PL166895B1 - Sposób rozrózniania kwasów nukleinowych na podstawie róznic nukleotydowych PL PL PL - Google Patents

Sposób rozrózniania kwasów nukleinowych na podstawie róznic nukleotydowych PL PL PL

Info

Publication number
PL166895B1
PL166895B1 PL91293188A PL29318891A PL166895B1 PL 166895 B1 PL166895 B1 PL 166895B1 PL 91293188 A PL91293188 A PL 91293188A PL 29318891 A PL29318891 A PL 29318891A PL 166895 B1 PL166895 B1 PL 166895B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
primer
dna
nucleic acid
nucleic acids
extension product
Prior art date
Application number
PL91293188A
Other languages
English (en)
Other versions
PL293188A1 (en
Inventor
Kenneth J Livak
Jan A Rafalski
Scott V Tingey
John G K Williams
Original Assignee
Du Pont
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=23963743&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL166895(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Du Pont filed Critical Du Pont
Publication of PL293188A1 publication Critical patent/PL293188A1/xx
Publication of PL166895B1 publication Critical patent/PL166895B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/14—Heterocyclic carbon compound [i.e., O, S, N, Se, Te, as only ring hetero atom]
    • Y10T436/142222—Hetero-O [e.g., ascorbic acid, etc.]
    • Y10T436/143333—Saccharide [e.g., DNA, etc.]

Abstract

1. Sposób rozrózniania kwasów nukleinowych na podstawie róznic nukleotydowych w losowych segmentach kwasów nukleinowych, znamienny tym, ze obejmuje: /a/ oddzielne przeprowadzenie reakcji przedluzenia na kazdym z co najmniej dwóch kwasów nukleinowych, która to reakcja polega na: /i/ kontaktowaniu kwasów nukleinowych z co najmniej jednym starterem oligonukleo- tydowym o dlugosci wiekszej niz 7 nukleotydów w takich warunkach, ze zachodzi synteza produktu przedluzenia co najmniej jednego startera dla co najmniej jednego kwasu nukleino- wego i /b/ porównanie wyników oddzielnie przeprowadzonych reakcji przedluzenia pod katem róznic. PL PL PL

