JP3315119B2 - Ｎ−（ホスホノメチル）グリシンの酵素的製造 - Google Patents

Ｎ−（ホスホノメチル）グリシンの酵素的製造

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 1.発明の分野 本発明は、グリオキシル酸及びアミノメチルホスホン
酸（AMPA）の混合物の製造、並びに後のＮ−（ホスホノ
メチル）グリシン（普通グリホセートといわれる）の製
造のための方法に関する。さらに特定すれば、本発明
は、水溶液状態で、AMPA,並びにグリコレートオキシダ
ーゼ（（Ｓ）−２−ヒドロキシ酸オキシダーゼ、EC1.1.
3.15）及びカタラーゼ（EC1.11.1.6）よりなる触媒の存
在下グリコール酸及び酸素の反応を含み、グリオキシル
酸及びAMPAを含有する混合物を系内で得る酵素的方法に
関し、この混合物は次に水素添加して多種多様の植物を
コントロールする際有用である広域スペクトルの発芽後
植物毒及び除草剤であるＮ−（ホスホノメチル）グリシ
ンを得る。
2.関連技術の説明 葉状緑色植物及び哺乳類細胞中に普通見出される酵素
であるグリコレートオキシダーゼは、グリオキシル酸へ
のグリコール酸の酸化の触媒となり、同時に過酸化水素
を生じる； HOCH2CO2H＋O2→OCHCO2H＋H2O2 N.E.Tolbertら、J.Biol.Chem.,181巻、905〜914頁（1
949年）は、グリコール酸の酸化の触媒となり、中間の
グリオキシル酸の生成を経由してギ酸及びCO2とする酵
素を、タバコの葉から抽出して最初に報告した。ある種
の化合物、例えばエチレンジアミンの添加は、中間体グ
リオキシル酸がそれ以上酸化されるのを限定する。この
酸化は、典型的には約３〜40mM（ミリモル）のグリコー
ル酸濃度を使用して、約８のpHにおいて実施された。こ
のグリコレート酸化のための至適pHは、8.9であると報
告された。シュウ酸は、グリコレートオキシダーゼの触
媒作用を阻害すると報告された。同様に、K.E.Richards
on及びN.E.Tolbert,J.Biol.Chem.,236巻、1280〜1284頁
（1961年）は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン（TRIS）を含有する緩衝液は、グリコレートオキシダ
ーゼ触媒のグリコール酸の酸化においてシュウ酸の生成
を阻害することを示した。C.O.Clagett,N.E.Tolbert及
びR.H.Burris,J.Biol.Chem.,178巻、977〜987頁（1949
年）は、酵素によるグリコール酸のグリコレートオキシ
ダーゼ触媒の酸化のための至適pHは、7.8〜8.6であり、
至適温度は35〜40℃であることを報告した。
I.Zelitch及びS.Ochoa,J.biol.Chem.,201巻、707〜71
8頁（1953年）、並びにJ.C.Robinsonら、J.Biol.Chem.,
237巻、2001〜2009頁（1962年）は、グリコール酸のほ
うれん草グリコレートオキシダーゼ触媒の酸化が、グリ
オキシル酸とのH2O2の非酵素反応から生じることを報告
した。かれらは、H2O2の分解の触媒となる酵素であるカ
タラーゼの添加が、ギ酸及びCO2の生成を抑えることに
よってグリオキシル酸の収量を大きく改善することを観
察した。FMN（フラビンモノヌクレオチド）の添加も、
グリコレートオキシダーゼの安定性を大きく増大させる
ことが見出だされた。
N.A.Frigerio及びH.A.Harbury,J.Biol.Chem.,231巻、
135〜157頁（1958年）は、ほうれん草から単離されたグ
リコール酸オキシダーゼの製造及び性質について報告し
ている。精製された酵素は、溶液状態できわめて不安定
であることが見出された；この不安定性は、酵素活性部
位へのフラビンモノヌクレオチド（FMN）の比較的弱い
結合に、又この酵素の酵素活性があるテトラマー及び
（又は）オクタマーの酵素活性がないモノマー及びダイ
マーへの解離に帰せられ、後者は不可逆的に凝集し、沈
殿する。酵素の溶液へのFMN（フラビンモノヌクレオチ
ド）への添加は、その安定性を大きく増大させ、高タン
パク濃度又は高イオン強度は、酵素をオクタマー又はテ
トラマーとして保持した。
グリコール酸オキシダーゼが触媒となるグリコール酸
の酸化に多くの他の参考文献がある。酵素の単離（及び
アッセイ法）、次の文献に記載されている;I.Zelitch,M
ethods in Enzymology,1巻、Academic Press,New Y
ork,1955年,528〜532頁（ほうれん草及びタバコの葉か
ら）、H.Asker及びD.Davies,Biochim,Biophys.Acta,761
巻、103〜108頁（1983年）（ラット肝から）、並びにM.
