JP3404037B2 - 薬剤供給システムとしての機能的活性融合ペプチドを含む人工膜小胞 - Google Patents
薬剤供給システムとしての機能的活性融合ペプチドを含む人工膜小胞Info
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は請求の範囲第１項の上位概念に記載の人工膜
小胞（リポソーム）に関し、特にその表面に融合ペプチ
ド分子及びその他の細胞特異タンパク質を有する小胞に
関する。本融合ペプチドは人工ペプチド又は精製したペ
プチドの形であってもよく、又例えばインフルエンザウ
イルス、パラインフルエンザウイルス又はセムリキ森林
熱ウイルスのようなエンベロープを有するウイルスのス
パイク糖タンパク質分子、例えば赤血球凝集素の一部で
あってもよい。細胞特異タンパク質はIgG−抗体、例え
ばCD4抗体であってもよい。
小胞（リポソーム）に関し、特にその表面に融合ペプチ
ド分子及びその他の細胞特異タンパク質を有する小胞に
関する。本融合ペプチドは人工ペプチド又は精製したペ
プチドの形であってもよく、又例えばインフルエンザウ
イルス、パラインフルエンザウイルス又はセムリキ森林
熱ウイルスのようなエンベロープを有するウイルスのス
パイク糖タンパク質分子、例えば赤血球凝集素の一部で
あってもよい。細胞特異タンパク質はIgG−抗体、例え
ばCD4抗体であってもよい。
ある薬剤を患者に投与した場合、薬剤は普通投与され
た部位からプラズマの範囲に達しなければならないの
で、この投与の経路が薬剤の循環に於ける薬物動態学的
状況に対して重要な影響を及ぼし得る。例えば経口投与
は便利ではあるが薬剤の作用が遅れて始まり、又プラズ
マの最適の薬剤レベルが得られるかどうか必ずしも確か
ではない。これに対して静脈内注射は患者に痛みと不快
感を与える代償として、正確な循環レベルを直ちに達成
することができる。しかし薬剤を直接体組織の循環系統
に注入した場合でも、投与された用量とターゲット部位
の薬剤レベルとその持続との間の関係は決して簡単では
ない。これらのパラメータは複雑な、しばしば競合する
経路網によって決まるので、そのため活性の薬剤分子が
ターゲット部位に蓄積されるか、或いは薬剤が失活して
排出される結果となる。これらの経路では肝臓その他の
組織に於けるバイオトランスフォーメーション、腎臓又
は胆汁からの排出、固定又は循環している細胞又は巨大
分子と薬剤との結合、及び膜壁を通しての薬剤の受動的
又は仲介輸送が行われる（Creasy,W.A.（1979）:Drug D
isposition in Humans（人体での薬剤の消費）、Oxford
University Press,New York）。
た部位からプラズマの範囲に達しなければならないの
で、この投与の経路が薬剤の循環に於ける薬物動態学的
状況に対して重要な影響を及ぼし得る。例えば経口投与
は便利ではあるが薬剤の作用が遅れて始まり、又プラズ
マの最適の薬剤レベルが得られるかどうか必ずしも確か
ではない。これに対して静脈内注射は患者に痛みと不快
感を与える代償として、正確な循環レベルを直ちに達成
することができる。しかし薬剤を直接体組織の循環系統
に注入した場合でも、投与された用量とターゲット部位
の薬剤レベルとその持続との間の関係は決して簡単では
ない。これらのパラメータは複雑な、しばしば競合する
経路網によって決まるので、そのため活性の薬剤分子が
ターゲット部位に蓄積されるか、或いは薬剤が失活して
排出される結果となる。これらの経路では肝臓その他の
組織に於けるバイオトランスフォーメーション、腎臓又
は胆汁からの排出、固定又は循環している細胞又は巨大
分子と薬剤との結合、及び膜壁を通しての薬剤の受動的
又は仲介輸送が行われる（Creasy,W.A.（1979）:Drug D
isposition in Humans（人体での薬剤の消費）、Oxford
University Press,New York）。
最近種々のキャリヤや楽剤供給システムを用いて薬剤
の分布と代謝に好影響を与えようとする試みに多くの関
心が寄せられてきた。これらのシステムは次のパラメー
タの一つ又は幾つかを制御するためのものである（Juli
ano,R.R.（1975）,Can.J.Physiol.Pharmaco 56,683−69
0）： ａ） ある特定の身体の範囲への薬剤の投入速度 ｂ） 身体内の薬剤の分布と集中 ｃ） 薬剤の持続性又は代謝速度。
の分布と代謝に好影響を与えようとする試みに多くの関
心が寄せられてきた。これらのシステムは次のパラメー
タの一つ又は幾つかを制御するためのものである（Juli
ano,R.R.（1975）,Can.J.Physiol.Pharmaco 56,683−69
0）： ａ） ある特定の身体の範囲への薬剤の投入速度 ｂ） 身体内の薬剤の分布と集中 ｃ） 薬剤の持続性又は代謝速度。
制御された薬剤供給システムは、Bangkamらによって
始めて発表されたリポソーム（Bangkam,A.D.,Standish,
M.M.,Watkins,J.C.（1965）,J.Mol.Biol.13,238−252）
の開発により大きく改善された。現在文献によれば特定
の薬剤をリポソームに入れて供給することにより極めて
種々の利点が得られると言われているが、これらの利点
は大略次のような項目に分類できる： 1. リポソームは生体膜を通過でき、普通は透過できな
い障壁を通しての薬剤の輸送を容易にする。特にリポソ
ームはカプセル入り配合物の細胞内への透過を容易にす
る。
始めて発表されたリポソーム（Bangkam,A.D.,Standish,
M.M.,Watkins,J.C.（1965）,J.Mol.Biol.13,238−252）
の開発により大きく改善された。現在文献によれば特定
の薬剤をリポソームに入れて供給することにより極めて
種々の利点が得られると言われているが、これらの利点
は大略次のような項目に分類できる： 1. リポソームは生体膜を通過でき、普通は透過できな
い障壁を通しての薬剤の輸送を容易にする。特にリポソ
ームはカプセル入り配合物の細胞内への透過を容易にす
る。
2. リポソームを特定の組織と作用するように構成し
て、薬剤の選択性を向上し毒性を低減することが可能で
ある。
て、薬剤の選択性を向上し毒性を低減することが可能で
ある。
3. リポソームは薬剤の放出、分布、体組織の循環から
の除去を調節して、薬物動態学的状況を改善する。
の除去を調節して、薬物動態学的状況を改善する。
4. 化学的、代謝的に不安定な薬剤の失活をリポソーム
により防止できる。
により防止できる。
カプセル入り配合物の方が無処理の物質に比べて少な
くとも試験管内では改良された性質を示すので、治療効
果の期待される薬剤をこの方法で隔離し得る。しかし、
化学療法へのこの新しい革新的手法に対する当初の期待
はその後の実験結果では残念ながら必ずしもその全てが
満たされてはいない（Fildes,F.J.T.（1981）,Liposome
s.From physical structure to therapeutic applicati
ons.（リポソーム、その物理的構造から治療への応用ま
で）Knight（編者）、Elsevier/North−Holland Biomed
ical Press）。
くとも試験管内では改良された性質を示すので、治療効
果の期待される薬剤をこの方法で隔離し得る。しかし、
化学療法へのこの新しい革新的手法に対する当初の期待
はその後の実験結果では残念ながら必ずしもその全てが
満たされてはいない（Fildes,F.J.T.（1981）,Liposome
s.From physical structure to therapeutic applicati
ons.（リポソーム、その物理的構造から治療への応用ま
で）Knight（編者）、Elsevier/North−Holland Biomed
ical Press）。
特定のタンパク質を有するリポソームのターゲッティ
ングによりベクターとしてリポソームを使用した結果が
よくなる筈であった。リポソームに封入された物質を選
択された器官又は組織に更に有効に供給するのがその目
的であったならば、このようなターゲッティング技術
は、望ましくない部位でのリポソームの蓄積を避け（こ
うして毒性を低減し）、特定の細胞への供給を最適化す
る（こうして所望の効果を高める）手段を講ずる必要が
あった。
ングによりベクターとしてリポソームを使用した結果が
よくなる筈であった。リポソームに封入された物質を選
択された器官又は組織に更に有効に供給するのがその目
的であったならば、このようなターゲッティング技術
は、望ましくない部位でのリポソームの蓄積を避け（こ
うして毒性を低減し）、特定の細胞への供給を最適化す
る（こうして所望の効果を高める）手段を講ずる必要が
あった。
いくつかの研究では、食細胞への供給を最適化するた
めに、凝集した免疫グロブリンでリポソームを被覆する
方法が用いられてきた（Ismail,G.,Boxer,L.A.,Bachne
r,R.L.（1979）,Pediatr.Res.,13,769−773;Finkelstei
n,M.C.,Kuhn,S.H.,Schieren,H.,Weissmann,G.,Haffstei
n,S.（1980）:Liposomes and Immunobiology（リポソー
ムと免疫生物学）（Tom,B.H.,Six,H.R.編）255−270,El
sevier/North−Holland Publishing Co.,Amsterdam）。
めに、凝集した免疫グロブリンでリポソームを被覆する
方法が用いられてきた（Ismail,G.,Boxer,L.A.,Bachne
r,R.L.（1979）,Pediatr.Res.,13,769−773;Finkelstei
n,M.C.,Kuhn,S.H.,Schieren,H.,Weissmann,G.,Haffstei
n,S.（1980）:Liposomes and Immunobiology（リポソー
ムと免疫生物学）（Tom,B.H.,Six,H.R.編）255−270,El
sevier/North−Holland Publishing Co.,Amsterdam）。
更に改良法として、Gregoriadis ＆ Neerunjun（197
5）,Biochem.Biophys.Res.Commun.65,537−544によれ
ば、リポソームのターゲッティングは細胞特異IgG−抗
体の会合により高められ、特殊の細胞株に対して作られ
たIgG−免疫グロブリンで会合したリポソームを異なる
細胞株に与えると、リポソームの吸収が３倍から25倍増
大した。しかしこの使用された技術では、このようにタ
ーゲットされたリポソームが細胞膜と融合できないた
め、薬剤を細胞に効果的に供給することが妨げられた
（Leserman,L.,Weinstein,J.N.,Blumenthal,R.,Sharro
w,S.O.,Texy,W.D.（1979）,J.Immunol.122,585−59
1）。
5）,Biochem.Biophys.Res.Commun.65,537−544によれ
ば、リポソームのターゲッティングは細胞特異IgG−抗
体の会合により高められ、特殊の細胞株に対して作られ
たIgG−免疫グロブリンで会合したリポソームを異なる
細胞株に与えると、リポソームの吸収が３倍から25倍増
大した。しかしこの使用された技術では、このようにタ
ーゲットされたリポソームが細胞膜と融合できないた
め、薬剤を細胞に効果的に供給することが妨げられた
（Leserman,L.,Weinstein,J.N.,Blumenthal,R.,Sharro
w,S.O.,Texy,W.D.（1979）,J.Immunol.122,585−59
1）。
薬剤供給システムを構築する上での大きな進歩は、ウ
イルスタンパク質を有するリポソームのターゲッティン
グであった。即ちリポソーム膜はインフルエンザウイル
スからの赤血球凝集素のようなタンパク質で再構成され
た（Almeida,J.D.,Brand,C.M.,Edwards,D.C.,Heath,T.
