BG61215B1 - Synthetic membrane vesicles containing functionally active fusion peptides as drug delivery systems - Google Patents

Synthetic membrane vesicles containing functionally active fusion peptides as drug delivery systems Download PDF

Info

Publication number
BG61215B1
BG61215B1 BG96928A BG9692892A BG61215B1 BG 61215 B1 BG61215 B1 BG 61215B1 BG 96928 A BG96928 A BG 96928A BG 9692892 A BG9692892 A BG 9692892A BG 61215 B1 BG61215 B1 BG 61215B1
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
cell
vesicles
hemagglutinin
membrane
vesicle
Prior art date
Application number
BG96928A
Other languages
English (en)
Other versions
BG96928A (bg
Inventor
Reinhard Glueck
Peter Klein
Peter Hermann
Original Assignee
Nika Health Products Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nika Health Products Ltd filed Critical Nika Health Products Ltd
Publication of BG96928A publication Critical patent/BG96928A/bg
Publication of BG61215B1 publication Critical patent/BG61215B1/bg

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1277—Processes for preparing; Proliposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6839—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting material from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
    • A61K47/6913—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome the liposome being modified on its surface by an antibody
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Feedback Control In General (AREA)
  • Measurement And Recording Of Electrical Phenomena And Electrical Characteristics Of The Living Body (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Fittings On The Vehicle Exterior For Carrying Loads, And Devices For Holding Or Mounting Articles (AREA)
  • Manufacturing Of Micro-Capsules (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Air Conditioning Control Device (AREA)

