CN1073482A - 酶促生成的二羟乙酸/氨甲基膦酸混合物的氢化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种N-(膦酰基甲基)甘氨酸，也称 为草甘膦的制备方法，该方法包括氢化二羟乙酸和氨 甲基膦酸的混合物，该混合物是就地在含有氨甲基膦 酸和甘醇酸酯酶和过氧化氢酶的水溶液存在下由乙 醇酸和氧气反应而酶促生成的。

Description

本发明是关于由在含有氨甲基膦酸（AMPA）和甘醇酸酯氧化酶（（S）-2-羟基-酸氧化酶，EC1.1.3.15）及过氧化氢酶（EC1.11.1.6）的水溶液中乙醇酸和氧气反应生成的混合物氢化制备N-（膦酰基甲基）甘氨酸的方法。N-（膦酰基甲基）甘氨酸是一种可用于控制多种植物生长的广谱苗后除草剂。
甘醇酸酯氧化酶，一种通常存在于多叶绿色植物和哺乳动物细胞中的酶，它能催化乙醇酸氧化成二羟乙酸并在氧化过程中有附随物质过氧化氢生成：
N.E.Tolbert等人，在J.Biol.Chem.，Vol，181，905-914（1949）中首次报道了一种从烟草叶中萃取得到的酶，它能催化氧化乙醇酸其中经过中间产物二羟乙酸的生成而最终制得甲酸和CO2。某些化合物的加入，例如乙二胺的加入限制了中间产物二羟乙酸的进一步氧化。氧化反应是在pH值约为8的条件下进行，典型的乙醇酸所用的浓度为约3-40mM（毫摩尔）。优选的用于甘醇酸酯氧化反应的pH值据报道应为8.9。草酸（100mM）可用来抑制甘醇酸酯氧化酶的催化作用。同样，K.E.Richardson和N.E.Tolbert，在J.Biol.Chem.，Vol.236，1280-1284（1961）中揭示了含有三（羟基甲基）氨基甲烷（TRIS）的缓冲剂抑制草酸在乙醇酸的甘醇酸酯氧化酶催化氧化过程中的生成。C.O.Clagett，N.E.Tolbert和R.H.Burris，在J.Biol.Chem.，Vol.178.977-987（1949）中报道了用于乙醇酸和氧气的甘醇酸酯氧化酶催化氧化方法中优选的pH值为7.8-8.6，优选的温度为35-40℃。
I.Zelitch和S.Ochoa，在J.Biol.Chem.，Vol.201，707-718（1953）中和J.C，Robinson等人在J.Biol.Chem.，Vol.237，2001-2009（1962）中报道了在菠菜甘醇酸酯氧化酶催化氧化乙醇酸的过程中由于H2O2与二羟乙酸的非酶反应生成了甲酸和CO2。他们观察到了过氧化氢酶即催化H2O2分解的酶的加入由于其抑制了甲酸和CO2的生成从而极大地提高了二羟乙酸的收率。FMN（黄素单核苷酸）的加入还极大地增进了甘醇酸酯氧化酶的稳定性。
N.A.Frigerio和H.A.Harbury，在J.Biol.Chem.，Vol.231，135-157（1958）中报道了从菠菜中分离得到的乙醇酸氧化酶的制备方法和性质。已经发现纯化的酶在溶液中非常不稳定，这种不稳定性归因于黄素单核苷酸（FMN）对于酶活性位置相当微弱的结合和酶的酶活性四聚物和/或八聚物离解成酶钝化的单体和二聚物，也就是发生了可逆的聚集和沉淀，FMN（黄素单核苷酸）加入到酶溶液中将会极大地增加其稳定性，另外，高蛋白浓度或高的离子强度也能使酶维持于四聚物或八聚物。
另外还有其它众多的参考文献涉及用乙醇酸氧化酶催化乙醇酸氧化的方法。下列参考文献中描述了酶的分离方法（和分析方法）：I.Zelitch，的Methods    in    Enzymology，Vol.1，Academic，Pre-ss，New    York，1955，P.528-532（从菠菜和烟草叶中），M.Nishimura等人，在Arch.Biochem，Biophys，Vol.222，397-402（1983）中（从南瓜Cotyledons），H.Asker和D.Davies，Biochim.Biophys.Acta，Vol.761，103-108（1983）（从鼠肝脏中），和M.J.Emes和K.H.Erismann，在Int.J.Biochem.Vol.16，1373-1378（1984）中Lemna    minor    L中）对酶的结构同样也有报道如：E.Cederlund等人在Eur，J，Biochem.，Vol.173，523-530（1988）中和Y.Lindquist和C.Branden，J.Biol，Chem.Vol.264.3624-3628（1989）。