Description

Wynalazek dotyczy sposobu coecóżniania kwasów nukleinowych. W szczególności, losowe segmenty kwasu nukleinowego coeróżnia się pczee kocdwnywanie różnic nukleotydowyrh w ucoduktach reakcji uceedłużania.
Genetyka opieca się na identyfikowaniu i charakteryzowaniu mutacji, które są emianami DNA /uolimocfiemy DNA/ spowodowanymi podstawieniem, inseccją bądź delecją nukleotydu. Roewinioto seeceg technik uocównywania homologicenych segmentów DNA w celu określenia, cey segmenty te są identycene, cey też cóżnią się jednym lub więkseą licebą nukleotydów. Pcaktycene eastosowania tych technik obejmują genetycene aiagnaeawanie chorób, stosowanie w sądownictwie, mauowanie ludekiego genomu i eastosowania w żalnictwin.
Najskuteceniejseą metodą uocównywania segmentów DNA jest ueSne okicilenie sekwencji nukleatyaawnj każdego segmentu. PczykSady stosowania sekwencjonowania do badania mutacji w genach ludekich ouisano w uublikacjach: Engelke i wsu., Pcoc. Natl. Acad. bci. U.b.A., 85:544-548 /1988/ oraz Wong i wsu., Nature 330:384-386 /1987/. Obecnie stosowanie ueSnego sekwencjonowania w celu uocównania ealeagin kilku segmentów DNA nie jest ucaktycene, kaniegaż aenaczenie, intecu^^tacja i uorównywanie infocmacji sekwencyjnych jest ebyt uracochSonne.
Dla celów makawania genetycenego najceościnj stosuje się kczeszukiwanin uod kątem uolimo^-emów DNA skawadawanych mutacjami, uolegające na trawieniu DNA endanukleazami restrykcyjnymi i analieowaniu otczymanych fragmentów, jak ouisali: Botstein i wsu. Am. J. Hum. Genet., 32:314-331 /1980/; White i wsu., bci. Am.,258:40-48 /1988/. Mutacje, któce mają wuSyw na sekwencje żozkaenawane uczee endonukleaeę uniemożliwiają enzymatycenn uczecięcie w tym miejscu, uczee co obrae DNA uoddanego takiemu cięciu ulega emirnie. Kwasy DNA uażdwnujn się seukając różnic w długościach fragmentów restrykcyjnych. Główną wadą tej metody /enanej jako mauowanie ualimażfizmu długości fragmentów cestcykcyjnych albo mauowanie RFLP/ jest bcak możliwości wykcycia takich mutacji, które nie mają wuSywu na cięcie enaanukleaeą restcykcyjną. Tak więc metoda ta nie uoewala na wykcycie seeregu mutacji. Oseacagana, że badanie wykonane uczee Jeffreys a, Cell, 18:1-18 /1979/umożliwiło wykcycie jedynie 0,7% wariantów mutacyjnych obecnych w regionie ludekiego DNA o długości 40 000 uac easad. Inną tn^<^^o.ś<riąjest to, że metody stosowane do wykcywania kalimażfizmdw długości fragmentów ^^st^^kicyjnych są budzo uracochłonne, ewSaszcea techniki obejmujące analieę blotingową bouthecn.
buosób uolegający na kczndSużaniu startera ouisany w ^ΠϊΖι^ϊ: Pcoudioot i wsu., bcience 209: 13129-1336 /1980/ stosowano seecoko do badania stcuktucy RNA, jak cównież do chacaktecyzowania DNA, uatce na uczykład Engelke i wsu., Pcoc. Natl. Acad. bci. U.b.A., 85:544-548 /1988/. buosób ten kaleza na hybżydyzawaniu enakowanego stacteca aliganuklnatyaawega e matcycą RNA lub DNA, a nastęunie na eastosowaniu kalimncazy DNA i trójfosfocanów aneaksynukleatyaawych w celu kceedłużnnia startera aż do końca 5 matcycy. Nastęunie enakowany ucodukt użzedłużenia frakcjonuje się według wielkości, ewykle uczee nlnktcafarezę w denatucującym żelu kaliakżylaamidagym. W kczyuadku każównywania homo^^nych segmentów DNA, suosób ten uoewala na wykcycie różnic suowodowanych inseccją lub delecją nukleotydu. Z uwagi na to, że jedynym kcyterium aznacznnia ucoduktu ^ze^użenia starterajest wielkość, skasabem tym nie można wykcyc różnic skagaaawanych uodstawieniem nukleotydu.
Mullis i wsu., uatent btanów Zjednoceonych Amecyki nc 4 683 195 orae Mullis, uatent btanów Zjednoceonych Amecyki nc 4 683 202 ujawniają reakcję seczekiania łańcuchów ea uomocą ualimnrazy, stosowaną do amuli^ikowania jakiegokolwiek skecyficznega segmentu kwasu nukleinowego. Te metody analitycene eastosowano do wykcycia ualimażfiemów uakczee amklifikację segmentów docelowego DNA wybranych e badanych genomów. Wada tych metod uolega na tym, że koniecena jest taka enajomość seeregu 2asad obu końców skecyficennga
166 895 segmentu, która umożliwia zaprojektowanie starterów oligonukleotydowych, które będą hybrydyzowały z różnymi nićmi docelowego segmentu. Uzyskanie wymaganych dla zaprojektowania starterów informacji odnośnie sekwencji docelowych genomów jest bardzo pracochłonne. M.H.Skolnic i R.B.Wallace, Simultaneous Analysis of Multiple Polymorphic Loci Using Amplified Sequence Polymorphisms /ASPs/, Genomics 2: 273-278.
Amplifikację przy użyciu oligonukleotydów o losowej sekwencji opisano w teoretycznych założeniach mapowania genomu wyższych eukariotów w Happy mapping: a Proposal for Rinkage Mapping the Human Genome, P.H. Dear i P.R. Cook, Nucleic Acids Research, tom 17, nr 17, 6795-6807/1989/. Autorzy proponują rozpoznanie odległości pomiędzy 5 000 różnych segmentów DNA ludzkiego genomowego DNA amplifikowanych na drodze reakcji szczepiania łańcuchów za pomocą polimerazy /PCR/ przy użyciu kombinacji różnych par starterów o dowolnej sekwencji. Matrycowy DNA izoluje się oddzielnie z pojedynczych komórek haploidalnych organizmu. Ich metoda sugeruje tworzenie map podających fizyczne umiejscowienie tych regionów DNA organizmów, które dają początek zamplifikowanym produktom.
Można tego dokonać przez identyfikowanie produktów reakcji PCR ulegających kompliiikacji z tego samego kawałka DNA, ustalając w ten sposób ich fizyczną odległość. W metodzie Dear a i Cook a polimorfizmy byłyby wyłączone z analizy. Ich idea wymaga identyfikacji tego samego segmentu DNA w wielu różnych komórkach haploidalnych, a występowanie polimorfizmów uniemożliwia spełnienie tego wymogu. Dobre zmapowanie, choć skuteczne jeśli chodzi o opisanie fizycznej odległości pomiędzy dwoma produktami PCR, nie pozwala na umiejscowienie cechy genetycznej będącej przedmiotem zainteresowania. Można tego dokonać jedynie przez skorelowanie segregacji cechy genetycznej zaistniałej w wyniku płciowego krzyżowania dwóch osobników, z szeregiem różnych polimorfizmów. Autorzy twierdzą, że konieczne jest stosowanie par starterów o długości większej niż 9-10 nukleotydów, ponieważ pary starterów 9 do 10-nukleotydowych działają jako startery niewydajnie.
Obecny wynalazek dotyczy sposobu wykrywania genetycznych polimorfizmów w losowych, niespecyficznych segmentach kwasu nukleinowego. Sposób wykorzystuje reakcję zapoczątkowaną przez oligonukleotyd /y/ wytworzony z łatwością bez wiedzy o sekwencji zasad amplikowanych segmentów.
Przedmiotem obecnego wynalazku jest sposób rozróżniania kwasów nukleinowych na podstawie różnic nukleotydowych w losowych segmentach kwasu nukleinowego, obejmujący:
/a/ oddzielne przeprowadzenie reakcji przedłużenia na każdym z co najmniej dwóch kwasów nukleinowych, która to reakcja polega na: /i/ kontaktowaniu kwasów nukleinowych z co najmniej jednym starterem oligonukleotydowym o długości większej niż 7 nukleotydów w takich warunkach, że zachodzi synteza produktu przedłużenia co najmniej jednego startera dla co najmniej jednego kwasu nukleinowego i /b/ porównaniu wyników oddzielnie przeprowadzonych reakcji przedłużenia po kątem różnic.
W innej postaci wynalazku, po etapie /i/, a przed etapem Pol prowadzi się dodatkowe etapy: /ii/ oddzielenia produktu przedłużenia od jego nici komplementarnej oraz /iii/ amplifikowanie losowego segmentu kwasu nukleinowego na drodze kontaktowania oddzielonego produktu przedłużenia ze starterem z etapu /i/ w takich warunkach, że następuje amplifikacja produktu przedłużenia przy użyciu jako matrycy oddzielonego produktu przedłużenia.
W jeszcze innej postaci wynalazku różnicę w produkcie przedłużenia stosuje się jako marker do konstruowania mapy genetycznej i do rozróżniania lub identyfikowania osobników.
Figura 1 przedstawia fotografię żelu porównującą produkty amplifikacji DNA wyizolowanego z nasion soi Glyine max /Bonus/ /nieparzysta numeracja linii/ i z nasion soi Glycine soja /PI 81762/ /parzysta numeracja linii/, powstałe przy zastosowaniu starterów oligonukleotydowych o różnych sekwencjach. Figura 2 przedstawia fotografię żelu porównującą produkty amplifikacji powstałe przy zastosowaniu startera 10b dla 19 osobników potomnych pokolenia F2, powstałych w wyniku krzyżowania pomiędzy Bonus i PI 81762. Figura 3 przedstawia fotografię żelu porównującą produkty amplifikacji DNA z Bonus /nieparzysta numeracja linii/ i z PI 81762 /parzysta numeracja linii/. Zastosowano starter AP8 oraz 10 innych starterów różniących się od AP8 pojedynczym nukleotydem. Figura 4 przedstawia fotografię żelu porów166 895 nującą produkty amplifikacji DNA pochodzącego z Zea /kukurydza/, Gossypium hirsutum /bawełna/, Saccharomyces cerevisiae /drożdże/ i Arabidopsis thaliana, powstałe przy zastosowaniu różnych starterów. Figura 5 przedstawia fotografię żelu demonstrującą wyniki amplifikacji przy użyciu starterów o długości od sześciu do dziesięciu nukleotydów. Figura 6 przedstawia fotografię żelu porównującą produkty amplifikacji DNA z sześciu transformowanych limfoblastów Homo sapiens /ludzkich/. Figura 7 przedstawia wykresy densytometryczne dotyczące osobników pokolenia F2 powstałych w wyniku krzyżowania pomiędzy Bonus i PI 81762 - homozygotycznych w odniesieniu do polimorfizmu - /2 kopie/ /7A/, heterozygotycznych /7B/ i homozygotycznych - /0 kopii/ /7C/.
Stosowane tu wyrażenie oligonukleotyd odnosi się do cząsteczki zawierającej dwa lub większą liczbę dezoksyrybonukleotydów lub rybonukleotydów.
Stosowane tu wyrażenie starter odnosi się do oligonukleotydu o dowolnej sekwencji, występującego albo naturalnie - jak w oczyszczonym produkcie trawienia, albo wytworzonego syntetycznie, który zdolny jest do działaniajako punkt inicjacji syntezy w warunkach, w których następuje synteza komplementarnego do nici kwasu nukleinowego produktu przedłużenia startera, to jest w obecności nukleotydów i czynnika wywołującego polimeryzację, takiego jak polimeraza DNA, w odpowiedniej temperaturze i przy odpowiednim pH. Startery korzystnie stanowią sekwencje nie tworzące ani drugorzędowej struktury przez parowanie zasad z innymi kopiami startera, ani też sekwencji o konfiguracji szpilki do włosów. Sekwencje te dogodnie projektuje się przy pomocy komputera lub wybiera się losowo z banku genów. Z uwagi na uzyskanie maksymalnej wydajności amplifikacji, korzystnie stosuje się starter jednoniciowy, lecz alternatywnie można zastosować starter dwuniciowy. W przypadku dwuniciowej budowy startera, poddaje się go obróbce rozdzielającej nici przed· zastosowaniem do wytworzenia, produktów przedłużenia. Korzystnie, jako starter stosuje się oligodezoksyrybonukleotyd.
Stosowane tu wyrażenie losowy segment kwasu nukleinowego odnosi się · do jakiejkolwiek matrycy lub segmentu kwasu nukleinowego, poddawanego działaniu startera, przy czym informacje odnośnie sekwencji tego kwasu nukleinowego nie są potrzebne przed prowadzeniem etapu przedłużania.
Zgłaszający odkryli, że do zaprojektowania starterów, które będą hybrydyzowały z róż-, nymi nićmi matrycy, nie jest wymagana szczegółowa znajomość dostatecznej liczby zasad obu końców tej matrycy.
W sposobie według wynalazku stosuje się co najmniej jeden starter o długości większej niż 7 nukleotydów. Startery krótsze niż 7-mio nukleotydowe działają niewydajnie. Startery syntetyzuje się przy użyciu standardowych technik znanych fachowcom. W korzystnej postaci wynalazku stosuje się co najmniej jeden starter o długości od 9 do 10 nukleotydów.
Dogodnie, stosuje się jeden starter. Co najmniej jeden stosowany starter może być biotynylowany. Oznacza to, że starter może być kowalentnie związany z biotyną lub z jej, analogiem. Zaleca się wybór takiej grupy wiążącej, która będzie pozwalała na zachodzenie reakcji przedłużania w opisanych tu warunkach.
W sposobie rozróżniania kwasów nukleinowych według wynalazku porównuje się różnice w produktach reakcji przedłużenia prowadzonych oddzielnie na co najmniej dwóch losowych segmentach kwasów nukleinowych.
