PL166721B1

PL166721B1 - Sposób wytwarzania kwasu glioksylowego PL

Info

Publication number: PL166721B1
Application number: PL90287345A
Authority: PL
Inventors: David L Anton; Cosimo Robert Di; Lawerence W Gosser
Original assignee: Du Pont
Priority date: 1989-10-16
Filing date: 1990-10-16
Publication date: 1995-06-30
Also published as: IE903677A1; AR246308A1; IE65417B1; CA2067382C; AU6611590A; NZ235697A; HUT64598A; NO921439D0; EP0496799A1; ZA908258B; DE69003247T2; JPH05501800A; HU9201286D0; CN1052143A; FI921558A0; NO921439L; DE69003247D1; ATE94210T1; BR9007752A; CA2067382A1

Abstract

1. Sposób wytwarzania kwasu glioksylowego, zgodnie z którym stanowiacy mieszanine reakcyjna wodny roztwór kwasu glikolowego, oksydazy glikolanowej i katalazy oraz ewen- tualnie aminy wybranej sposród etylenodwuaminy, tris(hydroksymetylo)metyloaminy i ich mieszaniny i/lub mononukleotydu flawinowego kontaktuje sie przy pH 7-10 z tlenem, znamienny tym, ze stosuje sie wodny roztwór o poczatkowym stezeniu kwasu glikolowego 200-2500 mM. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania kwasu glioksylowego, zgodnie z którym stanowiący mieszaninę reakcyjną wodny roztwór kwasu glikolowego, oksydazy glikolanowej i katalazy oraz ewentualnie aminy wybranej spośród etylenodwuaminy, tris/hydroksy-metylo/metyloaminy i ich mieszaniny i/lub mononukleotydu flawinowego kontaktuje się przy pH 7-10 z tlenem.

Katalizowane enzymatycznie reakcje kwasu glikolowego i tlenu są od dawna znane, jednak opisane dotychczas sposoby wytwarzania nie zostały zastosowane przemysłowo z kilku powodów. Najważniejszym z nich jest to, że wcześniejsze reakcje były prowadzone przy stosowaniu wysokich rozcieńczeń kwasu glikolowego, na ogół 40 nM lub mniej. Selektywność reakcji i wydajność wytwarzania kwasu glioksylowego były przeważnie niskie. Dodatkową niedogodnościąprzy stosowaniu bardzo niskich wyjściowych stężeń kwasu glikolowego była konieczność stosowania dużych i drogich naczyń reakcyjnych w celu osiągnięcia dużej wydajności. Odkąd kwas glioksylowy sprzedaje się jako 50% roztwór wodny /Ullmans/, zatężanie rozcieńczonego kwasu glioksylowego wyprodukowanego z rozcieńczonych substratów jest kosztowne. Ponadto, jeżeli takie zatężenie prowadzi się przez odparowywanie lub osmozę odwróconą, wszystkie nielotne półprodukty, takie jak kwasy szczawiowy i mrówkowy i/lub ich sole oraz nieprzereagowany kwas glikolowy zostają w roztworze jako zanieczyszczenia.

Obecny wynalazek daje praktyczny, przemysłowy sposób wytwarzania kwasu glioksylowego, na drodze katalizowanej przez oksydazę glikolanową reakcji utleniania kwasu glikolowego, przez zwiększenie wyjściowego stężenia substratów i przez zastosowanie wybranych ilości dodatków zwiększających wydajność reakcji.

166 721

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania kwasu glioksylowego na drodze utleniania kwasu glikolowego, przy zastosowaniu enzymu, oksydazy glikolanowej, jako katalizatora reakcji.

N.E.Talbert i wsp. J.Biol.Chem. Vol. 181, 905-914 /1949/ ujawnili, że enzym wyekstrahowany z liści tytoniu katalizuje utlenianie kwasu glikolowego do kwasu mrówkowego i CO2, a produktem przejściowym tej reakcji jest kwas glioksylowy. Następnie stwierdzono, że niektóre związki, takie jak etylenodwuamina, blokują utlenianie kwasu glioksylowego do produktów końcowych. Utlenianie prowadzono przy pH około 8, stosując stężenia kwasu glikolowego wynoszące około 3-40 mM /milimolarne/, z wyjątkiem jednego bardzo pobieżnie opisanego /str. 907/ doświadczenia, gdzie stosowano wyjściowe stężenie kwasu glikolowego wynoszącego 132 - 196 mM. Jedynymi podanymi szczegółami dotyczącymi tego doświadczenia, były przybliżone stężenie kwasu glikolowego i fakt, że utlenianie nie było polepszone i że wyizolowano pewną ilość 2,4-dwunitrofenylohydrazonu kwasu glioksylowego. Nie podano żadnych szczegółów dotyczących wydajności i czasu trwania reakcji. Stwierdzono, że optymalnie pH dla utleniania glikolanu wynosi 8,9 i że kwas szczawiowy /100 mM/ hamuje katalityczne działanie oksydazy glikolanowej.

I. Zelitch i S.Ochos, J.Biol. Chem. Vol.201, 707-718 /1953/ ujawnili, że wytworzone w katalizowanej przez oksydazę glikolanową reakcji utleniania kwasu glikolowego kwas mrówkowy i CO2 pochodzą z nieenzymatycznej reakcji H2O2 z kwasem glioksylowym, które są pierwotnymi produktami katalizowanego enzymatycznie utleniania kwasu glikolowego. Zaobserwowali oni także, że dodanie katalazy, enzymu, który rozkłada H2O2, zwiększyło wydajność wytworzonego kwasu glioksylowego, przez hamowanie wytwarzania kwasu mrówkowego i CO2. Stosowaną oksydazę glikolanową wyizolowano z liści szpinaku. Początkowe stężenie kwasu glikolowego wynosiło 10 mM, a pH około 8. Stwierdzili oni także, że dodatek mononukleotydu {lawinowego /FMN/ znacznie zwiększa wydajność oksydazy glikolanowej.

