RO109866B1 - Procedeu microbiologic, de hidroxilare terminala, de grupe etil la heterocicluri aromatice cu inel de 5 sau 6 atomi si hibridplalsimida pentru acest procedeu - Google Patents

Procedeu microbiologic, de hidroxilare terminala, de grupe etil la heterocicluri aromatice cu inel de 5 sau 6 atomi si hibridplalsimida pentru acest procedeu Download PDF

Info

Publication number
RO109866B1
RO109866B1 RO92-200262A RO92200262A RO109866B1 RO 109866 B1 RO109866 B1 RO 109866B1 RO 92200262 A RO92200262 A RO 92200262A RO 109866 B1 RO109866 B1 RO 109866B1
Authority
RO
Romania
Prior art keywords
reaction
dsm
plasmid
hybridplasmid
alk
Prior art date
Application number
RO92-200262A
Other languages
English (en)
Inventor
Andreas Kiener
Thomas Zimmermann
Original Assignee
Lonza Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lonza Ag filed Critical Lonza Ag
Publication of RO109866B1 publication Critical patent/RO109866B1/ro

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C12N9/0077—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14) with a reduced iron-sulfur protein as one donor (1.14.15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom
    • C12P17/12—Nitrogen as only ring hetero atom containing a six-membered hetero ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/15—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with reduced iron-sulfur protein as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.15)
    • C12Y114/15003—Alkane 1-monooxygenase (1.14.15.3)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Description