Description

Изобретението се отнася до синтетични мембранни везикули /липозоми/, както е описано в преамбюла на претенция 1, и особено до везикули, представляващи на повърхността си молекули на сляти пептиди или други клетъчно специфични протеини. Молекулата слят пептид може да бъде под формата на синтетичен или пречистен пептид или като част от класообразно разклонен гликопротеин от обвит вирус, например хемаглутинин от грипния, парагрипния или Semliri Forest вируси. Клетъчно специфичният протеин може да бъде IgG антитяло, например CD 4 антитяло.
Когато едно лекарство се прилага на даден субект, то обикновено трябва да премине от мястото на приложение до плазменото пространство и следователно начинът на приложение може да окаже значим ефект върху фармакокинетичния профил на лекарството в кръвообръщението. Така, при орално приложение на лекарството, когато е подходящо, се стига до слабо начало на неговото действие и ненадеждно, при достигането на оптимално ниво на лекарството в плазмата. Обратното, при интравенозно инжектиране се стига до бързо и точно установяване на ниво в кръвообращението за сметка на известна болка и неразположение на пациента. Въпреки това, даже когато лекарството се инжектира директно в системата на кръвообръщението, връзката между администрираната доза, нивото на лекарството и продължителността на действието му въобще не е проста. Тези параметри се определят с помощта на мрежа от сложни и често съревноваващи се пътеки, водещи или до акумулиране на активните лекарствени молекули на предназначеното място /мишена/, или до инактивиране и изхвърляне на лекарството. Тези пътища включват биотрансформация в черния дроб или в други тъкани, екскреция чрез бъбреците или жлъчния секрет, свързване на лекарствата към фиксирани или циркулиращи клетки или макромолекули, пасивно или медиирано преминаване на лекарството през мембранните бариери /Creasy, W.A. /1979/: Drug Disposition in Humans, Oxford University Press, New York.
В последните години се наблюдава голям интерес към перспективата да се влияе върху разпределението и метаболизма на лекарствата по благоприятни начини чрез използване на 5 различни видове носители или освобождаващи лекарства системи. Тези системи са предназначени да контролират един или повече от следващите параметри /Juliano, R.R. /1915/, Сап.]. Physiol. Pharmaco 56, 683-690/:
а/ степента на приложение на лекарството в определено телесно пространство;
Ь/ разпределението и локализирането на лекарството в тялото;
с/ продължителността или степента на 15 метаболизъм на лекарството.
Значително подобрение на контролираните освобождаващи лекарства системи представлява развитието на липозомите, които за първи път се описват от Bangkam et al. /Bangkam, 20 A.D., Standish, M.M. and Watkins J.C. /1965/, J.Mol.Biol. 13, 238-252/. В наши дни в литературата са посочени предимствата, които има представянето на дадени лекарства в липозоми. Те могат най-общо да се групират в следващите направления:
1. Липозомите могат да преминават през биологичните мембрани и да улесняват преноса /транспорта/ на лекарства чрез обикновено непропускливи бариери. Липозомите улесняват, в частност, вътреклетъчното навлизане на капсулирани съединения;
2. Липозомите могат да бъдат определени да взаимодействат със специфични тъкани, като подобряват специфичността на лекарството и намаляват токсичността му;
3. Фармакокинетиката на лекарствата може да бъде благоприятно модифицирана от липозомите чрез модулиране на освобождаването на лекарството, разпределението и отстраняването му от кръвоносната система;
4. Химично и метаболично лабилните лекарства могат да бъдат предпазвани от дезактивация чрез липозомите.
Лекарствата, представляващи потенциален интерес за терапевтиката, могат да бъдат отделяни по този начин, тъй като капсулираните съединения проявяват, поне in vitro, модифицирани свойства, при сравнение с немодифицраните субстанции. За съжаление, ранните надежди по отношение на революционно новия достъп до химиотерапията не бяха напълно осъществени от експерименталните фак61215 ти /Fildes, F.J.T. /1981/, Liposomes. From physical structure to therapeutic applications Knight / ed/,Elsevier /North - Holland Biomedical Press/.
По-добри резултати при използване на липозомите като вектори могат да бъдат постигнати чрез въоръжаване на липозомите със специфични протеини. Ако веществата, съдържащи се в липозомите, трябва да се отделят по-успешно при избраните органи или тъкани, то с цел да се избегне натрупването им на нежелани места, трябва да се създадат съответни техники, (като по този начин се намалява токсичността) и оптимизирането на отделянето при специфични клетки /като така се подсилва желаният ефект/.
При някои изследвания се използва покриването на липозомите със струпани имонуглобулини, с цел да се оптимизира освобождаването при фагоцитните клетки /Ismail, G., Boxer, L.A.and Bachner, R.L./1979/, Pediatr. Res., 13. 769-773 /Finkelstein, M.C., Kuhn, S.H., Schieren, H., Weissmann, G.and Haffstein, S./ 1980/: Liposomes and Immunobiology /Tom, B.H. and Six, H.R. eds. /255-270. Elsevier /North Holland Publishing Co., Amsterdam/.
Следващо подобрение е описано от Gregoriadis and Neerunjun /1975/, Biochem. Biohlys. Res. Commun., 65, 537-544, където въоръжаването на липозомите се засилва чрез асоцииране на клетъчно специфични IgG антитела. Ефектът от липозомите се увеличава от 3 до 25 пъти при поставяне на различни щамове клетки в присъствие на липозоми, асоциирани с IgG имуноглуболини срещу посочените клетъчни щамове. Използваната техника показва, че “въоръжените” липозоми по този начин не успяват да се слеят с клетъчната мембрана и следователно се избягва ефикасното освобождаване на лекарства в клетките. /Leserman, L., Weinstein, J.N., Blumenthal, R., Sharrou, SO. and Texy, W.D./1979/, J.Immunol. 122. 585-591/.
Най-значимото подобрение при производството на освобождаващи лекарства системи е “въоръжаването” на липозомите с вирусни протеини: липозомните мембрани се реконституират с протеини като хемаглутинина от грипния вирус /Almeida, J.D., Brand, С.М. Eduards, D.C.and Heath T.D. /1975/, Lancet 2, 899-900/. Ефективността и специфичността на ранното вирусно взаимодействие с клетката гостоприемник /абсорбция, пенетрация/ може да бъде предадено на липозомните но сители чрез инкорпориране на подходящите вирусни протеини в липозомните мембрани. Наистина, инкорпорирането на класообразно разклонени протеини от Сендай вирус, в двойния слой на липозомите, води до най-малко 100 пъти увеличение, при прилагане на миши I клетки от А фрагмента на дифтерийния токсин, сравнени със съдържащи фрагмент А липозоми, без класообразни разклонения /Uehida, T.,Kim, J., Yamaizumi, M., Miyahe, Y.and Okeda, Y. /1979/. Cell. Biol. 80,10-20/.