J. C.Robinson i wsp. J.Biol. Chem., Vol.237, 2002-2009 /1962/ także stwierdzili, że katalaza zwiększa wydajność kwasu glikoksylowego wytworzonego z kwasu glikolowego. Stosowali oni katalazę i oksydazę glikolanową w stosunku 80:1 i także stwierdzili, że katalaza rozkłada nadtlenek wodoru wytwarzany w katabzowanej przez oksydazę glikolanową reakcji kwasu glikolowego z tlenem /w ich pracy oksydaza glikolanowa jest nazywana oksydazą krótkołańcuchowych L-a-hydroksykwasów/. Stwierdzili, że FMN jest użyteczny dla zachowania aktywności oksydazy glikolanowej, a także określili, że maksymalna wydajność reakcji utleniania kwasu glikolowego, katalizowanej przez oksydazę glikolanową, ma miejsce przy stężeniu kwasu glikolowego /substrat/ równym 3,3 mM, i że Reakcja ta jest hamowana przez:.../a/ wysokie stężenie tych substratów, glikolanu i....

K. E. Richardson i N.E.Tolbert, J.Biol.Chem, Vol 236, 1280-1284 /1961/ wykazali, że bufory zawierające tris/hydroksymetylo/metyloaminę hamują wytwarzanie kwasu szczawiowego w reakcji utleniania kwasu glikolowego, katabzowanej przez oksydazę glikolanową. Oni także prowadzili reakcję przy pH około 8 i stwierdzili, że dodanie FMN zwiększa wydajność oksydazy glikolanowej. Maksymalne stosowane przez nich stężenie kwasu glikolowego wynosiło 20 mM.

C.O. Clagett, N.E.Tolbert i R.H.Burris, J.Biol. Chem., Vol 178, 977-987 /1949/ odkryli, że optymalne pH do prowadzenia reakcji utleniania kwasu glikolowego katalizowanej przez oksydazę glikolanową wynosi 7,8-8,6, optymalna temperatura 35 - 40°C, a maksymalne stężenie substratu /kwas glikolowy/ wynosi 20 mM.

Istnieje bogata literatura dotycząca reakcji utleniania kwasu glikolowego katalizowanej przez oksydazę glikolanową, np. izolowanie enzymu /zwykle obejmujące także metody oznaczania/, opisano w I. Zelitch, Methods of Enzymology, Vol.1 Academic Press, New York, 1955, str. 528-532/z liści szpinaku i tytoniu/, M.Nishimura i wsp., Arch.Biochem.Biophys., Vol 222, 397-402/ /z liścieni dyni/, H.Asker i D.Dawies, Biochem. Biophys, Acta, Vol. 761, 103-108 /1983/ /z wątroby szczura/ i M.J.Emes i K.H.Erismann, Int.J.Biochem., Vol. 16, 1373-1378 /1984/ /z rzęsy wodnej, Lemna minor L./, a strukturę enzymu opisano w E.Cederlund i wsp., Eur.J.Biochem., Vol. 173, 523-530 /1988/, Y.Lindquist i C.Branden, J.Biol. Chem., Vol. 263, 3624-3628/1989/.

166 721

We wszystkich cytowanych powyżej pozycjach literatury i wszystkich innych /z jednym wyjątkiem, wspomnianą powyżej pracą N.E.Tolbert i wsp., J.Biol.Chem.,Vol.l81, 905-914 /1949/ maksymalne, stosowane wyjściowe stężenie kwasu glikolowego wynosiło około 40 mM, a pH przeważnie wynosiło 8 - i), czasami dodawano FMN, aminy lub katalazy, wspomniano także o innych dodatkach zwiększających ilość wytworzonego kwasu glioksylowego.

Zaproponowano także kilka chemicznych /nieenzymatycznych/ sposobów przemysłowego wytwarzania kwasu glioksylowego, na przykład w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr nr 3 281460,4 146731,4 235 684, a także w Ullmanns Encyclopedie der technischen Chemie, wyd. czwarte Vol. 12 Verlag Chemie, Weinheim, 1976, str. 381 /dalej Ullmanns/. Niektóre z tych sposobów powodują wytworzenie szkodliwych dla środowiska zanieczyszczeń. Żaden z opisanych sposobów nie obejmuje utleniania kwasu glikolowego do kwasu glioksylowego.

Pomimo, że kwas glikolowy jest przedmiotem handlu, nikomu nie udało się dotychczas zastosować reakcji utleniania kwasu glikolowego, katalizowanej przez oksydazę glikolanową, do wytwarzania kwasu glioksylowego na skalę przemysłową. Spowodowane to jest prawdopodobnie słabą znajomością reakcji enzymatycznych, brakiem świadomości biochemików, że taki sposób byłby potrzebny, stosunkowo niską wydajnością produktu wytwarzanego znanymi sposobami w skali laboratoryjnej i niskim stopniem przemiany opisywanym w większości pozycji literaturowych. Istotne znaczenie ma tu także ugruntowane przekonanie, iż zwiększanie stężenia substratów prowadzi do wystąpienia zjawiska hamowania substratowego, to jest obniżenia wydajności procesu na skutek hamującego enzymy działania wysokiego stężenia substratów. Z kolei stosowanie niskich stężeń kwasu glikolowego jest nieekonomiczne z wyżej omówionych powodów, m.in. w związku z koniecznością zatężenia roztworu produktu.

Nieoczekiwanie okazało się, że wbrew dotychczasowemu stanowi wiedzy istnieje możliwość wydajnego wytwarzania kwasu glioksylowego drogą utleniania kwasu glikolowego w obecności enzymów, przy czym sposób według wynalazku nadaje się do zastosowania w skali przemysłowej. Tak więc zgodnie ze sposobem według wynalazku stanowiący mieszaninę reakcyjną wodny roztwór kwasu glikolowego, oksydazy glikolanowej i katalazy oraz ewentualnie aminy wybranej spośród etylenodwuaminy, triis/^^^<^r^c^^^s^r^^ty^lc^/ metyloaminy i ich mieszany i/lub mononukleotydu flawinowego kontaktuje się przy pH 7-10 z tlenem, a cechą tego sposobu jest to, że stosuje się wodny roztwór o początkowym stężeniu kwasu glikolowego 200-2500 mM. Powyższe stężenie kwasu glikolowego w mM /czyli mmolach/litr/ odnosi się do całkowitej objętości wodnego roztworu stanowiącego mieszaninę reakcyjną, to jest do wody i wszystkich pozostałych składników roztworu.