Invenția se referă la un procedeu microbiologic de hidroxilare terminală de grupe etil la heterocicluri aromatice cu inel de 5 sau 6 atomi și hibridplasmidă pentru acest procedeu.
Derivații de 2-hidroxietil sunt produse intermediare importante pentru prepararea de substanțe active farmaceutice ca, de pildă, 2-(4piridil)etanol pentru prepararea de derivați de acid penicilic.
Este cunoscut faptul că oxidarea biochimică de alcani cu microorganisme de specia Pseudomonas oleovorans se desfășoară în trei etape.
Prin acțiunea complexului de alcanhidroxilază (alkBA-Gene, care în cele ce urmează sunt denumite alkBFGH-Gene) se formează mai întâi corespunzător care, apoi se trece în acid în alte două etape, catalizat printro alcooldehidrogenază (alkC genă) și o aldehiddehidrogenază (cromosomal sau plasmidcodificat). în această tulpină se găsesc genele care sunt răspunzătoare pentru enzima de oxidare pe plasmida OCT (Witholt et al., TIBTECH, vol.8, 1990, pp. 46-52).
De asemenea, din EP.A 277674 mai este cunoscut un procedeu microbiologic pentru hidroxilarea terminală de compuși alifatici apolari cu 6 la 12 atomi de carbon, cât și prepararea de 1-octanol cu ajutorul unor microorganisme de specia Pseudomonas oleovorans sau Pseudomonas putida, care sunt rezistente față de faze apolare.
După cum reiese din exemplu este obligatoriu ca hidroxilarea acestor compuși să se execute într-un sistem bifazat costisitor.
Cu ajutorul unor procedee chimice, derivați de 2-hidroxietil cu heterocicluri de 5 sau 6 atomi sunt, de asemenea, greu de obținut
Procedeul microbiologic de hidroxilare terminală de grupe etil la heterocicluri aromatice cu inel de 5 sau 6 atomi, conform invenției, constă în aceea că reacția este condusă cu microorganisme care aparțin speciilor Pseudomonas, Acinetobacter, Rhizobium, Agrobacterium sau Escherichia care conțin gena alkBA de la o plasmidă OCT Pseudomonas, care formează o alcan monooxigenază activă, nu formează nici o alcool-dehidrogenază cromozomol sau plasmidcodificată activă și astfel sunt apte să hidroxileze grupe etil de la heterocicluri aromatice inelare cu 5 sau 6 atomi, care conțin unul sau mai mulți heteroatomi din seria oxigen, azot sulf, la hidroxietilderivatul corespunzător, heterociclul servind ca substrat pentru reacție, hidroxietil-derivatul nefiind metabolizat mai departe, iar reacția este condusă la o valoare de pH de 4,0 până la 11,0 și la o temperatură de 15 la 50°C.
Hibridplasmida pGMK 921, conform invenției, este transferată în Pseudomonas putida PpS81-DSM 6776 și Pseudomonas putida GPO-DSM, 6775, prin intermediul unui transfer conjugativ din Escherechia coli (mutanta D) și codifică pentru componenta de membrană a alcanhidroxilazei (alkB), rubredoxina (alkG), rubredoxină F (alkF), aldehidehidrogenaza (alkH), rubredoxinreductaza (alkS), regulator pozitiv (alkS).
Procedeul microbiologic și hibridplasmida, conform invenției, permite hidroxilarea mai simplă a grupelor etil la heterocicluri aromatice cu inel de 5 sau 6 atomi.
Descrierea figurilor:
- fig.l, pGEc41 constă dintr-un vector pLAFRl (genă 16 (1986), pp. 289-296) și dintr-un fragment EcorI gros de 30 kb din OCT-plasmidă-DNA, care codifică pentru o parte din alkBFGHC'-operon (ștergere în alkCgen) și la această poartă alkR-locus. Fragmentul hașurat redat, caracterizează ștergerea descendentă în alkBFGHC'-operon.
Cutiuțele redau mărimea și poziția proteinelor, cifrele se referă la masa moleculară în kilo-Dalton. în pGEc41 orientarea secvenței alkR-DNA și a secvenței alkBFGHC' este identică (J.Biol.Chem.262 (1987), p. 1771217718).
- fig.2, reprezintă schema de construcție pentru prepararea de pGMK921.
- fig.3, pGMK920 provine de la pGEc285 și pGEc41.
Direcția de transcripție de alkBFGH este în contrasensul acelor de ceasornic, alkST (alkR)-cistronii se transcriu în sensul acelor de ceasornic.
Partea de restricție de PGMK921, care conține o alk+ mutație este identică cu pGMK920.
Plasmida codifică pentru :
- componenta de membrană a alcanhidroxilazei (alkB);
- rubredoxin (alkG);
- rubredoxin-F (alkF);
- aldehiddehidrogenază (alkH);
- rubredoxinreductază (alkS);
- regulator pozitiv (alkS).
pGMK921 se poate transfera conjunctiv din E.coli cu ajutorul plasmidei auxiliare (pRK2013) în Pseudomonas.
Selecție: streptomicină 35 mg ml/1 (E.coli)·, streptomicină 150 ml/1 (Pseudomonas putida).
în mod convenabil, microorganismele conțin gena alkBFGH de la o Pseudomonas OCT-plasmidă care codifică pentru complexul de alcanhidroxilază. în acest caz, în mod convenabil, genele alk sau celelalte gene, care codifică pentru alcooldehidrogenazele active sunt îndepărtate sau inactivate.
Sursa pentru genele de alcanmonooxigenază:
Ca sursă pentru genele de alcanmonooxigenaza-genelor, servește OCTplasmida, de pildă, de Pseudomonas oleovorans sau alte microorganisme care pun în valoare alean.
La fel, de potrivite sunt hibridplasmide construite cu gene de alcanmonooxigeneză, care se găsesc în alte microorganisme, ca de pildă, în E.coli sau în Pseudomonas putida. O astfel de hibridplasmidă poate servi, de pildă, plasmida pGEc41 fig.l, dispusă în E.coli DH1 (CBS 102-87) sau dispusă în E.coli DH1 (DSM 6726). Noua hibridplasmidă construită pCMK921, fig.3, dispusă, fie în Pseudomonas putida PpS81 (DMS 6776), sau în Pseudomonas putida GPO12 (DSM 6775) poate, de asemenea, servi ca sursă pentru gena de alcan-monooxigenază.
