PL169440B1 - Mikrobiologiczny sposób koncowego hydroksylowania grup etylowych w 5- lub 6-czlonowycharomatycznych zwiazkach heterocyklicznych PL PL PL - Google Patents

Abstract

1. Mikrobiologiczny sposób koncowego hydroksylowania grup etylowych w 5- lub 6-czlonowych aromatycznych zwiazkach heterocyklicznych, znamienny tym, ze grupy etylowe w aromatycznych zwiazkach heterocyklicznych hydroksyluje sie z udzialem drob- noustrojów, nalezacych do rodzaju Pseudomonas, Acinetobacter, Rhizobium, Agrobacterium lub Escherichia, które a) zawieraja geny alk BA plazmidu OCT Pseudomonas b) nie wytwarzaja czynnej chromosomalnej lub kodowanej przez plazmid de- hydrogenazy alkoholowej, przy czym pochodna hydroksylowa nie jest dalej metabolizowana. PL PL PL

Description

Wynalazek dotyczy nowego mikrobiologicznego sposobu końcowego hydroksylowania grup etylowych w aromatycznych 5- lub 6-członowych związkach heterocyklicznych.

Pochodne 2-hydroksyetylowe są ważnymi związkami pośrednimi przy wytwarzaniu środków farmaceutycznych biologicznie czynnych, jak np. 2-/4-pirydylo/etanolu przy wytwarzaniu pochodnych kwasu penicylinowego.

Jest rzeczą znaną, ze biochemiczne utlenianie alkanów w drobnoustrojach gatunku Pseudomonas oleovorans przebiega w trzech etapach Pod wpływem kompleksu alkan-hydroksyiaza /geny alkBA, określane w dalszej części opisu jako geny alkBFGH powstaje wpierw odpowiedni alkohol, który następnie, w dwóch dalszych etapach katalizowanych przez dehydrogenazę alkoholową /geny alkC/ i dehydrogenazę aldehydową /chromosomalną lub kodowaną przez plazmid/, przekształcany jest w kwas. Szczep ten niesie geny, odpowiedzialne za enzymy uczestniczące w utlenianiu, w plazmidzie OCT [Witholt i in. TIBTEcH, tom 8, str. 6-52/1990/].

Dalej, znany jest z EP-A 277 674 mikrobiologiczny sposób końcowego hydroksylowania apolarnych związków alifatycznych zawierających od 6 do 12 atomów węgla, a mianowicie

169 440 wytwarzanie 1-oktanolu z wykorzystaniem drobnoustrojów gatunku Pseudomonas oleovorans lub Pseudomonas putida, odpornych na fazy apolarne. Jak wynika z przykładu realizacji wynalazku. sDOSób ten zmusza do Drzernowadzenia hvdrodsvlnwania tyrh zwwkńw w niee,· A AA -'«z --t ^Λ konomicznym dkładzie dw’ufDuv*m^ł*·

Również metodami chemicznymi trudno jest uzyskać pochodne 2-hydroksyetylowe 5- lub 6-członowych związków heterocyklicznych.

Zadanie niniejszego wynalazku polega na zapewnieniu prostego mikrobiologicznego sposobu końcowego hydroksylowania grup etylowych w aromatycznych 5- lub 6-członowych związkach heterocyklicznych.

Zadanie to rozwiązano nieoczekiwanie sposobem według wynalazku, który realizuje się z udziałem drobnoustrojów, należących do rodzaju Pseudomonas, Acmetobacter, Rhizobium. Agrobacterium lub Escherichia, które

a) zawierają geny alkBA plazmidu OCT Pseudomonas, tworzące aktywną monooksygenazę alkanową oraz

b) nie wytwarzają czynnej chromosomalnej lub kodowanej przez plazmid dehydrogenazy alkoholowej, a dzięki ternu są zdolne do hydroksylowania grup etylowych w aromatycznych 5lub 6-członowych związkach heterocyklicznych z utworzeniem odpowiedniej pochodnej hydroksylowej, przy czym związek heterocykliczny służy jako substrat dla tego przekształcenia, a pochodna hydroksylowa nie jest dalej metabolizowana.

Drobnoustroje zawierają geny alkBFGH plazmidu OCT Pseudomonas, które kodują kompleks alkan-hydroksylaza. Przy tym, celowe jest usunięcie, lub inaktywacja genów alkC lub innych, kodujących aktywne dehydrogenazy alkoholowe. Źródło genów monooksygenazy alkanowej.