Главните пречки при горните методи се дължат на липсата на напълно активни слети белтъци на грипния хемаглутинин. Грипните А вируси навлизат /пенетрират/ в техните клетки гостоприемници чрез мембранна фузия. След прикрепяне към клетъчната повърхност вирусните частици навлизат в клетките и се транспортират до ендозомите и лизозомите. Киселата среда в тези органели активира фузията/сливането/между мембраните на вируса и на клетката гостоприемник. Предимството на везикулярно-клетъчната фузия при ниско рН се основава на факта, че съдържимото на везикулите се освобождава след навлизането в клетъчната цитоплазма /рН в ендозома е около 5,2/. Откритието на индуцираната прй ниско рН фузия на гликопротеините на грипния вирус доведе до многобройни опити да се развият ефективно освобождаващите лекарства-системи чрез липозоми “въоръжени” с грипен хемаглутинин. Kawasaki, K.et al. /Biochemica et Biophysica Acta /1983/, 733, 286-290, използват реконституирани везикули от грипни хемаглутининови гликопротеини във фосфатидилхолин от яйчен жълтък/ спин-белязан фосфатидилхолин/холестерол /моларно отношение 1,6:0,4:1/. Препарати с подходящо отношение протеин-липид /1:44 и 1:105 mol/mol/ съдържат везикули с диаметър от 100 до 300 nm и с голяма плътност на класообразните разклонения на повърхността, но има и някои неудобства:
1/ Поради високото съдържание на холестерол и остатъците детергент, те показват намалена ендоцитоза на фагоцитните клетки. Самите Kawasaki et al описват само 66% активност; но според по-скоро разработения, подобрен метод-тест, активността е само 1% /!/ след 7 min /виж пример 10 по-долу/. Възможно е това да се дължи на факта, че Kawasaki et al използват Triton Х-100, който частично реаги3 pa c хемаглутинина и не се отстранява напълно чрез диализа.
2/ За да се изучи в детайли ролята на компонентите на вирусната мембрана при фузията, е нужно да сме във възможност да 5 манипулиране тези компоненти. За тази цел се изисква метод за изолиране и реконституиране на вирусните класообразно разклонени протеини, продуцирайки реконституирани вирозоми с пълна биологична активност към 10 фузия. Въпреки усилията на Kawasaki et al, не се описва реконституиране на вирусните обвивки на грипния вирус, които да показват пълна биологична активност към фузия.
3/ Прикрепянето на “въоръжените” 15 липозоми, съдържащи фармацевтично активни вещества, към специфични клетки не може да се демонстрира.
Повечето от другите методи, използвани за реконституиране на вирусни обвивки, се 20 базират на разтворимостта на вирусната мембрана с детергент и след седиментация на вътрешните вирусни протеини и генетичния материал се отделя детергентът от супернатантата. Детергенти с висока критична мицелна 25 концентрация като октилглюкозид, могат ефективно да се отстранят чрез диализа. Реконституиране чрез използване на октилглюгозид са описани за Semliki Forest вирус /SFV/ /Helenius, A., Sarvas, M. and Simons, К./1981/, Eur.J. 30 Biochem. 116, 27-35/; вируса на везикулярния стоматит /VSV// /Eidelman, O., Schlegel, R., Tralka, T.S. and Blumenthal, R. /1984/, J.Biol. Chem. 259,4622-4628/; грипния вирус /Huang, R.T.C., Wahu, K., Klenk, H.D.and Rou, R./1980/ 35 Virology, 104,294-302/; и Сендай вирус /Harmsen, M.D., Wilschut, J., Scherpof, G., Hulstaert, C. and Hoekstra, D./1985/, Eur. J.Biochem., 149591-599/. Въпреки това не се продуцират истински реконституирани вирусни обвивки във 40 всеки един от тези случаи. Например вирозомите, формирани от SFV, са с променено съотношение протеини-липиди спрямо това на вирусната мембрана, а вирозомите, продуцирани от VSV, не проявяват биологична активност 45 към фузия.
Друг метод, описан в литературата, е отделянето на класообразните разклонения на грипния вирус от вирусните частици с бромелайн. Полученият по този начин хемаглути- 50 нин се прикрепя към липозомите /Doms, R., Heleraus, D. and White, J./1985/J.Biol. Chem.,
260 /5/ 2973-2981/. Основната пречка при този метод е ограничената биологична активност на подобни везикули, дължаща се на разцепване с бромелайн. Техническият проблем е да се осигурят везикули които да транспортират желаните лекарства или фармацевтично активни субстанции до специфичните клетки, такива като макрофагите, Т4-помощните клетки, мозъчните клетки или други клетки на специфични органи, които везикули, след това се прикрепят плътно към тези клетки, навлизат в клетките чрез фагоцитоза или ендоцитоза, така че да се освободи желаното лекарство в цитоплазмата на желаната клетка, непосредствено след ендоцитозата.
Разрешението на описания технически проблем се постига чрез осигуряване на вирусните фемаглутининови вирозоми, характеризирани в първа претенция. Специфичните варианти на осъществяване на изобретението и на подобрените везикули са описани в подпретенции от 2 до 9. Метод за получаване на такива везикули е описан в претенции 10 и 11. Приложение на такива везикули е описано в претенции 12 и 13.
Съгласно това, се осигуряват вирусни хемаглутининови вирозоми, които включват липозома, идеална за ендоцитоза, и напълно активен биологично клетъчноспецифичен маркер, за предпочитане вирусен хемаглутининов гликопротеин или негов производен, или синтетичен слят пептид, способен да индуцира непосредствената фузия на спомената вирозома след ендоцитоза от желаната клетка.
Друг вариант за осъществяване на изобретението е този, при който подходящ крослинкер, който да адсорбира върху специфичната липозома, се използва в сместа заедно със специфично антитяло, насочено към отговорния рецептор на желаната клетка, за да индуцира механизма на ендоцитоза, което е свързано към крослинкера по такъв начин, че да остане напълно биологично активно.
Основната характеристика на тези везикули, освобождаващи лекарства, е, че те носят върху повърхността си въпросните напълно активни вирусни гликопротеини или техни производни и биологично активни, специфични антитела, способни да се прикрепят към желаните клетки, да навлязат в клетките чрез фагоцитоза или ендоцитоза, да индуцират непосредствената фузия на тези везикули с вът решната цитоплазмена мембрана и да освободят съдържанието на вирозомите в цитоплазмата на клетките. Благодарение на напълно активните слети пептиди съгласно изобретението лекарствата се освобождават веднага след фагоцитозата, с цел да се избегне нежеланият продължителен престой в ендоцитозомите, което би дало начало на неспецифична деградация на фармацевтичните субстанции, съдържащи се във вирусните хемаглутининови везикули съгласно настоящото изобретение. При pH 5 грипните сляти пептиди от повърхността на везикулите се активират по същия начин както при случая с живия грипен вирус. Съдържимото на везикулите се освобождава в цитоплазмата, както при случая с грипния вирус и освободения нуклеопротеин.