Informația genetică care codifică pentru alcan-monooxigenază, se poate obține în așa fel ca astfel:
a) se izolează OCT-plasmidă-DNA sau hibrid-plasmida-DNA din microorganisme apoi,
b) aceste DNA se digerează pentru izolarea genei alcan-monooxigenază și această secvență de gene specifică se introduce apoi,
c) într-un vector de expresie, în care caz, prin aceasta se formează o hibridplasmidă;
d) această hibridplasmidă se poate introduce apoi într-un microorganism;
e) potrivit pentru procedeu (tulpina gazdă) cu ajutorul transformării;
f) această tulpină gazdă transformată e) formează apoi tulpina de producție g) pentru procedeul, conform cu invenția de față.
a) Izolarea OCT-plasmidei DNA (hibridplasmida-DNA)
Atât OCT-plasmida DNA, cât și hibridplasmidă DNA se pot obține după metode obișnuite pentru specialiști. în acest caz, de pildă, microorganismul este complet desfăcut, în care caz plasmida DNA dorită se poate apoi obține cu ajutorul centrifugării gradientelor de densitate. Pentru aceasta se poate recomanda Manualul Current Protocols in Molecular Biology. Asubel și al., Eds.; J.Wiley, New York, 1989, alineatul 2.
b) Scindarea plasmidei DNA cu enzima de restricție
După izolarea plasmidei DNA, aceasta se poate apoi scinda după metode obișnuite specialistului, cu enzime de restricție în așa fel, încât DNA să nu formeze alcool dehidrogenaze plasmicodificate. Porțiunea DNA obținută (alkBEGH) care codifică pentru monooxigenaza activă se poate folosi apoi, de pildă, prin electroforeză în gel de agaroză.
c) Legarea porțiunii DNA în vectori de expresie
Porțiunea de genă alk-BFGH astfel obținută se poate lega cu ajutoirul unor metode molecularbiologice obișnuite cu un vector de expresie DNA tăiat mai întâi în aceiași măsură, cum este descris, de pildă, în
J.Biol.Chem., 1989, 264, pp. 5442-5451 (M.Kok et al.
Vectorii de expresie conțin, în mod obișnuit, un promotor potrivit, de cele mai multe ori reglabil. După acest promotor, se găsesc în mod favorabil, în direcția de transcripție unul sau mai multe locuri de tăiere singulare pentru enzime de restricție.
în aceste locuri de tăiere se inserează apoi, în mod obișnuit, porțiunea de genă dorită, pentru a cărei expresie există interes.
Transcripția genei alkBFGH se poate iniția, atât prin alk-promotorul cu reglare naturală (pGEK 41), cât și prin promotorul tac I, de asemenea, prin alk-promotorul cu reglare naturală (pGMK921).
în principiu, se potrivesc toți vectorii de expresie care pot să replice și să exprime porțiunea de genă alk BFGH în gazda aleasă.
d) Hibridplasmida
Hibridplasmidele formate astfel, în mod convenabil prezintă îndeosebi un spectru larg de gazdă și se pot folosi, în consecință în tulpini gazdă cu toleranță mare de substrat și de aduct.
Se folosește, mai ales, hibridplasmida pGEO41 care a fost depusă în E.coli DH1, atât la 15 ianuarie 1987 la Centralbureau voor Schimmelcultures at Baarm în Țările de Jos cu nr. CBS 102-87, cât și la 30 septembrie 1991 la Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Maschercoderweg lb, D-33OO Braunschweig, cu numărul DSM 6726.
O altă hibridplasmidă potrivită, preferată, este hibridplasmida pGMK921, fig.3, care a fost depusă, atât în Pseudomonas putida PpS81 (DSM 6776), cât și în Pseudomonas putida GPO12 (DSM 6775) la 6 noiembrie 1991 la DSM. Această hibridplasmidă, conform cu invenția de față, reprezintă o dezvoltare în continuare a hibridplasmidei pGEc285 deja cunoscută (J.Biol.Chem., 1989, 264, pp. 54425441). Consrucția de hibridplasmidă pGMK921 este reprezentată schematic în fig.2.
e) Tulpina gazdă
Hibridplasmidele astfel obținute se pot folosi într-un multiplu de tulpini gazdă.
în mod convenabil se folosesc tulpini gazdă cu mare toleranță de substrat și de educt, ca de pildă, microorganisme din specia Pseudomonas, Acinetobacter, Rhizobium, Agrobacterium sau Escherichia. De preferință, se folosesc ca tulpini gazdă E.coli DH1, Pseudomonas putida PpS81 sau Pseudomonas putida GPO12.
f) Transformare
Transformarea celulelor gazdă cu hibridplasmidele, din care rezultă tulpinile de producție, conform cu invenția de față, este, de asemenea, cunoscută în sine și este descrisă în manualul menționat mai sus.
g) Tulpini de producție
Ca tulpini de producție pot servi la toate tulpinile gazdă care sunt transformate împreună cu hibridplasmidele care conțin porțiunea de genă alkBFGH.
Reglarea naturală a alk-operonului se poate menține sau decupla.
îndeosebi, ca tulpini de producție servesc E.coli DH1, transformate cu hibridplasmida pGEO41 (CBS 102-87 sau DSM 6726), Pseudomonas putida pPS81 (DSM 6776) sau Pseudomonas putida GO 012 (DSM 6775), ambele transformate cu hibridplasmida pGMK 921, sau mutanți eficace de la aceste tulpini.
In aceste tulpini de producție este menținută reglarea naturală a alk-operonului (alkR = alkST).
Selecția microorganismelor transformate (tulpini de producție)