Jako źródło genów monooksydazy alkanowej służy plazmid OCT np. z Pseudomonas oleovorans lub innych drobnoustrojów utylizujących alkany.

Tak samo odpowiednie są skonstruowane plazmidy hybrydowe z genami monooksygenazy alkanowej, które zawarte są w innych drobnoustrojach, jak np. w E. coli lub w Pseudomonas putida. Jako tego rodzaju plazmid hybrydowy może służyć, na przykład, plazmid pGEc41, fig. 1 zdeponowany albo w E. coli DH1 /CBS 102-87/ albo zdeponowany w E. coli DH1 /DSM 6726/. Nowo skonstruowany plazmid hybrydowy pGMK921, fig. 3, zdeponowany albo w Pseudomonas putida PpS81 /dSM 6776/ albo w Pseudomonas putida GPO12 /DSM 6775/ również może służyć jako źródło genów monooksydazy alkanowej.

Informację genetyczną kodującą monooksygenazę alkanową można otrzymać w sposób obejmujący a) izolację albo DNA plazmidu OCT albo DNA plazmidu hybrydowego z drobnoustrojów, następnie b) strawienie tego DNA w celu wyodrębnienia genu monooksygenazy alkanowej, poczym c) wprowadzenie tej swoistej sekwencji genowej do wektora ekspresyjnego, w wyniku czego d) powstaje plazmid hybrydowy.

Następnie ten plazmid hybrydowy można do /nadającego się do omawianego sposobu/' drobnoustroju e) będącego szczepem-gospodarzem wprowadzić na drodze f) transformacji. Ten transformowany szczep-gospodarz e) tworzy następnie szczep produkcyjny g) dla sposobu według wynalazku.

a) Izolacja DNA plazmidu OCT /DNA plazmidu hybrydowego/

Zarówno DNA plazmidu OCT jak i DNA plazmidu hybrydowego otrzymać można metodami typowymi w tej dziedzinie techniki. I tak np., drobnoustrój poddaje się całkowitej lizie i pożądany DNA uzyskać można następnie za pomocą wirowania w gradiencie gęstości. Można tu powołać się,na przykład, na podręcznik: Current Protocols m Molecular Biology, red. Asubel i in., J. Wiley, New York, 1989, rozdział 2.

b) Rozszczepienie DNA plazmidu przy użyciu enzymów restrykcyjnych.

Po wyodrębnieniu DNA plazmidu można go tak przeciąć enzymami restrykcyjnymi, przy wykorzystaniu metod typowych w tej dziedzinie techniki, że DNA nie będzie tworzył kodowanej przez plazmid dehydrogenazy alkoholowej.

Otrzymany odcinek DNA /alkBFGH/, kodujący aktywną monooksygenazę alkanową. można następnie wyizolować za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.

c) Ligowanie odcinka DNA do wektorów ekspresyjnych.

169 440

Otrzymany tak odcinek genowy alkBFGH można ligować, z wykorzystaniem typowych technik mikrobiologicznych, do poprzednio w podobny sposób przeciętego DNA wektora ekspresyjnego, na przykład tak, jak to opisali M.Kok i in. w J. Biol. Chem., 264, 5442 - 5451 /1989/.

Wektory ekspresyjne zawierają zazwyczaj odpowiedni, przeważnie poddający się regulacji, promotor. Za promotorem tym znajduje się, korzystnie w kierunku transkrypcji, jedno, lub więcej niz jedno pojedyncze miejsce cięcia dla enzymów restrykcyjnych. W to miejsce cięcia zostaje wbudowany pożądany odcinek genowy, na którego ekspresji zależy.

Transkrypcję genu alkBFGH zainicjować można zarówno przy użyciu promotora alk, w warunkach regulacji naturalnej /pGEc41/jak i promotora tacl, jak promotor alk w warunkach regulacji naturalnej /pGMK921/.

Zasadniczo nadają się tu te wszystkie wektory ekspresyjne, które wpływają na replikację i ekspresję odcinka genowego alkBFGH w wybranym gospodarzu.

d) Plazmidy hybrydowe

Celowo utworzone tak plazmidy ekspresyjne wykazują szczególnie szerokie spektrum gospodarzy, to tez mogą być wprowadzane do szczepów-gospodarzy o wysokiej tolerancji jeśli chodzi o substraty i substancje wydzielane.