现有技术中已知有多种从氨甲基膦酸和二羟乙酸制备N-（膦酰基甲基）甘氨酸的方法。Rogers等人在欧洲专利申请186，648中就描述了一种这样的方法，它包括二羟乙酸或其盐与氨甲基膦酸或其盐的缩合生成中间产物，通常认为该中间产物是醛亚胺（席夫碱），然后不经分离通过催化加氢将该中间产物还原成N-（膦酰基甲基）苷氨酸。第二种方法是由Gaertner在美国专利4，094，928号中描述的，它包括分离由二羟乙酸酯和氨甲基膦酸酯在无水溶液中反应制得的相同的中间产物羰基醛亚氨甲膦酸酯，在水的共沸精馏和除去溶剂之后，将羰基醛亚氨甲膦酸酯还原并使酯基团水解制得了N-（膦酰基甲基）甘氨酸。
上述N-（膦酰基甲基）甘氨酸的合成路线的缺点是起始原料二羟乙酸成本太高，因此其它的较为经济的合成所需起始原料的路线被广泛地实践应用。现存的制备二羟乙酸的方法有，例如二卤乙酸水解，草酸的电解还原，乙二醛的氧化，乙烯或乙醛的催化氧化和马来酸，它的酯或酐的臭氧分解，但这些方法在实践中存在一种或多种困难，例如高成本的分离/净化步骤，低收率或大量的三废流。Gaertner描述的方法也有缺点，即该方法需要多个附加步骤（伴随了相应的收率损失），和中间产物不必要的分离。
另一种合成N-（膦酰基甲基）甘氨酸的方法公开在Kleiner的美国专利4，670，191号中，它包括氨甲基膦酸或其盐与约2摩尔当量的二羟乙酸在含水介质中的反应。过量的二羟乙酸可用作还原剂将二羟乙酸-氨甲基膦酸反应的中间产物转化成所需的N-（膦酰基甲基）甘氨酸，该产物本身的氧化生成了一种或多种包括CO2在内的副产物。同样，Fields等人的美国专利4，851，159号中通过加热带有二羟乙酸或其衍生物的N-酰基氨甲基膦酸制备了N-（膦酰基甲基）甘氨酸。二羟乙酸与N-酰基氨基组份的摩尔比优选的为2至1，否则较小的摩尔比会使收率下降。
Kleiner和Fields等人的方法不但具有使用了相当昂贵的二羟乙酸的缺点而且还使用这些昂贵的二羟乙酸作为牺牲性的还原剂（计算值对于制备每1摩尔N-（膦酰基甲基）甘氨酸需使用一摩尔甘醇酸酯作为还原剂）以及用作氨基-（或N-酰基氨基）甲基膦酸的缩合剂。
根据本发明，制备N-（膦酰基甲基）甘氨酸的方法包括氢化一种混合物，该混合物是在含有氨甲基膦酸（AMPA）和甘醇酸酯氧化酶及过氧化氢酶的水溶液存在下由乙醇酸和氧气反应而酶促生成的。为了本发明的目的，在氨甲基膦酸存在下使乙醇酸进行酶氧化反应来制备所说的混合物是有利的，其结果是除了所需的二羟乙酸之外氧化副产物有一固有的分布（包括下列这些非限定性的实例，草酸酯，甲酸酯和二氧化碳）。另外，在该混合物中还存在有未反应的甘醇酸酯和各种其它添加剂，如黄素单核苷酸（下面将简称为FMN）或类似物质，所有这些物质可能或不可能对接着所要进行的加氢反应产生影响（再次说明以下非限制性的实例，在AMPA存在下的二羟乙酸氢化的过程中当有甲酸酯和FMN存在时将会降低回收的碳平衡）。因此，本发明进一步提供了从酶氧化所得的溶液中除去和回收酶以及在加氢步骤前任意地除去FMN。
本发明提供一种改进的制备N-（膦酰基甲基）甘氨酸的方法，它包括通过加氢来还原二羟乙酸和氨甲基膦酸的混合物的步骤;所说的混合物是就地在水溶液中通过下述方法而酶促生成的，该方法是，向水溶液中加入乙醇酸，用于乙醇酸与氧气制备二羟乙酸和过氧化氢的氧化反应的第一种催化剂和用于过氧化氢分解的第二种催化剂，溶液的pH值调节在6至约10之间，在有效的温度下和足够的时间内在氨甲基膦酸存在下使溶液和氧源接触至少将部分乙醇酸组份转化成二羟乙酸组份并在还原步骤之前停止溶液与氧气的接触。
优选的催化剂是酶，更优选的是，第一种酶是甘醇酸酯氧化酶（（S）-2-羟基-酸氧化酶，EC1.1.3.15），第二种酶是过氧化氢酶（EC1.11.1.6）。在催化剂/酶存在下停止溶液和O2接触之后，在该溶液进入还原条件制备N-（膦酰基甲基）甘氨酸之前用过滤或离心分离的方法除去催化剂/酶。
因此，由于不再需要单独的制备二羟乙酸的步骤，本发明提供了一种更有效更为经济的制备N-（膦酰基甲基）甘氨酸的方法。
本发明的目的是提供一种改进的通过还原二羟乙酸和氨甲基膦酸混合物制备N-（膦酰基甲基）甘氨酸的方法，该方法不需要独立地制备二羟乙酸。
本发明的另一个目的是提供这样一种方法，即在该方法中，在氨甲基膦酸存在下就地可由易得的二羟乙酸的前体即乙醇酸酶促生成二羟乙酸，从而使N-（膦酰基甲基）甘氨酸的制备更有效和更为经济。
按照本发明，制备N-（膦酰基甲基）甘氨酸的改进方法包括用氨甲基膦酸（AMPA）（或其适当的衍生物）还原含有二羟乙酸（或其适当的衍生物）的混合物，该混合物优选的是通过在AMPA和有效量能催化乙醇酸和O2的反应生成二羟乙酸的催化剂存在下由乙醇酸组份和分子氧源接触而催化氧化乙醇酸组份或其适当的盐制得。所用的催化剂可以是自然生成的酶，甘醇酸酯氧化酶（EC1.1.3.15），也有人称之为乙醇酸氧化酶，它能在温和的pH值和温度条件下含水介质中以高收率和高乙醇酸转化率进行催化制备二羟乙酸的反应，即：