Терминът “липозома” се отнася до среден размер фосфолипиди с биламеларна структура, изготвени чрез контролирано отстраняване на детергента. Размерът на везикулите, първоначално формирани при отстраняването на детергента, зависи от използвания детергент и фосфолипид, и при някои случай, от метода и скоростта на отстраняване на детергента.
Настоящото изобретение се отнася също до метод за приготвяне на везикули, специално подходящи за фагоцитоза. Методът включва следните етапи:
/ Разтваряне на един или няколко фосфолипида в нейонен детергент;
2/ Формиране на везикули чрез отстраняване на детергента с микроносители от полистиролови перли /омрежен строеж - влажни -20-50;
3/ Извършва се определено механично движение по време на отстраняването на детергента;
4/ Желаният диаметър на везикулите /50- 100 пт/ се постига чрез ултразвукова обра-ботка.
Друг вариант на осъществяване на настоящото изобретение се отнася до везикули, при които фосфолипидите включват 70-95% фосфатидилхолин и 5 до 30% тегл. от друг фосфолипид като фосфатидилетаноламин. Съдържанието на холестерол е за предпочитане под 1%.
Терминът “слят пептид” се отнася до вирусни класообразно разклонени гликопротеини, включващи слетия пептид. Един вариант на осъществяване на настоящото изобретение се отнася до пълния хемаглутининов тример на класообразните разклонения на вирусната повърхност или до един мономер, или до една или две разцепени субединици, гликопептидите НА1 и НА2, съдържащи функционалния слят пептид. Друг вариант на осъществяване на настоящото изобретение се отнася до самия слят пептид, изолиран или синтетично получен. Един от предпочитаните варианти на осъществяване на настоящото изобретение е този, при който споменатите полипептиди, включващи слетия пептид се отнасят до грипни хемаглутинини, по-специално от подтип АΗ,Ν,.
Терминът “крослинкер” се отнася до органична хетерофункционална молекула, способна да се свързва към повърхността на везикулите, приготвени съгласно изобретението и способни да свързват полипептиди. Предпочитан вариант за осъществяване на настоящото изобретението е този, при който тази молекула е органична, бифункционална молекула, съдържаща карбоксилна група и тиолова група, по-специално сулфосукцинимидил-/5-/производно, като 5-4-/р-малеимидо-фенил/-бутират, S-ацетат, 8-2-/т-азидо-о-нитробензамидо/етил1,3'-дитиопропионат, S-6-/4'-азидо-2'-нитрофениламино/хексаноат Б-/4-азидофенилдитио/ пропионат, S-2/р-азидосалицил-амидо/етил1,3'-дитиопропионат, S-2/биотинамидо/-етил1,3'-дитиопропионат,8-6-/биотинамидо/хексаноат, 8-3-/4-хидроксифенил/пропионат, S-/4йодоацетил/ аминобензоат, 5-4-/1Ч-малеимидометил/цеклохексан-1 -карбоксилат, S-2,2,5,5тетраметил пиролин-1 -оксил-НС1.
Терминът “клетъчно специфичен” протеин или маркер се отнася до протеин, способен да се свързва към крослинкера на повърхността на везикулата и да се свързва към клетъчните рецептори, индуциращи механизма на ендоцитоза. Предпочитан вариант на настоящото изобретение е този, при който тази молекула се отнася до клетъчен-рецептор-специфично антитяло, по-специално до моноклонално антитяло.
Примерите и фигурите илюстрират изобретението:
Пример 1. Изготвяне на синтетични мембранни везикули от фосфатидилхолин с напълно функционално активни вирусни слети пептиди в хемаглутининов тример от грипния ' Τ“***.
л^»*«Жйййвйгл ,-ΜΓ-\ вирус и съдържащи декстран сулфат като антивирусно лекарство.
Фигура 1 показва схемата на метода, окръжностите представляват течни разтвори или суспензии, квадратите представляват твърди образувания или преципитати. Най-общо:
Смесват се слетият буферен разтвор F В, съдържащ 2700 mg сухо вещество и хемаглутининова суспензия НА, съдържаща 46 mg НА и 31,1 μπιοί вирусни фосфолипиди VPL и е подлагат на ултрацентрофугиране UC1. Получената плътна маса се разтваря с разтвор III, съдържащ слетия буфер F В и октаетилен гликол монододецилов етер OEG като умерен детергент. Следващо ултрацентрофугиране UC2 води до супернатанта IV, съдържаща F В, НА, VPL и OEG, към която се добавя антивирусния декстран сулфат за получаване на разтвор V. Междувременно фосфатидилхолинов /РС/ разтвор VI се подлага на изсушаване чрез ротационен вакуум-изпарител в облодънна колба, при което се получава тънък PC-слой на вътрешната повърхност на колбата. Разтвор V се прибавя към този слой и се получава разтвор VII, който се третира трикратно с микроносители от полистиролови перли РМВ за отстраняване на OEG до получаване на разтвор VIII, в който се проявяват везикулите VES от желания размер, вследствие на ултразвукова обработка US; получената суспензия IX се разрежда с NaCl - разтвор X до образуване на лекарствената суспензия DR.
В детайли:
Фузионният разтвор /I/ съдържа 7,9 mg NaCl/ml, 4,4 mg/ml тринатриевцитрат дихидрат, 2,1 mg/ml 2-морфолиноетан сулфонова киселина монохидрат /MES/ и 1,2 mg/ml N-хидроксиетил-пиперазин-№-2-етан сулфонова киселина във Н20 /рН се наглася на 7,3 с 1-N NaOH/.
Грипният вирус /щам А/Шахнайски/16/ 89/ /H3N2//се развива в алантоиса на кокоше яйце и се пречиства двукратно чрез ултрацентрофугиране в захарозен градиент, както е описано от Skehel and Schled 1971/ViroIogy 44,396408/. Суспензия /II/ от пречистен грипен вирион съдържа 266 μg/ml хемаглутинин от грипен вирус и общо количество 31,1 mol вирусни фосфолипиди, които са определени както следва:
Вирусни фосфолипиди се екстрахират съгласно Folch et al ./Folch J., Lees, M.and Sloane,
S.G.H./1957/; J.Biol.Chem.226,497-509/. За анализ на фосфолипидите тежката органична фаза се изпарява и остатъкът или се подлага на определяне на фосфатите /Chem,P.S., Toribara, 5 T.Y.and Warner., Η./1956/; Anal.Chem.28,17561758/, или се разтваря в малко количество хлороформ-метанол за последващ /TLC/ тънкослоен хроматографски анализ на фосфолипидите. Силикагелови плаки се използват 10 и се проявяват в система разтворители хлороформ-метанолоцетна киселина-вода /25:15:4:2; об./об./об./об./. Отделните фосфолипиди се визуализират чрез експониране с йод и се идентифицират на основата на техните стой15 ности /сравнение с контролни проби/. Протеините се определят по модифициран метод на Лоури /Peterson, G.L./1977/; Anal.Biochem. 83,346-356/.