Zwłaszcza stosowany tu będzie plazmid hybrydowy pGEc41, który został zdeponowany w E. coli, tak w dniu 15 stycznia 1987 w Centralbureau voor Schimmelcultures at Baarm w Holandii pod numerem rejestracyjnym CBS 102-87, jak również w dniu 30 września 1991 w Deutsche Sammlung fuer Mikroorganismen undZellkulturen GmbH /DSM/, Mascheroderweg lb, D-3300 Brunszwik, pod numerem rejestracyjnym DSM 6726.

Dalszym szczególnie odpowiednim plazmidem hybrydowym jest plazmid hybrydowy pGMK921, fig. 3, który został zdeponowany nie tylko w Pseudomonas putida PpS81 /DSM 6776/. ale także w Pseudomonas putida GP012 /DSM 6775/ w dniu 6 listopada 1991 w DSM. Ten plazmidhybrydowy według wynalazku stanowi dalsze rozwinięciejuż poznanego plazmidu hybrydowego pGEc285 [J. Biol. Chem., 264, 5442 - 5451 /1989/]. Konstrukcję plazmidu hybrydowego pGMK921 przedstawiono schematycznie na fig. 2.

e) Szczepy-gospodarze

Tak otrzymane plazmidy hybrydowe można wprowadzać do wielkiej ilości szczepów-gospodarzy. '

Celowo wprowadza się je do szczepów-gospodarzy o wysokiej tolerancji względem substratów i substancji wydzielanych, takich jak np. drobnoustroje z rodzaju Pseudomonas, Acineto - bacter, Rhizobium, Agrobacterium lub Eschenchia.

Korzystnie jako szczepy-gospodarze stosuje się E. coli DH1, Pseudomonas putida PpS81 lub Pseudomonas putida GP012

f) Transformacja

Transformacja komórek-gospodarzy z udziałem plazmidów hybrydowych, w wyniku której tworzą się szczepy produkcyjne według wynalazku, także jest znana i dokładnie opisana w powyżej przytoczonym podręczniku.

g) Szczepy produkcyjne

Jako szczepy produkcyjne służyć mogą wszystkie szczepy-gospodarze, które zostały transformowane plazmidami hybrydowymi zawierającymi odcinek genowy alkBFGH.

Naturalna regulacja operonu alk może być zachowana, względnie może być ona rozkojarzona. ^!

Jako szczepy-gospodarze służą w szczególności E. coli DH1, transformowane plazmidem hybrydowym pGEc41 /CBS 102-87 lub DSM 6726/, Pseudomonas putida PpS81 /DSM 6776/ lub Pseudomonas putida GPO12 /DSM 6775/, oba one transformowane plazmidem hybrydowym pGMK921, albo czynne mutanty tych szczepów.

W tych szczepach produkcyjnych zachowana jest naturalna regulacja operonu alk /alkR = alkST/. Selekcja transformowanych drobnoustrojów /szczepów produkcyjnych/.

Izolacja/selekcja/ transformowanych komórek-gospodarzy korzystnie odbywa się z podłoża selekcyjnego, do którego dodany jest biocyd, przeciw któremu oporność nadaje gen markerowy zawarty w plazmidzie hybrydowym. W przypadku gdy, korzystnie, plazmid hybry169 440 dowy pGEc41 zawiera gen oporności na tetracyklinę, do podłoża, stosownie do tego, dodaje się tetracyklinę. W przypadku plazmidu hybrydowego pGMK921 zawierającego gen oporności na streptomycynę, do podłoża, stosownie do tego, dodaje się streptomycynę. Wzrost komórek nie zawierających tego plazmidu hybrydowego zostanie w takim podłożu zahamowany

Proces fermentacyjny

Według wynalazku, jako szczepów produkcyjnych użyć można wszystkich szczepów transformowanych plazmidem hybrydowym, zawierającym odcinek genowy alkBFGH, takich jak transformowanych drobnoustrojów z rodzaju Pseudomonas, Acinetobacter, Rhizobium, Agrobacterium lub Escherichia.

Sposób prowadzenia procesu fermentacyjnego według wynalazku w przypadku użycia szczepu produkcyjnego E. coli DH1 transformowanego plazmidem hybrydowym pGEc41, zostanie objaśniony jak następuje.