乙醇酸或其适当的盐的催化氧化通常是在能催化乙醇酸和O2生成二羟乙酸的反应的酶催化剂存在下通过乙醇酸和分子氧源的接触而进行的。所用的催化剂是甘醇酸酯氧化酶（EC.1.1.3.15）也称作乙醇酸氧化酶。甘醇酸酯氧化酶可以从多种现有技术中已知的来源中分离获得。用于本发明反应中的甘醇酸酯氧化酶应以有效的浓度存在，通常为约0.01至约1000IU/ml，优选的为0.1至约4IU/ml.IU（国际单位）的定义为每分钟催化1微摩尔物质转变所需酶的量。测试这种酶的方法可参阅I.Zelitch和S.Ochoa的J.Biol.Chem;Vol 201，707-718（1953）。该方法也可用于回收或循环的甘醇酸酯氧化酶活性的测试。
虽然酶催化乙醇酸和氧气的反应是一种公知技术，但现有技术中从未获得高选择性的二羟乙酸，以前也从未报道过在氨甲基膦酸（AMPA）存在下进行乙醇酸的酶促氧化。在先申请国际专利公开号WO91/05868，1991年5月2日“用乙醇酸的酶促氧化制备二羟乙酸”中描述了在氧气、胺缓冲液、可溶的甘醇酸酯氧化酶和过氧化氢酶存在下将乙醇酸酶促转化成二羟乙酸的方法，该方法显示出预想不到的同时使用过氧化氢酶（破坏了副产物过氧化氢）和能与制得的二羟乙酸形成化学加合物的胺缓冲液（抑制了二羟乙酸的进一步氧化）的协同作用。单独加入使用过氧化氢酶或胺缓冲液都不能达到当两者同时使用时获得的高选择性，而且当同时使用过氧化氢酶和胺缓冲液时获得的二羟乙酸的收率要大于单独使用过氧化氢酶或胺缓冲液时所能获得的二羟乙酸收率。
由于二羟乙酸酯和胺缓冲液生成了抗氧化配合物（其中经历了N-取代半缩胶（hemiaminal）和/或亚胺的形成）而使制得的二羟乙酸酯的收率得到提高是由质子化的胺缓冲液的PKa决定的。在30℃和一个大气压氧气中，在胺缓冲液（0.33M，pH8.3），甘醇酸酯氧化酶（0.5IU/mL），过氧化氢酶（1，400IU/mL）和FMN（0.01mM）存在下氧化乙醇酸（0.25M）含水溶液24小时所得的结果列于下表，在表中同时还列出了使用两种不和二羟乙酸酯形成配合物的缓冲液（磷酸盐和N-二（羟乙基）甘氨酸）进行的反应。
缓冲液PKa    %草    %二羟    %甘醇    %甲
酸酯    乙酸酯    酸酯    酸酯
乙二胺(6.85,9.93)    6.8    85.5    0.8    2.4
TRIS(8.08)    1.1    81.0    2.8    12.0
甲胺(10.62)    1.0    53.9    39.8    5.1
乙醇胺(9.50)    1.8    69.6    4.81    24.5
氯化铵(9.24)    1.1    39.9    37.7    18.9
异丙醇胺(9.43)    2.0    60.0    4.8    37.4
N-二(羟乙基)甘氨酸(8.30)    1.0    24.9    25.6    43.8
磷酸盐(2.15,7.10,12.3)    0.7    24.5    52.4    21.2
从试验的胺缓冲液中可以看出，具有近似等于或低于反应混合物pH值的PKa的胺（即乙二胺和TRIS）能制得收率比使用那些PKas高于反应中pH值的胺缓冲液时高的多的二羟乙酸酯（和产生少量的甲酸酯的草酸酯）。这些结果是与非质子化胺可能必定与二羟乙酸酯生成抗氧化N-取代半缩胺和/或亚胺配合物的设想相一致，PKa高于反应混合物pH值的胺缓冲液主要以质子化的铵离子存在于反应混合物中，因此也就不容易与二羟乙酸形成所说的配合物。
氨甲基膦酸（AMPA）的质子化铵的PKa据报导为10.8（Lange’s“Handbook    of    Chemistry”，J.A.Dean，Ed.，Mc    Graw-Hill，New    York，1979第12版）。因此就不期望AMPA加入到pH为7至9的乙醇酸酶促氧化反应中会得到高收率的二羟乙酸。然而本申请的实施例却说明了使用这种胺可使二羟乙酸的收率高达92%。除获得了意想不到的高收率二羟乙酸之外，与不加入AMPA的反应相比（实施例13）AMPA的使用还改善了甘醇酸  氧化酶的回收和过氧化氢酶的活性。通常在使用酶催化剂的方法中需要回收用于循环的催化剂，因为催化剂的消耗会明显地提高总的生产成本。