J.Emes及びK.H.Erisman,Int.J.Biochem.,16巻、1373〜1
378頁（1984年）（Lemuna Minor Ｌから）。この酵素
の構造も報告されている:E.Cederiundら、Eur.J.Bioche
m.,173巻、523〜530頁（1988年）、並びにY.Lindquist
及びC.Branden、J.Biol.Chem.,264巻、3624〜3628頁（1
989年）。
アミノメチルホスホン酸およびグリオキシル酸からＮ
−（ホスホノメチル）グリシンを製造するため多くの方
法が知られている。上記の方法の１つは、Rogersら、ヨ
ーロッパ特許出願186、648に記載され、グリオキシル酸
又はその塩をアミノメチルホスホン酸又はその塩と縮合
させて、一般にアルドイミン（シッフ塩基）とみなされ
る中間生成物を生成させ、これを単離することなしに触
媒水素添加等によって還元してＮ−（ホスホノメチル）
グリシンとすることを含む。Gaertner、米国特許4,094,
928に記載されている第２の方法は、非水性溶媒中グリ
オキシル酸エステルのアミノメチルホスホネートエステ
ルとの反応によってこれらの同じ中間体カルボニルアル
ドイミノメタンホスホネートを単離する；水の共沸蒸留
及び溶媒の除去の後、カルボニルアルドイミノメタンホ
スホネートエステルを還元し、エステル基を加水分解し
てＮ−（ホスホノメチル）グリシンを得る。
Ｎ−（ホスホノメチル）グリシンへの上記の経路は、
グリオキシル酸がどちらかというとコストの高い出発物
質である点で問題があり、所望のものへの他のそれより
安価な経路が実施されている。グリオキシル酸の製造の
ための既存の方法、例えばジハロ酢酸の加水分解、シュ
ウ酸の電解還元、グリオキサールの酸化、エチレン又は
アセトアルデヒドの接触酸化及びマレイン酸、そのエス
テル又は無水物のオゾン分解は、実施上１つ又はそれ以
上の難点、例えばコストのかかる分離／精製工程、低い
収量又は大きい廃流を示す。Goertner中記載されている
方法も、いくつかの追加工程（対応して収量の損失を伴
う）及び不中要な中間体の単離を必要とするという点で
不利である。
Kleiner,米国特許4,670,191に開示されている、Ｎ−
（ホスホノメチル）グリシンの別の一合成法は、水性触
媒中アミノメチルホスホン酸又はその塩の約２モル当量
のグリオキシル酸との反応よりなる。過剰のグリオキシ
ル酸は、明らかに還元剤として機能し、中間体グリオキ
シル酸−アミノメチルホスホン酸反応生成物を所望のＮ
−（ホスホノメチル）グリシンに変換し、それ自体は酸
化されてCO2を含む１種又はそれ以上の副生成物とな
る。同様に、Fieldsらは、米国特許4,851,159におい
て、Ｎ−アシルアミノメチルホスホン酸をグリオキシル
酸又はその誘導体と共に加熱することによってＮ−（ホ
スホノメチル）グリシンを製造する。グリオキシル酸対
Ｎ−アシルアミノ成分のモル比は好ましくは２対１であ
り、そうでない場合にはそれより小さい比において収量
が損なわれる。
Kleiner及びFieldsの方法は、比較的高価なグリオキ
シル酸を用いるだけではなく、犠牲還元剤として（得ら
れるＮ−（ホスホノメチル）グリシンモルごとに用いら
れるグリオキシル酸約１モル）、並びにアミノ（又はＮ
−アシルアミノ）メチルホスホン酸のための縮合剤とし
てそれを用いるという不利点を伴う。
発明の要約 本発明の１つの面は、水溶液中、そしてAMPA並びに２
種の酵素触媒、グリコレートオキシダーゼ（（Ｓ）−２
−ヒドロキシ−酸オキシダーゼ、EC1.1.3.15）及びカタ
ラーゼ（EC1.11.1.6）の存在下グリコール酸を酸素で酸
化することによる、グリオキシル酸（又はその塩）及び
アミノメチルホスホン酸（AMPA）（又はその塩）の混合
物の製造に関する。この故に、この第一の面は、Ｎ−
（ホスホノメチル）グリシンの製造のための中間体の製
法を表し、この中間体は、グリオキシル酸成分及びアミ
ノメチルホスホン酸成分よりなり、この方法は、アミノ
メチルホスホン酸の存在下グリコール酸成分のグリオキ
シル酸成分への酵素触媒変換よりなる。
即ちこの第一の面によれば、本発明は、グリコール酸
成分及びアミノメチルホスホン酸成分の水溶液中にグリ
コール酸成分の酸素による酸化の触媒となり、グリオキ
シル酸成分及び過酸化水素とするのに適応した第一の触
媒、並びに過酸化水素の分解の触媒となるのに適応した
第二の触媒を配合することによってグリオキシル酸成分
を系内で発生させ、溶液のpHを６〜約10に調節し、この
溶液を有効な温度において有効な時間酸素源と接触させ
て、アミノメチルホスホン酸成分の存在下グリコール酸
成分のすくなくとも一部をグリオキシル酸に変換し、そ
して該中間体をＮ−（ホスホノメチル）グリシンに変換
する前にこの溶液の酸素との接触を停止する行程よりな
る、Ｎ−（ホスホノメチル）グリシンの製造のための中
間体として有用である混合物の製法を提供する。
本発明の他の一面は、水溶液中、そしてアミノメチル
ホスホン酸、並びに２種の触媒、グリコレートオキシダ
ーゼ（（Ｓ）−２−ヒドロキシ−酸オキシダーゼ、EC1.
1.3.15）及びカタラーゼ（EC1.11.1.6）の存在下グリコ
ール酸を酸素で酸化し、次いで水溶液中系中に発生した
得られたグリオキシル酸及びアミノメチルホスホン酸の
混合物を還元して、発生後植物毒及び除草剤である所望
のＮ−（ホスホノメチル）グリシンを得ることによるＮ
−（ホスホノメチル）グリシンの製造に関する。
この第二の面によれば、本発明は （ａ）水溶液中、アミノメチルホスホン酸、並びに酵素
グリコレートオキシダーゼ及びカタラーゼの存在下グリ
コール酸を酸素で酸化することによって、グリオキシル
酸成分及びアミノメチルホスホン酸成分の混合物を得；
そして （ｂ）工程（ａ）において得られた該混合物を還元する
ことによってＮ−（ホスホノメチル）グリシンを得る工
程よりなるＮ−（ホスホノメチル）グリシンの製法を提
供する。
換言すれば、本発明の第二の面は、第一の面からの混
合物を水素添加に付すことによってＮ−（ホスホノメチ
ル）グリシンを得ることを含む。
本発明の目的のためには、アミノメチルホスホン酸の
存在下グリコール酸の酵素酸化は、所望のグリオキシル
酸成分の外に酸化副生物（例としてオキサレート、ホル
メート及び二酸化炭素を含むが、それらに限定されな
い）の分布を本来的に生じることが認められるべきであ
る。又上記混合物中には未反応のグリコレート、並びに
種々の添加剤、例えばフラビンモノヌクレオチド（以下
FMNという）が存在し、それらはすべて所望の後の水素
添加反応に影響することもしないこともある（再び例と
して、ホルメート及びFMNは、AMPAの存在下グリオキシ
ル酸の水素添加の間に存在するときには、回収炭素バラ
ンスを低下させることが見出されているが、それらに限
定されない）。即ち本発明は更に、酵素酸化の結果得ら
れた溶液から酵素の除去及び回収、並びに場合によって
は水素添加の前FMNの除去を準備する。
好ましくは、触媒は酵素的であり、更に好ましくは第
一の酵素はグリコレートオキシダーゼ（（Ｓ）−２−ヒ
ドロキシ−酸オキシダーゼEC1.1.3.15）であり、第二の
酵素はカタラーゼ（EC1.11.1.6）である。触媒／酵素の
存在下溶液のO2との触媒を停止して後、溶液をＮ−（ホ
スホノメチル）グリシンを得るために還元条件にかける
前に、濾過又は遠心分離等により触媒／酵素を除去す
る。
則ち、別の工程においてグリオキシル酸を製法する必
要を回避することにより、本発明は、より効率的かつ経
済的なＮ−（ホスホノメチル）グリシンの製法を準備す
る。
別にグリオキシル酸を製造する必要を避ける、酵素的
製造及び後のグリオキシル酸及びアミノメチルホスホン