Izolarea, (selecția) celulelor gazdă transformate se face în chip avantajos dintr-un mediu nutritiv selectiv, căruia i se adaugă biocidul; împotriva acestuia se folosesc marcarea genetică ce conferă rezistența conținută în hibridplasmidă. Dacă, se preferă, hibridplasmida pGEc41 conține gena rezistenței la tetraciclină, în conformitate cu aceasta, se adaugă mediului nutritiv tetraciclină. în cazul hibridplasmidei pGMK 921, care conține gena rezistenței de streptomicină, în conformitate cu aceasta, mediului nutritiv i se adaugă streptomicină.
Celulele care nu conțin această hibridplasmidă sunt împiedicate la creșterea într-un astfel de mediu.
Procedeu de fermentare
Conform invenției de față, ca tulpini de producție se pot folosi toate tulpinile care sunt transformate cu o hibridplasmidă ce conține porțiunea de genă alkBFGH ca, de pildă, microorganisme transformate din specia Pseudomonas, Acinetobacter, Rhizobium, Agrobacterium sau Escherichia.
Procedeul de fermentare, conform invenției de față, este lămurit mai jos cu tulpina de producție E. coli DH1, transformată cu hibridplasmidă pGEO41.
Ca substraturi pentru reacție pot servi heterocicluri aromatice cu 5 sau 6 atomi, etilate care conțin unul sau mai mulți heteroatomi din seria oxigen, azot, sulf.
Ca heterocicluri aromatice cu 5 atomi pot servi , de pildă, derivați etilați de tiofen, furan, pirol, tiazol, pirazol sau imidazol.
Heterocicluri aromatice cu 6 atomi, potrivite sunt, de pildă, derivați etilați de piridină, pirimidină, pirazină sau piridazină.
îndeosebi, ca heterocicluri aromatice cu 6 atomi etilate servesc derivați din clasa de compuși pirazine sau piridine.
La E.coli DH1 conținând pGEO41 ca tulpină de producție se pot induce enzimele răspunzătoare de hidroxilare cu compuși ale alk-operonului care sunt descrise în (Grund et al., J.Bacteriol. 123, pp. 546-556, 1975). Este vorba despre compuși care, de pildă, pentru Pseudomonas oleovorans servesc ca sursă de carbon și de energie, ca, de pildă, alcanoli sau compuși ciclici alchilați.
Ca alcani se pot folosi, de pildă, octan, dodecan sau hexan.
Ca alcanoli se pot folosi, de pildă, octanol, dodecanol sau hexanol.
Ca reprezentanți ai compușilor ciclici alchilați se pot folosi , de pildă, etilbenzen.
Compușii, care, de pildă, pentru Pseudomonas oleovorans nu servesc ca sursă de carbon și de energie, care însă, cu toate acestea induc genele alk-operonului sunt, de pildă, diclopropilcetonă, diciclopropilmetanol sau dietoxietan. De preferință, inducerea enzimatică se execută laE.coli DH1 conținând pGEc41 cu diciclopropilcetonă.
Transformarea substratului se poate face, atât în prezența enziminductorului, cât și în absența enziminductorului.
Pentru creșterea tulpinii de producție menționată se pot folosi toate sursele de carbon și de energie obișnuită specialisților, ca de pildă, succinat de sodiu.
în mod convenabil, pentru stabilizarea plasmidei pGEO41 înainte de transformarea substratului (în vederea creșterii celulelor), la mediul de cultivare se adaugă tetraciclină.
Ca mediu de cultivare servesc mediile obișnuite în specialitate, ca de pildă, un mediu complex (Nutrient Broth no.2, Oxoid Ltd., Anglia) sau un mediu de sare minerală cum este, de pildă, descris în Kulla et al., Arch. Microbiol. 135, 1983, pp.1-7.
înainte de adăugare la substrat,celulele se cultivă în mod obișnuit și apoi reacția substratului se execută în mod convenabil la o densitate optică de 1 la 200 la 650 nm în mediul de cultură, de preferință, la o densitate optică de 5 la 100 la 650 nm. Reacția poate avea loc, fie cu adaos la substrat o singură dată sau continuu, astfel, încât concentrația de substrat în mediul de cultură să nu depășească 20% (greut/vol). De preferință, adaosul la substrat se face în așa fel, încât concentrația de substrat în mediul de cultură să nu depășească 5% (greut/vol), îndeosebi 1% (greut/vol).
Reacția se execută în mod convenabil într-un interval de pH de 4 la 11, de preferință, de 6 la 10.
Reacția se execută de obicei la o temperatură de 15 la 50°C , de preferință, la o temperatură de 25 la 40 °C.
în mod convenabil, reacția se execută pe un interval de timp de o oră până la mai multe zile, de preferință, în mod continuu timp de mai multe zile. După reacție, derivații corespunzători de 2-hidroxietil se pot izola în modul cunoscut, ca de pildă prin extracție.
Exemplul 1. E.coli DH1 (pGEc41)
CBS 102-87 s-a dezvoltat într-un mediu de sare minerală (Kulla et al., Arch. Microbiol.
135,1983, pp.1-7) cu 0,6% (greu/vol) succinat de sodiu ca singura sursă de carbon și de energie. Pentru stabilizarea plasmidei s-au adăugat 25 mg/1 tetraciclină la mediu. Ca enziminductor servește diciclopropilcetonă într-o concentrație de 1 mmol/1.
La suspensia de celule (100 ml) cu o densitate optică de 10 la 650 nm se adaugă un mmol 5-etil-2-metilpiridină, ceea ce corespunde unei concentrații de 0,12% (greu/vol) și suspensia de celule se incubează timp de alte 16 h, la o temperatură de 30°C, și la o valoare de pH de 7. în aceste condiții 1 mmol (121 mg/100 ml 5-etil-2-metilpiridină se transformă în 0,8 mmol 5-(2-hidroxietiI)-2-metilpiridină corespunzând unui randament de 80%, raportat la 5-etiI-2-metil-piridină folosită.
In mod corespunzător s-a executat și reacția cu E.coli DH1 (pGEc41 DSM 6726).
Exemplele 2 și 3, se execută ca în exemplul 1 și sunt trecute în tabel.
Exemplul 4. I Construcția hibridplasmidei pGMK921 (fig.2)