Sposób według wynalazku zapewnia dużą wydajność wytwarzania kwasu glioksylowego i wysoki stopień przetwarzania co czyni możliwym zastosowanie stosunkowo drogich enzymów w sposób ekonomiczny. Wydajność zwiększa się przez dodanie katalazy i innych dodatków pojedynczo lub łącznie. Biorąc pod uwagę doniesienie o hamowaniu substratowym i/lub możliwym hamowaniu produktowym oksydazy glikolanowej i ewentualnie hamowaniu produktowym katalazy /patrz M.Dixon i wsp., Enzymes, 3 rd Ed., Academic Press, New York, 1978, str. 96-97, 126-127, T.Godfray i J.Reichelt, Industrial Enzymology, The Nature Press, New York, 1983, p. 847/, wysoka wydajność reakcji jest zupełnie niespodziewana. Rzeczywiście stwierdzono, że przy wyjściowym stężeniu kwasu glikolowego powyżej 2500 mM reakcja katalizowana przez oksydazę glikolanową przebiega stosunkowo wolno. To spowolnienie tempa reakcji staje się zauważalne przy stężeniu wyjściowym wynoszącym 1500 mM i stopniowo pogłębia się wraz ze wzrostem stężenia substratu. To spowolnienie występuje jednak przy tak wysokich stężeniach i w tak minimalnym stopniu, że możliwe jest praktyczne zastosowanie wynalazku, nie sprawdzono, czy zwolnienie tempa wynika z substratowego lub produktowego hamowania enzymu, czy spowodowane jest innymi czynnikami. Także wysokie stężenia wybranych dodatków /jeśli są one obecne/, np. amin dodanych w celu zwiększenia wydajności, mogą powodować hamowanie, a nawet denaturację jednego lub obu enzymów.

Chociaż wysokie stężenie substratu jest kluczem do przemysłowej użyteczności opisanego wynalazku, innymi czynnikami stanowiącymi o jego użyteczności są wysoka selektywność w stosunku do wytworzonego produktu i wysoki stopień przemiany substratu do kwasu glioksy166 721 lowego. W celu uzyskania wysokiej wydajności kwasu glioksylowego i uniknięcia produktów i reakcji ubocznych, dodaje się do mieszaniny reakcyjnej dodatek zwiększający wydajność wytwarzania kwasu glioksylowego, to jest enzym katalazę oraz ewentualnie aminy, takie jak etylenodwuamina. Najlepszą wydajność uzyskuje się dodając katalazę i wybraną aminę. Ponadto w celu zwiększenia wydajności wytwarzania kwasu glioksylowego dodaje się niewielkie ilości mononukleotydu flawinowego /PMN/.

Używany tu termin wydajność oznacza procent wytworzonego kwasu glioksylowego, obliczony z całkowitej ilości kwasu glioksylowego obecnego na początku reakcji. Termin przemiana, stopień przemiany oznacza procent kwasu glikolowego obecnego na początku reakcji, który przereagował z wytworzeniem innego produktu. Termin selektywność oznacza procent kwasu glioksylowego wytworzonego z kwasu glikolowego, który przereagował. Wynika z tego, że matematycznie wydajność jest iloczynem selektywności i stopnia przemiany. Termin wydajność enzymu oznacza ilość kwasu glioksylowego wytworzonego na jednostkę enzymu.

Kwas glioksylowy /kwas 2-hydroksyoctowy/ jest dostępny w handlu /E.I. du Pont de Nomurs and Company, Inc./. W reakcji prowadzonej sposobem według wynalazku wyjściowe stężenie kwasu glikolowego wynosi 200-2500 mM, a korzystnie około 500-1000 mM. Ponieważ utlenianie katalizowano przez oksydazę glioksylanową prowadzi się przy pH 7 - 10, kwas glioksylowy obecny jest w formie anionu glikolanowego. Jest zrozumiałe, że termin kwas glikolowy w odniesieniu do kwasu glikolowego w środowisku o pH większym niż 4 oznacza anion glikolanowy.

Enzym oksydazę glikolanową izoluje się z kilku źródeł /supra/. Według Enzyme Nomenclature 1984 /Zalecenia Komisji Nomenklatury Międzynarodowej Unii Biochemicznej o Nomenklaturze i Klasyfikacji Katalizowanych Enzymatycznie Reakcji/, Academic Press, New York, 1984 /cytowany tu za MUB/, str, 52-53, systematyczna nazwa tego enzymu brzmi: oksydaza /S/-2-hydroksykwasów, numer: E.C. 1.1.2.15. MUB włączony jest tu przez cytowanie. Oksydaza glikolanowa stosowana w sposobie według wynalazku występuje w skutecznych stężeniach, przeważnie od około 0,001 do około 1000 IU/ml, korzystnie od około 0,1 do około 4 IU/ml. lU/jednostka międzynarodowajest zdefiniowanajako ilość enzymu, która katalizuje przekształcenie 1pm substratu w ciągu 1 minuty. Sposób badania aktywności enzymu zamieszczono w

I.Zelitch i S.Ochoa, J.Biol. Chem., Vol.201, 707-718 /1953/. Sposób ten jest także stosowany do określania aktywności odtworzonego lub zawróconego do obiegu enzymu.

pH mieszaniny reakcyjnej wynosi od około 7 do około 10, korzystnie od około 8 do około 9,5, najbardziej korzystnie od 8,0 do 9,0 pH, utrzymuje się przez buforowanie, ponieważ aktywność enzymu zmienia się wraz z pH. Stwierdzono także, że pH reakcji lekko spada w czasie jej trwania i korzystnie zaczyna się reakcję przy pH bliskim maksimum zakresu pH aktywności enzymu wynoszącym około 9,0 - 9,5 i pozwala się mu spadać w czasie trwania reakcji. Stwierdzono także, że niektóre aminy, takie jak etylenodwuamina i tris/hydroksymetylo/ metyloamina /dalej Tris/ poprawiają wydajność kwasu glioksylowego. Chociaż stosuje się bufory nieorganiczne, korzystnie stosuje się nadmiar /ponad molowe ilości kwasu glikolowego/ tych amin jako buforu i jako czynnika zwiększającego wydajność. Korzystnie stosuje się etylenodwuaminę. Aminy te stosuje się w stosunku molowym amina/kwas glikolowy /ilości wyjściowej/ od około 1 do 3, korzystnie od około 1,0 do około 2,0, najbardziej korzystnie od około 1,05 do około 1,33. W tym zakresie, dokładna wartość musi być dobrana tak, aby otrzymać pożądane pH. W przypadku prostych amin stosowanych w wysokich stosunkach, amina/kwas glikolowy, może być konieczne doprowadzenie pH do pożądanej wartości przez zakwaszenie na przykład kwasem solnym lub siarkowym. W przypadku amin złożonych, takich jak Tris, może być konieczne dodanie zasady, w celu otrzymania pożądanego pH. Chociaż możliwe jest stosowanie większych ilości amin, ilości te przeważnie mało lub wcale nie polepszają wydajności, a zwiększają nakłady finansowe, szczególnie w czasie izolacji produktu. Tak więc stosuje się niższy stosunek aminy do kwasu glikolowego, zależny od wymaganej wydajności, selektywności i żądanego pH.