D.（1975）,Lancet 2,899−901）。適当なウイルスタン
パク質をリポソーム膜に取り込むことにより、初期のウ
イルスと宿主細胞との相互作用の効果と特異性（吸収、
浸透）とをリポソームキャリヤに付与することができ
る。例えば、センダイウイルススパイクタンパク質をリ
ポソームの二重層に取り込めば、マウスＬ細胞によるジ
フテリア毒素フラグメントＡの吸収が、フラグメントＡ
を含むスパイクなしのリポソームと比較して少なくとも
100倍増加した（Uehida,T.,Kim,J.,Yamaizumi,M.,Miyah
e,Y.,Okada,Y.（1979）,Cell.Biol.80,10−20）。
イルスタンパク質を有するリポソームのターゲッティン
グであった。即ちリポソーム膜はインフルエンザウイル
スからの赤血球凝集素のようなタンパク質で再構成され
た（Almeida,J.D.,Brand,C.M.,Edwards,D.C.,Heath,T.
D.（1975）,Lancet 2,899−901）。適当なウイルスタン
パク質をリポソーム膜に取り込むことにより、初期のウ
イルスと宿主細胞との相互作用の効果と特異性（吸収、
浸透）とをリポソームキャリヤに付与することができ
る。例えば、センダイウイルススパイクタンパク質をリ
ポソームの二重層に取り込めば、マウスＬ細胞によるジ
フテリア毒素フラグメントＡの吸収が、フラグメントＡ
を含むスパイクなしのリポソームと比較して少なくとも
100倍増加した（Uehida,T.,Kim,J.,Yamaizumi,M.,Miyah
e,Y.,Okada,Y.（1979）,Cell.Biol.80,10−20）。
上述の方法の主な欠点は、活性の充分なインフルエン
ザ赤血球凝集素融合ペプチドの欠如である。インフルエ
ンザＡウイルスは膜融合によってその宿主細胞に透過す
る。ウイルス粒子はまず細胞の表面に結合してから、取
り込まれてエンドソーム、リソソームに運ばれる。これ
らのオルガネラの酸性の環境がウイルス細胞膜と宿主細
胞膜との融合を活性化する。低いpH−値での小胞と細胞
との融合の利点は、小胞の内容物が細胞の細胞質に取り
込まれた後で放出される点にある（エンドソームのpH−
値は約5.2である）。この低いpH−値で誘発されたイン
フルエンザウイルス糖タンパク質の融合の発見を契機と
して、インフルエンザ赤血球凝集素ターゲットリポソー
ムにより有効な薬剤供給システムを開発しようとする多
くの試みがなされた。
ザ赤血球凝集素融合ペプチドの欠如である。インフルエ
ンザＡウイルスは膜融合によってその宿主細胞に透過す
る。ウイルス粒子はまず細胞の表面に結合してから、取
り込まれてエンドソーム、リソソームに運ばれる。これ
らのオルガネラの酸性の環境がウイルス細胞膜と宿主細
胞膜との融合を活性化する。低いpH−値での小胞と細胞
との融合の利点は、小胞の内容物が細胞の細胞質に取り
込まれた後で放出される点にある（エンドソームのpH−
値は約5.2である）。この低いpH−値で誘発されたイン
フルエンザウイルス糖タンパク質の融合の発見を契機と
して、インフルエンザ赤血球凝集素ターゲットリポソー
ムにより有効な薬剤供給システムを開発しようとする多
くの試みがなされた。
Kawasakiら（Biochemica et Biophysica Acta（198
3）,733,286−290）は卵黄中のインフルエンザ赤血球凝
集素糖タンパク質の再構成された小胞、ホスファチジル
コリン／スピンラベルしたホスファチジルコリン／コレ
ステロール（モル比1.6:0.4:1）を用いた。タンパク質
と脂質との比率（1:44及び1:105モル／モル）が適当な
標品は、表面に高密度のスパイクを有する直径100−300
nmの小胞を含んでいたが、しかし幾つかの欠点があっ
た。
3）,733,286−290）は卵黄中のインフルエンザ赤血球凝
集素糖タンパク質の再構成された小胞、ホスファチジル
コリン／スピンラベルしたホスファチジルコリン／コレ
ステロール（モル比1.6:0.4:1）を用いた。タンパク質
と脂質との比率（1:44及び1:105モル／モル）が適当な
標品は、表面に高密度のスパイクを有する直径100−300
nmの小胞を含んでいたが、しかし幾つかの欠点があっ
た。
１） 高いコレステロール含有量と界面活性剤の残渣の
ため食細胞によるエンドサイトーシスが低下した。Kawa
sakiらはその活性が僅か66％と報告しているが、その後
に開発された、改良された試験方法によればその７分後
の活性は僅か１％（！）である（下記の実施例10参
照）。これはKawasakiらが使用したトリトンＸ−100が
一部赤血球凝集素と反応して透析により完全には除去さ
れないためと思われる。
ため食細胞によるエンドサイトーシスが低下した。Kawa
sakiらはその活性が僅か66％と報告しているが、その後
に開発された、改良された試験方法によればその７分後
の活性は僅か１％（！）である（下記の実施例10参
照）。これはKawasakiらが使用したトリトンＸ−100が
一部赤血球凝集素と反応して透析により完全には除去さ
れないためと思われる。
２） 融合反応に於けるウイルス膜成分の役割を詳しく
検討するにはこれらの成分を処理できなければならな
い。この目的にはウイルススパイクタンパク質を分離し
再構成して充分な生物学的融合活性を有する再構成され
たウイロソームを作る方法が必要である。Kawasakiらの
努力にかかわらず、充分な生物学的融合活性を示すイン
フルエンザウイルスのエンベロープの再構成は報告され
ていない。
検討するにはこれらの成分を処理できなければならな
い。この目的にはウイルススパイクタンパク質を分離し
再構成して充分な生物学的融合活性を有する再構成され
たウイロソームを作る方法が必要である。Kawasakiらの
努力にかかわらず、充分な生物学的融合活性を示すイン
フルエンザウイルスのエンベロープの再構成は報告され
ていない。
３） 薬学的に活性の薬剤を含むターゲットされたリポ
ソームを特定の細胞に結合することを明示できなかっ
た。
ソームを特定の細胞に結合することを明示できなかっ
た。
再構成ウイルスエンベロープを使用したその他の方法
の多くは、ウイルス膜を界面活性剤で可溶化し、内部の
ウイルスタンパク質と遺伝物質とが沈降した後で界面活
性剤を上澄みから除去する方法に基づいている。オクチ
ルグルコシドのような臨界ミセル濃度の高い界面活性剤
は透析により効果的に除去し得る。オクチルグルコシド
を使用した再構成に就いては、セムリキ森林熱ウイルス
（SFV）（Helenius,A.,Sarvas,M.,Simons,K.（1981）,E
ur.J.Biochem.116,27−35）、水胞性口内炎ウイルス（V
SV）（Eidelman,O.,Schlegel,R.,Tralka,T.S.,Blumenth
al,R.（1984）,J.Bio.Chem.259,4622−4628）、インフ
ルエンザウイルス（Huang,R.T.C.,Wahu,K.,Klenk,H.D.,
Rou,R.（1980）,Virology 104,294−302）及びセンダイ
ウイルス（Harmsen,M.D.,Wilschut,J.,Scherphof,G.,Hu
lstaert,C.,Hoekstra,D.（1985）,Eur.J.Biochem.149,5
91−599）に対しての報告がある。しかし正確に再構成
されたウイルスエンベロープはその全ての場合に作られ
なかった。例えばSFVからのウイロソームではタンパク
質と脂質との比がウイルス膜とは異なっており、VSVか
ら作られたウイロソームは生物学的融合活性を示さなか
った。
の多くは、ウイルス膜を界面活性剤で可溶化し、内部の
ウイルスタンパク質と遺伝物質とが沈降した後で界面活
性剤を上澄みから除去する方法に基づいている。オクチ
ルグルコシドのような臨界ミセル濃度の高い界面活性剤
は透析により効果的に除去し得る。オクチルグルコシド
を使用した再構成に就いては、セムリキ森林熱ウイルス
（SFV）（Helenius,A.,Sarvas,M.,Simons,K.（1981）,E
ur.J.Biochem.116,27−35）、水胞性口内炎ウイルス（V
SV）（Eidelman,O.,Schlegel,R.,Tralka,T.S.,Blumenth