Construcția lui pGMK921 reprezintă o dezvoltare în continuare regulativă de pGEc285 (vezi fig.2). pGEc285 este descris în J.Biol.Chem. 264 (1989). pp. 5442-5451 (M.Kok et al.). Această plasmidă este un derivat al multicopy number broad host range” Vectors pMMB24 (Gene 26 (1983), pp.273282) și conține un fragmnent de PstI DNA de la OCT-Plasmidă, respectiv de la pGEc41 (J.Biol.Chem.262 (1987), pp. 17712-17718), care pentru componenta de membrană citoplasmatică a alcanhidroxilazei (A1KB) codifică două rubretoxine (AlkF, AlkG) și o aldehidehidrogenază (AlkH). Transcripția de alkBFGH (=a!kBA) se poate iniția, atât prin alk-promotorul, cât și prin takl-promotorul. Pentru expresie de genă peste alk-promotorul cu reglare naturală în pGEc285 se leagă înăuntru alkST-cistronii (=alkR) de la OCTplasmidă, respectiv de pGEc41.
pGEc41 a fost tăiat cu Săli (4 unități pe pg - plasmida DNA) și fragmentele DNA au fost separate prin electroforeză pe cel de agaroză (0,6% greut/vol) agaroză în tampon
TBE (0,09 M trisborat, 2,5 mMNa2EDTA, pH=8,3, bromură de etidium (100pg/100 ml)). Fragmentul Săli în mărime de 2,5 kb, care codifică pentru alkST s-a izolat direct din gel de agaroză, peste membrană de DEAE-celuloză DNA apărut a fost spălat de pe membrană cu ajutorul de 0,5 ml tampon de eluare (20 mM trw-HCl, -pH=7,5; 1 mM Na2 EDTA, 1,5 M NaCl, în timp de o oră la 65°C. Bromură de etidium se extrage cu n-butanol saturat cu apă din proba de DNA și DNA se precipită apoi cu izopropanol. Precipitatul uscat al acestui preparat de fragment, în cele ce urmează denumit preparat (a), a fost preluat în 0,01 M tampon de trâ-HCl, pH=8,0; 0,001 M Nas EDTA.
pGEc285 a fost tăiat cu Xhol (4 unități pe pg plasmidă DNA) și, de asemenea, precipitat. Preparatul uscat de plasmidă, în cele ce urmează denumit preparat (b) a fost preluat în același tampon. Ambele preparatre (a) și (b), 0,1 - 4 pg DNA în 20 pl, au fost supuse unei reacții Klenow după prescripția (Maniatis et al., Molecular Cloning 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, paragraful 5. 40 - 5.43). Tampon Klenow: 50 mM frâ-HCI, pH=7,5; 10 mM MgCl2, 1 MM ditiotreitol, 50 pg/ml albumină serică de vită. La amestecul de reacție se adaugă 1 pl 0,5 mM din fiecare dNTP (dezoxinucleo- tidtrifosfat). După adăugarea de 1 - 5 unități Klenow polimerază, se incubează la 30°C, timp de 15 min, după care reacția se întrerupe prin încălzire la 75 °C, timp de 10 min.
Pentru legare, preparatele blunt-ends (a) și (b) capetele netede DNA, fără porțiuni suplimentare) au fost precipitate cu izopropanol și preluate în 100 pl tampon de legare (20 mM ir/s-HCl, pH=7,2; 10 nM DTT, 10 mM MgCl2, 0,6 mM ATP). Legarea se face după adăugare de T4-DNA-ligază (1 unitate / pg DNA) peste noapte, la 15°C.
E.coli s-a transformat cu selecție pe mediu de complex cu 30 mg streptomicină pe litru agar nutritiv (electrotransformare după Miniatis et al., Molecular Cloning 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, alianeatul 1.75). Plasmida capătă denumirea pGMK920 și nu conferă tulpinei gazdă capacitate pentru hidroxilarea de grupe alchil. Abia transformarea îh E.coli (mutD, propagare (expunere de pGMK920) în Mutator-fund ) și apoi transfer conjugactiv (cu plasmidă auxiliară pRK 2013) în Pseudomonas putida, (Ps.putidă) 5 PpS81 duce la un alk+fenotip al tulpinei purtătoare de recipiente (prezintă capacitatea de anhidroxila grupe alchil).
Pentru transferul conjugativ E.coli cu alk-hibridplasmidă se electrotransformă în plus 10 cu plasmidă auxiliară pRK2013 (Maniatis et al., ibid.). Selecția are loc pe mediu complex (agar nutritiv) cu streptomicină 30 mg/1 (hibridplasmidă) și kanamicină 25 mg/1 (plasmidă auxiliară). Câte 1 ml din această 15 cultură de donor și din cultură de recipiente (Ps.putidă PpS81) au fost spălate de mai multe ori cu soluție nutritivă, preluate în câte 50 μΐ soluție nutritivă, reunite și incubate pe agar nutritiv uscat, peste noapte , la 30°C. Celulele 20 s-au suspendat în 0,9% soluție de clorură de sodiu și diluări potrivite (101) din IO9 celule/ml suspensie s-au placat pe mediu selectiv (150 mg streptomicină pe litru).
Plasmida care acum determină alk+ fenotip capătă denumirea pGMK921.
II. Biotranșformare
Tulpina de producție Ps.putida PpS81 conținând pGMK921 se potrivește în mod deosebit din cauza alcA mutației gazdei, deoarece activitatea de alcanhidroxiiază este exprimată înaintea unui fund complet liber de alcool de hidrogenază. Ps.putida PpS81 cu pGMK921 se atrage pe mediu de sare minerală. (Arh.Microbiol.135 (1983), pp.1-7) cu o,2% (greut/vol) glucoză. Pentru stabilizare de plasmidă se adaugă streptomicină (150 mg/1). Pentru inducerea promotorului natural în vederea expresiei de alcan-monoxigenază s-a adăugat 1 mM diciclopropilcetonă.
La o densitate optică de OD650nM = 10 (culturi cu OD mai redus s-au concentrat la OD =10) din cultură au fost adăugate 0,1% (vol/vol) 5-etil-2-metilpirimidină la o temperatură de 30°C și un pB. neutru (7,0) acest substrat a fost transformat după 6 h complet în 5-(2-hidroxietil)-2-metilpirimidină.
Exemplu Substrat Concentrație de substrat pe 100 ml Timpul de reacție în ore Produsul final Conversie în %
2 3-Etil-pridin 1 mmol 16 3-(2-hidroxietil) piridin 50
3 2-Etil-pirazin 1 mmol 16 2-(2-hidroxietil) pirazin 80
Revendicări