在使用甘醇酸酯氧化酶作为催化剂氧化转化乙醇酸制备二羟乙酸的方法中的最佳效果是通过向反应溶液中掺入用于过氧化氢分解的催化剂而获得的。这种需与甘醇酸酯氧化酶结合使用才能有效破坏过氧化物的催化剂之一是过氧化氢酶（E.C.1.11.1.6）。过氧化氢酶催化过氧化氢分解成水和氧气，它在乙醇酸和O2的甘醇酸酯氧化酶催化反应中通过加速分解伴随二羟乙酸一同生成的过氧化氢而提高了本申请方法的二羟乙酸的收率。过氧化氢酶的浓度应为50至50，000IU/mL，优选的为500至15，000IU/mL。在上述范围内调节过氧化氢酶和甘醇酸酯氧化酶的浓度，以使过氧化氢酶和甘醇酸酯氧化酶的比率（每种酶以IU计）至少为约250∶1。
在反应溶液中的另一种任意的但通常是有益的成份是黄素单核苷酸（FMN），它通常是以0.0至约2.0mM，优选的为0.01至约0.2mM的浓度使用。可以相信FMN增加了甘醇酸酯氧化酶的产率即增加了每单位酶可使乙醇酸转化成二羟乙酸的量。应当明白的是添加的FMN的浓度是除与酶共同存在的FMN之外的，因为在酶的制备过程中，也常向酶中添加FMN。FMN的结构和它的分析方法可参阅在本申请中作为参考文献的K.Yagai的Methods    of    Biochemical    Analysis    Vol    X    Interscience    Publishers，New    York，1962，P.319-355。
乙醇酸（2-羟基乙酸）是商业上有售的物质。在本申请的方法中它的初始浓度为0.10M至2.0M，优选的为0.25M和1.0M。它可以以原形或其相容的盐使用，所说的盐是水溶性的而且它的阳离子不会对所需的乙醇酸向二羟乙酸的转化或对接着进行的氨甲基膦酸与二羟乙酸制备N-（膦酰基甲基）甘氨酸的反应产生干扰作用。合适的和相容的形成盐的阳离子基团易于用实验方法确定。具有代表性的盐有碱金属盐、碱土金属盐、铵盐、取代的铵盐、磷盐和取代的磷盐。
乙醇酸向二羟乙酸的转化较为容易，但优选的是在含水介质中进行。加入氨甲基膦酸（AMPA）或其适当的盐使AMPA/乙醇酸（起始量）的摩尔比达到0.01/1.0至3.0/1.0，优选的为0.25/1.0至1.05/1.0。在水溶液中AMPA和乙醇酸结合后，将所得混合物的pH值调至6和10，优选的为7.0至9.0。在该pH范围内，确切的值可通过加入相容的、无干扰的碱包括碱金属氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐和磷酸盐进行调节而获得。反应混合物的pH值随着反应的进行会略有下降。因此在反应初始将其pH调至接近于最佳酶活性pH范围的上端即约为9.0-8.5，并使其中反应过程中下降，由于酶活性是随pH而变化的，所以为维持反应过程中的pH可任意地通过单独加入无干扰的无机或有机缓冲液。
已经知道乙醇酸和二羟乙酸高度离解在水中，并且，如果不是其实质上全部地以甘醇酸酯或二羟乙酸离子存在的话，在pH为6和10的条件下，这种离解的程度会更大。本技术领域的普通技术人员也知道二羟乙酸（和它的共轭碱、二羟乙酸阴离子）还可以水合物的形式存在，例如（HO）2CHCOOH和/或以半缩醛HOOCCH（OH）OCH（OH）COOH的形式存在，它们的组合物和阴离子配对物等同于二羟乙酸并且它的阴离子适合用于本发明制备N-（膦酰基甲基）甘氨酸的反应物。
用于转化乙醇酸制备二羟乙酸的氧化剂，氧（O2）可以以气体通过在气液界面的液体搅动或通过透氧薄膜加入到反应中。可以相信，在大多数反应条件下，反应的速度至少部分地由氧气在含水介质中的溶解速度所控制。因此，尽管可以用空气作为氧气加入到反应中，但优选的还是使用相对纯的氧气，甚至使用高压力。虽然已知对氧化的压力上限没有限制，但是氧气压力最好还是低于50大气压，优选的上限为15大气压。搅动对于保持高的氧气溶解速度十分重要（由此而使反应进行）。搅动可以是任何常用的形式，如搅拌。另一方面，在酶技术领域内的普通技术人员也熟知，高剪切的搅动或搅拌会产生泡沫而降低酶的活性，因此应使其避免。
反应温度是一种重要的可变性条件，它会影响反应速度和酶的稳定性。反应温度可以为0℃至40℃，但优选的温度范围是5℃至15℃。在优选的温度范围内进行操作可使反应结束时回收酶的活性达到最大。温度不应太低，不能低至使含水溶液开始冷冻。可以用普通的方法控制温度，例如（不限于此方法）可使用有套反应器，其中将具有合适温度的液体流经反应器的套层以控制温度。反应器可以由任何对反应成份惰性的材料制成。反应结束后，用过滤或离心分离的方法分离出酶并重复使用。也可以通过加热例如加热到70℃5分钟使酶中毒并沉淀和/或如果它们的存在对接着要进行的二羟乙酸-氨甲基膦酸混合物向N-（膦酰基甲基）甘氨酸的转化步骤和从所得反应混合物中回收N-（膦酰基甲基）甘氨酸的步骤没有不利影响的话，可使它们仍然留在反应混合物中。
接着，停止反应溶液与O2的接触，然后优选的是除去甘醇酸酯氧化酶和过氧化氢酶（如有存在的话），通过使溶液与活性碳接触任意地除去黄素单核苷酸（FMN）。还原含有二羟乙酸和氨甲基膦酸（被认为与相应的亚胺相平衡）制得N-（膦酰基甲基）甘氨酸。