al,R.（1984）,J.Bio.Chem.259,4622−4628）、インフ
ルエンザウイルス（Huang,R.T.C.,Wahu,K.,Klenk,H.D.,
Rou,R.（1980）,Virology 104,294−302）及びセンダイ
ウイルス（Harmsen,M.D.,Wilschut,J.,Scherphof,G.,Hu
lstaert,C.,Hoekstra,D.（1985）,Eur.J.Biochem.149,5
91−599）に対しての報告がある。しかし正確に再構成
されたウイルスエンベロープはその全ての場合に作られ
なかった。例えばSFVからのウイロソームではタンパク
質と脂質との比がウイルス膜とは異なっており、VSVか
ら作られたウイロソームは生物学的融合活性を示さなか
った。
文献に記載されたもう一つの方法として、ブロメライ
ンを含むウイルス粒子からインフルエンザウイルススパ
イクを分離する方法があり、この方法で回収された赤血
球凝集素がリポソームに結合された（Domes,R.,Heleniu
s,A.,White,J.（1985）,J.biol.Chem.260（５）2973−2
981）。この方法の主な欠点はブロメラインによる切断
のためにこのような小胞の生物学的活性が低下している
点である。
ンを含むウイルス粒子からインフルエンザウイルススパ
イクを分離する方法があり、この方法で回収された赤血
球凝集素がリポソームに結合された（Domes,R.,Heleniu
s,A.,White,J.（1985）,J.biol.Chem.260（５）2973−2
981）。この方法の主な欠点はブロメラインによる切断
のためにこのような小胞の生物学的活性が低下している
点である。
従って本発明の課題は、特定の細胞、例えばマクロフ
ァージ、ヘルパー−T4−細胞、脳細胞、その外の特定の
器官の細胞に所望の薬剤又は薬学的に活性の物質を輸送
し、これらの細胞に十分付着し、ファゴサイトーシス又
はエンドサイトーシスにより取り込まれて、所望の薬剤
を − エンドサイトーシスの直後に − 目的の細胞
の細胞質に供給し得るような小胞を提供することにあ
る。
ァージ、ヘルパー−T4−細胞、脳細胞、その外の特定の
器官の細胞に所望の薬剤又は薬学的に活性の物質を輸送
し、これらの細胞に十分付着し、ファゴサイトーシス又
はエンドサイトーシスにより取り込まれて、所望の薬剤
を − エンドサイトーシスの直後に − 目的の細胞
の細胞質に供給し得るような小胞を提供することにあ
る。
この技術的課題は、請求の範囲第１項記載のリン脂質
二重層小胞の提供により解決される。本発明の特殊の実
施態様と改良された小胞は請求の範囲第２項〜第10項に
記載してある。又そのような小胞を生産する方法は請求
の範囲第11項〜第17項に記した。
二重層小胞の提供により解決される。本発明の特殊の実
施態様と改良された小胞は請求の範囲第２項〜第10項に
記載してある。又そのような小胞を生産する方法は請求
の範囲第11項〜第17項に記した。
即ち本発明は、エンドサイトーシスに最適のリポソー
ムと生物学的に充分活性の細胞特定標識とを含むウイル
ス赤血球凝集素ウイロソーム、好ましくはウイルス赤血
球凝集素糖タンパク質又はその誘導体、或いは目的の細
胞によるエンドサイトーシスの直後に前記ウイロソーム
の融合を誘発し得る人工融合ペプチドを含むウイルス赤
血球凝集素ウイロソームを提供する。
ムと生物学的に充分活性の細胞特定標識とを含むウイル
ス赤血球凝集素ウイロソーム、好ましくはウイルス赤血
球凝集素糖タンパク質又はその誘導体、或いは目的の細
胞によるエンドサイトーシスの直後に前記ウイロソーム
の融合を誘発し得る人工融合ペプチドを含むウイルス赤
血球凝集素ウイロソームを提供する。
本発明の一つの実施態様では、特定のリポソームに吸
着する適当な架橋剤と、エンドサイトーシス機構を誘発
するために目的の細胞の応答可能のリセプターに向けら
れた特定の抗体で、架橋剤と結合した後も尚生物学的に
充分活性であるような抗体とを混合物の中で併用する。
着する適当な架橋剤と、エンドサイトーシス機構を誘発
するために目的の細胞の応答可能のリセプターに向けら
れた特定の抗体で、架橋剤と結合した後も尚生物学的に
充分活性であるような抗体とを混合物の中で併用する。
この様な薬剤供給小胞の特徴は、これらの小胞がその
表面で、活性の充分なウイルス糖タンパク質又はその誘
導体と、目的の細胞に付着でき、ファゴサイトーシス又
はエンドサイトーシスによりこれらの細胞に取り込ま
れ、前記小胞と内部の細胞膜との即時の融合を誘発して
ウイロソームの内容物をこれらの細胞の細胞質の中に放
出することのできる、生物学的に活性の特定の抗体とを
輸送する点にある。本発明の活性の充分な融合ペプチド
により、薬剤はファゴサイトーシスの直後に放出される
ので、薬剤がエンドサイトソームの中に不当に長く滞留
して本発明のウイルス赤血球凝集素小胞の中に含まれた
薬学的物質が非特異的に分解する可能性を避けることが
できる。pH5に於いて、小胞の表面のインフルエンザ融
合ペプチドは生のインフルエンザウイルスの場合と同じ
ように活性化され、小胞の内容物は、インフルエンザウ
イルスと放出された核タンパク質の場合と同じように細
胞質の中に放出される。
表面で、活性の充分なウイルス糖タンパク質又はその誘
導体と、目的の細胞に付着でき、ファゴサイトーシス又
はエンドサイトーシスによりこれらの細胞に取り込ま
れ、前記小胞と内部の細胞膜との即時の融合を誘発して
ウイロソームの内容物をこれらの細胞の細胞質の中に放
出することのできる、生物学的に活性の特定の抗体とを
輸送する点にある。本発明の活性の充分な融合ペプチド
により、薬剤はファゴサイトーシスの直後に放出される
ので、薬剤がエンドサイトソームの中に不当に長く滞留
して本発明のウイルス赤血球凝集素小胞の中に含まれた
薬学的物質が非特異的に分解する可能性を避けることが
できる。pH5に於いて、小胞の表面のインフルエンザ融
合ペプチドは生のインフルエンザウイルスの場合と同じ
ように活性化され、小胞の内容物は、インフルエンザウ
イルスと放出された核タンパク質の場合と同じように細
胞質の中に放出される。
『リポソーム』というのは、界面活性剤の除去を制御
して調製した中間の大きさの二重膜のリン脂質で、界面
活性剤の除去の際の始めに形成される小胞の大きさは、
使用した界面活性剤及びリン脂質によって、場合によっ
ては界面活性剤の除去方法とその速度によって左右され
る。
して調製した中間の大きさの二重膜のリン脂質で、界面
活性剤の除去の際の始めに形成される小胞の大きさは、
使用した界面活性剤及びリン脂質によって、場合によっ
ては界面活性剤の除去方法とその速度によって左右され
る。
本発明は又ファゴサイトーシスに特に適した小胞を生
産する方法に関する。この方法は次の段階をから成る： １） 非イオン性界面活性剤に１種又は２種のリン脂質
を溶解 ２） ポリスチレンビーズマイクロキャリヤ（メッシュ
サイズ（湿潤）20−50）により界面活性剤を除去して小
胞を形成 ３） 界面活性剤の除去の間に所定の機械的運動を実施 ４） 超音波処理により小胞の所望の直径（50−100n
m）を達成 もう一つの実施態様では、本発明はそのリン脂質が重
量で70−95％のホスファチジルコリンと５−30％のその
他のリン脂質、例えばホスファチジルエタノールアミン
とから成る小胞に関する。コレステロールの含有量は１
％未満が好ましい。
産する方法に関する。この方法は次の段階をから成る： １） 非イオン性界面活性剤に１種又は２種のリン脂質
を溶解 ２） ポリスチレンビーズマイクロキャリヤ（メッシュ
サイズ（湿潤）20−50）により界面活性剤を除去して小
胞を形成 ３） 界面活性剤の除去の間に所定の機械的運動を実施 ４） 超音波処理により小胞の所望の直径（50−100n
m）を達成 もう一つの実施態様では、本発明はそのリン脂質が重
量で70−95％のホスファチジルコリンと５−30％のその
他のリン脂質、例えばホスファチジルエタノールアミン
とから成る小胞に関する。コレステロールの含有量は１
％未満が好ましい。
『融合ペプチド』とは融合ペプチドを含むウイルスス
パイク糖タンパク質のことである。一つの実施態様で