Claims (7)

1. Procedeu microbiologic de 45 hidroxilare terminală de grupe etil la heterocicluri aromatice cu inel de 5 sau 6 atomi, caracterizat prin aceea că, reacția este condusă cu microorganisme care aparțin speciilor Pseudomonas, Acinetobacter, Rhizo- 50 bium, Agrobacterium sau Escherichia, care conțin gena alkBa de la o plasmidă OCT Pseudomonas, care formează o alcanmonooxigenază activă, nu formează nici o alcooldehidrogenază cromozonal sau plasmid- 55 codificată activă și astfel sunt apte să hidrolizeze grupe etil de la heterocicluri aromatice inelare cu 5 sau 6 atomi , care conțin unul sau mai mulți heteroatomi din seria oxigen, azot, sulf, la hidroxietilderivatul corespunzător, heterociclul servind ca substrat pentru reacție hidroxietilderivatul nefrind metabolizat mai departe, iar reacția este condusă Ia o valoare de pH de 4,0 până la 11,0 și la o temperatură de 15 la 40°C.
2. Procedeu, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, reacția este condusă, fie cu E.coli DH1 (CBS 102-87), fie cu E.coli DH1 (DSM 6726), ambele transformate cu hibridplasmida pGEc41, sau cu o mutantă eficace de la aceste tulpini.
3. Procedeu, conform revendicării 1, 5 caracterizat prin aceea că, reacția este condusă, fie cu Pseudomonas putida PpS81 (DSM 6776), fie cu Pseudomonas putida GP012 (DSM 6775), ambele transformate cu hibridplasmida pGMK921, sau cu o mutantă 10 eficace a acestor tulpini.
4. Procedeu, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, drept substrat se folosește o pirazină sau o piridină etilată.
5. Procedeu, conform revendicării 1, 15 caracterizat prin aceea că, enzimele microorganismului sunt induse, cu compuși care servesc sau nu microorganismului ca sursă de carbon și energie.
6. Procedeu, conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că, reacția are loc cu adaos de substrat, o dată, sau în mod continuu, astfel, încât adaosul de substrat să nu depășească 20% (greutate/volum).
7. Hibridplasmidă pGMK921, caracterizată prin aceea că, este transferată în Pseudomonas putida PpS81 - DSM 6776 și Pseudomonas putida GPO12-DSM 6775, prin intermediul unui transfer conjugativ din Escherichia coli (mut.D) și codifică pentru componenta de membrană a alcanhidroxilazei (alk B), rubredoxina (alg G), rubredoxina F (alk F), aldehidehidrogenaza (alk H), rubredoxin-reductaza (alk S), regulator pozitiv (alk S).
RO92-200262A 1991-03-07 1992-03-05 Procedeu microbiologic, de hidroxilare terminala, de grupe etil la heterocicluri aromatice cu inel de 5 sau 6 atomi si hibridplalsimida pentru acest procedeu RO109866B1 (ro)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CH69691 1991-03-07