酸の混合物の還元によるＮ−（ホスホノメチル）グリシ
ンの改良製法を提供することが本発明の一目的である。
他の一目的は、グリオキシル酸が容易に入手されるそ
の前駆体、則ちグリコール酸からアミノメチルホスホン
酸の存在下に系内で酵素的に生成される上記の方法を提
供し、それによってより効率的かつ経済的なＮ−（ホス
ホノメチル）グリシンの製法を得ることである。
発明の詳細な説明 グリコール酸又は適当なその塩の接触酸化は、グリコ
ール酸のO2による酸化の触媒となってグリオキシル酸を
生成させる酵素触媒の存在下グリコール酸を分子状酸素
源と接触させることによって都合よく実施される。上記
触媒の１つは、グリコール酸オキシダーゼとしても知ら
れる酵素グリコレートオキシダーゼ（EC1.1.3.15）であ
る。グリコレートオキシダーゼは、当該技術に周知の多
くの源から単離することができる。この反応中使用され
るグリコレートオキシダーゼは、有効濃度、通常約0.01
〜約1000IU/ml,好ましくは約0.1〜約4IU/mlの濃度で存
在するべきである。IU（国際単位）は、毎分基質１マイ
クロモルの転換の触媒となる酵素の量と定義される。こ
の酵素のアッセイ操作は、I.Zelitch及びS.Ochoa,J.Bio
l.Chem.,201巻、707〜718頁（1953年）に見出される。
この方法は、回収又はリサイクルグリコレートオキシダ
ーゼの活性をアッセイするためにも使用される。
グリコール酸の酸素との酵素触媒反応は周知である
が、グリオキシル酸への高い選択性は以前には得られて
いず、アミノメチルホスホン酸（AMPA）の存在下グリコ
ール酸の酵素的酸化を行った以前の報告はない。前の出
願、1991年５月２日の国際公開番号WO91/05868「グリコ
ール酸の酵素的酸化によるグリオキシル酸の製造」は、
酸素、アミン緩衝剤、並びに可溶性酵素グリコレートオ
キシダーゼ及びカタラーゼの存在下グリコール酸のグリ
オキシル酸への酵素的変換法を記載した。この方法は、
カタラーゼ（副生物過酸化水素を破壊する）及び得られ
るグリオキシル酸との化学的アダクトを形成する（それ
以上の酸化を限定する）ことができるアミン緩衝剤を共
に使用することの予期されない相乗効果を実証した。カ
タラーゼ又はアミン緩衝剤の別々の添加は、両者が存在
したとき観察された高い選択性を得なかったことが見出
され、得られたグリオキシル酸のほとんど定量的な収量
は、カタラーゼ又はアミン緩衝剤単独を使用する単なる
相加効果から予期される以上であった。
グリオキシレートとアミン緩衝剤との酸化抵抗性コン
プレックスの形成（Ｎ−置換へミアミン系及び（又は）
イミンの生成経由）によって得られたグリオキシレート
の収量の改善は、プロトン化アミン緩衝剤のpKaに依存
することが見出された。アミン緩衝剤（0.33M,pH8.
3）、グリコレートオキシダーゼ（0.5IU/ml），カタラ
ーゼ（1,400IU/ml）及びFMN（0.01mM）の存在下30℃に
おいて、そして酸素１気圧下に24時間グリコール酸（0.
25M）の水溶液を酸化した結果を、グリコレートとコン
プレックスを形成することが期待されない２種の緩衝剤
（ホスフェート及びビシン）を使用して行われた反応と
共に下の表に列記する。
調べられたアミン緩衝剤のうち、反応混合物のpHとほ
ぼ等しいか又はそれより低いpKaをもつアミンは、pKaが
反応が行われるpHより高いアミンよりはるかに高い収量
のグリオキシレート（並びに低いホルメート及びオキサ
レート産生）を生じた（即ち、エチレンジアミン及びト
リス）。これらの結果は、グリオキサレートとの酸化抵
抗性Ｎ−置換へミアミン系及び（又は）イミンコンプレ
ックスを形成するためには、非プロトン化アミンが必要
であることがあるという予期と一致した;pKaが反応混合
物のpHよりはるかに高いアミン緩衝剤は、反応混合物中
に優先的にプロトン化アンモニウムイオンとして存在
し、従ってグリオキシレートとの上記コンプレックスを
形成する可能性が少ないことになる。
アミノメチルホスホン酸（AMPA）のプロトン化アミン
のpKaは、10.8であると報告され（Lange's Handbook
of Chemistry,J.A.Dean編、McGraw−Hill,New York,1
979年、12版）、従ってpH7〜９の範囲内のグリコール酸
の酵素的酸化物にAMPAを添加することがグリオキシル酸
の高い収量を生じさせることは予期されなかった。添付
実施例は、このアミンを使用して92％の高いグリオキシ
ル酸の収量が得られたことを例示する。得られるグリオ
キシル酸の予期されなかった高い収量の外に、AMPAの使
用は、添加AMPAの不存在下で実施された反応（実施例1
3）と比較するとき、グリコレートオキシダーゼ及びカ
タラーゼ活性の回収の改善も生じる。リサイクルのため
の触媒の回収は、酵素触媒を用いる方法において必要で
あり、その場合触媒のコストが、製造のコストにかなり
関係した。
グリオキシル酸へのグリコール酸の酸化的変換のため
の触媒としてグリコレートオキシダーゼを使用する際の
最適の結果は、反応溶液中に過酸化水素の分解のための
触媒を配合することによって得られる。グリコレートオ
キシダーゼと組み合わせて有効である上記過酸化物破壊
触媒の一つは、酵素カタラーゼ（EC1.11.1.6）である。
カタラーゼは、過酸化物水素の水及び酸素への分解の触
媒となり、グリコール酸のO2によるグリコレートオキシ
ダーゼ触媒の反応においてグリオキシル酸と共に生じる
過酸化水素の分解を加速することによって、本方法中グ
リオキシル酸の収量を改善すると考えられる。カタラー
ゼの濃度は、50〜50,000IU/ml、好ましくは500〜15,000
IU/mlであるべきである。カタラーゼ対グリコレートオ
キシダーゼの比（各酵素についてIU単位で測定して）が
少なくとも約250:1になるように、カタラーゼ及びグリ
コレートオキシダーゼの濃度を上の範囲内に調節するこ
とが好ましい。
反応溶液中随意かつ有益なことが多い他の一成分は、
一般に0.0〜2.0mM、好ましくは約0.01〜約0.2mMの濃度
で使用されるフラビンモノヌクレオチド（FMN）であ
る。FMNは、グリコレートオキシダーゼの生産性を増大
させると考えられ、生産性とは、酵素の単位あたりグリ
オキシル酸に変換されるグリコール酸の量の増大である
ことを意味する。FMNは、酵素の調整の間に酵素に添加
されることも多いので、添加FMNの濃度は、酵素と共に
存在するFMNの外であると理解されるべきである。FMNの
構造及びその分析法は、K.Yagai,Methods of Biochem
ical Analysis,X巻、Interscience Publishers,New
York,1962年、319〜355頁（参照によって本明細書に加
入される）に見出される。
グリコール酸（２−ヒドロキシ酢酸）は市販されてい
る。本反応においては、初期濃度は、0.10M〜2.0M,好ま
しくは0.25M〜1.0Mの範囲である。それはそのままか、
又はその相容性の塩、即ち水溶性であり、そしてグリオ
キシル酸へのグリコール酸の所望の変換、もしくは後の
グリオキシル酸生成物のアミノメチルホスホン酸とのＮ
−（ホスホノメチル）グリシンを生成する反応をその陽
イオンが妨害しない塩として使用することができる。適
当かつ相容性の塩形成イオン基は、試験によって容易に
決定される。上記の塩の代表的なものは、アルカリ金
属、アルカリ土類金属、アンモニウム、置換アンモニウ
ム、ホスホニウム及び置換ホスホニウム塩である。
グリコール酸のグリオキシル酸への変換は、水性媒質
中実施することが都合よくかつ好ましい。アミノメチル
ホスホン酸（AMPA）又はその適当な塩は、0.01/1.0〜3.