は、本発明は機能性融合ペプチドを含有する、ウイルス
表面スパイクの赤血球凝集素三量体全体、又は１個の単
量体、又は切断されたサブユニットの一方又は両方、糖
ペプチドHA1とHA2に関する。他の実施態様では、本発明
は分離された又は人工的に生産された融合ペプチドそれ
自体に関する。本発明の特に好ましい実施態様では、融
合ペプチドを含むこれらのボリペプチドはインフルエン
ザ赤血球凝集素、特にＡ−H1N1サブタイプの一つに関す
る。
パイク糖タンパク質のことである。一つの実施態様で
は、本発明は機能性融合ペプチドを含有する、ウイルス
表面スパイクの赤血球凝集素三量体全体、又は１個の単
量体、又は切断されたサブユニットの一方又は両方、糖
ペプチドHA1とHA2に関する。他の実施態様では、本発明
は分離された又は人工的に生産された融合ペプチドそれ
自体に関する。本発明の特に好ましい実施態様では、融
合ペプチドを含むこれらのボリペプチドはインフルエン
ザ赤血球凝集素、特にＡ−H1N1サブタイプの一つに関す
る。
『架橋剤』とは、本発明により調製された小胞の表面
に結合でき且つポリペプチドを結合できる有機のヘテロ
官能性分子のことである。本発明の好ましい実施態様で
は、この分子はカルボキシル基とチオール基とを含む有
機の二官能性分子、特にスルホスクシンイミジル（Ｓ）
−誘導体、例えばＳ−４−（ｐ−マレイミドフェニル）
−酪酸、Ｓ−酢酸、Ｓ−２−（ｍ−アジド−ｏ−ニトロ
ベンズアミド）エチル−1,3'−ジチオプロピオン酸、Ｓ
−６−（4'−アジド−2'−ニトロフェニルアミノ）ヘキ
サン酸、Ｓ−（４−アジドフェニルジチオ）プロピオン
酸、Ｓ−２−（ｐ−アジドサリシルアミド）エチル−1,
3'−ジチオプロピオン酸、Ｓ−２−（ビオチンアミド）
−エチル−1,3'−ジチオプロピオン酸、Ｓ−６−（ビオ
チンアミド）ヘキサン酸、Ｓ−３−（４−ヒドロキシフ
ェニル）プロピオン酸、Ｓ−（４−ヨードアセチル）ア
ミノ安息香酸、Ｓ−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シク
ロヘキサン−１−カルボン酸、Ｓ−2,2,5,5−テトラメ
チルピロリン−１−オキシル−HClである。
に結合でき且つポリペプチドを結合できる有機のヘテロ
官能性分子のことである。本発明の好ましい実施態様で
は、この分子はカルボキシル基とチオール基とを含む有
機の二官能性分子、特にスルホスクシンイミジル（Ｓ）
−誘導体、例えばＳ−４−（ｐ−マレイミドフェニル）
−酪酸、Ｓ−酢酸、Ｓ−２−（ｍ−アジド−ｏ−ニトロ
ベンズアミド）エチル−1,3'−ジチオプロピオン酸、Ｓ
−６−（4'−アジド−2'−ニトロフェニルアミノ）ヘキ
サン酸、Ｓ−（４−アジドフェニルジチオ）プロピオン
酸、Ｓ−２−（ｐ−アジドサリシルアミド）エチル−1,
3'−ジチオプロピオン酸、Ｓ−２−（ビオチンアミド）
−エチル−1,3'−ジチオプロピオン酸、Ｓ−６−（ビオ
チンアミド）ヘキサン酸、Ｓ−３−（４−ヒドロキシフ
ェニル）プロピオン酸、Ｓ−（４−ヨードアセチル）ア
ミノ安息香酸、Ｓ−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シク
ロヘキサン−１−カルボン酸、Ｓ−2,2,5,5−テトラメ
チルピロリン−１−オキシル−HClである。
『細胞特異』タンパク質又は標識とは、小胞の表面で
架橋剤に結合でき、細胞のレセプターと結合してエンド
サイトーシス機構を誘発し得るタンパク質のことであ
る。本発明の好ましい実施態様ではこの分子は細胞レセ
プター特異抗体、特に単クローン性抗体に関する。
架橋剤に結合でき、細胞のレセプターと結合してエンド
サイトーシス機構を誘発し得るタンパク質のことであ
る。本発明の好ましい実施態様ではこの分子は細胞レセ
プター特異抗体、特に単クローン性抗体に関する。
次に実施例と図面により本発明を説明する。
実施例１
インフルエンザウイルスからの赤血球凝集素三量体中
の機能的に活性の充分なウイルス融合ペプチドを有し、
抗ウイルス薬剤としてデキストラン硫酸を含む、ホスフ
ァチジルコリンの人工膜小胞の調製。
の機能的に活性の充分なウイルス融合ペプチドを有し、
抗ウイルス薬剤としてデキストラン硫酸を含む、ホスフ
ァチジルコリンの人工膜小胞の調製。
図１に本方法の原理を示す。円形枠は溶液又は懸濁
液、角形枠は固体のペレット又は沈殿である。一般には
次の通りである： 2700mgの固形分を含む融合緩衝液FBと46mgのHAを含む
赤血球凝集素懸濁液HAと31.1μmolのウイルスリン脂質V
PLとを混合し、超遠心UC1した。得られたペレットを融
合緩衝液FBと穏和な界面活性剤としてオクタエチレング
リコールモノドデシルエーテルOEGとを含む溶液IIIに溶
解した。更に超遠心UC2によりFB,HA,VPL,OEGを含む上澄
みIVが得られたが、これに抗ウイルス薬剤デキストラン
硫酸DSを加えて溶液Ｖとした。その間に、ホスファチジ
ルコリン（PC）溶液VIを回転する丸底フラスコの中で真
空乾燥し、フラスコの内面に薄いPCの層を形成した。こ
の層に溶液Ｖを加えて、層を溶解して溶液VIIを作り、
これをポリスチレンビーズマイクロキャリヤPBMで３回
処理してOEGを除き、溶液VIIIとした。この溶液中に
− 超音波処理USにより − 所望の大きさの小胞VES
を形成した。得られた懸濁液IXを食塩水Ｘで希釈して薬
剤懸濁液DRを得た。
液、角形枠は固体のペレット又は沈殿である。一般には
次の通りである： 2700mgの固形分を含む融合緩衝液FBと46mgのHAを含む
赤血球凝集素懸濁液HAと31.1μmolのウイルスリン脂質V
PLとを混合し、超遠心UC1した。得られたペレットを融
合緩衝液FBと穏和な界面活性剤としてオクタエチレング
リコールモノドデシルエーテルOEGとを含む溶液IIIに溶
解した。更に超遠心UC2によりFB,HA,VPL,OEGを含む上澄
みIVが得られたが、これに抗ウイルス薬剤デキストラン
硫酸DSを加えて溶液Ｖとした。その間に、ホスファチジ
ルコリン（PC）溶液VIを回転する丸底フラスコの中で真
空乾燥し、フラスコの内面に薄いPCの層を形成した。こ
の層に溶液Ｖを加えて、層を溶解して溶液VIIを作り、
これをポリスチレンビーズマイクロキャリヤPBMで３回
処理してOEGを除き、溶液VIIIとした。この溶液中に
− 超音波処理USにより − 所望の大きさの小胞VES
を形成した。得られた懸濁液IXを食塩水Ｘで希釈して薬
剤懸濁液DRを得た。
詳細には次の通りである：
融合緩衝液（Ｉ）として、食塩7.9mg/m、クエン酸
三ナトリウム二水和物4.4mg/m、２−モルホリノエタ
ンスルホン酸一水和物（MES）2.1mg/m、Ｎ−ヒドロキ
シエチルピペラジン−N'−２−エタンスルホン酸1.2mg/
mを含む水溶液（pHを１−N NaOHで7.3に調節）を調製
した。
三ナトリウム二水和物4.4mg/m、２−モルホリノエタ
ンスルホン酸一水和物（MES）2.1mg/m、Ｎ−ヒドロキ
シエチルピペラジン−N'−２−エタンスルホン酸1.2mg/
mを含む水溶液（pHを１−N NaOHで7.3に調節）を調製
した。
インフルエンザウイルス（株A/Shanghai/16/89（H3N
2））を鶏卵の尿膜腔で培養し、SkehelとSchildの方法
（1971,Virology 44,396−408）に従ってショ糖密度勾
配法により２回超遠心して精製した。精製したインフル
エンザビリオン懸濁液（II）はインフルエンザウイルス
赤血球凝集素266μg/mと全体で31.1μmolのウイルス
リン脂質を含んでいた。その分析は次のように行った： ウイルスリン脂質をFolchらの方法（Folch,J.,Lees,
M.,Sloane,S.G.H.（1957）,J.Biol.Chem.226,497−50
9）で抽出した。リン脂質を分析するために、下側の有
機相を蒸発し、残渣でリン酸塩の定量（Chen.,P.S.,Tor
ibara,T.Y.,Warner,H.（1956）,Anal.Chem.28,1756−17
58）を実施し、一方では少量のクロロホルム・メタノー
ルに溶解し、これを次のリン脂質のTLC−分析に供し
た。シリカゲルプレート（Merck）を使用し、クロロホ
ルム・メタノール・酢酸・水（25:15:4:2;v/v/v/v）の