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RO109866B1 true RO109866B1 (ro) 1995-06-30

Family

ID=4193039

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RO92-200262A RO109866B1 (ro) 1991-03-07 1992-03-05 Procedeu microbiologic, de hidroxilare terminala, de grupe etil la heterocicluri aromatice cu inel de 5 sau 6 atomi si hibridplalsimida pentru acest procedeu

Country Status (15)

Country Link
US (1) US5306625A (ro)
EP (1) EP0502524B1 (ro)
JP (1) JPH06181789A (ro)
AT (1) ATE138103T1 (ro)
CA (1) CA2062357A1 (ro)
CZ (1) CZ279503B6 (ro)
DE (1) DE59206267D1 (ro)
DK (1) DK0502524T3 (ro)
ES (1) ES2087327T3 (ro)
HU (1) HU212922B (ro)
IE (1) IE75349B1 (ro)
IL (1) IL101154A0 (ro)
MX (1) MX9200963A (ro)
PL (1) PL169440B1 (ro)
RO (1) RO109866B1 (ro)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6156946A (en) * 1996-04-12 2000-12-05 Exxon Research And Engineering Company Biological activation of aromatics for chemical processing and/or upgrading of aromatic compounds, petroleum, coal, resid, bitumen and other petrochemical streams
DE19951768A1 (de) * 1999-10-27 2001-05-03 Basf Ag Mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung aromatischer Aldehyde und/oder Carbonsäuren
DE50311954D1 (de) * 2002-06-17 2009-11-12 Saltigo Gmbh Verfahren zur Herstellung von mono-N-sulfonylierten Diaminen
DE102010015807A1 (de) 2010-04-20 2011-10-20 Evonik Degussa Gmbh Biokatalytisches Oxidationsverfahren mit alkL-Genprodukt

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK149080C (da) * 1980-06-06 1986-07-28 Sankyo Co Fremgangsmaade til fremstilling af derivater af ml-236b-carboxylsyre
NL8700085A (nl) * 1987-01-15 1988-08-01 Rijksuniversiteit Werkwijze voor het bereiden van verbindingen met eindstandige hydroxyl- of epoxygroep; daarvoor bruikbare microorganismen.