0/1.0、好ましくは0.25/1.0〜1.05/1.0の範囲のAMPA/グ
リコール酸（出発量）のモル比を得るように添加され
る。水溶液中AMPAとグリコール酸とを合して後、得られ
た混合物のpHを６〜10、好ましくは7.0〜9.0の値に調節
する。このpHの範囲内で、アルカリ金属水酸化物、炭酸
塩、重炭酸塩及び燐酸塩を含むいずれかの相容性の妨害
しない塩基を添加することによって、正確な値を調節し
て所望のpHを得ることができる。反応混合物のpHは、反
応が進行するのに従ってわずかに低下するので、最高酵
素活性pH範囲、約9.0〜8.5の上限近くで反応を開始し、
そして反応の間に低下させることがしばしば有用であ
る。酵素活性はpHと共に変動するので、場合によっては
妨害しない無機又は有機緩衝剤の別の添加によってpHを
保持することができる。
グリコール酸及びグリオキシル酸は、水中高度に解離
されており、６〜10のpHにおいては実質的に全部でなく
ても大部分グリコレート及びグリオキシレートイオンと
して存在すると理解される。グリオキシル酸（及びその
共役塩基、グリオキシレート陰イオン）は、水和物、例
えば（HO）2CHCOOH及び（又は）ヘミアセタールとして
も存在することがあることも、当業者に認められる。HO
OCCH（OH）OCH（OH）COOHは、その組成及びその陰イオ
ン相補物は、Ｎ−（ホスホノメチル）グリシンの生成の
ための適当な反応剤であるという本発明の目的の場合に
はグリコール酸及びその陰イオンと均等である。
グリコール酸のグリオキシル酸への変換のための酸化
剤である酵素（O2）は、ガスー液界面における液の撹拌
によるか又は酸素透過性の膜を通して、ガスとして反応
物に添加されてよい。大抵の条件下では、酸素が水性媒
質中に溶解することができる速度によって反応速度が少
なくとも部分的にコントロールされると考えられる。即
ち、酸素は、空気として反応物に添加することができる
が、比較的純粋な形態の酸素を使用し、そして高圧で使
用することさえも好ましい。酸素圧の上限は知られてい
ないが、50気圧までの酸素圧を使用することができ、15
気圧の上限が好ましい。高い酸素溶解（従って、反応）
速度を維持するために撹乱が重要である。撹拌等のいず
れかの都合のよい撹乱の形態が有用である。一方、酵素
技術者に周知のように、高せん断撹乱又は泡を生じる撹
乱は、酵素の活性を低下させることがあり、避けるべき
である。
反応温度は、反応速度及び酵素の安定性に影響すると
いう点で重要な変数である。０℃〜40℃の反応温度を使
用してよいが、好ましい反応温度範囲は５℃〜15℃であ
る。好ましい温度範囲において操作することは、反応の
終末において回収される酵素活性を最大にする。この温
度は、水溶液が凍結し始める程低くてはならない。温度
は、普通の方法、例えばジャケット型反応容器を使用
し、そして適当な温度の液をジャケットに通すことによ
ってコントロールすることができるが、これに限定され
ない。反応容器は、反応成分に不活性であるいずれかの
材料によって構築されてよい。
反応の完了時、酵素は、濾過又は遠心分離によって除
去し、再使用することができる。別法として、それらは
加熱（例えば70℃において５分間）によって変性析出さ
せることができ、そして（又は）グリオキシル酸−アミ
ノメチルホスホン酸混合物をＮ−（ホスホノメチル）グ
リシンに変換し、そして反応混合物からＮ−（ホスホノ
メチル）グリシンを回収する後の工程においてそれらの
存在が異議がない場合には、反応混合物中に留まらせる
ことができる。
反応混合物のO2との接触を停止して後、そして好まし
くは酵素グリコレートオキシダーゼ及び酵素カタラーゼ
（存在するときには）の除去の後、溶液を活性炭と接触
させることによって、場合によってはフラビンモノヌク
レオチドを除去することができる。グリオキシル酸及び
アミノメチルホスホン酸（これは対応するイミンと平衡
状態にあると考えられる）を含有する溶液を還元し、Ｎ
−（ホスホノメチル）グリシンを得る。
接触水素添加は、グリオキシル酸及びアミノメチルホ
スホン酸の混合物からのＮ−（ホスホノメチル）グリシ
ンの好ましい製法である。この目的のために適当な触媒
は、種々の白金族金属、例えばイリジウム、オスミウ
ム、ロジウム、ルテニウム、白金及びパラジウム；又種
々の他の遷移金属、例えばコバルト、銅、ニッケル及び
亜鉛を包含する（がそれらに限定されない）。触媒は、
例えばラネーニッケル又は酸化白金のように支持されて
いなくてよく、又は例えば白金黒、アルミナ上パラジウ
ム、あるいは珪藻土上ニッケルのように支持されていて
よい。パラジウム黒、珪藻土上ニッケル及びラネーニッ
ケルが好ましい。
水素添加は、４〜11、好ましくは５〜10のpHにおいて
行うことができる。このpH範囲内で、いずれかの相容性
の妨害しない塩基又は酸を添加することにより、正確な
値を調節して所望のpHを得ることができる。適当な塩基
は、アルカリ金属水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩及び燐酸
塩を包含するが、それらに限定されず、一方適当な酸
は、塩酸、硫酸、又は燐酸を包含するが、それらに限定
されない。
水素添加の温度及び圧力は広く変わることができる。
温度は、一般に０℃〜150℃、好ましくは20℃〜90℃の
範囲であってよく、一方H2圧は、一般にほぼ大気圧〜約
100気圧、好ましくは１〜10気圧である。水素添加触媒
は、所望の反応速度及び選ばれた反応条件下出発物質の