W pierwszym etapie sposobu /a/ prowadzi się reakcję przedłużenia oddzielnie na każdym z co najmniej dwóch kwasów nukleinowych przez /i/ kontaktowanie kwasów nukleinowych z co najmniej jednym starterem oligonukleotydowym o długości większej niż 7 nukleotydów w takich warunkach, że zachodzi synteza produktu przedłużenia co najmniej jednego startera dla co najmniej jednego kwasu nukleinowego, przy czym produkt przedłużeniajest komplementarny do losowego segmentu kwasu nukleinowego. W korzystnym wykonaniu tej reakcji wykorzystuje się zdolność większości polimeraz DNA do katalizowania reakcji przedłużenia startera. Do zajścia reakcji przedłużenia startera wymagany jest substrat w postaci kwasu nukleinowego ze starterem zhybrydyzowanym z nicią matrycy tak, że koniec 3 startera znajduje się przy końcu 5 nici matrycy. Ponieważ najczęściej stosuje się metody przedłużenia startera, którym jest DNA, nicią matrycy jest albo DNA albo RNA, a do przedłużania startera stosuje się polimerazę DNA. Podstawowe warunki wymagane do przeprowadzenia reakcji przedłużenia startera omówiono
166 895 w publikacji: Mullis i wsp., opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 683 195 oraz Mullis, opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 683 202.
Sposobem według wynalazku analizuje się kwasy nukleinowe DNA lub RNA, zarówno w postaci jedno- jak i dwuniciowej. Jako wyjściowy kwas nukleinowy stosuje się kwas nukleinowy z dowolnego źródła, w postaci oczyszczonej lub nieoczyszczonej. Przykładowo, stosuje się naturalny DNA lub RNA. jakiegokolwiek pochodzenia - z wirusów, bakterii i z organizmów wyższych takich jak rośliny, zwierzęta i drobnoustroje oraz klonowany DNA lub RNA. Ponadto, kwas nukleinowy może stanowić całość kwasu nukleinowego, lub frakcję wieloskładnikowej mieszaniny kwasów nukleinowych. Korzystnie jako kwas nukleinowy rozumie się kwas dezoksyrybonukleinowy. Nieoczekiwanie okazało się, że sposób według wynalazku jest użyteczny do rozróżniania kwasów nukleinowych pochodzących z różnych organizmów zarówno o krótkim DNA genomowym, jak DNA drożdży /2 x 107 par zasad w genomie/ jak i o długim DNA genomowym, jak ludzki DNA /3,0 x 109 par zasad w genomie/.
Wybór polimerazy stosowanej w reakcji przedłużenia zależy od charakteru matrycy. Dla nici matrycy w postaci DNA, odpowiednie, dostępne w handlu polimerazy DNA obejmują polimerazę DNA otrzymaną z bakterii odpornych na działanie temperatury Thermus aquaticus /polimeraza Taq/ lub inne polimerazy termostabilne.
Przypuszcza się, że w sposobie według wynalazku mogą być również użyteczne strukturalne warianty i zmodyfikowane formy tej polimerazy i innych polimeraz DNA. W przypadku, gdy matryca jest RNA, jako poiimerazę DNA stosuje się odwrotną transkryptazę. W obecności substratów w postaci trój fosforanów nukleotydowych, naturalnych bądź ich analogów, polimeraza przedłuża starter w kierunku 3 . Sekwencja produktu przedłużenia jest na ogół komplementarna do odpowiadającej jej sekwencji nici matrycy.
Trójfosforany nukleotydowe stosuje się jak opisano w PCR Protocols, A. Guide to Methods and Applications, M.A.Innis, D.H.Gelfand, J.-J.Sninsky i T.J.White, str. 3-12, wydawca Academic Press /1989/, oraz w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 683 195 i 4 683 204. Substraty można modyfikować sposobami znanymi fachowcom w celu prowadzenia różnych doświadczeń. Przykładowo, co najmniej jeden z substratów w postaci naturalnego trójfosforanu nukleotydowego można zastąpić analogiem o innej ruchliwości, jak podano w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 879 214.
W innej postaci wynalazku, po przeprowadzeniu etapu /i/ prowadzi się dodatkowe etapy - /ii/ oddzielenia produktu przedłużenia od jego nici komplementarnej i /iii/ amplifikowania losowego segmentu kwasu nukleinowego poprzez kontakowanie oddzielonego produktu przedłużenia ze starterem z etapu /i/ w takich warunkach, że następuje amplifikacja produktu przedłużenia przy użyciu jako matrycy oddzielonego produktu przedłużenia. Reakcję amplifikacji ujawnili Mullis i wsp. w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 683 195 oraz Mullis w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 683 202. Szczegółowe warunki amplifikacji matrycy kwasu nukleinowego podano w publikacji M.A.Innis i D.H. Geifand, PCR Protocols, A Guode to methods and Applications, M.A.Innis, D.H.Gelfand, J.-J.Sninsky i T.J.White, str. 3,12, wydawnictwo Academic Press /1989/.
W szczególności, opracowanie Mullisa dotyczy sposobu amplifikowania jakiejkolwiek pożądanej sekwencji kwasu nukleinowego zawartej w kwasie nukleinowym lub w mieszaninie kwasów. Sposób Mullisa polega na traktowaniu osobnych komplementarnych nici kwasu nukleinowego molowym nadmiarem dwóch starterów oligonukleotydowych i wydłużaniu startera, w wyniku czego powstają komplementarne produkty przedłużenia startera, stanowiące matrycę do syntetyzowania pożądanej sekwencji kwasu nukleinowego. Startery Mullisa są zaprojektowane tak, aby były komplementarne w wystarczającym stopniu w stosunku do różnych nici każdej specyficznej sekwencji poddawanej amplifikacji. Poszczególne etapy reakcji można prowadzić stopniowo lub jednocześnie, przy czym można je powtarzać tak często, jak jest to pożądane.
W reakcjach przedłużania według wynalazku, kwas nukleinowy kontaktuje się z co najmniej jednym opisanym tu starterem. Produkt przedłużenia oddziela się od komplementarnej nici losowego kwasu nukleinowego, na której zachodziła synteza, otrzymując cząsteczkę jednoniciową, a losowy segment kwasu nukleinowego amplifikuje się przez skontaktowanie jednoni166 895 ciowego produktu przedłużenia z poprzednim starterem, jak ujawniono na przykład w PCR Protocols i w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 683 202, w wyniku czego zachodzi amplifikacja produktu przedłużenia na matrycy w postaci uprzednio otrzymanej pojedynczej nici /to jest oddzielonego produktu przedłużenia/.
Opisane tu etapy prowadzi się kolejno lub jednocześnie, jak podano w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 683 195 i 4 683 202. Ponadto, etapy te można powtarzać aż do osiągnięcia pożądanego poziomu amplifikacji sekwencji, jak ujawniono w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 683 195 i 4 683 202.
Po zakończeniu reakcji przedłużenia, wyniki otrzymane w etapie /b/ porównuje się pod kątem różnic. Na ogół wynikiem jest wytworzony produkt lub brak produktu. Bardziej szczegółowo, produkty porównuje się pod 'kątem określenia, czy segmenty są identyczne, lub czy występują różnice w jednym, lub większej liczbie nukleotydów, spowodowane podstawieniem, insercją lub delecją nukleotydu. Różnice pomiędzy produktami przybierają postać, na przykład różnicy w wielkości, w sekwencji, w ilości wytworzonego produktu oraz w liczbie powstałych produktów.
Porównań dokonuje się przy użyciu szeregu technik znanych fachowcom, przykładowo, przez określenie sekwencji nukleotydowej amplifikowanego segmentu lub na drodze analizy RELP. Dogodnie, porównania dokonuje się przy zastosowaniu środka frakcjonującego pod względem wielkości. W przypadku uzyskania dostatecznie dobrego wyniku, można wykryć różnice w pojedyńczych nukleotydach. Korzystnie stosuje się elektroforezę w żelu poliakryloamidowym lub agarozowym.
Proste obejrzenie wyniku elektroforezy w żelu może ujawnić polimorfizmy, które rzutują na wielkość i ilość amplikowanego segmentu, jak również te polimorfizmy, które determinują, czy dany segment ulegnie amplifikacji.
Polimorfizmy wykryte sposobem według wynalazku można określić ilościowo przez poddanie zamplifikowanego produktu umiejscowionego w żelu znanym technikom densytometrycznym. Takie określenie ilościowe jest ważne w niektórych zastosowaniach, gdzie konieczne jest odróżnienie polimorfizmów homozygotycznych od heterozygotycznych. Zgłaszający wykazali, że homozygota posiadająca dwie kopie polimorfizmu tworzy dwa razy więcej produktu, niż heterozygota.
Sposób według wynalazku znajduje praktyczne zastosowania. Przykłady takich zastosowań obejmują mapowanie genetyczne oraz rozróżnianie i identyfikowanie osobników.
Zgłaszający wykazali, że polimorfizmy lub różnice ujawnione sposobem według wynalazku mogą znaleźć zastosowanie przy tworzeniu map genetycznych. Na ogół mapę genetyczną konstruuje się przy zastosowaniu analizy RELP. Można skonstruować mapę genetyczną organizmu zastępując markery genetyczne RELP opisane przykładowo przez Bolsein’ a D. w Construction of a Genetic Linkage Map in Man Using Restriction Fragment Length Polymorfisms, Am.J.Hum.Genet 32: 314-331 /1980/ , markerami genetycznymi w postaci polimorfizmów wykrytych sposobem według wynalazku. Mapowanie genetyczne przy użyciu jako markerów polimorfizmów, według wynalazku, znajduje ważne zastosowanie w hodowli roślin, jako że zgłaszający dowiedli, że polimorfizmy wykryte sposobem według wynalazku stanowią dziedziczne markery genetyczne. Markery te, tak samo jak markery RELP opisane w publikacji: Tanksley S.D. RELP Mapping in Plant Breeding: Nev Tools for an Old Science, Bio/Technology tom 7, Marzec 1989, str. 257-264, można zastosować jako sondy do badania obecności lub nieobecności niektórych części chromosonu, jako że zgłaszający wykazali, że polimorfizmy wykryte sposobem według wynalazku ulegają segregacji razem ze standardowymi markerami rElP. Ponadto, sposób według wynalazku można zastosować do skonstruowania tak zwanego odcisku palca kwasu nukleinowego. Takie odciski są .specyficzne dla poszczególnych osobników i mogą znaleźć zastosowanie do identyfikowania lub rozróżniania osobników. Można je konstruować stosując szereg polimorfizmów otrzymanych przy użyciu różnych starterów, które to polimorfizmy wykrywa się sposobem według wynalazku, tak jak do skonstruowania odcisku palca stosuje się polimorfizmy, według opracowania: Jeffrey A.J., Individual-Specific Fingerprints of Human DNA, Nature, tom 316, 4 lipca 1985. Tak więc, genomy porównuje się pod kątem obecności lub nieobecności polimorfizmów.
166 895
Przykład 1 obrazuje syntezę i oczyszczanie starterów oligonukleotydowych. Przykład 2 służy wykazaniu, że 10 różnych starterów oligonukleotydowych zdolnych jest do amplifikowania losowych segmentów kwasu nukleinowego i że możliwe jest wykrycie polimorfizmów pomiędzy próbkami genomowego DNA pochodzącego z dwóch upraw soi. Przykład 3 wykazuje, że polimorfizmy wykryte sposobem według wynalazku podlegają normalnemu dziedziczeniu przez potomstwo powstałe w wyniku krzyżowania dwóch linii soi. Przykład ten dowodzi użyteczności polimorfizmów jako markerów genetycznych. W przykładzie 4 wykazano, że obraz pasm amplifikowanych produktów jest specyficzny dla danej sekwencji startera. Większość zmian w pojedynczym nukleotydzie w sekwencji startera powoduje całkowitą zmianę w obrazie amplifikowanych segmentów DNA. Sugeruje to, że większość jednonukleotydowych polimorfizmów w odpowiadających miejscach startu w genomie będzie wykrywalna sposobem według wynalazku jako różnica w obrazie amplifikowanych segmentów DnA. Przykład 5 dowodzi, że 10-cio nukleotydowe startery amplifikują na ogół równoważne liczby segmentów DNA zarówno z małych, jak i z dużych genomów. Przykład 6 wykazuje użyteczność starterów o długości od 6 do 10 nukleotydów. Przykład 8 dowodzi, że sposobem według wynalazku wykrywa się polimorfizm, co może znaleźć zastosowanie o rozróżnianiu próbek ludzkiego DNA. Przykład 9 ilustruje ilościowe oznaczenie amplifikowanych produktów.
Przykład 1. Synteza i oczyszczanie starterów oligonukleotydowych,
Zsyntetyzowano osiem starterów oligonukleotydowych /Tabela 1 przy użyciu znanych metod w fazie stałej i z zastosowaniem chemii fosforoamidynów w automatycznym syntetyzerze DNA Du Pont Model Coder 300 /E.I. du Pont de Nemours and Company, Wilmington, DE/. Osiem starterów miało dowolne sekwencje nukleotydowe. Każdy starter zawierał taki sam stosunek ilości zasad A i T jak G i C, w celu uzyskania jednakowej trwałości po przyłączeniu do matrycy.
Po odbezpieczeniu w wodorotlenku amonowym znaną metodą, próbki wysuszono pod próżnią, rozpuszczono w 0,2 ml TEN /10mM Tris-Cl, pH 7,5, 1mM NaEDTA, 10 mM NaCl/ i oczyszczono przy użyciu chromatografii żelowej na kolumnie Sephadex G25 z wypełnieniem NAP-5 /Pharmacia, Piscataway, N.J./ zrównoważonej TEN, następnie na szczyt kolumny wprowadzono 0,5 ml TEN, zbierając 0,5 ml eluenta. Stężenie oczyszczonego oligonukleotydu obliczono spektrofotometrycznie przy absorbancji 260 nm. Wartość absorbancji równa 1 odpowiadała stężeniu 33 gg/ml.