Innym dodatkiem, który stosuje się w celu zwiększenia wydajności kwasu glioksylowego jest enzym katalaza. Katalaza /E.C. 1.11.1.6, MUB/ katalizuje rozkład nadtlenku wodoru do wody i tlenu i zwiększa wydajność reakcji prowadzonej sposobem według wynalazku, przyspie6

166 721 sząjąc rozkład nadtlenku wodoru, który jest pierwotnym produktem katalizowanej przez oksydazę glikolanową reakcji kwasu glikolowego z tlenem prowadzącej do wytworzenia kwasu glioksylowego. Stężenie katalazy wynosi od około 50 do około 100 000 IU/ml, korzystnie od około 350 do około 14 000 IU/ml. Korzystnie stężenie katalazy i oksydazy glikolanowej zawarte są wyżej podanych zakresach, a stosunek katalaza: oksydaza glikolanowa /mierzony w IU/ wynosi 250:1.

Dodatkowo stosuje się FMN, w stężeniach 0,0 do około 2,0 mM, korzystnie od około 0,01 do około 0,2 mM. FMN zwiększa wydajność oksydazy glikolanowej. Wydajność oksydazy glikolanowej oznacza ilość kwasu glikolowego przekształconą w kwas glioksylowy przez jednostkę enzymu. Jest zrozumiałe, że dodany w sposobie według wynalazku FMN dodaje się poza FMN zawartym już w enzymie, ponieważ często w tr^^ccie przygotowywania enzymu dodaje się FMN. Budowę FMN i metody jego oznaczania opisano w K.Yagai, Methods of Biochemistry Analysis, Vol. X, Intersciences Publishers, New York, 1972, str. 319-335.

Jako utleniacz w reakcji przemiany kwasu glikolowego do kwasu glioksylowego stosuje się tlen /O2/. Wprowadza się tlen do reakcji w postaci gazu, przez wzburzenie cieczy na granicy faz ciecz-gaz lub przez odpowiednią błonę przepuszczającą tlen. Uważa się, że w większości przypadków szybkości reakcji jest częściowo kontrolowana przez szybkość rozpuszczania się tlenu w płynnym podłożu. Chociaż tlen może być dodawany do mieszaniny reakcyjnej jako tlen z powietrza, korzystnie stosuje się stosunkowo czyste postacie tlenu, a nawet podwyższa się ciśnienie. Chociaż nie określono górnej granicy ciśnienia tlenu, korzystnie stosuje się ciśnienie wynoszące około 5,02 MPa, najkorzystniej około 1,52 MPa. Mieszanie płynu jest istotne dla utrzymania wysokiego stężenia tlenu a w konsekwencji dla utrzymania tempa reakcji/. Użyteczna jest każda tradycyjna forma wzburzania, taka jak mieszanie. Biegłym w tej dziedzinie dobrze wiadomo, że wzbudzenie z wysoką szybkością ścinania lub wytwarzające pianę zmniejsza aktywność enzymu, więc należy go unikać.

Ważną zmienną jest także temperatura reakcji, która wpływa na tempo reakcji i stabilność enzymu. Można stosować temperaturę 0 - 40°C, korzystnie 5 - 30°C, a najkorzystniej 5 - 20°C. Oczywiście temperatura nie powinna być niższa niż temperatura zamarzania wody. Korzystna temperatura jest niższa od tej opisywanej poprzednio i umożliwia zachowanie aktywności enzymu, a także temperatura reakcji /utleniania glikolanu/. Temperaturę można kontrolować różnymi metodami, np. z użyciem naczynia reakcyjnego z płaszczem wodnym, przez który przepływa woda o odpowiedniej temperaturze przez płaszcz.

Naczynie reakcyjne można wykonać z dowolnego materiału, który nie wchodzi w reakcję ze składnikami mieszaniny reakcyjnej.

Po zakończeniu reakcji enzymy można usunąć przez filtrowanie lub jeśli występują w tak małych ilościach, że ich obecność nie jest szkodliwa, można je zdenaturować przez ogrzanie do 20°C przez 5 minut. Aminy najbardziej dogodnie usuwa się używając żywic jonowymiennych. Do usuwania amin używa się kwasowej kationowej żywicy jonowymiennej. Użyteczne żywice to Amberlite CG 120, A.berlite IR 120 /Rohm i Hass Co./ i Dowex 50 /Dow Chemical Co./. Następnie amina może być odtworzona i zawrócona do obiegu przez przemycie żywicy silną zasadą. Odfiltrowanie enzymów i odtworzenie aminy zostanie później zilustrowane w przykładach.

Wytworzony kwas glioksylowy może być stosowany w wytwarzaniu waniliny, etylowaniliny, a także do wytwarzania żywic jonowymiennych i jako katalizator w przemyśle farmaceutycznym /Ullmanna/. Jak już wspomniano, przeważnie jest on sprzedawany w postaci 50% /wag/wag/ roztworu wodnego. Jest też zrozumiałe, że nazwa kwas glioksylowy używana jest w tym zgłoszeniu i oznacza także anion glioksylanowy, szczególnie, gdy kwas glioksylanowy występuje w roztworach, których pH jest większa niż około 2,3.

W poniższych przykładach i doświadczeniach do mieszania używano mieszadła magnetycznego, chyba że napisano inaczej. Końcową aktywność enzymu mierzono przez pobranie próbki mieszaniny reakcyjnej i bezpośrednią analizę przy użyciu standardowych metod /supra/.

Kluczowym problemem w poniższych przykładach i doświadczeniach jest dobranie odpowiednich metod analitycznych. Stwierdzono, że ciśnieniowa chromatografia cieczowa /HPLC/ jest najlepszą metodą analityczną i jest ona używana w poniższych przykładach.