全変換を得る最低濃度で用いられる。この濃度は試験に
よって容易に決定される。触媒は、反応中用いられるグ
リコール酸及びAMPAを合わせた重量100部あたり触媒の
重量で0.001〜20部又はそれ以上の量で使用することが
できる。
Ｎ−（ホスホノメチル）グリシンは、発生後除草剤と
して有用であり、還元法として何が用いられたにして
も、米国特許4,851,159及び4,670,191、並びにヨーロッ
パ特許出願186648及び413672に開示されている方法を含
む、当該技術に既知の回収法のいずれかによって還元溶
液から回収することができる。
次の実施例は、本発明を更に例示する役割を果たし、
そこではグリオキシレート、ホルメート及びオキサレー
トの収量、並びにグリコレートの回収収量は、反応の始
めに存在したグリコール酸の全量を基にした百分率であ
る。反応混合物の分析は、高圧液体クロマトグラフィー
を使用して行われた。有機酸の分析は、Bio−Rad HPX
−87Hカラムを使用して行われ、そしてAMPA及びＮ−
（ホスホノメチル）グリシンは、Bio−Rad Aminexグリ
ホセート分析カラムを使用して分析された。Ｎ−（ホス
ホノメチル）グリシンの報告されている収量は、どちら
が反応において限界試剤であるかにより、グリオキシレ
ートかAMPAかを基にする。
実施例１ ３オンスのフィッシャー−ポーターのガラス製エアロ
ゾル反応容器に、磁気撹拌棒を設置し、グリコール酸
（0.25モル）、アミノメチルホスホン酸（AMPA,0.263モ
ル）、FMN（0.01ミリモル）、プロピオン酸（HPLC内部
規格、0.125モル）、グリコレート オキシダーゼ（ホ
ウレンソウからのもの、1.0IU/mL），およびカタラーゼ
（アスペルギルス ニガーからのもの、1,400IU/mL）を
含む水溶液10mLをpH8.5で装入した。反応容器をシール
し、反応混合物を15℃に冷却し次いで反応容器を撹拌し
ながら５回70psigに加圧しては常圧に戻して酸素でフラ
ッシュさせた。この反応容器を次いで70psigに酸素で加
圧し混合物を15℃で撹拌した。反応の進行をモニターす
るためのHPLCによる分析のために定期的な間隔で分別量
（0.10mL）をサンプリングポートから（反応容器の圧力
損失なしに）シリンジで取り出した。５時間後のHPLCで
のグリオキシレート、ホルメート、およびオキザレート
の収率は、それぞれ70.4％、19.6％、及び2.2％で、5.3
％のグリコレートは残留した。グリコレートオキシダー
ゼおよびカタラーゼの残留活性はそれらの初期値のそれ
ぞれ27％および100％であった。
実施例 ２（比較例） 0.265モルのAMPAの代わりに0.33モルのK2HPO4を用い
て実施例１の反応を繰り返した。５時間後のHPLCでのグ
リオキシレート、ホルメート、およびオキザレートの収
率は、それぞれ34.1％、11.1％、及び0.2％で、58.7％
のグリコレートは残留した。23時間後のHPLCでのグリオ
キシレート、ホルメート、およびオキザレートの収率
は、それぞれ39.4％、44.7％、及び15.34％で、グリコ
レートは残留しなかった。グリコレートオキシダーゼお
よびカタラーゼの残留活性はそれらの初期値のそれぞれ
85％および87％であった。
実施例 ３（比較例） 0.265モルのAMPAの代わりに0.263モルのビシン緩衝液
を用いて実施例１の反応を繰り返した。５時間後のHPLC
でのグリオキシレート、ホルメート、およびオキザレー
トの収率は、それぞれ42.5％、49.6％、及び10.1％で、
0.2％のグリコレートが残留した。グリコレートオキシ
ダーゼおよびカタラーゼの残留活性はそれらの初期値の
それぞれ47％および100％であった。
実施例 ４ アスペルギルス ニガーからのカタラーゼ5,600IU/mL
を用いて実施例１の反応を繰り返した。６時間後のHPLC
でのグリオキシレート、ホルメート、およびオキザレー
トの収率は、それぞれ85.5％、7.6％、及び3.3％で、2.
5％のグリコレートが残留した。グリコレートオキシダ
ーゼおよびカタラーゼの残留活性はそれらの初期値のそ
れぞれ36％および100％であった。
実施例 ５ アスペルギルス ニガーからのカタラーゼ14,000IU/m
Lを用いて実施例１の反応を繰り返した。６時間後のHPL
Cでのグリオキシレート、ホルメート、およびオキザレ
ートの収率は、それぞれ88.0％、3.3％、及び3.0％で、
3.4％のグリコレートが残留した。グリコレートオキシ
ダーゼおよびカタラーゼの残留活性はそれらの初期値の
それぞれ28％および96％であった。
実施例 ６ アスペルギルス ニガーからのカタラーゼ56,000IU/m
Lを用いて実施例１の反応を繰り返した。６時間後のHPL
Cでのグリオキシレート、ホルメート、およびオキザレ
ートの収率は、それぞれ84.0％、0.4％、及び2.5％で、
8.4％のグリコレートが残留した。グリコレートオキシ
ダーゼおよびカタラーゼの残留活性はそれらの初期値の
それぞれ16％および76％であった。
実施例 ７ ３オンスのフィッシャー−ポーターのガラス製エアロ
ゾル反応容器に、磁気撹拌棒を設置し、グリコール酸
（0.25モル）、アミノメチルホスホン酸（AMPA,0.20モ
ル）、FMN（0.01ミリモル）、酪酸（HPLC内部規格、0.1
0モル）、グリコレート オキシダーゼ（ホウレンソウ
からのもの、1.0IU/mL），およびカタラーゼ（アスペル
ギルス ニガーからのもの、14,000IU/mL）を含む水溶