溶剤系中で展開した。個々のリン脂質をヨードに晒して
可視化し、そのRF−値を基にして（標準試料と比較し
て）同定した。タンパク質は改良Lowry法（Peterson,G.
L.（1977）,Anal.Biochem.83,346−356）により定量し
た。
2））を鶏卵の尿膜腔で培養し、SkehelとSchildの方法
（1971,Virology 44,396−408）に従ってショ糖密度勾
配法により２回超遠心して精製した。精製したインフル
エンザビリオン懸濁液（II）はインフルエンザウイルス
赤血球凝集素266μg/mと全体で31.1μmolのウイルス
リン脂質を含んでいた。その分析は次のように行った： ウイルスリン脂質をFolchらの方法（Folch,J.,Lees,
M.,Sloane,S.G.H.（1957）,J.Biol.Chem.226,497−50
9）で抽出した。リン脂質を分析するために、下側の有
機相を蒸発し、残渣でリン酸塩の定量（Chen.,P.S.,Tor
ibara,T.Y.,Warner,H.（1956）,Anal.Chem.28,1756−17
58）を実施し、一方では少量のクロロホルム・メタノー
ルに溶解し、これを次のリン脂質のTLC−分析に供し
た。シリカゲルプレート（Merck）を使用し、クロロホ
ルム・メタノール・酢酸・水（25:15:4:2;v/v/v/v）の
溶剤系中で展開した。個々のリン脂質をヨードに晒して
可視化し、そのRF−値を基にして（標準試料と比較し
て）同定した。タンパク質は改良Lowry法（Peterson,G.
L.（1977）,Anal.Biochem.83,346−356）により定量し
た。
溶液（II）の全量173mを同じ量の前記融合緩衝液
（Ｉ）と混合した。このインフルエンザウイルス希釈液
を100 000gで10分超遠心した。
（Ｉ）と混合した。このインフルエンザウイルス希釈液
を100 000gで10分超遠心した。
前記融合緩衝液中にオクタエチレングリコールモノド
デシルエーテル（OEG）54mg/m（＝100μmol/m）を
含む界面活性剤溶液15.3mにインフルエンザウイルス
ペレットを加えた。これは18μｇ＝33.3nmol OEG/μｇ
赤血球凝集素に相当する。10分後にはペレットは完全に
溶解した。その溶液を100 000gで１時間超遠心した。乾
燥した抗ウイルス薬剤デキストラン硫酸（Ｌscher,M.
＆ Glck,R.,Antiviral Research 14,39−50）3000mg
を、可溶化したインフルエンザ赤血球凝集素三量体、非
必須のノイラミニダーゼ残渣及びその外の成分を含む残
存上澄みIVに加えて溶液Ｖを作った。
デシルエーテル（OEG）54mg/m（＝100μmol/m）を
含む界面活性剤溶液15.3mにインフルエンザウイルス
ペレットを加えた。これは18μｇ＝33.3nmol OEG/μｇ
赤血球凝集素に相当する。10分後にはペレットは完全に
溶解した。その溶液を100 000gで１時間超遠心した。乾
燥した抗ウイルス薬剤デキストラン硫酸（Ｌscher,M.
＆ Glck,R.,Antiviral Research 14,39−50）3000mg
を、可溶化したインフルエンザ赤血球凝集素三量体、非
必須のノイラミニダーゼ残渣及びその外の成分を含む残
存上澄みIVに加えて溶液Ｖを作った。
ホスファチジルコリン（SIGMA）をクロロホルムとメ
タノールとの2:1混合溶液に10mg/mの濃度に溶解し
た。この溶液VIの28mを回転蒸発器で真空下で注意し
て蒸発し、丸底フラスコの内面に280mgの薄いリン脂質
の層を形成した。
タノールとの2:1混合溶液に10mg/mの濃度に溶解し
た。この溶液VIの28mを回転蒸発器で真空下で注意し
て蒸発し、丸底フラスコの内面に280mgの薄いリン脂質
の層を形成した。
この丸底フラスコの中のリン脂質の層に溶液Ｖを加
え、少なくとも15分振盪してホスファチジルコリンを完
全に溶解した。得られた溶液VIIをメッシュサイズ（湿
潤）25−50のポリスチレンビーズマイクロキャリヤPBM
4.8gと共にガラス容器に移した。
え、少なくとも15分振盪してホスファチジルコリンを完
全に溶解した。得られた溶液VIIをメッシュサイズ（湿
潤）25−50のポリスチレンビーズマイクロキャリヤPBM
4.8gと共にガラス容器に移した。
この容器を、内容物が毎秒２回一端から他端へ動くよ
うに振盪した。１時間後懸濁液を細いピペットで吸引し
て、同じサイズのポリスチレンビーズマイクロキャリヤ
2.4gと共に新しい容器に移して、このカラムを30分振盪
した。この過程を２回繰り返した。最後の過程で得られ
た溶液VIIIをビーズから分離し、水浴に固定して超音波
処理装置（Bransonic,Branson Europe BV,周波数50kHz
±10％）で処理した。10秒間の超音波の衝撃をそれぞれ
10秒の間隔を置いて２回繰り返して、直径約50−100nm
の中間サイズの小胞を作った。次に最終の溶液IXを生理
的食塩水で1:100に希釈して溶液Ｘを得た。
うに振盪した。１時間後懸濁液を細いピペットで吸引し
て、同じサイズのポリスチレンビーズマイクロキャリヤ
2.4gと共に新しい容器に移して、このカラムを30分振盪
した。この過程を２回繰り返した。最後の過程で得られ
た溶液VIIIをビーズから分離し、水浴に固定して超音波
処理装置（Bransonic,Branson Europe BV,周波数50kHz
±10％）で処理した。10秒間の超音波の衝撃をそれぞれ
10秒の間隔を置いて２回繰り返して、直径約50−100nm
の中間サイズの小胞を作った。次に最終の溶液IXを生理
的食塩水で1:100に希釈して溶液Ｘを得た。
実施例２
インフルエンザウイルスの赤血球凝集素三量体で吸着し
た抗ウイルス抗体薬剤とCD4単クローン性抗体とを含む
人工膜小胞の調製 実施例１の方法を次のように変更して小胞を調製し
た:1m当たりホスファチジルコリン10mgの代わりに9mg
とホスファチジルエタノールアミン（ケファリン）1mg
とを、クロロホルム・メタノールの2:1混合液に溶解し
た。
た抗ウイルス抗体薬剤とCD4単クローン性抗体とを含む
人工膜小胞の調製 実施例１の方法を次のように変更して小胞を調製し
た:1m当たりホスファチジルコリン10mgの代わりに9mg
とホスファチジルエタノールアミン（ケファリン）1mg
とを、クロロホルム・メタノールの2:1混合液に溶解し
た。
実施例１の方法で赤血球凝集素小胞を調製してから、
2mの水に溶かしたスルホスクシンイミジル−４−（Ｎ
−マレイミドフェノール）−酪酸（SMPB）（架橋剤とし
て）20mgを溶液に加えた。室温で１時間緩やかに振盪し
てから、小胞を100 000gで10分間超遠心してペレットに
した。
2mの水に溶かしたスルホスクシンイミジル−４−（Ｎ
−マレイミドフェノール）−酪酸（SMPB）（架橋剤とし
て）20mgを溶液に加えた。室温で１時間緩やかに振盪し
てから、小胞を100 000gで10分間超遠心してペレットに
した。
抗−Leu 3A（Becton ＆ Dickinson）8mをペレット
に加え、再懸濁した材料を室温で１時間の間５分毎にそ
れぞれ数秒間注意して振盪し、最後にこれを100 000gで
10分間超遠心して再度ペレットにした（結合しなかった
抗体を除くため）。このペレットを生理的食塩水1500m
に再懸濁した。
に加え、再懸濁した材料を室温で１時間の間５分毎にそ
れぞれ数秒間注意して振盪し、最後にこれを100 000gで
10分間超遠心して再度ペレットにした（結合しなかった
抗体を除くため）。このペレットを生理的食塩水1500m
に再懸濁した。
実施例３
実施例２を次のように変更して繰り返した：
デキストラン硫酸の代わりにイミダゾルカルボキサミ
ドとヒドロキシ尿素（Brunner,Nagelは黒色腫に対して
薬学的に有効と記載,Springer Verlag,2版、Internisti
sche Krebstherapie（癌の内科的治療）,p.93（197
9））とをそれぞれ1000mg溶液IV（実施例１参照）に加
えた。架橋剤を加え、更に実施例２のように処理してか
ら、単クローン性抗体2.1mg（R24:Houghton,A.N.et al.