Общо количество 173 ml/ от разтвор /II/ се смесва със същото количество от въпросния слят буфер разтвор /I/. Този разреден грипен вирус се уплътнява чрез ултрацентрофугиране при 100,000 xg за 10 min.
15,3 ml детергентен разтвор, съдържащ 54 mg/ml /= 100 μπιοί/ml от октаетилен гликол монододецилов етер /OEG/ във въпросния слят буферен разтвор се прибавя към уплътнения грипен вирус. Това отговаря на 18 pg. 33,3 nmol OEG pg хемаглутинин. След десет минути уплътнената утайка се разтваря напълно. Разтворът се подлага в продължение на 1 h на ултрацентрофугиране при 100,000 х g.300 mg от изсушеното антивирусно лекарство декстран сулфат /Luscher, M.and Gluck, R., Antirvral Research 14,39-50/ се прибавят към останалата супернатанта IV, съдържаща разтворен грипен хемаглутининов тример плюс неосъществен остатък от невраминидаза и други съставки, които образуват разтвор V.
Фосфатидилхолин /SIGMA/ се разтваря в смес 2:1 на хлороформ и метанол до концентрация 10 mg/ml. 28 ml от този разтвор VI внимателно се изпаряват чрез прилагане на вакуумротационен изпарител, като се образува тънък фосфолипиден слой от 280 mg по вътрешната повърхност на облодънна колба.
Разтвор V се прибавя към фосфолипидния слой в облодънната колба. След поне 15 минутно разбъркване и пълно разтваряне на фосфатидилхолина образуваният разтвор VII се прехвърля в стъклен контейнер заедно с 4,8 g микроносители от полистиролови перли
РВМ с омрежена структура с размер /влажни/ от 25-50.
Контейнерът се разклаща, така че съдържанието да се придвижи двукратно за секунда от единия до другия край. Един час покъсно суспензията се аспирира с тънка пипета и се прехвърля в нов контейнер с 2,4 g микроносители от полистиролови перли от същия размер. Контейнерът се разбърква в продължение на 30 min. Процедурата се повтаря двукратно. След последната стъпка полученият разтвор VIII се отделя от перлите, фиксира се на водна баня и се подлага на ултразвукова обработка на апарат /Bransonic, Branson Europe BV, честота 50 kHz ±10%. 10 секунден ултразвуков шок се повтаря двукратно, през интервали от 10 секунди всеки, и се получават везикули със среден размер с диаметър от около 50-100 nm. Крайният разтвор IX се разрежда 1:1000 с физиологичен NaCl разтвор X.
Пример 2. Приготвяне на синтетични мембранни везикули, съдържащи антивирусно антитяло лекарство, адсорбирано върху хемаглутининов тример от грипния вирус и CD4 моноклонални антитела.
Везикулите се приготвят съгласно пример 1 със следните модификации: вместо 10 mg, само 9 mg фосфатидилхолин, и 1 mg фосфатидилетаноламин/кефалин/ на ml се разтварят в 2:1 смес от хлороформ и метанол.
След приготвянето на хемаглутининовите везикули съгласно пример 1 20 mg сулфосукцинимидил-4-/№малецдофенил-бутират /SMPB/ /като крослинкер/ в 2 ml вода се прибавят към разтвора. След 1 h престой на стайна температура и при внимателно разклащане везикулите се уплътняват чрез ултрацентрофугиране при 100,000 х g в продължение на 10 min.
ml от Anti-Leu ЗА /Becton Dickinson/ се прибавят към центрофугата /уплътнението/. Ресуспендираният материал се разклаща внимателно за няколко секунди на всеки 5 min в продължение на 1 h при стайна температура. Накрая се уплътнява отново/ за отстраняване на несвързаните антитела/чрез ултрацентрофугиране при 100,000 х g за 10 min. Центрофугата се ресуспендира в 1,500 ml физиологичен разтвор на NaCl.
Пример 3. Пример 2 се повтаря със следните модификации:
Вместо декстранов сулфат 1000 mg от имидазолкарбоксамид и 1000 mg хидроксиуреа /фармацевтично ефикасно срещу меланоми както е описано от Brunner and Nagel, Springer Verlag, 2 nd, edition, Intemistische Krebstherapie, page 93/1979//се прибавят към разтвор IV/ вж.пример 1/.
След прибавяне на крослинкера и по-нататъшното обработване, както в пример 2, 1 mg от моноклоналните антитела /също R 24, както е описано от Hought, A.N.et al./1985/, Proc. Nat.Ac.S.Vol.82.p. 1242; или 0,5 mg L55 - 0,5 mg L72,както е описано от Iric, R.S.et al., Lancet / 1989/,p 786-787/ се прибавят към разтвора на везикулите VES, като се достига до следният общ състав в Mg за 1000 човешки дози: 46 хемаглутинин, 25 фосфатидилхолин, 30 фосфатидилетаноламин/кефалин/, 20 крослинкер /SulfoSMPB/, 1 моноклонално антитяло 1000 имидазол-карбоксимид и 1000 хидроксиуреа.
Тези все още конвенционални препарати трябва да бъдат приложени в петкратно количествено дозиране, т.е. посочените количества са само за 200 човешки дози.
Пример 4. Пример 2 се повтаря със следните модификации.
Вместо декстранов сулфат се добавят към разтвор IV /виж пример 1/ по 1000 mg от всеки от поне един от следващите фармацевтични препарати: адрипластин, ендоксан, флуорурацил /както е описано от Brunner and Nagel, Jntemistische Krebstherapie; Springer - Verlag, 2nd edition, p.309, 1979/ и колхицин /Sigma/.
След прибавяне на крослинкера и по-нататъшна обработка, както в пример 2, 1 mg от моноклонално антитяло JDB1 /като е описано от Strelkauskas, A.J.,Cancer - Immunol. Immunofher.Vol.23.p.31, 1986/ се прибавят към разтвора с везикули VES до получаване на пълен състав за 1000 човешки дози от фармацевтичния препарат срещу mamma -карциноми със състав в mg; 46 хемаглутинин, 250 фосфатидилфолин, 30 фосфатидилетаноламин, 20 крослинкер /Sulfo-SMPB/, 1 моноклонално антитяло, 1000 адрипластин, 1000 ендоксан и 1000 флуорурацил.
Пример 5. Примери 1 и 2 се повтарят със следните модификации:
Вместо грипен хемаглутининов тример се използват мономерите, включващи слетите белтъци. Хемаглутинин-2-монометьрът, включващ слетият белтък, се получава чрез разцепване на S-Η моста чрез химическо редуциране с 4-дитиотреитол /DTT, Sigma/ и послед ващо отделяне на хемаглутинин-1 пептида чрез гелхроматография /Sepha dex G 50/ при pH 6. Пречистеният хемаглутинин-2-мономер е суспендиран, като суспензията съдържа 180 pg мономери, включително слетия пептид.
Пример 6. Пример 2 се повтаря със следните модификации:
Вместо грипния хемаглутининов тример се използва нативният белтък. Грипният слят пептид, използван за приготвяне на синтетични мембранни везикули, се получава чрез химичен синтез. Може да се използва коя да е от изброените на фиг.2 аминокиселинни последователности. Установено бе, че разположението на поне една, за предпочитане три, цистеинови групи на единия край на съответната последователност е благоприятно за фузионната /слята/активност.
Разтворът с един от тези синтетични слети пептиди съдържа 4 pg/ml.
Везикулите, съдържащи един от горните слети пептиди, се приготвят по следния начин. 9 mg фосфатидилхолин и 1 mg фосфатидилетаноламин на ml се разтварят в смес 2:1 на хлороформ и метанол. 28 ml от разтвора внимателно се изпаряват чрез прилагане на вакуумротационен изпарител, при което се оформя тънък фосфолипиден слой по вътрешната повърхност на облодънна колба.