催化加氢是一种优选的从二羟乙酸和氨甲基膦酸的混合物制备N-（膦酰基甲基）甘氨酸的方法，适用的催化剂包括（但并不仅限于这几种）各种铂金属例如铱、锇、铑、钌、铂和钯;也可以是其它各种过渡金属如钴、铜、镍和锌。催化剂可以是无载体的，例如Raney镍或氧化铂，或可以是有载体的如碳上的铂，铝上的钯或硅藻土上的镍，其中碳上的钯，硅藻土上的镍和Raney镍是优选的。
加氢反应可以在pH为4至11，优选的为5至10的条件下进行。在该pH范围内，确切的值可通过加入任何相容的无干扰的碱或酸来调节以获得所需的pH。合适的碱包括（但不限于这些碱）碱金属氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐和膦酸盐。而合适的酸（不只限于这几种酸）包括盐酸、硫酸或磷酸。
加氢反应的温度和压力可以在一个很宽的范围内变化。温度通常为0℃至150℃，优选的为20℃至90℃，而H2的压力通常为常压至约100大气压，优选的为1至10大气压，加氢催化剂可以以在所选的反应条件下能足以获得所需的反应速度和起始原料总转化率的最低浓度来使用。该浓度易于实验方法来确定。催化剂的用量可以为每100份反应中使用的二羟乙酸和AMPA的重量和需要0.001至20份重量的催化剂或更多。
用作苗后除草剂的N-（膦酰基甲基）甘氨酸可以用任何现有技术中已知的回收方法从用任何还原方法制得的还原溶液中回收，所说的回收方法已公开在美国专利4，851，159和4，670，191中和欧洲专利申请186，648和413，672中。
下面的实施例将用来进一步说明本发明，二羟乙酸酯、甲酸酯和草酸酯的收率和甘醇酸酯的回收率是以反应开始时存在的乙醇酸的总量为计的百分数。反应混合物用高压液相色谱来分析。用Bio-Rad    Hpx-87H柱进行有机酸分析，用Bio-Rad    Am-inex草甘膦分析柱分析AMPA和N-（膦酰基甲基）甘氨酸。N-（膦酰基甲基）甘氨酸的收率是以二羟乙酸酯或AMPA为计的，它们是反应中限定试剂的依据。
实施例1
向装有磁力搅拌棒的3盎司Fisher-Porter玻璃喷雾反应器中加入10mL含有乙醇酸（0.25M）、氨甲基膦酸（AMPA，0.263M）、FMN（0.01mM）、丙酸（HPLc内标，0.125M）、甘醇酸酯氧化酶（从菠菜中分离得到，1.0IU/mL）和过氧化氢酶（从曲霉属皂脚中分离得到，1.400IU/mL）的pH为8.5的含水溶液。将反应器封闭并使反应混合物冷却至15℃，然后用加压至70psig的氧气冲洗反应器并随着搅拌将反应器向大气放空5次。将反应器加压至氧气的70psig并在15℃下搅拌混合物。每隔一定的时间通过反应器的取料汽门用注射器取出等分试样（0.10）（在反应器中没有压力损失）用于HPLc分析以观察反应的进程。5小时后，二羟乙酸酯、甲酸酯和草酸酯的HPLc收率分别为70.4%、19.6%和2.2%，并在反应混合物中仍有5.3%的甘醇酸酯。反应后甘醇酸酯氧化酶过氧化氢酶的活性分别为其最初活性的27%和100%。
实施例2（比较例）
用0.33MK2HPO4代替0.265MAMPA来重复实施例1的反应，5小时后，二羟乙酸酯、甲酸酯和草酸酯的HPLc收率分别为34.1%、11.1%和0.2%，反应混合物中仍含有58.7%甘醇酸酯。23小时后，二羟乙酸酯、甲酸酯和草酸酯的HPLc收率分别为39.4%、44.7%和15.34%，反应混合物中无甘醇酸酯存在。反应后甘醇酸酯氧化酶和过氧化氢酶的活性分别为它们最初活性的85%和87%。
实施例3（比较例）
用0.263MN-二（羟乙基）甘氨酸缓冲液代替0.265MAMPA来重复实施例1的反应。5小时后，二羟乙酸酯、甲酸酯和草酸酯的HPLc收率分别为42.5%、49.6%和10.1%，反应混合物中仍有0.2%甘醇酸酯。反应后甘醇酸酯氧化酶和过氧化氢酶的活性为其最初活性的47%和100%。
实施例4
用5，600IU/mL过氧化氢酶（从曲霉属皂脚中获得）重复实施例1的反应。6小时后，二羟乙酸酯、甲酸酯和草酸酯的HPLc收率分别为85.5%、7.6%和3.3%，反应混合物中仍有2.5%甘醇酸酯。反应后，甘醇酸酯氧化酶和过氧化氢酶的活性为其最初活性的36%和100%。
实施例5
用14，000IU/mL从曲霉属皂脚中获得的过氧化氢酶重复实施例1的反应。6小时后，二羟乙酸酯、甲酸酯和草酸酯的HPLc收率分别为88.0%、3.3%和3.0%，反应混合物中仍有3.4%甘醇酸酯。反应后，甘醇酸酯氧化酶和过氧化氢酶的活性分别为其最初活性的28%和96%。
实施例6