（1985）,Proc.Nat.Ac.Sc.,Vol.82,p.1242による；又は
0.5mg L55＋0.5mg L72:Iric,R.S.et al.,Lancet（198
9）,p.786−787による）を小胞溶液VESに加えて、ヒト1
000人分の用量の次の全組成物を得た： 46mg赤血球凝集素 250mgホスファチジルコリン 30mgホスファチジルエタノールアミン（ケファリ
ン） 20mg架橋剤（スルホ−SMPB） 1mg単クローン性抗体 1000mgイミダゾールカルボキサミド 1000mgヒドロキシ尿素 この医薬は従来通りならば約５倍の量投与すべきであ
るから、上述の量はヒト200人分の用量に過ぎない。
ドとヒドロキシ尿素（Brunner,Nagelは黒色腫に対して
薬学的に有効と記載,Springer Verlag,2版、Internisti
sche Krebstherapie（癌の内科的治療）,p.93（197
9））とをそれぞれ1000mg溶液IV（実施例１参照）に加
えた。架橋剤を加え、更に実施例２のように処理してか
ら、単クローン性抗体2.1mg（R24:Houghton,A.N.et al.
（1985）,Proc.Nat.Ac.Sc.,Vol.82,p.1242による；又は
0.5mg L55＋0.5mg L72:Iric,R.S.et al.,Lancet（198
9）,p.786−787による）を小胞溶液VESに加えて、ヒト1
000人分の用量の次の全組成物を得た： 46mg赤血球凝集素 250mgホスファチジルコリン 30mgホスファチジルエタノールアミン（ケファリ
ン） 20mg架橋剤（スルホ−SMPB） 1mg単クローン性抗体 1000mgイミダゾールカルボキサミド 1000mgヒドロキシ尿素 この医薬は従来通りならば約５倍の量投与すべきであ
るから、上述の量はヒト200人分の用量に過ぎない。
実施例４
実施例２を次のように変更して繰り返した：
デキストラン硫酸の代わりに次の医薬の少なくとも１
種をそれぞれ1000mg溶液IV（実施例１参照）に添加し
た：アドリプラスチン、エンドキサン、フルオロウラシ
ル（Brunner,Nagel,Internistische Krebstherapie（癌
の内科的治療）,Springer Verlag,2版,p.309（1979）に
よる）、コルヒチン（SIGMA）。
種をそれぞれ1000mg溶液IV（実施例１参照）に添加し
た：アドリプラスチン、エンドキサン、フルオロウラシ
ル（Brunner,Nagel,Internistische Krebstherapie（癌
の内科的治療）,Springer Verlag,2版,p.309（1979）に
よる）、コルヒチン（SIGMA）。
架橋剤を加え、更に実施例２のように処理してから、
単クローン性抗体JDB1（Strelkauskas,A.J.,Cancer−Im
munol.Immunother.Vol.23,p.31,1986による）2.1mgを小
胞溶液VESに加えて乳癌用医薬のヒト1000人分の用量の
次の全組成物を得た： 46mg赤血球凝集素 250mgホスファチジルコリン 30mgホスファチジルエタノールアミン 20mg架橋剤（スルホ−SMPB） 1mg単クローン性抗体 1000mgアドリプラスチン 1000mgエンドキサン 1000mgフルオロウラシル 実施例５ 実施例１及び２を次のように変更して繰り返した： インフルエンザ赤血球凝集素三量体の代わりに、融合
ペプチドを含む単量体を使用した。融合ペプチドを含む
赤血球凝集素−２−単量体は、Ｓ−Ｈ結合をD4−ジチオ
トレイトール（DTT,Sigma）を用いて化学的還元により
切断し、次にpH6でゲルクロマトグラフィー（セファデ
ックスG50）により赤血球凝集素−１ペプチドから分離
して得られた。精製した赤血球凝集素−２−単量体懸濁
液は融合ペプチドを含めて単量体を180μｇ含有してい
た。
単クローン性抗体JDB1（Strelkauskas,A.J.,Cancer−Im
munol.Immunother.Vol.23,p.31,1986による）2.1mgを小
胞溶液VESに加えて乳癌用医薬のヒト1000人分の用量の
次の全組成物を得た： 46mg赤血球凝集素 250mgホスファチジルコリン 30mgホスファチジルエタノールアミン 20mg架橋剤（スルホ−SMPB） 1mg単クローン性抗体 1000mgアドリプラスチン 1000mgエンドキサン 1000mgフルオロウラシル 実施例５ 実施例１及び２を次のように変更して繰り返した： インフルエンザ赤血球凝集素三量体の代わりに、融合
ペプチドを含む単量体を使用した。融合ペプチドを含む
赤血球凝集素−２−単量体は、Ｓ−Ｈ結合をD4−ジチオ
トレイトール（DTT,Sigma）を用いて化学的還元により
切断し、次にpH6でゲルクロマトグラフィー（セファデ
ックスG50）により赤血球凝集素−１ペプチドから分離
して得られた。精製した赤血球凝集素−２−単量体懸濁
液は融合ペプチドを含めて単量体を180μｇ含有してい
た。
実施例６
実施例２を次のように変更して繰り返した：
インフルエンザ赤血球凝集素三量体の代わりに、粗製
の融合ペプチドを用いた。人工膜小胞の調製に使用した
インフルエンザ融合ペプチドは化学的に合成した。図２
に挙げたアミノ酸配列の何れも使用可能であるが、それ
ぞれの配置の一方の端末に少なくとも１個、好ましくは
３個のシステイン基の配置が融合活性に対して効果のあ
ることが判明した。
の融合ペプチドを用いた。人工膜小胞の調製に使用した
インフルエンザ融合ペプチドは化学的に合成した。図２
に挙げたアミノ酸配列の何れも使用可能であるが、それ
ぞれの配置の一方の端末に少なくとも１個、好ましくは
３個のシステイン基の配置が融合活性に対して効果のあ
ることが判明した。
これらの人工融合ペプチドの一つを有する溶液は、こ
れを４μg/m含んでいた。
れを４μg/m含んでいた。
上記の融合ペプチドの一つを含む小胞は次のようにし
て調製された： ホスファチジルコリン9mg/mとホスファチジルエタ
ノールアミン1mg/mとをクロロホルム・メタノールの
2:1混合液に溶解し、この溶液の28mを回転蒸発器で真
空下で注意して蒸発し、丸底フラスコの内面に薄いリン
脂質の層を形成した。
て調製された： ホスファチジルコリン9mg/mとホスファチジルエタ
ノールアミン1mg/mとをクロロホルム・メタノールの
2:1混合液に溶解し、この溶液の28mを回転蒸発器で真
空下で注意して蒸発し、丸底フラスコの内面に薄いリン
脂質の層を形成した。
デキストラン硫酸3gを、融合緩衝液1m当たり100μm
olのオクタエチレングリコールモノドデシルエーテルを
含む界面活性剤溶液15.3mに溶解し、その溶液を丸底
フラスコのリン脂質の層に加えた。少なくとも15分振盪
してリン脂質の層を完全に溶解し、得られた溶液をメッ
シュサイズ（湿潤）25−50のポリスチレンビーズマイク
ロキャリヤ4.8gと共にガラス容器に移した。
olのオクタエチレングリコールモノドデシルエーテルを
含む界面活性剤溶液15.3mに溶解し、その溶液を丸底
フラスコのリン脂質の層に加えた。少なくとも15分振盪
してリン脂質の層を完全に溶解し、得られた溶液をメッ
シュサイズ（湿潤）25−50のポリスチレンビーズマイク
ロキャリヤ4.8gと共にガラス容器に移した。
この容器を、内容物が毎秒２回一端から他端へ動くよ
うに振盪した。１時間後懸濁液を細いピペットで吸引し
て、同じサイズのポリスチレンビーズマイクロキャリヤ
2.4gと共に新しい容器に移して、このカラムを30分振盪
した。この過程を２回繰り返した。最後の過程で得られ
た溶液をビーズから分離し、水浴に固定して超音波処理
装置（Bransonic,Branson Europe BV,周波数50kHz±10
％）で処理した。10秒間の超音波の衝撃をそれぞれ10秒
の間隔を置いて２回繰り返して、直径約50−100nmの中
間サイズの小胞を作った。
うに振盪した。１時間後懸濁液を細いピペットで吸引し