g декстрансулфат се разтварят в 15,3 ml в детергентен разтвор, съдържащ 1000 mol октаетилен гликол монододецилов етер на 1 ml от фузионния буфер. След това разтворът се прибавя към фосфолипидния слой в облодънната колба. След разбъркване в продължение на поне 15 min и напълно разтваряне на фосфолипидния слой разтворът се прехвърля в стъклен контейнер заедно с 4,8 g микроносители от полистиролови перли с пореста структура /влажна/ от 25-50.
След това контейнерът се разклаща по такъв начин, че съдържанието да се придвижва двукратно за секунда от единия до другия край. Един час по-късно суспензията се аспирира с тънка пипета и се прехвърля в нов контейнер с 2,4 g микроносители от полистиролови перли със същия размер. Контейнерът се разклаща в продължение на 30 min. Процедурата се повтаря двукратно. След последната стъпка полученият разтвор се отстранява от перлите, фиксира се на водна баня и се подлага на ултразвукова обработка на апарат Bransonic,
Branson Europe BV, c честотата 50 kHz ±10%. 10 - минутен ултразвуков шок се повтаря двукратно през интервали от 10 секунди всеки, което води до везикули със среден размер от около 50-100 nm в диаметър.
Към суспензията се прибавят 2 ml вода, съдържаща 20 mg сулфо-SMPB /Pierce/. След 1 h престой при стайна температура леко разклащане везикулите се уплътняват чрез 15-минутно ултрацентрофугиране при 100,000 х g.
Към уплътнената утайка се прибавят 2 ml разтвор, съдържащ синтетичния слят пептид. Ресуспендираният материал се разклаща внимателно в продължение на няколко секунди на всеки 5 min, в продължение на 1 h на стайна температура. Накрая материалът отново се уплътнява /за да се отделят несвързаните слети пептиди/чрез ултрацентрофугиране при 100,000 х g за 10 min. Уплътнената утайка се ресуспендира в 200 ml физиологичен NaCl.
Пример 7. Пример 6 се повтаря със следните модификации.
ml от разтвор съдържащи 2 g от синтетичния слят пептид, и 2 ml съдържащи 100 g Anti - Leu ЗА, се прибавят към утайката с везикулите. Ресуспендираният материал се разклаща внимателно няколко секунди на всеки 5 min, в продължение на 1 h при стана температура. Накрая материалът се уплътнява отново /с цел да се отстранят несвързаните слети белтъци и специфични белтъци/чрез ултрацентрофугиране при 100,000 х g за 10 min. Утайката се ресуспендира в 200 ml физиологичен разтвор на NaCl.
Пример 8. Везикули съгласно пример 1 до 4 се приготвят със слетия пептид или хемаглутинин от рабдовируси, парагрипни или тогавируси.
а/ Рабдовирусът на бяса се продуцира в човешки диплоидни клетки. Получените супернатанти, съдържащи 107 вируса на бяса на ml, се пречистват и концентрират в захарозен градиент чрез ултрацентрофугиране. Суспензията с вирусите на бяса съдържа 210 g хемаглутинин от вируси на бяса на ml и се обработва по-нататък съгласно пример 1.
б/ Парагрипен вирус тип III се развива в алантоиса на кокоше яйце и се пречиства двукратно чрез ултрацентрофугиране в захарозен гладиент съгласно пример 1. Пречисте-ният парагрипен вирион се суспендира до 245 pg хемаглутинин от парагрипен вирус на ml и по нататък се обработва съгласно пример 1.
в/ Тогавирусът на рубеолата се продуцира в човешки диплоидни клетки и се пречиства съгласно а. Пречистеният рубеолен вирион се суспендира до 205 gg на ml хемаглутинин от вируса на рубеолата и се обработва по-нататък съгласно пример 1.
Пример 9. Антивирусните лекарства се приготвят съгласно пример 1. Мишки hu-PBLSCID се третират с рибонуклеазен димер в продължение на 14 дни, 10 дни алтернативно само с разтвор на фосфатен буфер, с декстран сулфат или рибонуклеазен димер/приготвен съгласно пример 1 от PCT/US90/00141/ на три нива на дозировка, с декстранов сулфат в липозоми, или рибонуклеазен димер в липозоми, като и двете се обработват по-нататък съгласно пример 1 от настоящото изобретение. Третирането се инициира едновременно с това на вируса 100 TCIDJ0 от HIV-1I|IB Мишките hu - PBL - SC1D се оценяват според данните от вирусната инфекция /вирусни изолати, PCR детекция на провирусните секвенции /на 2,4 и 6-тата седмици, следващи вирусната инфекция. Резултатът от изучаването показва процента животни във всяка от третираните групи от кой ви рус са изолирани:
Разтвор на фосфатен буфер /празна проба/ 80%
Рибонуклеазен димер 0.001 mg/kg 92%
Рибонуклеазен димер 0.1 mg/kg 30%
Декстран сулфат 10 mg/kg 33%
Рибонуклеазен димер 10 mg/kg 63%
Декстран сулфат 10 mg/kg в липозоми 14%
Рибонуклеазен димер в липозоми 25%
Резултатите от изследването показват предпазване на по-голямата част от третираните мишки hu-PBL-SCID от Η IV инфекция след 12 h от инжектирането от 0,1 mg/kg рибонуклеазен димер, 10 mg/kg декстран сулфат, липозоми, съдържащи рибонуклеазен димер, и липозоми, съдържащи декстран сулфат. Защитата с рибонуклеазен димер при 10 mg/kg е странична, което може би се дължи на факта, че при високите степени на дозиране, рибонуклеазният димер подтиска имунитета. Не се наблюдава защитен ефект на рибонуклеазния димер при 0,001 mg/kg. Все пак с рибонуклеазния димер, включен в липозоми съгласно изобретението, успешната норма се подобрява от 63% на 25% за сметка на високите дози. Очакват се по-нататъшни подобрения чрез оптималната степен на дозиране в липозомите.
До същия извод се достига, когато мишки със слабо функциониращо PBL присаждане накрая на експеримента се изключват от анализа, въпреки че става ясно от анализа на нивата но човешки имуноглобулин ир-глобин PCR анализа, че третиране с липозоми с рибонуклеазен димер, както и с липозоми с декстрансулфат, интерферира с преживяемостта на човешките клетки. Изключването на hu-PBLSCID мишките от основата на човешката функция налага някои разлики между директното антивирусно въздействие и имуномодулаторната активност.
Пример 10. При теста за фузия, описан от Luscher and Gluck /1990/ /Antiviral Research 14,39-50/, везикули, приготвени съгласно пример 1, се сравняват с реконституирани грипни везикули, приготвени съгласно метода на Kawasaki et al във фузионна активност с моделните мембрани.
Фиг.З показва кинетиката на гаснене на флуоресценцията на RlS-белязан грипен вирус А с DOPC-холестерол липозоми. Повишаването на флуоресценцията се изразява в % FDQ /гаснене на флуоресценцията/, изчислена според Luscher & Gluck /виж по-горе/.
Началната степен на фузия се получава от тангентата към кривата на фузия при време 0, когато фузията се инициира/прекъсната линия на фиг.З/. Крива 2 отговаря на активността на сливане на везикули, приготвени съгласно метода на Kawasaki et al.