Jako substraty mogą służyć w przemianie tej etylowane aromatyczne 5- lub 6-członowe związki heterocykliczne, które zawierająjeden, lub więcej niż jeden heteroatom z grupy złożonej z tlenu, azotu i siarki.

Jako aromatyczne 5-członowe związki heterocykliczne mogą służyć, na przykład, etylowane pochodne tiofenu, furanu, pirolu, tiazolu, pirazolu lub imidazolu.

Odpowiednimi aromatycznymi 6-członowymi związkami heterocyklicznymi są, na przykład, etylowane pochodne pirydyny, pirymidyny, pirazyny lub pirydazyny.

Jako aromatyczne etylowane 6-członowe pochodne heterocykliczne służą zwłaszcza pochodne z klasy związków typu pirazyny lub pirydyny.

W przypadku zawierającej pGEc41 E. coli DH1 jako szczepu produkcyjnego, enzymy odpowiedzialne za hydroksylację operonu alk mogą być indukowane przez związki, które zostały już opisane przez Grunda i in. [J.Bacteriol., 123, 546-556 /1975/]. Należą tu związki, które, na przykład, służą dla Pseudomonas oleovorans jako źródło węgla i energii, takie jak, na przykład, alkany, alkanole lub alkilowane związki cykliczne.

Jako alkanów uzyć można, na przykład, oktanu, dodekanu lub heksanu.

Jako alkanoli użyć można, na przykład, oktanolu, dodekanolu lub heksanolu.

Jako reprezentant alkilowanych związków cyklicznych może znaleźć zastosowanie, na przykład, etylobenzen.

Związkami, które nie służą, na przykład dla Pseudomonas oleovorans jako źródła węgla i energii, ale które mimo to indukują geny operonu alk, są na przykład, keton dicyklopropylowy, dicyklopropylometanol lub dietoksyetan. Korzystnie, indukcji enzymu w przypadku E. coli DH1 zawierającej pGEc41 dokonuje się przy użyciu ketonu dicyklopropylowego.

Przekształcenie substratu nastąpić może tak w obecności jak i nieobecności induktorów enzymu.

Dla uzyskania wzrostu wspomnianego szczepu produkcyjnego można wykorzystać wszystkie typowe w tej dziedzinie techniki źródła węgla i energii, takie jak, na przykład, bursztynian sodowy.

Wskazane jest, aby dla stabilizacji plazmidu pGEc41 przed przekształceniem substratu /w przypadku hodowli komórek/ do podłoża hodowlanego dodać tetracyklinę.

Jako podłoża hodowlane służą tu podłoża typowe w tej dziedzinie techniki, takie jak, na przykład, podłoże złożone /Nutrient Broth No. 2, Oxoid Ltd., Anglia/lub podłoże z solami mineralnymi, jak na przykład podłoże, które opisali Kulla i in. [ Arch. Microbiol., 135, 17/1983/].

Przed dodaniem substratu przeprowadza się typowy sposób hodowlę komórek, a następnie dokonuje się przekształcenia substratu w podłożu hodowlanym, odpowiednio przy gęstości optycznej od 1 do 200 przy 650 nm, korzystnie przy gęstości optycznej od 5 do 100 przy 650 nm. Przekształcenie zachodzić może w warunkach jednorazowego lub ciągłego dodawania substratu tak, żeby stężenie substratu w podłożu hodowlanym nie przekraczało 20% /wag/obj/.

Korzystnie dodawanie substratu odbywa się tak, że jego stężenie w podłożu hodowlanym nie przekracza 5% /wag/obj/, a zwłaszcza 1% /wag/obj /.

169 440

Przekształcenia dokonuje się, odpowiednio, w pH w zakresie od 4 do 11, korzystnie od 6 do 10.

Typowo, przekształcenie odbywa się w temperaturze od 15 do 50°C, korzystnie w temperaturze od 25 do 4Q°C

Celowe jest prowadzenie procesu przekształcenia w czasie od 1 godziny do kilku dni, korzystnie w sposób ciągły przez kilka dni.

Po zajściu przekształcenia, odpowiednie pochodne 2-hydro-ksyetylowane można wyodrębnić w sposób znany, na przykład za pomocą ekstrakcji.