T ab e 1 al
Sekwencja startera Nazwa startera Stężenie roztworu podstawowego kg
5'-AGCACTGTCA 10b 10
5'-TCGTAGCCAA AP3 10
5'-TCACGATGCA AP4 10
5'-CTGATGCTAC AP5 10
5'-GCAAGTAGCT AP6 10
5'-CTGATACGGA AP7 10
5'-TGGTCACTGA AP8 10
5'-ACGGTACACT AP9 10
Przykład 2. Startery /Tabela V wykrywają polimorfizmy w matrycach w postaci DNA soi.
Genomowy DNA wyizolowano z hodowli nasion soi PI 81762 i Bonus przez odwirowanie w CsCl/bromek etydyny jak opisano w pracy: Murray, M.G. Rapid isolation of High Molecular Weight Plant DNA, Nucleic Acids Res., tom, 8 /1980/, str. 4321-4326. Hodowle nasion soi pochodziły od profesora Theodore a Hymowitz a, University of Illinois.
Startery w postaci oligonukleotydów, każdy o długości 10 nukleotydów /Tabela I/ testowano osobno w reakcji amplifikacji opisanej niżej, pod kątem ich zdolności amplifikowania segmentów DNA pochodzących z dwóch różnych odmian soi.
166 895
Reakcję według wynalazku przeprowadzono w 50 ml roztworze reakcyjnego zawierającego mieszaniny genomowego DNA, które zawierały: 10 mM Tris-Cl, pH 8,3,50 mM KCl, 2,5 mM MgCl2, 0,001 % żelatyny /Sigma, St.Louis, MO, katalog: /1990/ nr G-2500/, 0,1 μg sojowego DNA, 20 pikomoli oligonukleotydów, 200 pM każdego z trójfosforanów dezoksynukleotydowych-dATP, dCTP, dGTP, dTTO oraz 1,25 jednostek polimerazy DNA Amplitag /Perkin-Elmer Cetus, nr katalog. N801-0060, Norwalk, CN/. Mieszaninę genomowego DNA przygotowano przez zmieszanie składników 1-5 /Tabela II/ i ogrzewanie w temperaturze 99°C w ciągu 4 minut w bloku grzewczym urządzenia do cyklicznego wygrzewania DNA. Następnie przed dodaniem składników 6 i 7 /Tabela II/ mieszaninę ochłodzono do temperatury pokojowej. Amplifikację prowadzono w próbkach do ultrawirowania o pojemności 6 ml /kat. nr 1048-00-0, Robbins Scientific Corp., 1280 Space Park Way, Mtn. View, CA 94943 /1990/, reakcję zainicjowano przez dodanie do 2 pl każdego startera z Tabeli 148 pl mieszaniny genomowego DNA /Tabela II/, przy czym mieszaninę reakcyjną pokryto warstwą 40 pl oleju mineralnego /Sigma, katalog: nr M 3516/.
Tabela II
Mieszaniny genomowego DNA Objętość
PI 81762 pl Bonus pl
Zdejonizowana woda 309,0 308,0
10x Bufor 45,0 45,0
MgCl2,200 mM 2,2 2,2
DNA z PI 81762,672 pg/ml 1,3 -
DNA z Bonus, 448 pg/ml - 2,0
Mieszanina dATP, dCTP, dGTP, ITP, 1,25 mM każdego 72,0 72,0
Polimeraza Amplitag, 5 jednostek / pl 2,2 2,2
* 10 x Bufor składa się z: 100 mM TrisCl, /pH 8,3/, 500 mM KCl, 15mM MgCl2 i 0,01% żelatyny według zalecenia Perkin-Elmer Cetus, katalog, nr N801-0060
Polimeraza DNA Amplitaq.
Okresowych zmian temperatury amplifikacji dokonano w urządzeniu do cyklicznego wygrzewania DNA - DNA Thermal Cycler /Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CN/ przez zastosowanie 30 cykli o parametrach: 94°C przez 1 minutę, 35°C przez 30 sekund, zmiana do 72°C w ciągu 1 minuty i 51 sekund, 72°C przez 2 minuty.
Po zakończeniu 16-tu oddzielnych reakcji amplifikacji, 5 pl każdej próbki zanalizowano przez elektroforezę prowadzoną na 1,4% żelu agarozowym przy napięciu 8,5 V/cm w ciągu 60 minut. Elektroforezę prowadzono zgodnie ze znaną praktyką, jak opisano w publikacji: J.Sambrook, E.F.Fritsch i T.Maniatis, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring-Harbor Laboratory Press, str. 6.3-6.19 /1989/. Żel zabarwiono bromkiem etydyny i sfotografowano.
Polimorfizmy, to znaczy różnice w otrzymanych obrazach DNA dla produktów reakcji, były ewidentne dla wszystkich starterów poza starterem AP6, przy porównaniu ścieżek DNA zarówno z Bonus jak i z PI 81762 /Figura 1/, który to DNA amplifikowano przy użyciu danego startera. Figura 1 przedstawia fotografię zabarwionego żelu, w którym prowadzono elektroforezę. Linia O stanowi wzorzec masy cząsteczkowej. Linie oznaczone cyframi nieparzystymi odpowiadają produktom amplifikacji DNA z Bonus, prowadzonej przy użyciu ośmiu starterów /Tabela I/, a linie oznaczone cyframi parzystymi odpowiadają produktom amplifikacji DNA z PI 81762, prowadzonej przy użyciu tych samych starterów. Z fotografii tej wynika, że losowe segmenty kwasu nukleinowego można rozróżnić na podstawie różnic nukleotydowych. Przykładowo, dwie ścieżki oznaczone A i B obrazujące wyniki amplifikacji przy użyciu startera 10b są widoczne w DNA z PI 81762 /linia 2/, a nie są widoczne w DNA z Bonus /linia 1/.
Przykład3. Zamplifikowane polimorfizmy są użyteczne dla genetycznego mapowania.
W celu określenia, czy polimorfizmy uwidocznione w Przykładzie 2 znajdują zastosowanie w genetycznym mapowaniu, polimorfizm ścieżki A wykryty starterem 10b /figura 2/
166 895 naniesiono na mapę genomu soi. Dokonano tego przez ocenianie każdego z 66 segregujących osobników F2 /T.Hymowitz, U. of I11 / pod kątem dziedziczenia przez nich polimorfizmu ścieżki A i przez porównanie z danymi odnośnie segregacji wśród tych samych 66 osobników, uzyskanymi przy użyciu 430 markerów RFLP wprowadzonych wcześniej na mapę genomu soi /J.A.Rafalski i S.V.Tingey, Abstract, Genome Mapping and Sequencing, 26-30 kwietnia, 1989/. Próbki genomowego DNA z F2 poddano procedurze według wynalazku przy zastosowaniu startera 10b w warunkach opisanych w Przykładzie 2 i analizowano przez elektroforezę w 1,4% żelu agarozowym. Linia O stanowi wzorzec masy cząsteczkowej, a pozostałe linie obrazują produkty reakcji DNA z osobników F2. Tabela 3 przedstawia obraz dziedziczenia po rodzicach polimorfizmu ścieżki A uwidocznionego przy użyciu startera 10b. Ponieważ ścieżka A jest zamplifikowana z PI 81762 a nie z Bonus, /Figura 2/, obecność ścieżki A w pojedynczej próbce wskazuje na to, że próbka ta ma co najmniej jedną kopię segmentu DNA z PI 181762. Przy pierwszym sprawdzeniu trudno jest rozróżnić homozygoty, które otrzymały duże kopie ścieżki A z PI 181762 od heterozygot, które otrzymały tylko jedną kopię ścieżki A z PI 181762. Dlatego ten polimorfizm ocenia się jako marker dominujący /patrz objaśnienie do Tabeli 3/. Osobniki, które nie zawierają ścieżki A odziedziczyły ten segment z Bonus. W celu oznaczenia pozycji locus ścieżki A w genomie soi konieczne było skorelowanie dziedziczenia tego locus z dziedziczeniem różnych markerów RELP naniesionych wcześniej na mapę genomu soi. /J.A.Rafalski i S. V. Tingey, Abstract, Genome Mapping and Sequencing, 26-30 kwietnia, 1989/. Tę mapę genetyczną /dane nie pokazane/ skonstruowano w oparciu o standardową metodykę RFLP na podstawie analizy segregacji obrazów różnych markerów RFLP w tej samej populacji F2, którą stosowano w tym przykładzie /odnośnie standardowej technologii mapowania RFLP - patrz T.Helentjaris, M.Slocum, S.Wright, A. Schaefer i J.Nienhuis, 1986, Theor. Appl. Genet., 72, 761-769/. Podstawą analizy genetycznego mapowania jest to, że markery umiejscowione w genomie blisko siebie dziedziczą się razem w potomstwie F2, a markery umiejscowione dalej podlegają współdziedziczeniu rzadziej.
Przeprowadzono analizę segregacji i obliczono pozycje markerów na mapie przy zastosowaniu programu MapMaker/E.S.Lander, P.Green, J. Abrahamson, A.Barlow, J.F.Daly, S.E.Lincoln i L.Newburg, 1987, Genomics, 1: 174-181/. Wyniki wskazują na to, że na mapie polimorfizm ścieżki A uwidoczniony starterem 10b w grupie A jest sprzężony genetycznie z markerami RFLP 249 i 7315, leżąc pomiędzy nimi w odległości 9,4 i 9,2 centymorganów, odpowiednio. Prawdopodobieństwo, że polimorfizm ścieżki A ulega segregacji jedynie przez przypadek, według obserwowanych danych, wynosiło 1 do 10'H’8, co wskazuje na ważność tej pozycji mapy. Przykład ten dowodzi, że polimorfizmy uwidocznione sposobem według wynalazku znajdują zastosowanie jako markery genetyczne.
T abe l a III
Osobnik F2
Nazwa markera 1 2 4 5 6 7 8 9 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 25 26 27
Parker RFLP 249 B A H H H H A H B H H H A H H H A H A H m H A
Marker RFLP 7315 B A H m H A H H B B H A H H H E A H H m H a m
Ścieżka A startera 10b b A b m b b m b b b b A A A b b A b A m b m A
Nazwa markera Osobnik F2 28 29 30 31 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51
Marker RFLP 249 H A B A B A H H B a H A A m A B B H B H A B A
Marker RFLP 7315 H A B A B H H H B H H A A A A H H H B H H B H
ścieżka A startera 10b b A b A b b b b b b b A A A A b b b b b b b A
166 895
c.d. tabeli III
Osobnik F2
Nazwa 52 5 54 55 56 57 58 59 61 62 63 64 65 68 70 71 72 73 74 75 76 77 78
Marker RFLP 249 H B H B A A B m m m m m m H A H B A A H B B H
Marker RFLP 7315 H B H H A A B H H A H A m H m A m m A m B B H
ścieżka A startera 10b b b b b A A b b b m m A m b m m m A m b b A
Osobnik F2
Nazwa markera 80 82 83 84 85 86 88 90 91 96
Marker RFLP 249 H A B A A B m El m m
Marker RFLP 7315 H H H A A A m m B A
Ścieżka A startera 10b b b b A A b m m b A
Objaśnienie do Tabeli III
DNA wyizolowany z 88 osobników F2 powstałych w wyniku krzyżowania pomiędzy Bonus i PI 81762. Genotyp każdego osobnika w miejscach każdego powyższego markera określono albo przy użyciu analizy RFLP lub sposobem według wynalazku /patrz tekst/. Pojedyncze litery oznaczają genotyp rodzicielski locus markera. Znak A lub B oznacza, że locus zostało odziedziczone po Bonus lub po PI 181762 odpowiednio. Znak H oznacza, że locus zostało odziedziczone zarówno po Bonus jak i po PI 181762. Znak A oznacza, że locus zostało odziedziczone albo jedynie po Bonus, albo zarówno po Bonus jak i po PI 181762. Znak b oznacza, że locus zostało odziedziczone albo po PI 181762, albo zarówno po Bonus jak i po PI 81762 Znak m oznacza brak danych.
Przykład 4. Obraz produktów amplifikacji segmentów DNA jest czuły na zmiany pojedyńczych nukleotydów w sekwencji startera.
Na bazie startera oligonukleotydowego AP8 z Przykładu 2 /Tabela I/ zsyntetyzowano serie starterów. Każdy wariant różnił się od sekwencji podstawowej pojedyńczym nukleotydem w kolejnych miejscach wzdłuż całej sekwencji startera. W każdym wariancie utrzymywano taki skład nukleotydów, że zasady A+T stanowiły 50%, jak w Przykładzie 2. W tablicy IV małymi literami oznaczono nukleotydy, które różnią się od nukleotydów z sekwencji podstawowej.
Tabela IV
Sekwencja startera Nazwa startera Stężenie roztworu podstawowego
5'-TGGTCACTGA AP8 podstawowy 10 μ-iM
5'^^GGTCACTGA APS—a 10 ^uM
5'—TcGTCACTGA AP8—b 10 ^uM
5'-TGcTCACTGA APS—C 10 μ-iM
5* —TGGaCACTGA AP8—d 10 yUM
5' —KiGTgACTGA AP8~e 10 zuM
5'-l\iGTCtCTGA AP8—f 10 ^uM
5' —BGGtCAgTGA AP8—g 10
5'—TGGPGAGaGA AP8~h 10 ^uM
5'—TiGTCAGTcA AP8~i 10 ^uM
5'—TGGl’CAGTBGt AP8~j 10 μ-iM
166 895
Mieszaniny zawierające genomowy DNA z Bonus i z PI 81762 przygotowano tak, jak opisano w Przykładzie 2 /Tabela II/. Zamiast stosowania probówek do ultrawirowania jako naczyń reakcyjnych, próbki umieszczono w studzienkach 96-ścio studzienkowej płytki do mikromiareczkowania z polichlorku winylu /PVC/ Falcon, 1989, 3911, Becton Dickinson Labware, Oxnard, CA/. Próbki pokryto warstwą 40 μ! oleju mineralnego /Sigma, St.Louis, MO, nr katalog. M 3516 1990/. Nieużywane studzienki wypełniono 50 μl wody plus 40 μl oleju. 96-ścio studzienkową płytkę bez przykrywki umieszczono w przedmuchiwanym powietrzem piecu do cyklicznego wygrzewania /BSC 1000 zaopatrzonego w sondę temperatury BSC-2005, Bios, Corp., 291 Whitney Ave., New Haven, cT 06511/ na szczycie metalowego statywu do probówek z rusztem o powierzchni 6,45 cm2. Statyw miał 5,08 cm wysokości na skutek usunięcia górnej półki ze statywu trójpoziomego /szerokość 12,07 cm x długość 29,21 cm x wysokość 10,16 cm/. Tę usuniętą półkę umieszczono na wierzchu 96-studzienkowej płytki. Piec znajdował się w pomieszczeniu o temperaturze otoczenia wynoszącej 22°C; jego pracę zaprogramowano na 35 cykli o następujących parametrach: 93°C przez 1 minutę, 35°C przez 1 minutę, zmiana do 72°C w ciągu 2 minut, 72°C przez 2 minuty. Tolerancję temperatury wygrzewania ustalono na 2°C.
Po zakończeniu reakcji amplifikacji według wynalazku, 12 μl każdej próbki analizowano przy zastosowaniu elektroforezy w 1,4% żelu agarozowym, jak opisano w Przykładzie 2.