166 721

Metoda HPLC.

Próbki do analizy przygotowuje się przez zmieszanie 100 μΐ mieszaniny reakcyjnej z 300 μl 0,1 N kwasu siarkowego i przefiltrowanie powstałego roztworu przez zestaw do filtrowania Millipore Ultrafree MC /przepuszcza cząsteczki o masie molowej poniżej 10 000/. Analizę zawartości kwasu glioksylowego, glikolowego, szczawiowego i mrówkowego prowadzono metodą HPLC na kolumnie Bio-Rad Aminex HPX-874 /300 x 7,8 mm/ w temperaturze 40°C, używając jako rozpuszczalnika wodnego roztworu H2SO4 /0,01 N/ i kwasu 1-hydroksyetano-1,1 -dwufosfonowy /0,1 mM/ i szybkości wymywania 1,0 ml/minutę. Stosowano system Waters 840 HPLC z pompą Model 510, automatu do pobierania próbek 712 WISP i kolejno detektora UV 490E i refraktometru różnicującego 410. Analizę UV przeprowadzono przy długości fali 210 mm. Czas zatrzymania kwasu szczawiowego, glioksylowego, glikolowego, mrówkowego i propionowego/standard wewnętrzny/ wynosi odpowiednio4,29,6,09,7,77,8,79 i 11,41 μl/minut.

Przykład I. Otrzymanie Oksydazy glikolanowej ze szpinaku. Liście szpinaku /2000 g/ homogenizuje się w dostępnym w handlu homogenizatorze o pojemności 4 dm³zawierającym 1000 ml 0,1 M buforu fosforanowego, pH 8,0, w temperaturze 40°C. Miazgę wyciska się przez cztery warstwy gazy i otrzymuje 1800 ml soku. Ekstrakt zakwasza się do pH

5.2 przez dodanie około 1 ml kwasu octowego lodowatego. Mieszaninę odwirowuje się przez 15 minut przez 14000 x g żeby usunąć cząstki stałe. Do supernatantu dodaje się stałego siarczanu amonowego /10,6 g/100 ml ekstraktu/ w celu otrzymania 20% roztworu. pH utrzymuje się pomiędzy 7,8 - 8,0 przez dodanie 6 N KOH. Następnie pozwala się roztworowi odstać przez 15 minut i wiruje go przez 20 minut przy 14000 x g, a osad usuwa. Do supematantu dodaje się siarczanu amonowego /8,3 g/100 ml/ otrzymując roztwór 35%. Osad zbiera się po 15 minutach przez wirowanie przez 20 minut przy 14000 x g. Osad rozpuszcza się w jak najmniejszej objętości /około 180 ml/ 20 mM etylenodwuaminy - HC1, pH 8,0 zawierającej 2 mM mononukleotydu flawinowego. Po rozpuszczeniu dodaje się siarczanu amonowego do stężenia końcowego

3.2 M. Zawiesina oksydaza glikolanowa-siarczan amonowy jest przechowywana w ciemności w temperaturze 4°C.

Przykład II. Utlenianie kwasu glikolowego. Do szklanego, aerozolowego naczynia reakcyjnego Fishera-Portera o masie 84 g wkłada się mieszadło magnetyczne i wlewa ł0 ml wodnego roztworu zawierającego kwas glikolowy /250 mM/, etylenodwuaminę /EDA/ /330 mM/, FMN /0,001 mM/, kwas propionowy /standard wewnętrzny HPLC/ /75 mM/, oksydazę glikolanową /GAO/ /ze szpinaku, 2,0 IU/ml/ i katalazę z kroplidlaka czarnego, 1400 IU/ml/. Końcowe pH roztworu wynosi 8,9. Naczynie reakcyjne uszczelnia się i oziębia do temperatury 15°C, następnie przedmuchuje tlenem przez podniesie ciśnienia do 4832 hPa i odpowietrzając do ciśnienia atmosferycznego, pięciokrotnie, stale mieszając. Następnie w naczyniu podnosi się ciśnienie do 4832 hPa i stale miesza. W regularnych odstępach czasu pobiera się 0,10 ml roztworu, przez zawór do pobierania próbek, co nie powoduje obniżenia ciśnienia. Próbki analizuje się metodą HPLC w celu stwierdzenia przebiegu reakcji. Po 4 godzinach analiza HPLC wykazuje następujące ilości 98,9%, 0,5% i 0% kwasu glioksylowego, szczawiowego i mrówkowego, odpowiednio i 0,6% pozostałego kwasu glikolowego. Końcowa aktywność enzymów oksydazy glikolanowej i katalazy wynosi dla obu enzymów 100% ich wartości początkowej.

Przykład III. Utlenianie kwasu glikolowego. Powtórzono doświadczenie z przykładu I zastępując K2HPO4 /330 mM/ etylenodwuaminą, a końcowe pH roztworu doprowadzono do 8,0 dodając stężony HCl. Po 4 godzinach, HPLC wykazało ilości glioksylanu, szczawianu i mrówczanu, odpowiednio 24,4%, 0,3% i 8,4% oraz 67,1% pozostałego kwasu glikolowego. Końcowa aktywność oksydazy glikolanowej i katalazy wynosiła odpowiednio 95% i 44% ich początkowej wartości.

Przykład IV. Utlenianie kwasu glikolowego. W szklanym, aerozolowym naczyniu reakcyjnym Fishera Portera o masie 84 kg umieszcza się mieszadło magnetyczne i 50 ml wodnego roztworu zawierającego kwas glikolowy /750 mM/, etylenodwuaminę /862 mM/, FMN /0,1 mM/, kwas propionowy /standard wewnętrzny HPLC, 75 mM/, oksydazę glikolanową /ze szpinaku, 1,(0 IU/ml/ i katalazę /z kropidlaka czarnego/, 1400 IU/m/. Końcowe pH roztworu g

166 721 wynosi 8,9. Naczynie reakcyjne uszczelnia się i oziębia do temperatury 15°C, następnie przedmuchuje tlenem przez podniesienie ciśnienia do 4832 hPa i odpowietrzenie do ciśnienia atmosferycznego, pięciokrotnie, stale mieszając. Następnie w naczyniu podnosi się ciśnienie do 4 832 hPa tlenu i stale miesza. W regularnych odstępach czasu pobiera się 0,1 ml roztworu i analizuje metodą HPLC, w celu stwierdzenia przebiegu reakcji. Po 90 godzinach analiza HPLC wykazała następujące ilości 99,8%, 0,2%, 0%, odpowiednio glioksylanu, szczawianu i mrówczanu, oraz brak kwasu glikolowego. Końcowa aktywność oksydazy glikolanowej i katalazy wynosiła odpowiednio 34% i 88% ich początkowej wartości.