Przykład I. E. coli DH1 /pGEc41/, CBS 1θ2-87, umieszczono w podłożu z solami mineralnymi [ Kulla i in., Arch. Microbiol., 135, 1-7 /1983/] z 0,6% /wag/obj/ bursztynianu sodowego jako jedynego źródła węgla i energii.

Dla stabilizacji plazmidu do podłoża dodano tetracyklinę w ilości 25 mg/litr.

Jako induktor enzymu służył keton dicyklopropylowy w stężeniu wynoszącym 1 mmol/litr.

Do 100 ml zawiesiny komórek o gęstości optycznej 10 przy 650 nm, dodano 1 mmol 5-etylo-2-metylopirydyny, co odpowiada stężeniu 0,12% /wag/obj./ i zawiesinę komórek inkubowano w ciągu dalszych 16 godzin w temperaturze 30°C przy wartości pH 7. W tych warunkach przekształceniu ulegał 1 mmol/121 mg/100 ml/5-etylo-2-metylopirymidyny z utworzeniem 0,8 mmola 5-/2-hydroksyetylo/-2-metylopirydyny, co odpowiada wydajności 80% w przeliczeniu na wprowadzoną 5-etylo-2-metylopirydynę.

W podobny sposób dokonano przekształcenia z udziałem E. coli DH1 /pGEc41/ DSM

6726.

Przykłady II i III zrealizowano zgodnie z przykładem I i wyniki zestawiono w tabeli I.

Tabela I

Przykład	Substrat	Stężenie substratu na 100 ml	Czas reakcji w h	Produkt końcowy	Wydajność w %
II	3-etylopirydyna	1 mmol	16	3-/2-hydroksy- etylo/pirydyna	50
III	2-etylopirazyna	1 mmol	16	2-/2-hydroksy- etylo/pirazyna	80

Przykład IV.

I Konstrukcja plazmidu hybrydowego pGMK921 (fig. 2).

Konstrukcja pGMK921 stanowi regulatywne dalsze rozwinięcie pGEc285 (patrz fig. 2). pGEc285 jest opisany w J. Biol. Chem., 264, 5442 - 5451 (1989) przez Koka i in. Plazmid ten stanowi pochodną wektora multicopy number broad host rangę pMMB24 [ Gen, 26,273 - 282 /1983/] i zawiera fragment DNA.Pstl plazmidu OCT względnie pGEc41 [J. Biol. Chem., 262, 17712 - 17718 /1987/], który koduje cytoplazmatyczne składniki błonowe hydroksylazy alkanowej /AlkB/, dwie rubretoksyny /AlkF, AlkG/ i hydrogenazę aldehydową/AlkH/. Transkrypcję alkBFGH/ = alkBA/ może zainicjować zarówno promotor alk jak i promotor tael. Dla ekspresji genu z udziałem promotora alk przy naturalnej regulacji zligowano do pGEc285 cistrony alkST / = alkR/ plazmidu OCT, względnie pGEc41 przecięto przy użyciu Sali /4 jednostki na 1 |ig DNA plazmidu/ i fragmenty DNA rozdzielono metodą preparatywnej elektroforezy na żelu agarozowym /0,6%/wag/obj./ agarozy w buforze TBE /0,09 ** Tris-boran, 2,5 mM Na₂EDTA, pH 8,3, bromek etidium /100 pg/100 ml/. Fragment Sali o długości 2,5 kz, kodujący alkST, wyizolowano bezpośrednio z żelu agarozowego przy użyciu błony z DEAE-celulozy. Nagromadzony DNA odmyto z błony przy użyciu 0,5 ml buforu do elucji /20 mM Tris-HCl, pH 7,5 ImM Na₂EDTA, 1,5 M NaCl/ w ciągu godziny, w temperaturze 65°C. Bromek etidium z próbki DNA wyekstrahowano przy użyciu n-butanolu nasyconego wodą, a następnie wytrącono DNA

169 440 izopropanolem. Wysuszony osad preparatu tego fragmentu, określanego w dalszym ciągu jako preparat /a/ przeniesiono do 0,01 M buforu Tris-HCl, pH 8,0, 0,001 M Na2EDTA.

pGEc285 przecięto przy użyciu Xhol /4 jednostki na 1 pg DNA plazmidu/ i również wrtrot/rzn λλ/νοi icznnw rnyniłrirt o/ Hnlc7vm oiemi nlri-pclaun\/ iitlrr» z/m-narat /e z^a_

V* j VI · » ł J £>»-«. A »-4.v 11AŁJ1 AAAMM, » » AHA1UŁ. j ίκ. WJ V*. »->»_>> kz 1 1 j J 14JW X Ul I L·/! , £/l niesiono do takiego samego buforu.