Figura 3 przedstawia fotografię barwionego żelu po elektroforezie. Linia O stanowi wzorzec masy cząsteczkowej. Uwidocznione są produkty amplifikacji DNA z Bonus /linie oznaczone cyframi nieparzystymi/ oraz produkty amplifikacji DNA z PI 81762 /linie oznaczone cyframi parzystymi/. Strzałki pokazują pozycję w każdym starterze, w której występuje różnica w stosunku do sekwencji startera AP8. Każdy starter wytwarzał bardzo różne obrazy amplifikowanych segmentów DNA, za wyjątkiem AP8 i AP8-a, dla których obrazy wydawały się różnić jakościowo tylko w jednej ścieżce /patrz ścieżki odpowiadające 250 bp znalezione jedynie dla startera AP8-a; Figura 3, linie 1-4/. Chociaż ogólny obraz ścieżek różnił się dla większości starterów, było co najmniej kilka ścieżek, które mogą być wspólne dla różnych starterów /należy zauważyć polimorficzne ścieżki odpowiadające 1kb, które wydają się być amplifikowane przez AP8, AP8-a i AP8-b; Figura 3, linie 1-6/. Za wyjątkiem AP8 i AP8-a, każdy starter uwidaczniał różne polimorfizmy pomiędzy Bonus a PI 81762. Wśród obrazów utworzonych przez wszystkie 11 starterów, wystąpiło około 22 różnych polimorfizmów uwidocznionych obecnością ścieżki w jednym genomie i odpowiadającą nieobecnością ścieżki w drugim genomie.
Poza kilkoma wyjątkami, zmiana pojedyńczego nukleotydu w starterze powodowała na ogół znaczącą zmianę w obrazie amplifikowanych ścieżek i ujawniła nowe polimorfizmy. Sugeruje to, że warunki tego doświadczenia są wystarczające na to, aby udział brała większość, jeżeli nie wszystkie, z zasad w danym starterze.
Przykład 5. Amplifikacja DNA pochodzącego z różnych gatunków przy użyciu 10-cio nukleotydowych starterów o dowolnej sekwencji.
W tym przykładzie badano genomowy DNA pochodzący z bawełny /line 315, Coker Seed Co., Hartsville, S.C. 29550/, z drożdży /linia DB Y 931, E.I. du Pont de Nemours and Co., Wilmington, DE/, z Arabidopsis /linia W5, patrz K.A.Feldman i wsp., Science, /1989/ 243: 1351-1354/ oraz z kukurydzy /linia B73, University of Illinois/. Próbki DNA przygotowano znanymi metodami jak następuje: Gossypium hirsutum /bawełna/, R.Bernatzky i S.D.Tanksley, 1986, Theor. Appl. Genet. 72, 314-321; Saccharomyces cerevisiae /drożdże/, R.W.Davis, M.-Thomas, J.Cameron, T.P. St. John, S.Scherer i R.-A.Padget, 1980, Methods Enzymol. 65, 404-411; Arabidopsis thalina /Arabidopsis/, Shure, Wessler, Fedoroff, 1983, Cell, 35, 225-233; oraz Zea mays /kukurydza/, Dellaporta, S.L. Molecular Biology of Plants a Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor, N.Y., 11724 /1985/, str. 36-37. Stosowano reagenty w stężeniach wyszczególnionych w Przykładzie 2, przygotowano je jak pokazano w Tabeli V.
166 895
Tabel a V
Mieszanina Objętość gl
Dejonizowana woda 1837,0
10 x Bufor 550,0
MgCl2, 1M 5,5
Mieszanina dATP, dCTP, dGTP 880,0
TTP, 1,25 mM każdego
Polimeraza Amplitaq, 5 jednostek/ gl 27,0
Startery AP3, AP4, AP5, AP6, AP7 i AP8 /Tabela I/ rozcieńczono wodą do stężeń 2 gM. Próbki genomowego DNA rozcieńczono wodą do stężeń 10 mg/ml, ogrzewano w temperaturze 99°C w ciągu 4 minut w urządzeniu do cyklicznego wygrzewania Perkin-Elmer i oziębiono do temperatury pokojowej przed użyciem. Mieszaniny reakcyjne do amplifikacji przygotowano na 96-ścio studzienkowej płytce przez zmieszanie 10 gl genomowego DNA, 10 gl startera z Tabeli I, i 30 gl mieszaniny z Tabeli V. Zastosowano wszystkie studzienki i wszystkie pokryto kropią /40 ul/ oleju mineralnego. Prowadzono wygrzewanie cykliczne w piecu do wygrzewania cyklicznego, jak opisano w Przykładzie 4. Temperaturę renaturacji zaprogramowano na 36°C.
Produkty reakcji amplifikacji analizowano na drodze elektroforezy w żelu agarozowym jak w Przykładzie 3. Figura 4 przedstawia fotografię barwionego żelu po elektroforezie. Linie
1-6 odpowiadają produktom amplifikacji DNA z bawełny, linie 7-12 - z drożdży, linie 13-18 z Arabidopsis, a linie 19-20 - z kukurydzy. Wyniki wykazują, że wszystkie próbki z powodzeniem uległy amplifikacji za pomocą badanych starterów. Jest to nieoczekiwane w świetle małych rozmiarów genomów drożdży, i arabidopsis w porównaniu z rozmiarami genomów bawełny, kukurydzy i soi.
Przykład 6. Startery o długości większej niż 7 nukleotydów sprzyjają amplifikacji
DNA
W tym Przykładzie porównywano sześć różnych starterów o długości od 6 do 10 nukleotydów' /Tabela VII/ pod kątem ich zdolności do pełnienia funkcji starterów w reakcji amplifikacji. Stosowano reagenty opisane w Przykładzie 2 przygotowane jak pokazano w Tabeli VI.
Tabe 1 a VI
Mieszanina genomowego DNA Objętość gl
Bonus PI 81762
Zdejonizowana woda 1240 1242
10 x Bufor 175 175
MgCl2, 200 mM 3,5 3,5
Mieszanina dATP, dCTP, dGTP, TTP, 1,25 mM każdego 140 140
Polimeraza Amplitaq, 5 jednostek/ gl 9 9
DNA z Bonus, 448 gg/ml 7,8 -
NA z PI 81762,670 gg/ml - 7,8
Tabela VII
Sekwencja startera Nazwa startera Stężenie roztworu podstawowego
5’-ATTGCGTCCA AP13 4 gM
5’TTGCGTCCA AP13a 4 gM
5’-TGCGTCCA AP13b 4 gM
5’-GCGTCCA AP13c 4 gM
5’-CGTCCA AP13d 4 gM
5’-CGCCCA AP13e 4 gM
Starter AP13 stanowił dowolną sekwencję zawierającą 50% zasad A+T jak w Przykładzie 1. Startery AP13a do AP13e zaprojektowano przez kolejne usuwanie nukleotydów z końca 5 . Starter AP13c posiadał dodatkową T podstawioną przez C w celu nadania mu trwałości. Każdy starter /2,5 μΐ/ zmieszano oddzielnie w probówkach do ultrawirowania o pojemności 0,6 ml jak w Przykładzie 2 z 22,5 μΐ każdej mieszaniny zawierającej matrycowy DNA pochodzący bądź z Bonus, bądź z PI 81762. Każdą mieszaninę pokryto warstwą 40 μΐ oleju mineralnego /Przykład 2/. Obróbkę cyklicznego wygrzewania prowadzono w urządzeniu do cyklicznego wygrzewania DNA - DNA Thermał Cycler /Perkin Elmer-Cetus, Norwalk, CT/ stosując 35 cykli o następujących parametrach: 94°Ć przez 1 minutę, 35°C przez 1 minutę, zmiana temperatury do 72°C w ciągu 2 minut, 72°C przez 2 minuty. Po zakończeniu reakcji amplifikacji według wynalazku, 12 μΐ każdej próbki analizowano przez elektroforezę na 1,4% żelu agarozowym jak opisano w Przykładzie 2.
Figura 5 przedstawia fotografię barwionego żelu po elektroforezie. Linia O stanowi wzorzec masy cząsteczkowej. Wyniki wskazują na to, że w wybranych warunkach amplifikacji startery o długości mniejszej niż 8 nukleotydów nie wywołują wykrywalnych poziomów amplifikacji.
Przykład 7. Amplifikacja ludzkiego DNA przy użyciu startera o długości 10 nukleotydów o dowolnej sekwencji /AP9/.
Tabela VIII
Mieszanina Objętość μΐ
Zdejonizowana woda 103,5
10 x Bufor 45,0
MgCl2, 50 mM 9,0
Mieszanina dATP, dCTP, dGTP, TTP, 2 mM każdego 45,0
Starter AP9, 10 μΜ /patrz Przykład 2/ 18,0
Polimeraza Amplitaą, 5 jednostek/ μΐ 4,5
* (Użyty tu 10 x Bufor składa się z 100 mM Tris-HCl, pH 8,3; 500 mMKCl; 15mM MgCh; 50 μΜ EDTA; 0,1% żelatyny.)
W każdej z siedmiu probówek reakcyjnych umieszczono 25 mikrolitrów mieszaniny /Tabela VIII/. Próbki genomowego DNA przygotowane z transformowanych limfoblastów pochodziły od sześciu anonimowych osób, oznaczono je Hu 1-6. Próbki genomowego DNA otrzymano od dr Johna Gilbert a i Allen a Roses a z Duke Medical Center, Durham, NC. Każdą próbkę genomowego DNA przygotowano przez dodanie do 25 μΐ H2O 10 ng DNA /2-3 μΐ/, ogrzewanie w kąpieli wrzącej wody w ciągu 1 minuty i umieszczenie na lodzie. Do każdej reakcji amplifikacji do mieszaniny reakcyjnej dodano 25 μΐ DNA. Przygotowano również ślepą próbę przez dodanie 25 μΐ H2O do probówki zawierającej mieszaninę reakcyjną. Reagenty pokryto kroplą oleju mineralnego. Prowadzono wygrzewanie cykliczne w urządzeniu DNA Thermal Cycler zgodnie z następującym programem: wstępna 4-minutowa inkubacja w temperaturze 93°C; 30 następujących cykli: 1 minuta w temperaturze 93°C; 30 sekund w temperaturze 35°C; zmiana temperatury do 72°C w ciągu 2 minut i 10 sekund, 2 minuty w temperaturze 72°C, po czym końcowa 5-minutowa inkubacja w temperaturze 72°C. Po przeniesieniu do świeżych probówek, do każdej probówki dodano 50 μΐ 5M octanu amonowego i 250 μΐ etanolu. Po dwóch godzinach inkubacji w temperaturze -20°C każdą próbkę DNA zebrano przez odwirowanie, wysuszono i rozpuszczono w 20 μΐ 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA.
Dwa mikrolitry każdej próbki poddano elektroforezie na 1,4% żelu agarozowym /8,3 cm x 6 cm/ w buforze TAE /40 mM octanu Tris, pH 7,8, 5 mM octanu sodowego; 1 mM ESTA/, przy napięciu 50V w ciągu 160 minut. Po zabarwieniu przy użyciu etydyny, żel sfotografowano oświetlając światłem ultrafioletowym. Wyniki przedstawione na figurze 6 wykazują, że próbki Hul i HU2 mają dodatkową ścieżkę odpowiadającą w przybliżeniu wartości 1,3 kb, która nie występuje w czterech innych próbkach. Tak więc, reakcja amplifikacji przy użyciu startera AP9
166 895 o długości 10 nukleotydów pozwoliła na wykrycie polimorfizmu genetycznego, który można stosować do rozróżniania próbek ludzkiego DNA.
Przykład 8. Ilościowe oznaczenie produktów PCR.
W Przykładzie 3 stosowano sposób według wynalazku do genetycznego mapowania polimorfizmu. Dokonano tego przez zbadanie dziedziczenia rodzicielskiego obrazu polimorfizmu u kilku osobników, u których następowała segregacja. Jak wykazano w Przykładzie 3, nie było możliwe rozróżnienie osobników heterozygotycznych wobec markera od homozygotycznych wobec tego samego markera, przy czym polimorfizm uznano za cechę dominującą. Osobnik heterozygotyczny zawiera dwie różne kopie /allele/ szczególnego segmentu DNA w danym miejscu /locus/ w genomie. Osobnik homozygotyczny będzie zawierał w tym miejscu dwa identyczne allele. Dla niektórych zastosowań /na przykład przy ilościowym mapowaniu cech/ konieczna jest możliwość odróżnienia osobników heterozygotycznych. Należy oczekiwać, że osobniki, które odziedziczyły dwie kopie pojedynczego allelu, wykażą w sposobie według wynalazku dwa razy więcej zamplifikowanego produktu, niż osobniki, które odziedziczyły jedną kopię tego samego allelu. W celu zbadania, czy heterozygoty można odróżnić od homozygot przez ilościowe określenie wyników testu, wybrano osobniki, o których było wiadomo, że są homozygotami Bonus, heterozygotami Bonus i PI 81762 lub homozygotami PI 81762 w odniesieniu do segmentów DNA w regionie chromosomalnym zawierającym polimorfizm ścieżki A. Osobniki te wybrano na podstawie genotypu flankujących markerów RFLP /patrz Przykład 3 i Tabela III/. Zele z Przykładu 3 analizowano densytometrycznie w celu określenia ilości zamplifikowanego produktu odpowiadającego ścieżce A /patrz objaśnienie do figury 7/. Figura 7A przedstawia wynik dla osobnika 30 /patrz Przykład 3/ homozygotycznego w odniesieniu do allelu PI 81762. Figura 7B przedstawia wynik dla osobnika 9 /patrz Przykład 3/ heterozygotycznego w odniesieniu do alleli Bonus i PI 81762. Figura 7C przedstawia wynik dla osobnika 57 /patrz Przykład 3/ homozygotycznego w odniesieniu do allelu Bonus. Zaznaczono pik odpowiadający polimorfizmowi ścieżki A. Wynik pomiaru densytometrycznego wykazuje, że osobniki homozygotyczne w odniesieniu do alleli PI 81762 zawierają dwa razy więcej DNA w polimorfizmie ścieżki A, niż osobniki heterozygotyczne, zawierające allele PI 81762 i Bonus. Osobniki homozygotyczne w odniesieniu do alleli Bonus nie zawierają DNA odpowiadającego ścieżce A. Ten przykład wykazuje, że produkty amplifikacji można oznaczać ilościowo w celu identyfikowania osobników heterozygotycznych i ujawnienia współdominującego polimorfizmu. Takie postępowanie znajdzie zastosowanie tam, gdzie konieczne jest odróżnienie heterozygot od odpowiadających homozygot.
Wyniki uwidocznione na fotografiach żelu na figurze 2 przetworzono w postać cyfrową przy użyciu aparatu fotograficznego Monochrome CCD /model 4815-5000, Cohn Inc., San Diego. CA /połączonego z komputerem Macintosh IIex /Apple Computer Corp., Cupertino, CA/. Dane analogowe przekształcono na cyfrowe przy użyciu karty QuickCapture /Data Translations Inc., Marlboro, MA/. Pojedyncze linie skanowano w,celach obliczeniowych przy użyciu programu Scan Analysis /wersja 2.11, Biosoft Inc., Miltown, N.J./. Wartości zaznaczone na osi X odpowiadają odległości elektroforetycznej, a zaznaczone na osi Y odpowiadają wielkości piku.