液10mLをpH8.5で装入した。反応容器をシールし、反応
混合物を５℃に冷却し次いで反応容器を撹拌しながら５
回70psigに加圧しては常圧に戻して酸素でフラシュさせ
た。この反応容器を次いで70psigに酸素で加圧し、混合
物を５℃で撹拌した。反応の進行をモニターするための
HPLCによる分析のために定期的な間隔で分別量（0.10m
L）をサンプリングポートから（反応容器の圧力損失な
しに）シリンジで取り出した。６時間後のHPLCでのグリ
オキシレート、ホルメート、およびオキザレートの収率
は、それぞれ92.3％、4.36％、及び5.5％で、グリコレ
ートは残留しなかった。グリコレートオキシダーゼおよ
びカタラーゼの残留活性はそれらの初期値のそれぞれ87
％および88％であった。反応混合物の最終pHは6.7であ
った。
得られたグリコール酸（0.23モル）とAMPA（0.20モ
ル）の混合物をAmicon Centriprep 10濃縮器（10,000
分子量カットオフ）を用いて濾過し、可溶性酵素を除
き、次いで濾液を磁気撹拌棒が設置された３オンスのフ
ィッシャー−ポーターの瓶に装入した。次いでこの瓶に
10％Pd/Cの0.100gを加え、瓶をシールし窒素ガスでフラ
シュし、次いで水素で50psigに加圧し25℃で撹拌した。
17時間後のＮ−（ホスホノメチル）−グリシンの濃度は
HPLCで定量して0.13モル（AMPAに基づいて66％収率）で
あった。
実施例 ８ ３オンスのフィッシャー−ポーターのガラス製エアロ
ゾル反応容器に、磁気撹拌棒を設置し、グリコール酸
（0.50モル）、アミノメチルホスホン酸（AMPA,0.40モ
ル）、FMN（0.01ミリモル）、酪酸（HPLC内部規格、0.1
0モル）、グリコレート オキシダーゼ（ホウレンソウ
からのもの、1.0IU/mL），およびカタラーゼ（アスペル
ギルス ニガーからのもの、14,000IU/mL）を含む水溶
液10mLをpH8.5で装入した。反応容器をシールし、反応
混合物を５℃に冷却し（さきの実施例の15℃に代え
て）、次いで撹拌しながら反応容器を５回70psigに加圧
しては常圧に戻して酸素でフラシュさせた。この反応容
器を次いで70psigに酸素で加圧し、混合物を５℃で撹拌
した。反応の進行をモニターするためのHPLCによる分析
のために定期的な間隔で分別量（0.10mL）をサンプリン
グポートから（反応容器の圧力損失なしに）シリンジで
取り出した。17.5時間後のHPLCでのグリオキシレート、
ホルメート、およびオキザレートの収率は、それぞれ9
1.0％、2.9％、及び2.9％で、4.1％のグリコレートが残
留した。反応混合物の最終pHは6.7であった。グリコレ
ートオキシダーゼおよびカタラーゼの残留活性はそれら
の初期値のそれぞれ63％および91％であった。
得られたグリコール酸（0.46モル）とAMPA（0.40モ
ル）の混合物をAmicon Centriprep 10濃縮器（10,000
分子量カットオフ）を用いて濾過し、可溶性酵素を除
き、次いで濾液を磁気撹拌棒が設置された３オンスのフ
ィッシャー−ポーターの瓶に装入した。次いでこの瓶に
10％Pd/Cの0.100gを加え、瓶をシールし窒素ガスでフラ
シュし、次いで水素で50psiに加圧し25℃で撹拌した。1
7時間後のＮ−（ホスホノメチル）−グリシンの濃度はH
PLCで定量して0.29モル（AMPAに基づいて72％収率）で
あった。
実施例 ９ 実施例８のグリコール酸の酵素酸化を、グリコール酸
（0.75モル）、アミノメチルホスホン酸（AMPA,0.60モ
ル）、FMN（0.01ミリモル）、酪酸（HPLC内部規格、0.1
0モル）、グリコレート オキシダーゼ（ホウレンソウ
からのもの、2.0IU/mL），およびカタラーゼ（アスペル
ギルス ニガーからのもの、14,000IU/mL）を含む水溶
液10mLを用いてpH8.5で繰り返した。40時間後のHPLCで
のグリオキシレート、ホルメート、およびオキザレート
の収率は、それぞれ83.2％、2.3％、及び7.5％で、グリ
コレートは残留しなかった。反応混合物の最終pHは6.8
であった。グリコレートオキシダーゼおよびカタラーゼ
の残留活性はそれらの初期値のそれぞれ65％および86％
であった。
得られたグリコール酸（0.62モル）とAMPA（0.60モ
ル）の混合物をAmicon Centriprep 10濃縮器（10,000
分子量カットオフ）を用いて濾過し、可溶性酵素を除
き、次いで濾液を磁気撹拌棒が設置された３オンスのフ
ィッシャー−ポーターの瓶に装入した。次いでこの瓶に
10％Pd/Cの0.100gを加え、瓶をシールし、窒素ガスでフ
ラシュし、次いで水素で50psiに加圧し25℃で撹拌し
た。24時間後のＮ−（ホスホノメチル）−グリシンの濃
度はHPLCで定量して0.42モル（AMPAに基づいて70％収
率）であった。
実施例 10 実施例８のグリコール酸の酵素酸化を、グリコール酸
（1.0モル）、アミノメチルホスホン酸（AMPA,0.80モ
ル）、FMN（0.01ミリモル）、酪酸（HPLC内部規格、0.1
0モル）、グリコレート オキシダーゼ（ホウレンソウ
からのもの、2.0IU/mL），およびカタラーゼ（アスペル
ギルス ニガーからのもの、14,000IU/mL）を含む水溶
液10mLを用いてpH8.5で繰り返した。66時間後のHPLCで
のグリオキシレート、ホルメート、およびオキザレート
の収率は、それぞれ78.9％、2.2％、及び12.1％で、2.0
％のグリコレートが残留した。反応混合物の最終pHは6.