Przykład V. Utlenianie kwasu glikolowego. W szklanym, aerozolowym naczyniu reakcyjnym Fishera-Portera o masie 84 g umieszcza się mieszadło magnetyczne i 10 ml wodnego roztworu zawierającego kwas glikolowy /2000 mM/, etylenodwuaminę /2100 mM/, FMN /0,01 mM/, oksydazę glioksylanową /ze szpinaku, 1,2 IU/ml/ i katalazę /z kropidlaka czarnego, 1400 IU/ml/. Końcowe pH roztworu wynosi 9,0. Naczynie reakcyjne uszczelnia się i oziębia do temperatury 15°C, następnie przedmuchuje tlenem przez podniesienie ciśnienia do 4832 hPa i odpowietrzenie do ciśnienia atmosferycznego, pięciokrotnie, ciągle mieszając. Następnie w naczyniu podnosi się ciśnienie tlenu do 4832 hPa i stale miesza. W regularnych odstępach czasu pobiera się 0,1 ml roztworu i analizuje metodą HPLC, w celu stwierdzenia przebiegu reakcji. Po 31 godzinach nie stwierdzono aktywności oksydazy glikolanowej, więc dodano dodatkowe 2,0 IU/ml. Po 143 godzinach analiza HPLC wykazała następujące ilości 96,8%, 2,2%, 1,0%, odpowiednio, glioksylanu, szczawianu i mrówczanu, oraz brak glikolanu. Końcowa aktywność oksydazy glikolanowej i katalazy wynosiła odpowiednio 69% i 100% ich początkowej wartości.

Przykład VI. Utlenianie kwasu glioksylowego. W 84 g, szklanym, aerozolowym naczyniu reakcyjnym Fischera-Portera umieszcza się mieszadło magnetyczne i 10 ml wodnego roztworu zawierającego kwas glikolowy /250 mM/, tris/hydroksymetylo/aminometan /TRIS, 330 mM/, FMN /0,02 mM/ i kwas propionowy /standard wewnętrzny HPLC, 75 mM/, oksydazę glikolanową /ze szpinaku, 0,25 IU/ml/ i katalazę /z kropidlaka czarnego, 1400 IU/ml/. Końcowe pH wynosi 8,3 i zostało doprowadzone do tej wartości 5% roztworem NaOH. Naczynie reakcyjne uszczelnia się i oziębia do temperatury 30°C, następnie pięciokrotnie przedmuchuje tlenem przez podniesienie ciśnienia do 966 hPa i odpowietrzenie do ciśnienia atmosferycznego, ciągle mieszając. Następnie w naczyniu podnosi się ciśnienie tlenu do 966 hPa i ciągle miesza. W regularnych odstępach czasu pobiera się 0,1 ml roztworu /bez obniżenia ciśnienia w naczyniu reakcyjnym/ i analizuje metodą HPLC, w celu stwierdzenia przebiegu reakcji. Po 30 godzinach analiza HPLC wykazała następujące ilości 89,5%, 3,3%, 2,8%, odpowiednio, glioksylanu, szczawianu i mrówczanu, oraz brak glikolanu. Końcowa aktywność oksydazy glikolanowej i katalazy wynosiła odpowiednio 52% i 60% ich początkowej wartości.

Przykład VII. Utlenianie kwasu glikolowego. Powtórzono doświadczenie z przykładu IV stosując stężenia kwasu glikolowego i etylenodwuaminy, odpowiednio 2500 mM i 2630 mM, i nie dodano powtórnie oksydazy glikolanowej i 31 godzinie reakcji. Po 143 godzinach analiza HPLC wykazała następujące ilości 27,4% i 0%, 0%, odpowiednio, glioksylanu, szczawianu i mrówczanu, oraz 72,6% pozostałego glikolanu, co wskazuje, że tempo reakcji spada przy stężeniu 2500 mM glikolanu. Końcowa aktywność oksydazy glikolanowej i katalazy wynosiła odpowiednio 68% i 80% ich początkowej wartości.

Przykład VIII. Wpływ temperatury na utlenianie kwasu glikolowego. Zależność aktywności katalazy i GAO od temperatury reakcji została określona przy użyciu 84 g Fischer-Porter szklanego, aerozolowego naczynia reakcyjnego. Roztwór wodny /10 ml/ zawierający glikolan /250 mM/, etylenodwuaminę /330 ml/, oksydazę glikolanową /0,5 IU/ml/, katalazę /1400 IU/ml/ i FMN /0,01 mM/ mieszano w różnych temperaturach o pH 8,3 pod ciśnieniem tlenu i atmosfery. Po 1 godzinie określono wydajność glioksylanu w reakcjach prowadzonych w temperaturze 40°C, 30°C,15°C, 5°C, wynosi odpowiednio 92%, 96%, 99%, 99%. Końcowa aktywność katalazy/GAO wynosi odpowiednio 38%/87%, 60%/100%, 100%/100% i 100%/100%. Niższe temperatury reakcji dają wyższą końcową aktywność enzymów i wyższą selektywność.

166 721

Przykład IX. Wpływ tlenu. Ciśnienie w reakcji utleniania kwasu glikolowego. Wodne roztwory /10 ml/ zawierające 250 mM kwasu glikolowego, 330 mM buforu Tris o pH wynoszącym 8,3, 75 mM kwasu propionowego /standart wewnętrzny HPLC/, 0,25 IU/ml oksydazy glikolanowej pochodzącej ze szpinaku, 1400 IU/ml katalazy z Aspergillus niger i 0,2 mM FMN mieszano w temperaturze 30°C pod ciśnieniem powietrza wynoszącym 1013,25 hPa/202,65 hPa tlenu/ lub 1013,25 hPa, 2026,50 hPa, 3039,75 hPa, 6079,50 hPa lub 10132,5 hPa tlenu, stosując procedurę jak w przykładzie II. Początkowe szybkości wytwarzania kwasu glioksylowego /pierwsze 10-15% reakcji/ przy różnych ciśnieniach tlenu uwidoczniono w tabeli 1.