Oba preparaty, /a/ i /b/, 0,1 - 4 pg DNA w 20 pl, poddano reakcji Klenowa zgodnie z przepisem [ Maniatis i in., Molecular Cloning, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Rozdział 5.40 - 5.43/]. Bufor Klenowa: 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCb, ImM ditiotreitol, 50 pg/ml albuminy surowicy bydlęcej.

Do mieszaniny reakcyjnej dodano po 1 pl 0,5 mM każdego z dNTP /deoksynuklcotydotrifosforanów/. Po dodaniu 1-5 jednostek polimerazy Klenowa przeprowadzono inkubację w temperaturze 30°C w ciągu 15 minut. Następnie reakcję przerwano za pomocą ogrzewania w temperaturze 75°C w ciągu 10 minut

Do ligowania wytrącono izopropanolem preparaty /a/ i /b/ blunt-ends /gładkie końce DNA, bez wystających domen pojedynczych nici/ i przeniesiono do 100 pl buforu do ligowania /20 mM Tns-HCl, pH 7,2,10 mM DTT, 10 mM Mg CI2, 0,6 mM ATP/. Ligacja następowała po dodaniu ligazy DNA T4 /jednostka/ pg DNA/ przez noc, w temperaturze 15°C.

Transformacja zachodziła w E. coli w warunkach selekcji na podłożu złożonym, z 30 mg streptomycyny na litr agaru odżywczego. /Elektrotransformacja według Maniatisa i in., Molecular Cloning, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Rozdział 1.75/. Plazmid otrzymał nazwę pGMK920 i nie brał udziału w nadaniu szczepowi-gospodarzowi zdolności do hydroksylowania grup alkilowych. Dopiero transformacja w E. coli /mutD, namnażanie /wyłącznie plazmidu pGMK920/ w Mutator-Hintergrund/ z następującym potem koniugacyjnym transferem/ z wykorzystaniem plazmidu wspomagającego pRK2013/ w Pseudomonas putida /Ps. putida/ PpS81, doprowadziły do uzyskania fenotypu Alk+ niosącego plazmid szczepu-biorcy /posiada zdolność hydroksylowania grup alkilowych/.

W celu koniugacyjnego transferu E. coli poddano elektrotransformacji z udziałem plazmidu hybrydowego alk z dodaniem plazmidu wspomagającego pRK2013 /Maniatis i in., tamże/. Selekcja odbywała się na podłożu zlozożym /agar odżywczy/ ze streptomycyną /30 mg/ litr, plazmid hybrydowy/ i kanamycynę 25 mg/litr, plazmid wspomagający/.

Po 1 ml tych hodowli dawcy i biorcy /Ps. putida PpS81 przemyto kilkakrotnie za pomocą Nutrient Broth i przeniesiono do Nutrient Broth użytym w ilości po 50 pl, po czym połączono i inkubowano na suchym agarze odżywczym przez noc w temperaturze 30°C. Komórki zawieszono w 0,9% roztworze NaCl i zawiesinę 10⁹ komórek/ml naniesiono w stosownych rozcieńczeniach /W¹/ na płytki z podłożem selekcyjnym /150 mg streptomycyny na litr/. Ten plazmid brał udział w uzyskaniu fenotypu Alk+ i otrzymał on nazwę pGMK921.

II Biotransformacja

Szczep produkcyjny Ps. putida PpS81 zawierający pGMK921 ze względu na mutację alcA gospodarza jest tu szczególnie odpowiedni, ponieważ aktywność hydroksylazy alkanowej ulega ekspresji z tła całkowicie pozbawionego dehydrogenazy alkoholowej. Ps putida PpS81 z pGMK921 umieszczono w podłożu z solami mineralnymi [Arch. Microbiol., 135, 1-7 /1983/] z 0,2% /wag/obj./ glukozy. W celu stabilizacji plazmidu dodano streptomycynę /150 mg/litr/. Aby zaindukować naturalny promotor ekspresji monooksygenazy alkanowej dodano 1 mM ketonu dicyklopropylowego.