从56，000IU/mL从曲霉属皂脚中获得的过氧化氢酶重复实施例1的反应。6小时后，二羟乙酸酯、甲酸酯和草酸酯的HPLc收率分别为84.0%、0.4%和2.5%，反应混合物中仍有8.4%的甘醇酸酯。反应后，甘醇酸酯氧化酶和过氧化氢酶的活性分别为其最初活性的16%和76%。
实施例7
向装有磁力搅抖棒的3盎司Fisher-Porter玻璃喷雾反应器中加入10mL含有乙醇酸（0.25M）、氨甲基膦酸（AMPA，0.20M）、FMN（0.01mM）、丁酸（HPLc内标，0.10M）、甘醇酸酯氧化酶（从菠菜中获得，1.0IU/mL）、和过氧化氢酶（从曲霉属皂脚中获得，14，000IU/mL）的pH为8.5的含水溶液。将反应器封闭并使反应混合物冷却至5℃，然后用加压至70psig的氧气冲洗并随着搅拌向大气放空5次，接着使反应器加压至氧气的70psig并在5℃下搅拌反应混合物。每隔一定的时间通过取样汽门（在反应中没有压力损失）用注射器取出等分试样（0.10mL）进行HPLc分析以观察反应的进程，6小时后，二羟乙酸酯、甲酸酯和草酸酯的HPLc收率分别为92.3%、4.36%和5.5%，反应混合物中无甘醇酸酯存在。反应后甘醇酸酯氧化酶和过氧化氢酶的活性分别为其最初活性的87%和88%。反应混合物最终的pH为6.7。
用Amicon    Centriprep    10浓缩器（10，000摩尔重量断流）过滤反应得到的二羟乙酸（0.23M）和AMPA（0.20M）的混合物以除去可溶性的酶，然后将滤液置于装有磁力搅拌棒的3盎司Fisher-Porter瓶中，向该瓶中加入0.100g    10%    pd/c并封闭该瓶，用氮气冲洗，然后用氢气将其加压至50psi并在25℃下搅拌。17小时后N-（膦酰基甲基）-甘氨酸（用HPLc测定）的浓度为0.13M（基于AMPA的收率为66%）。
实施例8
向装有磁力搅拌棒的3盎司Fisher-Porter玻璃喷雾反应器中加入含有乙醇酸（0.5M）、氨甲基膦酸（AMPA，0.40M）、FMN（0.01mM）、丁酸（HPLc内标，0.10M）、甘醇酸酯氧化酶（从菠菜中获得，1.0IU/mL）和过氧化氢酶（从曲霉属皂脚中获得，14，000IU/mL）pH为8.5的10mL含水溶液。将反应器封闭并使反应混合物冷却至5℃（而不是以前实施例所述的15℃），然后用加压至70psig的氧气冲洗并随着搅拌向大气放空5次。接着将反应器加压至氧气的70psig并在5℃下搅拌混合物。每隔一定的时间从取样汽门（在反应器中没有压力损失）用注射器取出等分试样进行HPLc分析以观察反应的进程。17.5小时后，二羟乙酸酯、甲酸酯的草酸酯的HPLc收率分别为91.0%、2.9%和2.9%，反应混合物仍有4.1%甘醇酸酯存在。反应混合物的最终pH为6.7。反应后甘醇酸酯氧化酶和过氧化氢酶的活性为其最初活性的63%和91%。
Amicon    Centriprep    10浓缩器（10，000摩尔重量断流）过滤反应所得的二羟乙酸（0.46M）和AMPA（0.40M）的混合物以除去可溶性酶。然后将滤液置于装有磁力搅拌棒的3盎司Fisher-Porter瓶中，接着向该瓶中加入0.100g    10%的pd/c并将该瓶封闭，用氮气冲洗并用氢气加压至50psi，在25℃下搅拌反应混合物。17小时后，N-（膦酰基甲基）甘氨酸（用HPLc测定）的浓度为0.25M（基于AMPA的收率为72%）。
实施例9
用10ml含有乙醇酸（0.75M）、氨甲基膦酸（AMPA，0.6M）、FMN（0.01mM）、丁酸（HPLc内标，0.10M）、甘醇酸酯氧化酯（从菠菜中获得，2.0IU/mL）和过氧化氢酶（从曲霉属皂脚中获得，14，000IU/mL）的pH为8.5的溶液重复实施例8的乙醇酸酯促氧化反应。40小时后，二羟乙酸酯、甲酸酯和草酸酯的HPLc收率分别为83.2%、2.3%和7.5%，反应混合物中无甘醇酸酯存在。反应混合物的最终pH值为6.8。反应后甘醇酸酯氧化酶和过氧化氢酶的活性分别为它们最初活性的65%和86%。
用Amicon    Centriprep    10浓缩器（10，000摩尔重量断流）过滤反应得到的二羟乙酸（0.62M）和AMPA（0.60M）的混合物以除去可溶性酶，然后将滤液置于装有磁力搅拌棒的3盎司Fisher-Porter瓶中。接着向该瓶中加入0.100g    10%    pd/c并封闭该瓶，用氮气冲洗，用氢气加压至50psi，在25℃下搅拌反应混合物。24小时后，N-（膦酰基甲基）甘氨酸（由HPLc测定）的浓度为0.42M（基于AMPA的收率为70%）。
实施例10