9であった。グリコレートオキシダーゼおよびカタラー
ゼの残留活性はそれらの初期値のそれぞれ64％および87
％であった。
得られたグリコール酸（0.79モル）とAMPA（0.80モ
ル）の混合物をAmicon Centriprep 10濃縮器（10,000
分子量カットオフ）を用いて濾過し、可溶性酵素を除
き、次いで濾液を磁気撹拌棒が設置された３オンスのフ
ィッシャー−ポーターの瓶に装入した。次いでこの瓶に
10％Pd/Cの0.100gを加え、瓶をシールし、窒素ガスでフ
ラシュし、次いで水素で50psiに加圧し25℃で撹拌し
た。23時間後のＮ−（ホスホノメチル）−グリシンの濃
度はHPLCで定量して0.51モル（グリコール酸に基づいて
65％収率）であった。
実施例 11 実施例８の反応をpH8.0で繰り返した。17.5時間後のH
PLCでのグリオキシレート、ホルメート、およびオキザ
レートの収率は、それぞれ87.0％、2.2％、及び1.9％
で、8.5％のグリコレートが残留した。グリコレートオ
キシダーゼおよびカタラーゼの残留活性はそれらの初期
値のそれぞれ44％および97％であった。
実施例 12 実施例８の反応をpH7で繰り返した。17.5時間後のHPL
Cでのグリオキシレート、ホルメート、およびオキザレ
ートの収率は、それぞれ88.0％、1.4％、及び1.9％で、
8.2％のグリコレートが残留した。グリコレートオキシ
ダーゼおよびカタラーゼの残留活性はそれらの初期値の
それぞれ44％および93％であった。
実施例 13 ３オンスのフィッシャー−ポーターのガラス製エアロ
ゾル反応容器に、磁気撹拌棒を設置し、グリコール酸
（0.50モル）、FMN（0.01ミリモル）、イソ酪酸（HPLC
内部規格、0.10モル）、グリコレート オキシダーゼ
（ホウレンソウからのもの、1.0IU/mL），およびカタラ
ーゼ（アスペルギルス ニガーからのもの、14,000IU/m
L）を含む水溶液10mLをpH8.5で装入した。反応容器をシ
ールし、反応混合物を５℃に冷却し次いで反応容器を撹
拌しながら５回70psigに加圧しては常圧に戻して酸素で
フラシュさせた。この反応容器を次いで70psigに酸素で
加圧し、混合物を５℃で撹拌した。反応の進行をモニタ
ーするためのHPLCによる分析のために定期的な間隔で分
別量（0.10mL）をサンプリングポートから（反応容器の
圧力損失なしに）シリンジで取り出した。21時間後のHP
LCでのグリオキシレート、ホルメート、およびオキザレ
ートの収率は、それぞれ81.7％、1.2％、及び2.2％で、
7.5％のグリコレートが留した。グリコレートオキシダ
ーゼおよびカタラーゼの残留活性はそれらの初期値のそ
れぞれ19％および77％であった。この反応を次ぎにグリ
コール酸0.50モルおよびアミノメチルホスホン酸（AMP
A）0.25モル、0.40モル、0.50モル、または0.62モルの
存在下に繰り返した。お混合物の最終pHは6.7であっ
た。これらの反応の反応生成物の収率、および酵素回収
率は次に示される。
実施例 14 実施例８のグリコール酸の酵素酸化を、グリコール酸
（0.25モル）、アミノメチルホスホン酸（AMPA,0.263モ
ル）、FMN（0.01ミリモル）、酪酸（HPLC内部規格、0.2
5モル）、グリコレート オキシダーゼ（ホウレンソウ
からのもの、1.0IU/mL），およびカタラーゼ（アスペル
ギルス ニガーからのもの、14,000IU/mL）を含む水溶
液10mLを用いてpH7.0で15℃において繰り返した。８時
間後のHPLCでのグリオキシレート、ホルメート、および
オキザレートの収率は、それぞれ82.8％、0.9％、及び
2.1％で、13.9％のグリコレートが残留した。反応混合
物の最終pHは6.6であった。
このグリコール酸（0.21モル）とAMPA（0.263モル）
の混合物をAmicon Centriprep 10濃縮器（10,000分子
量カットオフ）を用いて濾過し、可溶性酵素を除き、次
いでこの濾液と50mgの10％Pd/Cとをガラス内張りを施し
たステンレス鋼製圧力容器に装入した。次いでこの容器
をシールし、窒素ガスでフラシュし、次いで水素ガスで
1000psiに加圧し25℃で震盪した。容器の圧力は最初の
0.5時間に着実に下降し、ついで容器を1000psiに再加圧
した。４時間後に容器の圧力を放出し容器を窒素でフラ
シュした。Ｎ−（ホスホノメチル）−グリシンの濃度は
HPLCで定量して0.16モル（グリコール酸に基づいて76％
収率）であった。
実施例 15 実施例14のグリコール酸の酵素酸化をpH8で繰り返し
た。８時間後のHPLCでのグリオキシレート、ホルメー
ト、およびオキザレートの収率は、それぞれ86.7％、1.
8％、及び4.1％で、13.2％のグリコレートが残留した。
反応混合物の最終pHは6.7であった。
このグリコール酸（0.22モル）とAMPA（0.263モル）
との混合物を実施例５に記載された操作と同じ操作で10
00psiで水素化した。４時間後Ｎ−（ホスホノメチル）
−グリシンの濃度をHPLCで定量したところ0.14モル（グ
リコール酸に基づいて64％収率）であった。
実施例 16 実施例14のグリコール酸の酵素酸化をpH9で繰り返し
た。７時間後のHPLCでのグリオキシレート、ホルメー
ト、およびオキザレートの収率は、それぞれ70.0％、5.
6％、及び11.1％で、グリコレートの残留はなかった。
反応混合物の最終pHは6.8であった。
このグリコール酸（0.18モル）とAMPA（0.263モル）
との混合物を実施例５に記載された操作と同じ操作で10
00psiで水素化した。４時間後Ｎ−（ホスホノメチル）
−グリシンの濃度をHPLCで定量したところ0.094モル（A
MPAに基づいて52％収率）であった。
実施例 17 実施例14のグリコール酸の酵素酸化をpH8.5でグリコ
ール酸とAMPAの初期濃度をそれぞれ0.50モルおよび0.40
モルとして繰り返した。16.5時間後のHPLCでのグリオキ
シレート、ホルメート、およびオキザレートの収率は、
それぞれ85.4％、3.5％、及び6.3％で、1.4％のグリコ
レートが残留していた。反応混合物の最終pHは7.0であ
った。
このグリコール酸（0.43モル）とAMPA（0.40モル）と
の混合物を実施例５に記載された操作と同じ操作で1000
psiで水素化した。４時間後Ｎ−（ホスホノメチル）−
グリシンの濃度をHPLCで定量したところ0.30モル（AMPA
に基づいて75％収率）であった。
実施例 18 実施例８のグリコール酸の酵素酸化を、グリコール酸
（0.50モル）、アミノメチルホスホン酸（AMPA,0.375モ
ル）、FMN（0.01ミリモル）、酪酸（HPLC内部規格、0.1
0モル）、グリコレート オキシダーゼ（ホウレンソウ
からのもの、1.0IU/mL），およびカタラーゼ（アスペル
ギルス ニガーからのもの、14,000IU/mL）を含む水溶
液10mLを用いてpH8.5で繰り返した。17時間後のHPLCで
のグリオキシレート、ホルメート、およびオキザレート
の収率は、それぞれ87.1％、1.9％、及び2.1％で、8.9
％のグリコレートが残留した。反応混合物の最終pHは6.