Tabela 1

Ciśnienie tlenu hPa	Szybkość pmol/ml/minutę
202,65	0,027
1013,25	0,156
2026,50	0,301
3039,75	0,494
6079,50	0,752
10132,50	1,025

Przykład X. Wpływ oksydazy glikolanowej. Stężenie w reakcji utleniania kwasu glikolowego. Wodne roztwory /10 ml/ zawierające 250 mM glikolanu, 330 mM EDTA, 75 mM kwasu propionowego /standart wewnętrzny HPLC/, 0,20,0,40 lub 4,0 IU/ml oksydazy glikolanowej, 1400 IU/ml katalazy oraz 0,01 mM FMN mieszano w temperaturze 15°C przy pH wynoszącym 8,9 z tlenem pod ciśnieniem 6079,50 hPa, stosując procedurę jak w przykładzie II. Początkowe szybkości wytwarzania kwasu glioksylowego /pierwsze 10-15% reakcji/ przy zastosowaniu stężeń oksydazy glikolanowej z buraka GAO wynoszących 0,20 IU/ml, 0,40 IU/ml i 4,0 IU/ml wynosiły 1,37 umol/ml/minutę, 1,33 umol/ml/minutę i 1,32 umol/ml/minutę odpowiednio. W tych warunkach reakcji nie obserwowano żądanej zależności szybkości reakcji od stężenia enzymu.

Przykład XI. Utlenianie kwasu glikolowego. Enzymatyczną syntezę kwasu glioksylowego na dużą skalę przeprowadzono w komorze Amicon Model 2000 High-Output Strirred Celi, w której jako membranę filtracyjną zastosowano arkusz teflonu o grubości 1,6 mm, która to komora zaopatrzona była w mieszadło magnetyczne. Oksydazę glikolanową wyizolowaną ze szpinaku /2000 IU/ dodano do 2,0 litrów roztworu zawierającego kwas glikolowy /113 g, 1,49 mola/, etylenodwuaminę /95 g, 1,58 mola/, FMN /9,7 mg, 0,02 milimola/ oraz katalazę z Aspergillus niger /Sigma/ /2,8 x 10⁶IU/. Tak otrzymaną mieszaninę o końcowym pH wynoszącym 8,9 mieszano w temperaturze 15°C z tlenem pod ciśnieniem 6079,50 hPa. Pod wielokrotne części próbki brano w regularnych odstępach czasu do analizy metodą HPLC w celu kontrolowania przebiegu reakcji. Po 77 godzinach analiza HPLC mieszaniny reakcyjnej wykazała obecność 110 g kwasu glioksylowego /wydajność 99,6%/, obecność kwasu mrówkowego /0,2%/ oraz obecność kwasu szczawiowego/wydajność 0,2%/jako jedynych produktów reakcji. Osiągnięto całkowitą przemianę kwasu glikolowego. Aktywności oksydazy glikolanowej i katalazy wynosiły 74% i 87% ich aktywności początkowych, odpowiednio. Reakcję zakończono przez zraszanie mieszaniny reakcyjnej azotem, a następnie mieszaninę reakcyjną ogrzewano w ciągu 5 minut do temperatury 70°C w atmosferze azotu.

Wytrącone białko usunięto przez odwirowanie, a FMN usunięto przez filtrowanie mieszaniny reakcyjnej przez węgiel aktywny. Pozostałe białko rozpuszczalne usunięto przez filtrowanie przy zastosowaniu układu do filtrowania Millipore Minitan Filtration System zatrzymującego cząstki o masie cząsteczkowej wynoszącej 10000. Następnie oddzielono glioksylan i etylenodwuaminę przy zastosowaniu chromatografii jonowymiennej. Amberkt CG-120 /firmy Rohm and Haas, 900 g, nr sita 100-200, 4,5 meg/g/ zawieszono w 1,0 N HCl w celu wytworzenia 2 litrów spęcznionej żywicy, którą następnie przepłukano wodą destylowaną w celu usunięcia nadmiaru HCL Kolumnę Pharmaciak /50cm x 1O0cm/ napełniono 1900 ml przemytej żywicy,

166 721 przepompowywano przez nią 2,0 litra wody destylowanej z szybkością 8,0 ml/minutę. Następnie do kolumny wprowadzono mieszaninę reakcyjną kwas glioksylowy/ etylenodwuamina, zawierającą 0,78 mola etylenodwuaminy i 0,75 mola kwasu glioksylowego, z szybkością przepływu wynoszącą 8 ml/minutę. Kwas glioksylowy zbierano w początkowej fazie elucji wodą, wykazywał on absorbancję przy 254 nm. Zebrano około 2,2 litra eluentu zawierającego kwas glioksylowy. Etylenodwuaminę eluowano za pomocą 3,4 litra IN NaOH uzyskując 0,77 mola etylenodwuaminy /99% odzysku/. Kolumnę zrównoważono ponownie przemywając ją 1N HCl w ilości 2,4 litra, a następnie 3 litrami wody destylowanej w celu usunięcia chlorków. Połączone frakcje zawierające kwas glioksylowy z rozdzielania metodą jonowymienną oraz dwie 1,1 litrowe frakcje z eluatu kwas glioksylowyeetylenodwuamina połączono i zatężono przez odparowanie w wyparce obrotowej w temperaturze 40°C otrzymując 50% wag. roztwór zawierający 1,40 mola kwasu glioksylowego /wydajność 94%/. Czystość wytworzonego kwasu glioksylowego była większa niż 99,5%, jak określono za pomocą Spektroskopii NHR /^I3C/ i analizy metodą HPLC.

Przykład XII. Utlenianie kwasu glikolowego. Powtórzono reakcję jak w przykładzie II z tym, że nie dodano katalazy. Po 4 godzinach stwierdzono metodą HPLC uzyski glioksylanu, szczawianu i mrówczanu wynoszące odpowiednio 6,2%, 0,7% i 16,3%. Pozostało 7,1% glikolanu, co dowodzi, że w przypadku nieobecności katalazy osiąga się niższe selektywności. Końcowa aktywność oksydazy glikolanowej wynosiła 5% jej aktywności początkowej.