用10mL含有乙醇酸（1.0M）、氨甲基膦酸（AMPA，0.80M）、FMN（0.01mM）、丁酸（HPLc内标，0.10M）、甘醇酸酯氧化酶（从菠菜中获得，2.0IU/mL）和过氧化氢酶（从曲霉属皂脚中获，14，000IU/mL）的pH为8.5的水溶液重复实施例8的乙醇酸酶促氧化反应。66小时后，二羟乙酸酯、甲酸酯和草酸酯的HPLc收率分别为78.9%、2.2%和12.1%，反应混合物中存在有2.0%甘醇酸酯。反应混合物的最终pH为6.9。反应后甘醇酸酯氧化酶和过氧化氢酶的活性分别为其最初活性的64%和87%。
用Amicon    Centriprep    10浓缩器（10，000摩尔重量断流）过滤反应得到的二羟乙酸（0.79M）和AMPA（0.80M）的混合物以除去可溶性酶，然后将所得滤液置于装有磁力搅拌棒的3盎司Fisher-Porter瓶中，接着向该瓶中加入0.100g10%Pd/c并封闭该瓶，用氮气冲洗，用氢气加压至50psi并在25℃下搅拌，23小时后N-（膦酰基甲基）甘氨酸的浓度（由HPLc测定）为0.51M（基于二羟乙酸的收率为65%）。
实施例11
在pH为8.0的条件下，重复实施例8的反应。17.5小时后，二羟乙酸酯、甲酸酯和草酸酯的HPLc收率分别为87.0%、2.2%和1.9%，反应混合物中仍有8.5%甘醇酸酯存在。反应后甘醇酸酯氧化酶和过氧化氢酶的活性分别为其最初活性的44%和97%。
实施例12
在pH为7的条件下重复实施例8的反应。17.5小时后，二羟乙酸酯、甲酸酯和草酸酯的HPLc收率分别为88.0%、1.4%和1.9%，反应混合物中仍有8.2%的甘醇酸酯存在。反应后甘醇酸酯氧化酶和过氧化氢酶的活性分别为其最初活性的44%和93%。
实施例13
向装有磁力搅拌棒的3盎司Fisher-Porter玻璃喷雾反应器中加入10mL含有乙醇酸（0.50M）、FMN（0.01mM）、异丁酸（HPLc内标，0.10M）、甘醇酸酯氧化酶（从菠菜中获得，1.0IU/mL）和过氧化氢酶（从曲霉属皂脚中获得，14，000IU/mL）的pH为8.5的水溶液。将反应器封闭并将反应混合物冷却至5℃，然后用加压至70psig的氧气冲洗反应器并随着搅拌向大气放空5次。接着将反应器加压至氧气的70psig，在5℃下搅拌反应混合物。每隔一定的时间，从取样汽门（反应器中没有压力损失）用注射器取出等试样（0.10mL）进行HPLc分析以观察反应的进程。21小时后，二羟乙酸酯、甲酸酯和草酸酯的HPLc收论分别为81.7%、1.2%的2.2%，反应混合物中仍有7.5%的甘醇酸酯存在，反应后甘醇酸酯氧化酶和过氧化氢酶的活性分别为其最初活性的19%和77%。用0.50M乙醇酸和在0.25M、0.375M、0.40M、0.50M或0.625M氨甲基膦酸（AMPA）存在下重复上述反应，它们反应产物的收率和从反应中回收得到的酶的量列于下表：
二羟    甲酸    草酸    甘醇    过氧化
[AMPA]    甘醇酸酯
乙酸酯    酯    酯    酸酯    氢酶
(M)    (%)    (%)    (%)    (%)    氧化酶(%)    (%)
0.00    81.7    1.2    2.2    7.5    19    77
0.25    79.4    2.1    3.3    2.5    48    79
0.375    78.3    2.3    3.6    1.7    57    95
0.40    91.0    2.9    2.9    4.1    63    91
0.50    85.2    1.5    3.3    5.5    49    93
0.625    79.6    1.7    1.8    14.0    42    94
实施例14
用10mL含有乙醇酸（0.25M）、氨甲基膦酸（AMPA，0.263M）、FMN（0.01mM）、丁酸（HPLc内标，0.25M）、甘醇酸酯氧化酶（从菠菜中获得，1.0IU/mL）和过氧化氢酶（从曲霉属皂脚中获得，14，000IU/mL）的水溶液，在pH为7.0温度为15℃的条件下重复实施例8的乙醇酸酶促氧化反应。8小时后，二羟乙酸酯、甲酸酯和草酸酯的HPLc收率分别为82.8%、0.9%和2.1%，反应混合物中仍有13.9%的甘醇酸酯存在。反应混合物的最终pH为6.6。
用Amicon    Centriprep    10浓缩器（10，000摩尔  滤二羟乙酸（0.21M）和AMPA（0.263M）的混合物以    酶。然后将该溶液和50mg10%pd/c放入装有玻璃    压力容器中。将该容器封闭并用氮气冲洗，然后用氢1000psi并在25℃下振动。在反应开始的0.5小时后，容器的压力降至稳定的值，然后再将其加压至1000psi。4小时后将容器放空并用氮气冲洗。N-（膦酰基甲基）甘氨酸的浓度（由HPLc测定）为0.16M（其于二羟乙酸的收率为76%）。
