositions and methods for enhancement of major histocompatibility complex class 1 restricted antigen presentation by attaching the antigen to a specific peptide
AU762006B2 (en) 1998-12-24 2003-06-19 Ucb Peptidic product, process and composition
SK4782002A3 (en) * 1999-10-08 2002-09-10 Nika Health Products Ltd Lipidic vesicles, a method for the manufacture thereof pharmaceutical composition containing the same and use thereof
WO2001044023A1 (de) * 1999-12-17 2001-06-21 Duerschinger Guenter Induktiv aktivierbare zündkapsel für insassen-rückhaltesysteme und prüfschaltung für diese zündkapsel
US20040028687A1 (en) * 2002-01-15 2004-02-12 Waelti Ernst Rudolf Methods and compositions for the targeted delivery of therapeutic substances to specific cells and tissues
US20040176283A1 (en) * 2002-04-01 2004-09-09 Robinson John A. Methods and compositions for the design of synthetic vaccines
ATE476963T1 (de) * 2002-04-29 2010-08-15 Biotesys Gmbh Polymerisierte peptid-modifizierte lipide als biologische transportsysteme für mikronutrients
EP1447080A1 (en) * 2003-02-13 2004-08-18 Bestewil Holding B.V. Method for producing virosome-like particles
US8658203B2 (en) 2004-05-03 2014-02-25 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Liposomes useful for drug delivery to the brain
ES2967961T3 (es) 2004-05-03 2024-05-06 Ipsen Biopharm Ltd Liposomas útiles en la administración de fármacos
US20070160658A1 (en) * 2005-10-20 2007-07-12 The Penn State Research Foundation Delivery system for diagnostic and therapeutic agents
EP2839837B1 (en) * 2006-09-15 2019-05-08 Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute Inc. Oncolytic farmington rhabdovirus
BR122021024957B1 (pt) 2015-10-16 2023-12-12 Ipsen Biopharm Ltd Processos de produção de uma composição de irinotecano lipossômico estabilizado em armazenamento

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0047480B1 (en) * 1980-09-05 1986-02-05 Institut Armand Frappier Formation of an immunosome exclusively made of viral antigens reconstituted on an artificial membrane
US4871488A (en) * 1985-04-22 1989-10-03 Albany Medical College Of Union University Reconstituting viral glycoproteins into large phospholipid vesicles
US4663161A (en) * 1985-04-22 1987-05-05 Mannino Raphael J Liposome methods and compositions
US4790987A (en) * 1985-11-15 1988-12-13 Research Corporation Viral glycoprotein subunit vaccine
US5000960A (en) * 1987-03-13 1991-03-19 Micro-Pak, Inc. Protein coupling to lipid vesicles
IL86650A0 (en) * 1987-06-30 1988-11-30 Biophor Corp Animal derived cells and liposomes,having an antigenic protein incorporated into their membrane
WO1991003258A1 (en) * 1989-09-01 1991-03-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoliposomes for transmittal of activating signals to cells
AU652778B2 (en) * 1990-10-15 1994-09-08 Quest International B.V. Treatment composition

Also Published As

Publication number Publication date
BG61215B1 (en) 1997-03-31
NO923703L (no) 1992-11-26
RU2125868C1 (ru) 1999-02-10
HU215533B (hu) 1999-01-28
NO923703D0 (no) 1992-09-24
WO1992013525A1 (en) 1992-08-20
DE69111414T2 (de) 1996-02-01
DK0497997T3 (da) 1995-11-27
HUT66194A (en) 1994-10-28
PL296382A1 (en) 1993-11-02
EP0497997A1 (en) 1992-08-12
AU657730B2 (en) 1995-03-23
KR100205693B1 (en) 1999-07-01
FI109969B (fi) 2002-11-15
ES2077086T3 (es) 1995-11-16
GR3017490T3 (en) 1995-12-31
CA2079685A1 (en) 1992-08-03
NO306194B1 (no) 1999-10-04
FI924418A (fi) 1993-04-03
BR9204116A (pt) 1993-06-08
HK56696A (en) 1996-04-12
FI924418A0 (fi) 1992-10-01
HU9203141D0 (en) 1992-12-28
ATE125154T1 (de) 1995-08-15
RO114736B1 (ro) 1999-07-30
JP3404037B2 (ja) 2003-05-06
GEP20002229B (en) 2000-09-25
US6040167A (en) 2000-03-21
CA2079685C (en) 2001-11-27
JPH05505406A (ja) 1993-08-12
DE69111414D1 (de) 1995-08-24
BG96928A (bg) 1994-03-24
EP0497997B1 (en) 1995-07-19
AU1169392A (en) 1992-09-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL170169B1 (en) Artificial membrane beads containing functionally active peptides responsible for fusion as a drug administering system
Zhou et al. Induction of cytotoxic T lymphocytes in vivo with protein antigen entrapped in membranous vehicles.
Gregoriadis Liposomes for drugs and vaccines
WO1997038010A2 (en) Fusogenic liposomes
WO1997038010A9 (en) Fusogenic liposomes
AU4221489A (en) Affinity associated vaccine
US4148876A (en) Biological preparations
JP2000509404A (ja) 遺伝物質の導入システムとしてのカチオン性ヴィロソーム
CA1079634A (en) Antigens bound to exterior surface of microvesicles
de Jonge et al. Use of a dialyzable short-chain phospholipid for efficient solubilization and reconstitution of influenza virus envelopes
Hu et al. Alum as an adjuvant for nanoparticle based vaccines: A case study with a hybrid nanoparticle-based nicotine vaccine
Ali et al. Virosome: An engineered virus for vaccine delivery
Schoen et al. Delivery of foreign substances to cells mediated by fusion-active reconstituted influenza virus envelopes (virosomes)
HU219353B (en) Synthetic membrane vesicles as vehicles containing functionally active fusional peptides and pharmaceutical compositions comprising them
Van Houte et al. Liposomes as carriers of immunogenic determinants
Nalawade et al. Virosomes: A Drug Carrier System
WO1990001947A1 (en) Affinity associated vaccine
Singh et al. Virosomes: A Drug Delivery System
Sugahara et al. Preparation of cationic immunovesicles containing cationic peptide lipid for specific drug delivery to target cells
Singh et al. 24 Virosomes
EP4108251A1 (en) Griffithsin for use in a method of preventing or treating infections with respiratory viruses
Medarametla et al. A comprehensive study on the review of virosomes As a novel drug delivery system
CA1334165C (en) Affinity associated vaccine
JP2003512306A (ja) カチオン性ｄｏｓｐｅｒビロソーム
Rabinsky Effect of Protein Coatings on the Delivery Performance of Liposomes.

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20100117