Also Published As

Publication number Publication date
US5306625A (en) 1994-04-26
PL169440B1 (pl) 1996-07-31
CZ279503B6 (cs) 1995-05-17
PL293733A1 (en) 1992-11-02
EP0502524B1 (de) 1996-05-15
IE920681A1 (en) 1992-09-09
MX9200963A (es) 1992-09-01
JPH06181789A (ja) 1994-07-05
IL101154A0 (en) 1992-11-15
CS66392A3 (en) 1992-09-16
ATE138103T1 (de) 1996-06-15
EP0502524A1 (de) 1992-09-09
DK0502524T3 (da) 1996-06-03
CA2062357A1 (en) 1992-09-08
HU212922B (en) 1996-12-30
HUT62929A (en) 1993-06-28
IE75349B1 (en) 1997-08-27
ES2087327T3 (es) 1996-07-16
DE59206267D1 (de) 1996-06-20
HU9200763D0 (en) 1992-05-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Sun et al. Regulators of aerobic and anaerobic respiration in Bacillus subtilis
Yang et al. Identification of the pdxK gene that encodes pyridoxine (vitamin B6) kinase in Escherichia coli K-12
JPH028714B2 (ro)
KR100312456B1 (ko) 슈도모나스 플루오레슨스 유래의 외래단백질 분비촉진유전자
EP3880835A1 (en) Improved production of riboflavin
Alves et al. Enzymes of glucose and methanol metabolism in the actinomycete Amycolatopsis methanolica
JP2002512802A (ja) 芳香族代謝／ｉｉｉ物質の微生物による製造
Harms et al. Genetics of C 1 metabolism regulation in Paracoccus denitrificans
Usdin et al. Cloning, expression, and purification of glutamine synthetase from Clostridium acetobutylicum
ZHAO et al. An allosterically insensitive class of cyclohexadienyl dehydrogenase from Zymomonas mobilis
RO109866B1 (ro) Procedeu microbiologic, de hidroxilare terminala, de grupe etil la heterocicluri aromatice cu inel de 5 sau 6 atomi si hibridplalsimida pentru acest procedeu
Woo et al. Methyl viologen hydrogenase II, a new member of the hydrogenase family from Methanobacterium thermoautotrophicum delta H
CZ279464B6 (cs) Způsob hydroxylace methylových skupin v aromatických heterocyklech, hybridní plasmidy pL05 a p L04 uložené v mikroorganismech Pseudomonas putida a Escherichia coli
EP1449923B1 (en) Novel formate dehydrogenase tolerant to halogen compounds and process for producing the same
Yun et al. A novel five-subunit-type 2-oxoglutalate: ferredoxin oxidoreductases from Hydrogenobacter thermophilus TK-6
US6153398A (en) Method to identify specific inhibitors of IMP dehydrogenase
KR940005598B1 (ko) 아스코르빈산-2-인산의 제조법
RU2067619C1 (ru) Микробиологический способ терминального окисления этильных групп в карбоксильные группы
Kimura Application of recDNA techniques to the production of ATP and glutathione by the “Syntechno System”
US4761374A (en) Thermally stable tryptophanase, process for producing the same, and thermally stable tryptophanase-producing microorganism
Mayerl et al. Functional expression of 8-hydroxy-5-deazaflavin-dependent DNA photolyase from Anacystis nidulans in Streptomyces coelicolor
Ro et al. Growth on methanol of a carboxydobacterium, Acinetobacter sp. strain JC1 DSM 3803
Umeda et al. In vivo cloning of genes determining lithoautotrophy (Aut) on a plasmid from Alcaligenes hydrogenophilus
JPS63157986A (ja) 遺伝子組換によるｌ−フエニルアラニンの製造方法
Jiang et al. Optimized Heterologous Expression of Glutathione Reductase from CyanobacteriumAnabaenaPCC 7120 and Characterization of the Recombinant Protein