て、同じサイズのポリスチレンビーズマイクロキャリヤ
2.4gと共に新しい容器に移して、このカラムを30分振盪
した。この過程を２回繰り返した。最後の過程で得られ
た溶液をビーズから分離し、水浴に固定して超音波処理
装置（Bransonic,Branson Europe BV,周波数50kHz±10
％）で処理した。10秒間の超音波の衝撃をそれぞれ10秒
の間隔を置いて２回繰り返して、直径約50−100nmの中
間サイズの小胞を作った。
20mgのスルホ−SMPB（Pierce）を含む2mの水を上記
の懸濁液に加えた。室温で１時間緩やかに振盪してか
ら、小胞を100 000gで15分間超遠心してペレットにし
た。
の懸濁液に加えた。室温で１時間緩やかに振盪してか
ら、小胞を100 000gで15分間超遠心してペレットにし
た。
人工融合ペプチドを含む溶液2mをペレットに加え、
再懸濁した材料を室温で１時間の間５分毎にそれぞれ数
秒間注意して振盪し、最後にこれを100 000gで10分間超
遠心して再度ペレットにした（結合しなかった融合ペプ
チドを除くため）。このペレットを生理的食塩水200m
に再懸濁した。
再懸濁した材料を室温で１時間の間５分毎にそれぞれ数
秒間注意して振盪し、最後にこれを100 000gで10分間超
遠心して再度ペレットにした（結合しなかった融合ペプ
チドを除くため）。このペレットを生理的食塩水200m
に再懸濁した。
実施例７
実施例６を次のように変更して繰り返した：
人工融合ペプチド２μｇを含む溶液2mと抗−Leu 3A
100μｇを含む溶液2mとを小胞を含むペレットに加
え、再懸濁した材料を室温で１時間の間５分毎にそれぞ
れ数秒間注意して振盪し、最後にこれを100 000gで10分
間超遠心して再度ペレットにした（結合しなかった融合
ペプチドと細胞特異ペプチドとを除くため）。このペレ
ットを生理的食塩水200mに再懸濁した。
100μｇを含む溶液2mとを小胞を含むペレットに加
え、再懸濁した材料を室温で１時間の間５分毎にそれぞ
れ数秒間注意して振盪し、最後にこれを100 000gで10分
間超遠心して再度ペレットにした（結合しなかった融合
ペプチドと細胞特異ペプチドとを除くため）。このペレ
ットを生理的食塩水200mに再懸濁した。
実施例８
実施例１〜４による小胞をラブドウイルス、パライン
フルエンザウイルス又はトガウイルスからの融合ペプチ
ド又は赤血球凝集素により調製した。
フルエンザウイルス又はトガウイルスからの融合ペプチ
ド又は赤血球凝集素により調製した。
ａ） 狂犬病ラブドウイルスはヒトの二倍体細胞で作ら
れた。1m当たり107個の狂犬病ウイルスを含む生産物
（上澄み）を精製し、ショ糖密度勾配超遠心法により濃
縮した。精製した狂犬病ウイルス懸濁液は210μg/mの
狂犬病ウイルス赤血球凝集素を含んでいた。これを実施
例１にならって更に処理した。
れた。1m当たり107個の狂犬病ウイルスを含む生産物
（上澄み）を精製し、ショ糖密度勾配超遠心法により濃
縮した。精製した狂犬病ウイルス懸濁液は210μg/mの
狂犬病ウイルス赤血球凝集素を含んでいた。これを実施
例１にならって更に処理した。
ｂ） パラインフルエンザウイルスIII型を鶏卵の尿膜
腔で培養し、実施例１のようにショ糖密度勾配超遠心法
により２回精製した。精製したパラインフルエンザビリ
オン懸濁液は245μg/mのパラインフルエンザウイルス
赤血球凝集素を含んでいた。これを実施例１にならって
更に処理した。
腔で培養し、実施例１のようにショ糖密度勾配超遠心法
により２回精製した。精製したパラインフルエンザビリ
オン懸濁液は245μg/mのパラインフルエンザウイルス
赤血球凝集素を含んでいた。これを実施例１にならって
更に処理した。
ｃ） 風疹トガウイルスをヒトの二倍体細胞で作り、
ａ）にならって精製した。精製いた風疹ウイルスビリオ
ン懸濁液は205μg/mの風疹ウイルス赤血球凝集素を含
んでいた。これを実施例１にならって更に処理した。
ａ）にならって精製した。精製いた風疹ウイルスビリオ
ン懸濁液は205μg/mの風疹ウイルス赤血球凝集素を含
んでいた。これを実施例１にならって更に処理した。
実施例９
抗ウイルス薬剤を実施例１によって調製した。hu−PB
L−SCIDマウスを14日間リボヌクレアーゼ二量体で、10
日間リン酸塩緩衝液（空試験）のみ、デキストラン硫
酸、又はリボヌクレアーゼ二量体（PCT/US90/00141の実
施例１により調製）の３用量レベル、リポソーム中のデ
キストラン硫酸、又はリポソーム中のリボヌクレアーゼ
二量体（最後の二つは本発明の実施例１により調製）の
何れかで処置した。この処置はHIV−1III Bの100TCID50
によるウイルス感染と同時に始めた。hu−PBL−SCIDマ
ウスはウイルス感染後２週、４週、６週目にそのウイル
ス感染の程度（ウイルス分離、プロウイルス配列のPCR
−検出）を調査した。本研究の結果を各処置グループ毎
にウイルスの分離されたマウスの百分率で示した： リン酸塩緩衝液（空試験） 80％ リボヌクレアーゼ二量体0.001mg/kg 92％ リボヌクレアーゼ二量体0.1mg/kg 30％ リボヌクレアーゼ二量体10.0mg/kg 63％ デキストラン硫酸10mg/kg 33％ リポソーム中のデキストラン硫酸10mg/kg 14％ リポソーム中のリボヌクレアーゼ二量体 25％ 本研究の結果によれば、リボヌクレアーゼ二量体0.1m
g/kg、デキストラン硫酸10mg/kg、リボヌクレアーゼ二
量体含有リポソーム、及びデキストラン硫酸含有リポソ
ームは注射12時間後にこれらの処置したhu−PBL−SCID
マウスの過半数をHIV−感染から保護した。リボヌクレ
アーゼ二量体の10.0mg/kgではよい結果が得られなかっ
たが、これは用量レベルが高くなるとリボヌクレアーゼ
二量体が免疫性を抑圧するためと思われる。0.001mg/kg
ではリボヌクレアーゼ二量体は保護効果がなかった。し
かし、本発明によるリポソームに入れたリボヌクレアー
ゼ二量体では用量が高い場合でも効果率は63％から25％
に改良された。リポソーム中の最適の用量レベルの場合
には更に高い効果が期待される。
L−SCIDマウスを14日間リボヌクレアーゼ二量体で、10
日間リン酸塩緩衝液（空試験）のみ、デキストラン硫
酸、又はリボヌクレアーゼ二量体（PCT/US90/00141の実
施例１により調製）の３用量レベル、リポソーム中のデ
キストラン硫酸、又はリポソーム中のリボヌクレアーゼ
二量体（最後の二つは本発明の実施例１により調製）の
何れかで処置した。この処置はHIV−1III Bの100TCID50
によるウイルス感染と同時に始めた。hu−PBL−SCIDマ
ウスはウイルス感染後２週、４週、６週目にそのウイル
ス感染の程度（ウイルス分離、プロウイルス配列のPCR
−検出）を調査した。本研究の結果を各処置グループ毎
にウイルスの分離されたマウスの百分率で示した： リン酸塩緩衝液（空試験） 80％ リボヌクレアーゼ二量体0.001mg/kg 92％ リボヌクレアーゼ二量体0.1mg/kg 30％ リボヌクレアーゼ二量体10.0mg/kg 63％ デキストラン硫酸10mg/kg 33％ リポソーム中のデキストラン硫酸10mg/kg 14％ リポソーム中のリボヌクレアーゼ二量体 25％ 本研究の結果によれば、リボヌクレアーゼ二量体0.1m
g/kg、デキストラン硫酸10mg/kg、リボヌクレアーゼ二
量体含有リポソーム、及びデキストラン硫酸含有リポソ
ームは注射12時間後にこれらの処置したhu−PBL−SCID
マウスの過半数をHIV−感染から保護した。リボヌクレ
アーゼ二量体の10.0mg/kgではよい結果が得られなかっ
たが、これは用量レベルが高くなるとリボヌクレアーゼ
二量体が免疫性を抑圧するためと思われる。0.001mg/kg
ではリボヌクレアーゼ二量体は保護効果がなかった。し
かし、本発明によるリポソームに入れたリボヌクレアー
ゼ二量体では用量が高い場合でも効果率は63％から25％