实施例15
在pH为8的条件下重复实施例14的乙醇酸的酶促氧化反应，8小时后二羟乙酸酯、甲酸酯和草酸酯的HPLc收率分别为86.7%、1.8%和4.1%，反应混合物中仍有13.2%的甘醇酸酯存在。反应混合物的最终pH为6.7。
用实施例5中描述的方法在1000psi条件下氢化二羟乙酸（0.22M）和AMPA（0.263M）的混合物，4小时后，N-（膦酰基甲基）甘氨酸的浓度（由HPLc测定）为0.14M（基于二羟乙酸的收率为64%）。
实施例16
在pH为9的条件下重复实施例14的乙醇酸酶促氧化反应。7小时后，二羟乙酸酯、甲酸酯和草酸酯的HPLc收率分别为70.0%、5.6%和11.1%，反应混合物中无甘醇酸酯存在。反应混合物的最终pH为6.8。
用实施例5中描述的方法在1000psi压力下氢化二羟乙酸（0.18M）和AMPA（0.263M）的混合物。4小时后N-（膦酰基甲基）甘氨酸的浓度（由HPLc测定）为0.094M（基于AMPA的收率为52%）。
实施例17
用初始浓度分别为0.50M和0.40M的乙醇酸和AMPA在pH为8.5的条件下重复实施例14的乙醇酸酶促氧化反应。16.5小时后，甘醇酸酯、甲酸酯和草酸酯的HPLc收率分别为85.4%、3.5%的6.3%，在反应混合物中仍有1.4%的甘醇酸酯存在。反应混合物的最终pH为7.0。
用实施例5中描述的方法在1000psi压力下氢化二羟乙酸（0.43M）和AMPA（0.40M）的混合物。4小时后，N-（膦酰基甲基）甘氨酸的浓度（由HPLc测定）为0.30M（基于AMPA的收率为75%）。
实施例18
用10mL含有乙醇酸（0.50M）、氨甲基膦酸（AMPA，0.375M），FMN（0.01mM）、丁酸（HPLc内标，0.10M）、甘醇酸酯氧化酶（从菠菜中获得，1.0IU/mL）和过氧化氢酶（从曲霉属皂脚中获得，14，000IU/mL）的水溶液在pH为8.5的条件下重复实施例8中的乙醇酸的酶促氧化反应。17小时后，二羟乙酸酯、甲酸酯和草酸酯的HPLc收率分别为87.1%、1.9%和2.1%，反应混合物中仍有8.9%的甘醇酸酯存在。反应混合物的最终pH为6.7。
用Amicon    Centriprep    10浓缩器（10，000摩尔重量断流）过滤二羟乙酸（0.435M）和AMPA（0.375M）反应所得的混合物以除去可溶性酶，将所得滤液与50mg脱色碳混合（以除去FMN）并再次过滤，将所得滤液置于装有磁力搅拌棒的3盎司Fisher-Porter瓶中，然后向该瓶中加入0.100g10%pd/c并封闭该瓶，用氮气冲洗，随之用氢气使其加压至50psi并在25℃下进行搅拌。17小时后，N-（膦酰基甲基）甘氨酸的浓度（由HPLc测定）为0.372M（基于AMPA的收率为99%）。

Claims (10)

1、一种制备N-(膦酰基甲基)甘氨酸的方法，它包括氢化一种混合物，所说的混合物是在含有氨甲基膦酸和甘醇酸酯氧化酶和过氧化氢酶的水溶液存在下由乙醇酸和氧气反应而酶促生成的。
2、一种改进的制备N-（膦酰基甲基）甘氨酸的方法，它包括用加氢方法还原二羟乙酸和氨甲基膦酸的混合物，所说的混合物是就地在水溶液中通过下述方法酶促生成的，即向水溶液中加入乙醇酸和用于乙醇酸与氧气制备二羟乙酸和过氧化氢的氧化反应的第一种催化剂和用于过氧化氢分解的第二种催化剂，调节溶液的pH至6和10之间，在氨甲基膦酸存在下，在有效的温度下和足够的时间内将该溶液与氧源接触以使至少部分乙醇酸成份转化成二羟乙酸的成分，并在还原步骤前停止氧源与所说溶液的接触。
3、权利要求2的方法，其中第一种催化剂为甘醇酸酯氧化酶，第二种催化剂为过氧化氢酶。
4、权利要求1的方法，其中加氢反应是在加氢催化剂存在下进行。
5、权利要求2的方法，其中还原反应是在加氢催化剂存在下进行。
6、权利要求4和5的方法，其中加氢催化剂选自碳上钯、硅藻土上的镍和Raney镍。
7、权利要求6的方法，其中加氢催化剂的用量为每100份二羟乙酸和氨甲基膦酸的重量和需要0.001至20份重量的催化剂。
8、权利要求7的方法，其中加氢反应的条件是pH为4至11，温度为0℃至150℃，氢气压力为1至约100大气压。
9、权利要求7的方法，其中加氢反应的条件是pH为5至10，温度为20℃至90℃，氢气压力为1至约10大气压。
10、按照上述任何一个权利要求的方法所制得的产物。
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