Claims (19)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sposób rozróżniania kwasów nukleinowych na podstawie różnic nukleotydowych w losowych segmentach kwasów nukleinowych, znamienny tym, że obejmuje:
    /a/ oddzielne przeprowadzenie reakcji przedłużenia na każdym z co najmniej dwóch kwasów nukleinowych, która to reakcja polega na:
    /i/ kontaktowaniu kwasów nukleinowych z co najmniej jednym starterem oligonukleotydowym o długości większej niż 7 nukleotydów w takich warunkach, że zachodzi synteza produktu przedłużenia co najmniej jednego startera dla co najmniej jednego kwasu nukleinowego i /b/ porównanie wyników oddzielnie przeprowadzonych reakcji przedłużenia pod kątem różnic.
  2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że obejmuje po etapie /i/, a przed etapem /b/ dodatkowe etapy /ii/ oddzielenia produktu przedłużenia od jego nici komplementarnej oraz /iii/ amplifikowanie losowego segmentu kwasu nukleinowego na drodze kontaktowania oddzielonego produktu przedłużenia ze starterem z etapu /i/ w takich warunkach, że następuje amplifikacja produktu przedłużenia przy użyciu jako matrycy oddzielonego produktu przedłużenia.
  3. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że etapy prowadzi się co najmniej dwukrotnie.
  4. 4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako substraty stosuje się polimerazę kwasu nukleinowego i trójfosforany nukleotydowe lub ich analogi i mieszaniny.
  5. 5. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że stosuje się jeden starter.
  6. 6. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że stosuje się starter o długości od 9 do 10 nukleotydów.
  7. 7. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że co najmniej jeden starter jest biotynylowany.
  8. 8. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że kwasy nukleinowe pochodzą od różnych osobników.
  9. 9. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że jako polimerazę kwasu nukleinowego stosuje się polimerazę DNA ajako substraty trójfosforanowonukleotydowe stosuje się trój fosforany dezoksyrybonukleotydowe.
  10. 10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że jako polimerazę DNA stosuje się termostabilną polimerazę.
  11. 11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że jako polimerazę DNA stosuje się polimerazę Taq.
  12. 12. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że porównania dokonuje się przez frakcjonowanie pod względem wielkości.
  13. 13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że porównania dokonuje się na drodze elektroforezy w żelu poliakryloamidowym lub w żelu agarozowym.
  14. 14. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że porównania dokonuje się przez analizę polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych.
  15. 15. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że porównania dokonuje się przez określenie sekwencji nukleotydowej.
  16. 16. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że źródło kwasu nukleinowego wybrane jest z grupy obejmującej rośliny, zwierzęta i drobnoustroje.
  17. 17. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że źródłem kwasu nukleinowego jest człowiek.
  18. 18. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że różnicę w produkcie przedłużenia stosuje się jako marker do konstruowania mapy genetycznej.
    166 895
  19. 19. Sposób wedhig zastrz . 1 albo 1, znamienny tym, że różnicę w produkcie przedłużenia stosuje się jaka macknc da caecdżniania lub identyfikowania osobników.
PL91293188A 1990-03-14 1991-02-12 Sposób rozrózniania kwasów nukleinowych na podstawie róznic nukleotydowych PL PL PL PL166895B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/494,258 US5126239A (en) 1990-03-14 1990-03-14 Process for detecting polymorphisms on the basis of nucleotide differences
PCT/US1991/000841 WO1991014001A2 (en) 1990-03-14 1991-02-12 A process for distinguishing nucleic acids on the basis of nucleotide differences