Claims (15)

  1. Патентни претенции
    1. Фосфолипидна двуслойна везикула, включваща клетъчно специфични маркери върху мембраната и съдържаща поне едно фармацевтично активно вещество, характеризираща се с това, че клетъчно специфичните маркери имат най-малко 90% биологична активност при измерване съгласно Luescher & Glueck, Antiviral Research 14,39-50, 1990.
  2. 2. Везикула съгласно претенция 1, характеризираща се с това, че съдържанието на холестерол е под 10%, за предпочитане под 2% тегл. и/или съдържанието на детергент в мембраната е по-малко от 10, за предпочитане по-малко от 1 ppb.
    Л.»ЛМ·’ · .^*Г>/хЙС4Й<-Л< ·--?·’ · * χ·’--.’ ?·?”.· -Г1
    II I
    -- - · - - ' '’-•.^•’Г.^Ч*-·'-··.-· -’· 7-Λ·-.·.·: >·♦- +
  3. 3. Везикула съгласно претенция 1 или 2, характеризираща се с това, че е с диаметър помалък от 100 nm, за предпочитане около 80 nm.
  4. 4. Везикула съгласно коя да е от горните претенции, характеризираща се с това, че клетъчно специфичните маркери включват поне едно - за предпочитане моноклонално антитяло.
  5. 5. Везикула съгласно коя да е от горните претенции, характеризираща се с това, че клетъчно специфичните маркери се подбират от групата, състояща се от тримерен или мономерен хемаглутинин, една или две разцепени субединици вместо гликопептиди НА1 и НА2, слят пептид, изолиран от естествени източници, синтетичен “слят пептид”.
  6. 6. Везикула съгласно претенция 5, характеризираща се с това, че хемаглутининът произлиза поне от един член от групата, състояща се от грипния вирус, за предпочитане от подтип А-Н^ррабдовирус, парагрипния вирус и тогавирус.
  7. 7. Везикула съгласно коя да е претенция от 1 до 3, характеризираща се с това, че клетъчно специфичните маркери включват наймалко един слят пептид под формата на аминокиселинна секвенция, като най-малко един край на секвенцията е образуван от поне една цистеинова група, за предпочитане от три цистеинови групи.
  8. 8. Везикула съгласно коя да е от горните претенции, при която фосфолипидът произлиза от най-малко един член на групата, състояща се от грипния вирус, за предпочитане от подтип А-Н^ррабдовирус, парагрипния вирус и тогавирус, в комбинация с 2 до 100, за предпочитане 5 до 15 пъти количество фосфатидилхолин.
  9. 9. Везикула съгласно коя да е от горните претенции, характеризираща се с това, че:
    - фосфолипидът от мембраната съдържа 70 до 95% тегл. фосфатидилхолин и 5 до 30% тегл. за предпочитане 10 до 20% тегл. фосфатидилетаноламин; 5 до 10% тегл. за предпочитане 6 до 8 % тегл. крослинкер, за предпочитане производен на сулфосукцинимидил и поне един клетъчно специфичен слят пептид, свързани към мембраната.
  10. 10. Метод за приготвяне на фосфолипидна двуслойна везикула, включваща хемаглутинин като клетъчно специфичен маркер
    5 върху мембраната и съдържаща най-малко едно фармацевтично активно вещество, като хемаглутининът съдържа най-малко един слят белтък, при което хемаглутининът е отделен от вирусен щам с помощта на нейонен детергент и ултра центрофугиране, характеризиращ се с това, че се използва нейонен детергент, за предпочитане октаетилен гликол монододецил етер, който не реагира с хемаглутинина, при което след ултрацентрофугиране към супернатантата се прибавя желаното активно лекарство, а детергентът се отделя чрез многократно третиране на разтвора с микроносители от полистиролови перли, за предпочитане с омрежен строеж - влажни - от 20 до 50, след което се оформят везикули с желания размер чрез обработка на разтвора с ултразвук.
  11. 11. Метод съгласно претенция 10, характеризиращ се с това, че детергентният разтвор е с концентрация между 10 и 250, за предпочитане между 80 и 120 gmol и/или детергентът се отделя от разтвора чрез прилагането на 1 до 2 g, за предпочитане около 1,5 g микроносители от полистиролови перли на 100 mg детергент.
  12. 12. Използване на везикулите съгласно коя да е претенция от 1 до 9 или изготвени съгласно претенции 10 или 11 за фармацевтични препарати срещу СПИН.
  13. 13. Използване съгласно претенция 12, при което везикулите съдържат поне едно от следващите вещества: декстрансулфат, димер на рибонуклеаза, димер на лизозим.
  14. 14. Използване на везикулите съгласно коя да е претенция от 1 до 9 или изготвени съгласно претенции 10 или 11 за фармацевтични препарати срещу карциноми.
  15. 15. Използване съгласно претенция 14, при което везикулите съдържат най-малко едно от следващите вещества: имидазол-карбоксамид, хидрокси-уреа, адрипластин, ендоксан, флуорурацил, колхицин.
BG96928A 1991-02-02 1992-09-29 Synthetic membrane vesicles containing functionally active fusion peptides as drug delivery systems BG61215B1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP91101414A EP0497997B1 (en) 1991-02-02 1991-02-02 Synthetic membrane vesicles containing functionally active fusion peptides as drug delivery systems
PCT/EP1992/000089 WO1992013525A1 (en) 1991-02-02 1992-01-17 Synthetic membrane vesicles containing functionally active fusion peptides as drug delivery systems