Przy gęstości optycznej ODć50nm = 10 /hodowle o niższej wartości OD zatężano do OD = 10/ do hodowli dodano 0,1% /obj./obj./ 5-etylo-2-metylopirymidyny. W temperaturze 30°C i obojętnym pH /7,0/ substrat ten został w ciągu 6 godzin całkowicie przekształcony w 5-/2-hydroksyetylo/-2-metylopirymidynę.

Figura 1 pGEc41 składa się z wektora pLAFR1 [Gene, 16, 289-296 /1986/] i fragmentu EcoRI długości 30 kz z DNA plazmidu OCT, kodującego część operonu alkBFGHC’ /delecja w genie alkC/, a do tego niosącego locus alkR. Zakreskowany, odtworzony fragment oznacza delecję w dół w operonie alkBFGHC’.

169 440

Ramki podają wielkość i pozycję białek, liczby odnoszą się do masy cząsteczkowej w kilodaltonach. W pGEc41 orientacja sekwencji DNA alkR i orientacja sekwencji alkBFGHC' są identyczne [ J. Biol. Chem., 262, 17712 - 17718 /1987/].

Figura 2

Przedstawia schemat konstrukcyjny wytwarzania pGMK921.

Figura , ,3 pGMK920 wywodzi się z pGEc285 i pGEc41. Kierunek transkrypcji alkBFGH jest przeciwny ruchowi wskazówek zegara, cistrony alkST /alkR/ transkrybowane są w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara.

Mapa restrykcyjna pGMK921, który zawiera mutację Alk+, jest identyczna z mapą pGMK920.

Plazmid koduje:

- składniki błonowe hydroksylazy alkanowej /alkB/,

- rubredoksynę /alkG/,

- rubredoksynę-F /alkF/, _- dehydrogenazę aldehydową /alkH/,

- reduktazę rubredoksynową /alkS/,

- regulator dodatni /alkS/.

pGMK921 można koniugatywnie przenieść przy użyciu plazmidu wspomagającego pRK2013 z E. coli do Pseudomonas.

Selekcja: streptomycyna 35 mg/litr /E. coli/ streptomycyna 150 mg/litr/Pseudomonas putida/.

Claims (9)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Mikrobiologiczny sposób końcowego hydroksylowania grup etylowych w 5- lub 6-członowych aromatycznych związkach heterocyklicznych, znamienny tym, że grupy etylowe w aromatycznych związkach heterocyklicznych hydroksyluje się z udziałem drobnoustrojów, należących do rodzaju Pseudomonas. Acinetobacter, Rhizobium, Agrobacterium lub Escherichia. które

   a) zawierają geny alk BA plazmidu OCT Pseudomonas

   b) nie wytwarzają czynnej chromosomalnej lub kodowanej przez plazmid dehydrogenazy alkoholowej, przy czym pochodna hydroksylowa nie jest dalej metabolizowana.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że hydroksylowanie prowadzi się z udziałem albo E. coli DH1 /CBS 102-87/ lub E. coli DH1 /DSM 6726/, przy czym oba te drobnoustroje są transformowane plazmidem hybrydowym pGEc41, albo czynnego mutanta tych szczepów.
3. 3. Sposób według zastrz 1, znamienny tym, ze hydroksylowanie prowadzi się albo z udziałem Pseudomonas putida PpS81 /DSM 6776/ lub Pseudomonas putida GPO12 /DsM 6775/, przy czym oba te drobnoustroje są transformowane plazmidem hybrydowym pGMK921, albo czynnego mutanta tych szczepów. _
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ze jako substrat stosuje się, etylowany aromatyczny 5- lub 6-członowy związek heterocykliczny, który zawiera jeden, lub więcej niż jeden heteroatom z grupy złożonej z tlenu, azotu i siarki.
5. 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że jako substrat stosuje się etylowaną pirazynę i pirydynę.
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że enzymy drobnoustroju są indukowane.
7. 7. Sposób według zastrz. 1. znamienny tym, że przekształcenie zachodzi przy jednorazowym lub ciągłym dodawaniu substratu przy czym wsad substratu nie przekracza 20% /wag/obj/.
8. 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, ze przekształcenia dokonuje się przy wartości pH od 4 do 11.
9. 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, ze przekształcenia dokonuje się w temperaturze od 15 do 50°C.