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL293188A1 PL293188A1 (en) 1992-11-02
PL166895B1 true PL166895B1 (pl) 1995-06-30

Family

ID=23963743

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL91293188A PL166895B1 (pl) 1990-03-14 1991-02-12 Sposób rozrózniania kwasów nukleinowych na podstawie róznic nukleotydowych PL PL PL

Country Status (17)

Country Link
US (1) US5126239A (pl)
EP (1) EP0520039B1 (pl)
JP (1) JP2818486B2 (pl)
AT (1) ATE115634T1 (pl)
AU (1) AU639565B2 (pl)
BR (1) BR9106151A (pl)
CA (1) CA2078132C (pl)
DE (1) DE69105959T2 (pl)
DK (1) DK0520039T3 (pl)
ES (1) ES2065684T3 (pl)
FI (1) FI924049A (pl)
IL (1) IL97503A (pl)
NO (1) NO304655B1 (pl)
NZ (1) NZ237396A (pl)
PL (1) PL166895B1 (pl)
WO (1) WO1991014001A2 (pl)
ZA (1) ZA911891B (pl)

Families Citing this family (101)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5595870A (en) * 1989-02-17 1997-01-21 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Identifying nucleic acids by restriction digestion and hybridization with random or pseudorandom oligonucleotides
US5547839A (en) * 1989-06-07 1996-08-20 Affymax Technologies N.V. Sequencing of surface immobilized polymers utilizing microflourescence detection
US6074818A (en) * 1990-08-24 2000-06-13 The University Of Tennessee Research Corporation Fingerprinting of nucleic acids, products and methods
DE69128545D1 (de) * 1990-08-24 1998-02-05 Univ Tennessee Res Corp Technik des genetischen fingerabdrucks mit dns-vervielfältigung
WO1992004458A1 (en) * 1990-09-11 1992-03-19 The Brookdale Hospital Medical Center Drug resistance screening method
WO1992007095A1 (en) * 1990-10-15 1992-04-30 Stratagene Arbitrarily primed polymerase chain reaction method for fingerprinting genomes
US5635354A (en) * 1991-01-09 1997-06-03 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Method for describing the repertoires of antibodies (Ab) and of T-cell receptors (TcR) of an individual's immune system
US5401630A (en) * 1991-05-03 1995-03-28 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Species-specific DNA-DNA hybridization probe prepared using chromosome size DNA
EP0543484B1 (en) * 1991-08-30 2001-01-31 Research Development Corporation of Japan A method of DNA amplification
US20100267023A1 (en) 1992-09-24 2010-10-21 Keygene N.V. Selective restriction fragment amplification: fingerprinting
US7026115B1 (en) 1991-09-24 2006-04-11 Keygene N.V. Selective restriction fragment amplification: fingerprinting
HU223760B1 (hu) * 1991-09-24 2005-01-28 Keygene N.V. Szelektív restrikciós fragmentumsokszorosítás, általános módszer DNS-fingerprint analízisére
US5665544A (en) * 1992-05-27 1997-09-09 Amersham International Plc RNA fingerprinting to determine RNA population differences
US5340728A (en) * 1992-12-09 1994-08-23 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for amplification of targeted segments of nucleic acid using nested polymerase chain reaction
US5962221A (en) * 1993-01-19 1999-10-05 Univ Tennessee Res Corp Oligonucleotide constructs and methods for the generation of sequence signatures from nucleic acids
WO1994024307A1 (en) * 1993-04-16 1994-10-27 Forbio Pty. Ltd. Method of random amplification of polymorphic dna
WO1995019697A1 (en) * 1994-01-21 1995-07-27 North Carolina State University Methods for within family selection in woody perennials using genetic markers
WO1995021269A1 (en) * 1994-02-04 1995-08-10 Perlin Mark K Method and apparatus for analyzing genetic material
US6037127A (en) * 1994-03-31 2000-03-14 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for detection of non-denatured nucleic acid fragments
US5831065A (en) * 1994-04-04 1998-11-03 Lynx Therapeutics, Inc. Kits for DNA sequencing by stepwise ligation and cleavage
US5714330A (en) * 1994-04-04 1998-02-03 Lynx Therapeutics, Inc. DNA sequencing by stepwise ligation and cleavage
US5552278A (en) * 1994-04-04 1996-09-03 Spectragen, Inc. DNA sequencing by stepwise ligation and cleavage
US5547861A (en) 1994-04-18 1996-08-20 Becton, Dickinson And Company Detection of nucleic acid amplification
US5585238A (en) * 1994-04-25 1996-12-17 Ciba-Geigy Corporation Detection of fungal pathogens using the polymerase chain reaction
US5660981A (en) * 1994-06-06 1997-08-26 E. I. Du Pont De Nemours And Company Selection of diagnostic genetic markers in microorganisms and use of a specific marker for detection of salmonella
US6013445A (en) * 1996-06-06 2000-01-11 Lynx Therapeutics, Inc. Massively parallel signature sequencing by ligation of encoded adaptors
USRE43097E1 (en) 1994-10-13 2012-01-10 Illumina, Inc. Massively parallel signature sequencing by ligation of encoded adaptors
WO1996017082A2 (en) * 1994-11-28 1996-06-06 E.I. Du Pont De Nemours And Company Compound microsatellite primers for the detection of genetic polymorphisms
ES2097701B1 (es) * 1995-02-09 1997-11-16 Consejo Superior Investigacion Procedimiento para obtener sondas especificas de estirpe o de especie.
JPH09149799A (ja) * 1995-11-30 1997-06-10 Hitachi Ltd 核酸の分析方法又は検査方法、及び核酸の分析装置又は検査装置
US5670325A (en) * 1996-08-14 1997-09-23 Exact Laboratories, Inc. Method for the detection of clonal populations of transformed cells in a genomically heterogeneous cellular sample
US5741650A (en) * 1996-01-30 1998-04-21 Exact Laboratories, Inc. Methods for detecting colon cancer from stool samples
US5747257A (en) * 1996-02-29 1998-05-05 E. I. Du Pont De Nemours And Company Genetic markers and methods for the detection of escherichia coli serotype-0157:H7
JP4034351B2 (ja) 1996-04-25 2008-01-16 バイオアレイ ソリューションズ エルエルシー 粒子近接表面の光制御した動電学的アッセンブリ
US5811239A (en) * 1996-05-13 1998-09-22 Frayne Consultants Method for single base-pair DNA sequence variation detection
US6203993B1 (en) 1996-08-14 2001-03-20 Exact Science Corp. Methods for the detection of nucleic acids
US5928870A (en) * 1997-06-16 1999-07-27 Exact Laboratories, Inc. Methods for the detection of loss of heterozygosity
US6300077B1 (en) 1996-08-14 2001-10-09 Exact Sciences Corporation Methods for the detection of nucleic acids
US6020137A (en) * 1996-08-14 2000-02-01 Exact Laboratories, Inc. Methods for the detection of loss of heterozygosity
US6100029A (en) * 1996-08-14 2000-08-08 Exact Laboratories, Inc. Methods for the detection of chromosomal aberrations
US6146828A (en) * 1996-08-14 2000-11-14 Exact Laboratories, Inc. Methods for detecting differences in RNA expression levels and uses therefor
US5952178A (en) 1996-08-14 1999-09-14 Exact Laboratories Methods for disease diagnosis from stool samples
US5814453A (en) * 1996-10-15 1998-09-29 Novartis Finance Corporation Detection of fungal pathogens using the polymerase chain reaction
US5800997A (en) * 1996-11-01 1998-09-01 Novartis Finance Corporation Detection of maize fungal pathogens using the polymerase chain reaction
US5922538A (en) * 1996-11-08 1999-07-13 E.I. Du Pont De Nemours And Company Genetic markers and methods for the detection of Listeria monocytogenes and Listeria spp
US6268136B1 (en) 1997-06-16 2001-07-31 Exact Science Corporation Methods for stool sample preparation
US6406857B1 (en) 1997-06-16 2002-06-18 Exact Sciences Corporation Methods for stool sample preparation
US5827695A (en) * 1997-08-04 1998-10-27 Novartis Finance Corporation Detection of wheat fungal pathogens using the polymerase chain reaction
US6173525B1 (en) 1997-09-19 2001-01-16 Cantharellus Ab Chanterelle mycelium
US20020064792A1 (en) * 1997-11-13 2002-05-30 Lincoln Stephen E. Database for storage and analysis of full-length sequences
JP2002501760A (ja) * 1998-02-02 2002-01-22 アマーシャム・ファルマシア・バイオテック・アクチボラグ 核酸解析方法
US7078224B1 (en) 1999-05-14 2006-07-18 Promega Corporation Cell concentration and lysate clearance using paramagnetic particles
US8337753B2 (en) 1998-05-01 2012-12-25 Gen-Probe Incorporated Temperature-controlled incubator having a receptacle mixing mechanism
DK1623764T3 (da) 1998-05-01 2009-05-25 Gen Probe Inc Automatiseret fremgangsmåde til isolation og amplifikation af en målnucleinsyresekvens
WO2000017399A2 (en) 1998-09-18 2000-03-30 The Board Of Regents Of The University Of Nebraska High resolution genome scanning
US6703228B1 (en) 1998-09-25 2004-03-09 Massachusetts Institute Of Technology Methods and products related to genotyping and DNA analysis
EP1001037A3 (en) * 1998-09-28 2003-10-01 Whitehead Institute For Biomedical Research Pre-selection and isolation of single nucleotide polymorphisms
WO2000034484A1 (en) * 1998-12-08 2000-06-15 Children's Hospital And Regional Medical Center Polymorphic loci that differentiate escherichia coli 0157:h7 from other strains
US6280947B1 (en) 1999-08-11 2001-08-28 Exact Sciences Corporation Methods for detecting nucleotide insertion or deletion using primer extension
US6503718B2 (en) 1999-01-10 2003-01-07 Exact Sciences Corporation Methods for detecting mutations using primer extension for detecting disease
US6551777B1 (en) 1999-02-25 2003-04-22 Exact Sciences Corporation Methods for preserving DNA integrity
FR2792000B1 (fr) * 1999-04-08 2003-04-11 Centre Nat Rech Scient Procede de cartographie d'une molecule d'adn comprenant une etape d'amplification ad infinitum
US6964846B1 (en) * 1999-04-09 2005-11-15 Exact Sciences Corporation Methods for detecting nucleic acids indicative of cancer
US6586177B1 (en) * 1999-09-08 2003-07-01 Exact Sciences Corporation Methods for disease detection
US6849403B1 (en) 1999-09-08 2005-02-01 Exact Sciences Corporation Apparatus and method for drug screening
US6919174B1 (en) * 1999-12-07 2005-07-19 Exact Sciences Corporation Methods for disease detection
US7368233B2 (en) * 1999-12-07 2008-05-06 Exact Sciences Corporation Methods of screening for lung neoplasm based on stool samples containing a nucleic acid marker indicative of a neoplasm
US6242191B1 (en) * 1999-12-30 2001-06-05 The Ohio State University Research Foundation Methods for assessing the beef characteristics of live cattle
WO2001073119A2 (en) 2000-03-29 2001-10-04 Cambia Methods for genotyping by hybridization analysis
US9709559B2 (en) 2000-06-21 2017-07-18 Bioarray Solutions, Ltd. Multianalyte molecular analysis using application-specific random particle arrays
WO2001098765A1 (en) 2000-06-21 2001-12-27 Bioarray Solutions, Ltd. Multianalyte molecular analysis
US7695901B2 (en) * 2000-07-26 2010-04-13 North Carolina State University Identification of poinsettia cultivars
EP1207209A3 (en) * 2000-11-09 2002-09-11 Agilent Technologies, Inc. (a Delaware corporation) Methods using arrays for detection of single nucleotide polymorphisms
US6428964B1 (en) 2001-03-15 2002-08-06 Exact Sciences Corporation Method for alteration detection
US7262063B2 (en) 2001-06-21 2007-08-28 Bio Array Solutions, Ltd. Directed assembly of functional heterostructures
WO2003034029A2 (en) 2001-10-15 2003-04-24 Bioarray Solutions, Ltd. Multiplexed analysis of polymorphic loci by concurrent interrogation and enzyme-mediated detection
CA2468579A1 (en) * 2001-12-10 2003-06-19 Iowa State University Research Foundation, Inc. Nucleic acids related to plant retroelements
US7776524B2 (en) * 2002-02-15 2010-08-17 Genzyme Corporation Methods for analysis of molecular events
US7157228B2 (en) * 2002-09-09 2007-01-02 Bioarray Solutions Ltd. Genetic analysis and authentication
US7526114B2 (en) 2002-11-15 2009-04-28 Bioarray Solutions Ltd. Analysis, secure access to, and transmission of array images
US20060068036A1 (en) 2002-12-31 2006-03-30 National Yang-Ming University Extract of Dioscorea sp. and the medical uses thereof
US20040259101A1 (en) * 2003-06-20 2004-12-23 Shuber Anthony P. Methods for disease screening
WO2005029705A2 (en) 2003-09-18 2005-03-31 Bioarray Solutions, Ltd. Number coding for identification of subtypes of coded types of solid phase carriers
EP1664722B1 (en) 2003-09-22 2011-11-02 Bioarray Solutions Ltd Surface immobilized polyelectrolyte with multiple functional groups capable of covalently bonding to biomolecules
NZ547492A (en) 2003-10-28 2009-12-24 Bioarray Solutions Ltd Optimization of gene expression analysis using immobilized capture probes of different lengths and densities
PT1694859E (pt) 2003-10-29 2015-04-13 Bioarray Solutions Ltd Análise de ácidos nucleicos multiplexada através de fragmentação de adn de cadeia dupla
US20080241827A1 (en) * 2004-05-10 2008-10-02 Exact Sciences Corporation Methods For Detecting A Mutant Nucleic Acid
US20080124714A1 (en) * 2004-05-14 2008-05-29 Exact Sciences Corporation Method for Stabilizing Biological Samples for Nucleic Acid Analysis
US7848889B2 (en) 2004-08-02 2010-12-07 Bioarray Solutions, Ltd. Automated analysis of multiplexed probe-target interaction patterns: pattern matching and allele identification
EP1623996A1 (en) * 2004-08-06 2006-02-08 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Improved method of selecting a desired protein from a library
US7981607B2 (en) * 2004-08-27 2011-07-19 Esoterix Genetic Laboratories LLC Method for detecting recombinant event
WO2006047787A2 (en) 2004-10-27 2006-05-04 Exact Sciences Corporation Method for monitoring disease progression or recurrence
US9777314B2 (en) * 2005-04-21 2017-10-03 Esoterix Genetic Laboratories, Llc Analysis of heterogeneous nucleic acid samples
US8486629B2 (en) 2005-06-01 2013-07-16 Bioarray Solutions, Ltd. Creation of functionalized microparticle libraries by oligonucleotide ligation or elongation
US20070015191A1 (en) * 2005-07-01 2007-01-18 Promega Corporation Network of buoyant particles for biomolecule purification and use of buoyant particles or network of buoyant particles for biomolecule purification
EP1963526A4 (en) * 2005-12-09 2009-11-18 Promega Corp PURIFICATION OF NUCLEIC ACID WITH A BINDING MATRIX
WO2007105041A2 (en) * 2006-03-10 2007-09-20 Council Of Scientific And Industrial Research A method for the screening of bacterial isolates
US8481267B2 (en) 2009-08-21 2013-07-09 E. I. Du Pont De Nemours And Company Genetic fingerprinting and identification method
US8039613B2 (en) 2009-08-28 2011-10-18 Promega Corporation Methods of purifying a nucleic acid and formulation and kit for use in performing such methods
US8222397B2 (en) * 2009-08-28 2012-07-17 Promega Corporation Methods of optimal purification of nucleic acids and kit for use in performing such methods
BR112014001792A2 (pt) 2011-07-25 2017-02-21 Du Pont método para a identificação da espécie, sorotipo e linhagem de um micro-organismo, polinucleotídeo isolado e kit