Przykład XIII. Utlenianie kwasu glikolowego. Przygotowano roztwór podstawowy przez zmieszanie 12,5 g zdemineralizowanej wody, 30 mg kwasu glikolowego, 1,2 Tris i 1,0 g 0,02 mM roztworu FMN w buforze fosforanowym o pH równym 6,8. Część roztworu podstawowego /10 g/ umieszczono w kolbie Erlenmeyer’a wraz z 2 mg katalazy z wątroby bydlęcej /firmy Sigma Chemical Co., St.Lauis, MO, 63178, numer katalogowy C-10, około 1200 JU/mg/. Część zawiesiny oksydazy glikolanowej /0,5 g/ /firmy Sigma, numer katalogowy C-4136, pochodzącej z buraków cukrowych, roztwór zawierający 2,4 M /NH4/2SO4, 10 mM Tris, SmMFMNii około 7,5 JU/ml/ odwirowano, a ciecz odrzucono. Ciało stałe dodano do roztworu znajdującego się w kolbie Erlenmeyer’a. Ph wynosiło 8,5. Przez kolbę przepuszczono tlen w ciągu 5 minut z szybkością 20 ml tlenu na minutę. Kolbę zamknięto i wytrząsano w ręcznej wstrząsarce w ciągu około 23 godzin. Analiza metodą HPLC /podobna, lecz nie identyczna jak opisano powyżej/ wykazała, że glikolan uległ całkowitemu utlenieniu do glioksylanu. Analiza ta wykazała również obecność małej ilości szczawianu.

Przykład XIV. Utlenianie kwasu glikolowego przy zastosowaniu reaktora membranowego. Przygotowano roztwór podstawowy przez zmieszanie 12,4 ml zdemineralizowanej wody, 305 mg kwasu glikolowego, 1,0 g 0,15 mM FMN w buforze fosforanowym o pH równym

7.5 i 1,3 g 20% wag. roztworu wodnego etylenodwuaminy. Przygotowano mieszaninę reakcyjną przez zmieszanie 12 g roztworu podstawowego, 4 mg katalazy z wątroby bydlęcej /firmy Sigma, numer katalogowy C-10, około 2800 JU/mg/ i ciała stałego otrzymanego w wyniku odwirowania 1,0 g dostępnej w handlu zawiesiny oksydazy glikolanowej /firmy Sigma, numer katatogowy C-8620, zawierającej 3,2 M /NH4/2SO4, 2 mM FMN, 2,8 JU/ml, oksydaza glikolanowa wyizolowana ze szpinaku/. Ph wynosiło 9,1. Reaktor składał się z trzech części: rurki z kauczuku silikonowego o długości 3,65 m, średnicy wewnętrznej 1,6 mm i średnicy zewnętrznej 3,2 mm firmy Dow Corning Corp., pompy przewodowej Masterflex oraz z probówki szklanej o średnicy wewnętrznej 10 mm i długości 10 cm, służącej jako zbiornik. Rurki prowadzące do i z pompy przechodziły przez ściankę zamykającą zbiornik w postaci probówki. Mieszaninę reakcyjną wprowadzono do reaktora, a następnie pompowano przez rury w ciągu 23 godzin z szybkością

3.5 ml/minutę. W ciągu tego czasu około 5 ml mieszaniny znajdowało się w rurach, a 5 ml w zbiorniku /cały czas krążąc w obiegu/. Rury były zwinięte luźno w łagodnym przepływie powietrza. Analiza HPLC /podobna, lecz nie identyczna jak opisano powyżej/ wykazała obecność małej ilości szczawianu oraz że nastąpiło całkowite utlenienie do glioksylanu.

Przykład XV. Utlenianie kwasu glikolowego. W polipropylenowej rurce do wirowania o objętości 15 ml umieszczono 3 ml wodnego roztworu zawierającego kwas glikolowy /3,3 mM/, K2HPO4 /33 mM, pH równe 8,0/, oksydazę glikolanową /pochodzącą ze szpinaku, 0,33 JU/ml/, katalazę /pochodzącą z wątroby bydlęcej, 1400 JU/ml/ oraz FMN /0,01 mM/. Roztwór trzymano

166 721 na powietrzu w temperaturze 30°C. Brano podwielokrotne części próbki, filtrowano je przez filtr Millipore zatrzymujący cząstki o masie cząsteczkowej wynoszącej 10000 i analizowano metodą HPLC. Po 1 godzinie uzyski glioksylanu, szczawianu i mrówczanu wynosiła odpowiednio 80,9%, 3,8% i 0%: pozostało 15,5% glikolanu. Po 2 godzinach nie wykryto glikolanu, a uzyski glioksylanu, szczawianu i mrówczanu wynosiły odpowiednio 80,6%, 19,75 i 0%.

Chociaż powyżej opisano korzystne aspekty wynalazku, jest zrozumiałe, że wynalazek nie ogranicza się do powyższych przykładów. Ponadto wynalazek obejmuje również wszystkie zmiany i modyfikacje objęte załączonymi zastrzeżeniami.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 1,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania kwasu glioksylowego, zgodnie z którym stanowiący mieszaninę reakcyjną wodny roztwór kwasu glikolowego, oksydazy glikolanowej i katalazy oraz ewentualnie aminy wybranej spośród etylenodwuaminy, tris(hydroksymetylo)metyloaminy i ich mieszaniny i/lub mononukleotydu flawinowego kontaktuje się przy pH 7-10 z tlenem, znamienny tym, że stosuje się wodny roztwór o początkowym stężeniu kwasu glikolowego 200-2500 mM.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się wodny roztwór, w którym wyjściowy stosunek aminy do kwasu glikolowego wynosi 1,0-3,0, a stężenie katalazy wynosi 50-100000 IU/ml.
3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że stosuje się wodny roztwór o początkowym stężeniu kwasu glikolowego 250-1500 mM.
4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że stosuje się wodny roztwór o stężeniu oksydazy glikolanowej 0,001-1000 IU/ml.
5. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że stosuje się wodny roztwór o początkowym stężeniu katalazy 350-1400 IU/ml.
6. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że stosuje się wodny roztwór o początkowym stężeniu mononukleotydu flawinowego do 2,0 mM.
7. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że stosuje się wodny roztwór, w którym stosunek katalazy do oksydazy glikolanowej wynosi co najmniej 250:1.
8. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że reakcję prowadzi się w temperaturze 0-40°C, powyżej temperatury zamarzania wody w mieszaninie reakcyjnej.
9. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że stosuje się gazowy tlen pod ciśnieniem od atmosferycznego do 5,07 MPa.