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BG96928A BG96928A (bg) 1994-03-24
BG61215B1 true BG61215B1 (en) 1997-03-31

Family

ID=8206362

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG96928A BG61215B1 (en) 1991-02-02 1992-09-29 Synthetic membrane vesicles containing functionally active fusion peptides as drug delivery systems

Country Status (22)

Country Link
US (1) US6040167A (bg)
EP (1) EP0497997B1 (bg)
JP (1) JP3404037B2 (bg)
KR (1) KR100205693B1 (bg)
AT (1) ATE125154T1 (bg)
AU (1) AU657730B2 (bg)
BG (1) BG61215B1 (bg)
BR (1) BR9204116A (bg)
CA (1) CA2079685C (bg)
DE (1) DE69111414T2 (bg)
DK (1) DK0497997T3 (bg)
ES (1) ES2077086T3 (bg)
FI (1) FI109969B (bg)
GE (1) GEP20002229B (bg)
GR (1) GR3017490T3 (bg)
HK (1) HK56696A (bg)
HU (1) HU215533B (bg)
NO (1) NO306194B1 (bg)
PL (2) PL296382A1 (bg)
RO (1) RO114736B1 (bg)
RU (1) RU2125868C1 (bg)
WO (1) WO1992013525A1 (bg)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2079444C (en) * 1991-02-14 2004-02-03 Rimona Margalit Binding of recognizing substances to liposomes
US5603872A (en) * 1991-02-14 1997-02-18 Baxter International Inc. Method of binding recognizing substances to liposomes
US5879656A (en) * 1993-10-26 1999-03-09 Thomas Jefferson University Methods of treating metastatic colorectal cancer with ST receptor binding compounds
US7097839B1 (en) * 1993-10-26 2006-08-29 Thomas Jefferson University ST receptor binding compounds and methods of using the same
WO1995032706A1 (en) * 1994-05-31 1995-12-07 Inex Pharmaceuticals Corp. Virosome-mediated intracellular delivery of therapeutic agents
US6861053B1 (en) * 1999-08-11 2005-03-01 Cedars-Sinai Medical Center Methods of diagnosing or treating irritable bowel syndrome and other disorders caused by small intestinal bacterial overgrowth
US5908777A (en) * 1995-06-23 1999-06-01 University Of Pittsburgh Lipidic vector for nucleic acid delivery
WO1997004748A2 (en) * 1995-08-01 1997-02-13 Advanced Therapies, Inc. Enhanced artificial viral envelopes for cellular delivery of therapeutic substances
NZ332666A (en) * 1996-05-08 2000-05-26 Nika Health Products Ltd Cationic virosomes having a positively charged lipid bilayer membrane with an integrated viral fusogenic peptide as genetic transfer systems for use in gene therapy
JP2002532514A (ja) * 1998-12-14 2002-10-02 デンドレオン コーポレイション 主要組織適合性複合体クラスｉ拘束抗原提示の増強のための、組成物および方法
US7148324B1 (en) 1998-12-14 2006-12-12 Dendreon Corporation Compositions and methods for enhancement of major histocompatibility complex class I restricted antigen presentation
EP1140202A1 (en) 1998-12-24 2001-10-10 Ucb S.A. Peptidic product, process and composition
CZ20021216A3 (cs) * 1999-10-08 2002-10-16 Nika Health Products Limited Lipidové váčky obsahující DOSPER
ES2202218T3 (es) * 1999-12-17 2004-04-01 Schott Glas Capsula fulminante activable inductivamente para sistemas de retencion de pasajeros y circuito de prueba para esta capsula fulminante.
US20040028687A1 (en) * 2002-01-15 2004-02-12 Waelti Ernst Rudolf Methods and compositions for the targeted delivery of therapeutic substances to specific cells and tissues
US20040176283A1 (en) * 2002-04-01 2004-09-09 Robinson John A. Methods and compositions for the design of synthetic vaccines
DE50312971D1 (de) * 2002-04-29 2010-09-23 Biotesys Gmbh Polymerisierte peptid-modifizierte lipide als biologische transportsysteme für mikronutrients
EP1447080A1 (en) 2003-02-13 2004-08-18 Bestewil Holding B.V. Method for producing virosome-like particles
CN103948545B (zh) 2004-05-03 2017-10-03 益普生生物制药公司 用于药物输送的脂质体
US8658203B2 (en) 2004-05-03 2014-02-25 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Liposomes useful for drug delivery to the brain
WO2007048019A2 (en) * 2005-10-20 2007-04-26 The Penn State Research Foundation Delivery system for diagnostic and therapeutic agents
CN105769931B (zh) * 2006-09-15 2021-04-27 渥太华医院研究机构 溶瘤弹状病毒
EP3362049A1 (en) 2015-10-16 2018-08-22 Ipsen Biopharm Ltd. Stabilizing camptothecin pharmaceutical compositions

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0047480B1 (en) * 1980-09-05 1986-02-05 Institut Armand Frappier Formation of an immunosome exclusively made of viral antigens reconstituted on an artificial membrane
US4871488A (en) * 1985-04-22 1989-10-03 Albany Medical College Of Union University Reconstituting viral glycoproteins into large phospholipid vesicles
US4663161A (en) * 1985-04-22 1987-05-05 Mannino Raphael J Liposome methods and compositions
US4790987A (en) * 1985-11-15 1988-12-13 Research Corporation Viral glycoprotein subunit vaccine
US5000960A (en) * 1987-03-13 1991-03-19 Micro-Pak, Inc. Protein coupling to lipid vesicles
IL86650A0 (en) * 1987-06-30 1988-11-30 Biophor Corp Animal derived cells and liposomes,having an antigenic protein incorporated into their membrane
WO1991003258A1 (en) * 1989-09-01 1991-03-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoliposomes for transmittal of activating signals to cells
AU652778B2 (en) * 1990-10-15 1994-09-08 Quest International B.V. Treatment composition

Also Published As

Publication number Publication date
PL170169B1 (en) 1996-10-31
JP3404037B2 (ja) 2003-05-06
CA2079685C (en) 2001-11-27
KR100205693B1 (en) 1999-07-01
BG96928A (bg) 1994-03-24
ATE125154T1 (de) 1995-08-15
FI109969B (fi) 2002-11-15
RU2125868C1 (ru) 1999-02-10
EP0497997A1 (en) 1992-08-12
NO306194B1 (no) 1999-10-04
AU1169392A (en) 1992-09-07
BR9204116A (pt) 1993-06-08
HU9203141D0 (en) 1992-12-28
GEP20002229B (en) 2000-09-25
NO923703L (no) 1992-11-26
RO114736B1 (ro) 1999-07-30
DE69111414T2 (de) 1996-02-01
US6040167A (en) 2000-03-21
JPH05505406A (ja) 1993-08-12
NO923703D0 (no) 1992-09-24
FI924418A (fi) 1993-04-03
DE69111414D1 (de) 1995-08-24
DK0497997T3 (da) 1995-11-27
EP0497997B1 (en) 1995-07-19
ES2077086T3 (es) 1995-11-16
GR3017490T3 (en) 1995-12-31
HK56696A (en) 1996-04-12
HUT66194A (en) 1994-10-28
CA2079685A1 (en) 1992-08-03
FI924418A0 (fi) 1992-10-01
PL296382A1 (en) 1993-11-02
WO1992013525A1 (en) 1992-08-20
AU657730B2 (en) 1995-03-23
HU215533B (hu) 1999-01-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BG61215B1 (en) Synthetic membrane vesicles containing functionally active fusion peptides as drug delivery systems
JP6886406B2 (ja) コバルトポルフィリン・リン脂質コンジュゲート及びポリヒスチジンタグを含むナノ構造体
US20080268028A1 (en) Lyophilization of virosomes
AU4221489A (en) Affinity associated vaccine
US4148876A (en) Biological preparations
KR101290475B1 (ko) 인플루엔자 바이러스 및 비형 간염 바이러스로부터의항원을 포함하는 비로좀 입자
CA1079634A (en) Antigens bound to exterior surface of microvesicles
CA3138856A1 (en) Nanostructures comprising cobalt porphyrin-phospholipid conjugates and polyhistidine-tags
HU219353B (en) Synthetic membrane vesicles as vehicles containing functionally active fusional peptides and pharmaceutical compositions comprising them
US11207421B2 (en) Nanostructures comprising cobalt porphyrin-phospholipid conjugates and polyhistidine-tags
EP4108251A1 (en) Griffithsin for use in a method of preventing or treating infections with respiratory viruses
CA1334165C (en) Affinity associated vaccine
Mufeeda et al. International Journal of Modern Pharmaceutical Research
Rabinsky Effect of Protein Coatings on the Delivery Performance of Liposomes.