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683202A (en) * 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) * 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4851331A (en) * 1986-05-16 1989-07-25 Allied Corporation Method and kit for polynucleotide assay including primer-dependant DNA polymerase
JP2634208B2 (ja) * 1987-11-13 1997-07-23 パイオニア・ハイ―ブレツド・インターナシヨナル・インコーポレイテツド 制限断片長多型性分析方法及びその装置
WO1990001065A1 (en) * 1988-07-26 1990-02-08 Genelabs Incorporated Rna and dna amplification techniques
US4879214A (en) * 1988-11-15 1989-11-07 E. I. Du Pont De Nemours And Company Differentiation of nucleic acid segments on the basis of nucleotide differences
JP3021036B2 (ja) * 1989-02-13 2000-03-15 ジェネコ・ピーティーワイ・リミテッド 核酸配列又はその中の変化の検出
US5043272A (en) * 1989-04-27 1991-08-27 Life Technologies, Incorporated Amplification of nucleic acid sequences using oligonucleotides of random sequence as primers

Also Published As

Publication number Publication date
DK0520039T3 (da) 1995-02-20
ATE115634T1 (de) 1994-12-15
NZ237396A (en) 1993-08-26
NO923544D0 (no) 1992-09-11
CA2078132C (en) 1999-08-31
WO1991014001A3 (en) 1991-10-31
AU7782091A (en) 1991-10-10
US5126239A (en) 1992-06-30
CA2078132A1 (en) 1991-09-15
PL293188A1 (en) 1992-11-02
DE69105959T2 (de) 1995-05-18
FI924049A0 (fi) 1992-09-10
NO923544L (no) 1992-09-11
IL97503A0 (en) 1992-06-21
AU639565B2 (en) 1993-07-29
JPH05505528A (ja) 1993-08-19
FI924049A (fi) 1992-09-10
ES2065684T3 (es) 1995-02-16
ZA911891B (en) 1992-11-25
DE69105959D1 (de) 1995-01-26
IL97503A (en) 1995-05-26
WO1991014001A2 (en) 1991-09-19
EP0520039A1 (en) 1992-12-30
NO304655B1 (no) 1999-01-25
BR9106151A (pt) 1993-03-09
JP2818486B2 (ja) 1998-10-30
EP0520039B1 (en) 1994-12-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL166895B1 (pl) Sposób rozrózniania kwasów nukleinowych na podstawie róznic nukleotydowych PL PL PL
US5861245A (en) Arbitrarily primed polymerase chain reaction method for fingerprinting genomes
US5437975A (en) Consensus sequence primed polymerase chain reaction method for fingerprinting genomes
US5766847A (en) Process for analyzing length polymorphisms in DNA regions
US5674686A (en) Allelic ladders for short tandem repeat loci
EP0726905B1 (en) Single nucleotide polymorphisms and their use in genetic analysis
EP0238329B1 (en) Improvements in genetic probes
US8999644B2 (en) Method for detecting the presence of a DNA minor contributor in a DNA mixture
KR20070011354A (ko) 취약 ｘ염색체 증후군과 같은 ｓｔｒｐ의 검출 방법
NO174825B (no) Fremgangsmåte ved påvisning av nukleotidsekvenser, nukleotidsekvens for bruk i denne og diagnostisk sett
EP0812211A1 (en) Cleaved amplified rflp detection methods
CA2366374C (en) Method for the detection and/or analysis, by means of primer extension techniques, of single nucleotide polymorphisms in restriction fragments, in particular in amplified restriction fragments generated using aflp
EP1021559B1 (en) Method and kit for amplification, sequencing and typing of classical hla class i genes
KR102265417B1 (ko) 단일염기다형성 다중 분석용 프라이머
AU2008301233A1 (en) Method of amplifying nucleic acid
JP2007330260A (ja) イヌ科動物の遺伝子型決定のためのマイクロサテライト配列
JPH08297A (ja) バクテリアを検出するためのオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブ
US20050244830A1 (en) Quantitative multiplex amplification on a genomic scale, and applications for detecting genomic rearrangements
US6383747B1 (en) Method for determining ancestral haplotypes using haplospecific geometric elements within the major histocompatibility complex multigene cluster
US20030022163A1 (en) Detection of repeated nucleic acid sequences
CA2009870A1 (en) Metod for determining the origin of a human dna-containing sample
EP1066413A1 (en) Polymorphism iii : linkage of atopy to a locus on chromosome 13

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20100212