に改良された。リポソーム中の最適の用量レベルの場合
には更に高い効果が期待される。
実験の終わりでの機能の劣ったヒトPBL−移植片で処
置したマウスを除外すれば、同じ結論が得られる。しか
し、ヒト免疫グロブリンレベルとβグロブリンPCRとの
分析から、リボヌクレアーゼ二量体リポソーム又はデキ
ストラン硫酸リポソームの処置の何れもがヒト細胞の生
存を妨げるように思われる。ヒト機能に基づくhu−PBL
−SCIDマウスの除外により直接の抗ウイルス効果と免疫
調節活性とをある程度区別することができる。
置したマウスを除外すれば、同じ結論が得られる。しか
し、ヒト免疫グロブリンレベルとβグロブリンPCRとの
分析から、リボヌクレアーゼ二量体リポソーム又はデキ
ストラン硫酸リポソームの処置の何れもがヒト細胞の生
存を妨げるように思われる。ヒト機能に基づくhu−PBL
−SCIDマウスの除外により直接の抗ウイルス効果と免疫
調節活性とをある程度区別することができる。
実施例10
Ｌscher ＆ Glck（1990）（Anti−viral Researc
h 14,39−50）の報告した融合試験では、実施例１によ
り調製した小胞とKawasakiらの方法で調製した再構成イ
ンフルエンザ小胞とのモデル膜による融合活性が比較さ
れた。
h 14,39−50）の報告した融合試験では、実施例１によ
り調製した小胞とKawasakiらの方法で調製した再構成イ
ンフルエンザ小胞とのモデル膜による融合活性が比較さ
れた。
図３はR18−標識付きインフルエンザＡウイルスのDOP
C−コレステロールリポソームによる蛍光デケンチング
の変化を示す。蛍光の増加は、Ｌscher ＆ Glck
（上述）により算出したFDQ％で示してある。
C−コレステロールリポソームによる蛍光デケンチング
の変化を示す。蛍光の増加は、Ｌscher ＆ Glck
（上述）により算出したFDQ％で示してある。
最初の融合速度は、融合が始まった時間零に於ける融
合曲線の接線（図３の破線）から求めた。曲線２がKawa
sakiらの方法で調製した小胞の融合活性度に相当する。
合曲線の接線（図３の破線）から求めた。曲線２がKawa
sakiらの方法で調製した小胞の融合活性度に相当する。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ａ６１Ｋ 31/675 Ａ６１Ｋ 31/675
31/70 31/70
39/395 39/395 Ｌ
47/24 47/24
Ａ６１Ｐ 31/18 Ａ６１Ｐ 31/18
35/00 35/00
(56)参考文献 特開 昭57−118794（ＪＰ，Ａ)
特表 平２−502633（ＪＰ，Ａ)
特表 平４−506518（ＪＰ，Ａ)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
A61K 9/127
A61K 31/16
A61K 31/17
A61K 31/415
A61K 31/505
A61K 31/675
A61K 31/70
A61K 39/395
A61K 47/24
A61P 31/18
A61P 35/00
Claims (11)
- 【請求項１】膜の上の少なくとも１種の官能的に活性な
ウイルス融合ペプチドを有し、さらに望ましい薬剤ある
いは薬学的に活性な物質を含むリン脂質二重層小胞であ
って、前記小胞が、 ａ）ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチ
ジルコリンから成る非ウイルスリン脂質を含む膜、 ｂ）赤血球凝集素三量体または単量体、切断されたサブ
ユニットの一方又は両方、糖ペプチドHA1および糖ペプ
チドHA2、天然の原料から分離された融合ペプチド、及
び人工の融合ペプチドから成るグループから選択された
少なくとも１つの官能的に活性なウイルス融合ペプチ
ド、 ｃ）該膜に架橋された二官能性の架橋剤と、 ｄ）前記架橋剤によって膜に結合された少なくとも１種
の細胞特異標識 を含むことを特徴とするリン脂質二重層小胞。 - 【請求項２】コレステロール含有量が重量で１％未満で
あることを特徴とする請求の範囲第１項記載のリン脂質
二重層小胞。 - 【請求項３】前記小胞の直径が100nm未満であることを
特徴とする請求の範囲第１項又は第２項記載のリン脂質
二重層小胞。 - 【請求項４】前記細胞特異標識が抗体であることを特徴
とする請求の範囲第１項ないし第３項のいずれかに記載
のリン脂質二重層小胞。 - 【請求項５】前記赤血球凝集素が、インフルエンザウイ
ルス、ラブドウイルス、パラインフルエンザウイルスタ
イプIII、セムリキ森林熱ウイルス及びトガウイルス、
から成るグループの少なくとも１種のメンバーに由来す
ることを特徴とする請求の範囲第１項ないし第４項のい
ずれかに記載のリン脂質二重層小胞。 - 【請求項６】膜が、そのウイルスリン脂質の２〜100倍
量のホスファチジルコリンと共存していることを特徴と
する請求の範囲第１項ないし第５項のいずれかに記載の
リン脂質二重層小胞。 - 【請求項７】次の点を特徴とする請求の範囲第１項ない
し第６項のいずれかに記載のリン脂質二重層小胞、 前記膜のリン脂質が重量で70〜95％のホスファチジルコ
リンと５〜30％のホスファチジルエタノールアミンと、 前記膜全体に対して重量で５〜10％の架橋剤とを含む。 - 【請求項８】所望の細胞への薬剤供与のための、特許請
求の範囲第１項ないし第７項のいずれかに記載のリン脂
質二重層小胞。 - 【請求項９】医薬品の調製のための、請求の範囲第１項
ないし第８項のいずれかに記載のリン脂質二重層小胞。 - 【請求項１０】HIV感染または癌腫に対する医薬品の調
製のための、請求の範囲第１項ないし第８項のいずれか
に記載のリン脂質二重層小胞。 - 【請求項１１】前記小胞が次の物質の少なくとも１種を
含む請求の範囲第１項ないし第10項のいずれかに記載の
リン脂質二重層小胞。 イミダゾールカルボキサミド、ヒドロキシ尿素、アドリ
プラスチン、エンドキサン、フルオロウラシル、コルヒ
チン、デキストラン硫酸、リボヌクレアーゼ二量体、リ
ソチーム二量体。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP91101414A EP0497997B1 (en) | 1991-02-02 | 1991-02-02 | Synthetic membrane vesicles containing functionally active fusion peptides as drug delivery systems |
| EP91101414.0 | 1991-02-02 | ||
| PCT/EP1992/000089 WO1992013525A1 (en) | 1991-02-02 | 1992-01-17 | Synthetic membrane vesicles containing functionally active fusion peptides as drug delivery systems |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05505406A JPH05505406A (ja) | 1993-08-12 |
| JP3404037B2 true JP3404037B2 (ja) | 2003-05-06 |
Family
ID=8206362
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50347192A Expired - Fee Related JP3404037B2 (ja) | 1991-02-02 | 1992-01-17 | 薬剤供給システムとしての機能的活性融合ペプチドを含む人工膜小胞 |
Country Status (22)
| Country | Link |
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