7であった。
このグリコール酸（0.435モル）とAMPA（0.375モル）
の混合物をAmicon Centriprep 10濃縮器（10,000分子
量カットオフ）を用いて濾過し、可溶性酵素を除き、次
いでこの濾液を50mgの脱色用のカーボンと混合して（FM
Nを除き）再び濾過した。
濾液を磁気撹拌棒を装着した３オンスのフィッシャー
−ポーターの瓶に装入した。次いでこの瓶にの0.100gの
10％Pd/Cを加え、瓶をシールし、窒素ガスでフラシュ
し、次いで水素で50psiに加圧し25℃で撹拌した。17時
間後のＮ−（ホスホノメチル）−グリシンの濃度はHPLC
で定量して0.372モル（AMPAに基づいて99％収率）であ
った。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ７８８，６８３ (32)優先日 平成３年11月６日(1991．11．6) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (72)発明者 デイコージモ，ロバート アメリカ合衆国デラウエア州 19808. ウイルミントン．フオークスドライブ 2817 (72)発明者 ポータ，アーネスト・ウイリアム アメリカ合衆国ペンシルベニア州 19350．ランデンバーグ．フオツクスブ ルツクドライブ104 (56)参考文献 特開 昭61−161291（ＪＰ，Ａ) 特表 平７−501940（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 7/40 C07F 9/38 C12P 13/04 ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims (21)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】グリオキシル酸成分とアミノメチルホスホ
    ン酸成分とからなるＮ−（ホスホノメチル）グリシンの
    製造のための中間体の製造方法であって、アミノメチル
    ホスホン酸の存在下でグリコール酸成分がグリオキシル
    酸成分へグリコレートオキシダーゼにより触媒されて変
    換されることを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】アミノメチルホスホン酸とグリコレートオ
    キシダーゼおよびカタラーゼの酵素との存在下で、水溶
    液中のグリコール酸を酸素で酸化する工程を含むことを
    特徴とするグリオキシル酸とアミノメチルホスホン酸と
    の混合物の製造方法。
  3. 【請求項３】Ｎ−（ホスホノメチル）グリシンの製造の
    ための中間体として有用な混合物の製造方法であって、
    グリコール酸成分とアミノメチルホスホン酸成分の水溶
    液に、グリコール酸成分の酸素による酸化を触媒してグ
    リオキシル酸成分と過酸化水素とを生成させるための第
    １の触媒としてのグリコレートオキシダーゼならびに過
    酸化水素の分解を触媒するための第２の触媒を加え、該
    溶液のpHを６と約10の間に調整し、該溶液を酸素源と有
    効な温度および十分な時間接触させてアミノメチルホス
    ホン酸成分の存在下で少なくともグリコール酸成分の１
    部をグリオキシル酸成分へ変換することにより該水溶液
    中にグリオキシル酸成分を生成させる工程、上記中間体
    をＮ−（ホスホノメチル）グリシンへ変換する前に該溶
    液と酸素との接触を停止させる工程を含むことを特徴と
    する製造方法。
  4. 【請求項４】（ａ）水溶液中、アミノメチルホスホン酸
    とグリコレートオキシダーゼおよびカタラーゼの酵素と
    の存在下でグリコール酸を酸素で酸化することによりグ
    リオキシル酸成分およびアミノメチルホスホン酸成分の
    混合物を製造する工程、および （ｂ）工程（ａ）で製造された混合物を還元してＮ−
    （ホスホノメチル）グリシンを生成する工程 を含んでなるＮ−（ホスホノメチル）グリシンの製造方
    法。
  5. 【請求項５】１）グリコール酸成分、アミノメチルホス
    ホン酸成分、酸素によるグリコール酸の酸化を触媒して
    グリオキシル酸と過酸化水素とを生成させるための第１
    の触媒としてのグリコレートオキシダーゼ、ならびに過
    酸化水素の分解を触媒するための第２の触媒を水溶液中
    に組入れ、該溶液のpHを６と約10の間に調整することに
    より水溶液中でグリオキシル酸成分とアミノメチルホス
    ホン酸成分との混合物を酵素的に生成させる工程、 ２）該溶液と酸素との接触を停止させる工程、次いで ３）上記混合物を水素添加せしめてＮ−（ホスホノメチ
    ル）グリシンを生成する工程、 を含むことを特徴とするＮ−（ホスホノメチル）グリシ
    ンの製造方法。
  6. 【請求項６】カタラーゼの存在下で実施される請求項1,
    3または５に記載の製造方法。
  7. 【請求項７】フラビンモノヌクレオチドの存在下で実施
    される請求項１〜６のいずれかに記載の製造方法。
  8. 【請求項８】酸素反応が０℃乃至約40℃の温度で実施さ
    れる請求項１〜７のいずれかに記載の製造方法。
  9. 【請求項９】グリコレートオキシダーゼが0.01乃至1000
    IU/mlの濃度で存在する請求項１〜８のいずれかに記載
    の製造方法。
  10. 【請求項１０】カタラーゼが50乃至50,000IU/mlの濃度
    で存在する請求項１〜９のいずれかに記載の製造方法。
  11. 【請求項１１】工程（ａ）で生成した上記溶液から工程
    （ｂ）の還元の前にグリコレートオキシダーゼとカタラ
    ーゼを分離し回収する工程をさらに含んでなる請求項４
    に記載の製造方法。
  12. 【請求項１２】工程（ａ）のグリオキシル酸混合物の生
    成がフラビンモノヌクレオチドの存在下で行われ、工程
    （ｂ）の還元の前に工程（ａ）で生成した上記溶液から
    上記フラビンモノヌクレオチドを分離する工程をさらに
    含んでなる請求項４に記載の製造方法。
  13. 【請求項１３】第２の触媒がカタラーゼである請求項５
    に記載の製造方法。
  14. 【請求項１４】水素添加が触媒の存在下で実施される請
    求項５に記載の製造方法。
  15. 【請求項１５】水素添加触媒がパラジュウム炭素、ニッ
    ケル珪藻土およびラネーニッケルからなる群から選択さ
    れたものである請求項14に記載の製造方法。
  16. 【請求項１６】水素添加触媒が使用されたグリオキシル
    酸とアミノメチルホスホン酸の合計重量100部当たり0.0
    01乃至20重量部存在する請求項15に記載の製造方法。
  17. 【請求項１７】水素添加が４乃至11のpH、０℃乃至150
    ℃の範囲の温度および１乃至約100気圧の水素圧で実施
    される請求項15に記載の製造方法。
  18. 【請求項１８】請求項１、２または３に記載の方法で得
    られる中間体をＮ−ホスホノメチルグリシンを形成する
    ように還元する工程を含むことを特徴とするＮ−ホスホ
    ノメチルグリシンの製造方法。
  19. 【請求項１９】中間体が接触水素添加により還元される
    請求項18に記載の製造方法。
  20. 【請求項２０】中間体の反応混合物が製造された反応系
    内で中間体が水素添加される請求項19に記載の方法。
  21. 【請求項２１】Ｎ−ホスホノメチルグリシンの製造のた
    めに請求項1,2または３のいずれかの１つに記載の方法
    を使用する方法。
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