PL159685B1 - Beauveria bassiana PL PL PL - Google Patents

Abstract

Sposób wytwarzania entomopatogennego preparatu zawierajacego zarodniki grzyba Beauveria bassiana, znamienny tym, ze szczep swiezo przepasazowany przez stonke ziemnia- czana namnaza sie w wieloetapowych przemyslowych hodowlach wglebnych, na podlozach zawierajacych zródla wegla, azotu i soli mineralnych przy aeracji pozywki. PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sfusób wytwarzania na toodze mikrobiolo^gicznej todowli wgłętoej entomopatogennego preparatu szczególnie cennego przy niszczeniu stonki ziemniaczanej .

Jako patogena wykorz^ystano wyselekcjonowany w Instytucie ^Ekologii PAN szczep ^grzyba Beauveria tossiana /Bals./ Vuill./ Aeuterornycetes, Moniliales/. Pśtogen w ^bio^pre^paracie musi ^być trwały i wirulentny. Wobec tego musi występować w formie zarodników konidialnych, które są najtw/alsz^ stadirmi rozwojowym tego ^grzyto.

^Znane są trzy spionto wzrostu grzyba Beauveria tossiana; ^powierzchniowy, wgłętoopowierzchniowy i wgłętiny. Według toisów patentowych ^ZSRR nr 301 142, nr 313 531, nr 66 995j ^CSRS nr 172 55², nr ²12 ⁰78 szczególnie obfity plon zarodników konidialnych uzyskuje się w hotowlach powierzchniowych i wgł^m-powierzchniowych W hodowlach wgłębnych otrz^nano dotychczas mieszaniny zarodników kontolalnych i nietrwałych zarodników wegetatywnych Wszystkie lplso^by posiatojące etap hiodowli na powierzchni podłoża uważane są za nieekonomiczne ze względu na potrzebę korzystania z (itoych ^przeπylłowych ^povri.erzctoi, na trudńo^ści w ztiieraniu homateriału, z także ze względu na powstawanie przy ^produkcji zanieczy^szczenia powietrza zarodnikami mogącymi wywołać alergiczne toorolny.

Sposobem według wynalazku o-trzjmiuje się w wieloetopowych todowlach wgłębnych entompatogenny preparat; zawierający przewagę zarodników koniiiialnych ^grzyba Beaweria tossiana odporny na suszenie i inne wpływy zewnętrzne.

159 685

Preparat ten pod względem morfologii i zjadHwości nie różni aię od preparatu otrzymanego w drodze hodowli powierzchniowych czy też wgłębno-povW.erzchninwych. Preparat tego typu nie był dotychczas w Polsce wytwarzany i stosowany. Preparat ten stanolłby alternatywę dla chemicznych pestycydów. Negatywne etrony stosoirania chemicznych pestycydów w obecnym czasie stały się ocz:ywi^1;e. Objawiają się nie tylko brakiem selektywności w działaniu i zanieczyszczeniem środoRska lecz także prowadzą do powstawała ras szkodników odpornych na te środki. Włączenie do nlki ze stonką ziemniaczaną mikrobiologicznych preparatów rozszerzałoby moniwości skutecznej TOlki ze szkodnikami bez drastycznego naruszania równoragi biologicznej środoRska i byłoby bardziej bezpieczne dla człowieka. WyestuRła Ręc pilna potrzeba opracowała w -trunkach przemysłowej Reloetapnej hodOTH wgłębnej biopreparatu zaReraj ącego zarodniki grzyba Beauweria bassiana.

Prace w skali przemysłowej zostały poprzedzone intensywnymi badaniami laboratoryjnymi, których zamierzeniem było uzyskanie stabi^niego szczepu produkcyjnego o dużej zjadliwości.

StRerdzono, że kilkakrotne pasażowanie szczepu poprzez stonkę ziemniaczaną jako naturalnego żyRciela utrzymuje,, wiględnie nawet podwyższa ^^togennośó szczepu. W celu osiągnię cla zamierzonego przed3ię^więcia, posiewowy mttriał do inoculacji przygotowuje się w postaci płynnej hodowH. Hodowlę w fermentorach prowadzi się trzy lub czterostopniowo. Zastosnaie stopniowości oraz rozgraniczenio podłóż wzrostowych i sporulacyjnych pozwala uzyskać qq etapie sporulacyjiym w stosunkowo krótkim czasie 68 - 72 h największe zmiany morfo

50 3 logiczne, najRększą koncentrację zarodników 10 - 10 w 1 cm , których większość stanowią zarodnik! konidialne. Po tym czasie podłoża; węgiel, azot, fosfor zostają w znacznym stopniu zużyte, obniża się endogenne oddycheane, obserwuje się lizę grzybni wegetatywnej, koncennracja zarodników osiąga swoje mikuimum.

Przykład I. Szczep taauverla bassiana po ^^zepasażo^i^lu przez patogena poddaje się liofilizacji z zastosowaniem mleka Difco jako środka ochronnego, a następnie dalszemu pasażows^u na pod łożach Saboiurauda i ziemniaczanym.

Hodowlę na skosach prowadzi się w ciągu 7-10 dni w tamp^ni^^e 28°C. Inoculum hoduje 3 3 się w kolbach stożkowych V = 2 dm z 0,25 dm pożywki o składzie wagowym: sacharoza 0,5%, ekstrakt drożdżowy 1%, aminokwasy 0,1%, olej słonecznikowy 0,1%, woda destylowana do 100%. PH pożywki po sterylizacji 5,6 - 5,8.

Pożywkę w kolbach szczepi się kulturą zebraną ze skosów agarowych. Po zaszczepieniu kolby

i.nkubuje eię w t = 2⁶ - 2⁸°C ^przez 4^{8 h} na tazęsawce obrotowej. Wy^hr^drwata w kolLbata kultura stanowi inoculim do zaszczepienia przygotowanej w fermentorze pożywki produkcyjnej o składzie wagowym: glukoza lub sacharoza 1,0 - 2,<%, azotan amonu 0,3%, pepton 0,5%, fosforan potasu I zas. 0,5%, siarczan magnezu 0,2%, chlorek potasu 0,i%, aminokwasy 0,001%, olej słonecznikowy 0,1%, woda dest^oi^^na do 100%.

PH pożywki naturalne 5,0 - 6,0.

3

Do zaszczepienia 25 dm podłoża produkcyjnego używa się inoculum w ilości 2 dt^ kultury wyhodo^wruj w kolbach. Wzrost prowadzi się w t = 26 - 28°C przy stałjm mieszaniu w ciągu 68 - 72 h.

W trakcie biosyntezy hodowlę się napoRetrza sprężonym poRetrzem, którego przepływ w^3 3 nosi 0,4 - 0,8 dm poRetrza na 1 dm kultury i na 1 Rn. przy nadciśnieniu 0,05 - 0,06 MPa, Nadmar piany gasi aię olejem słonnczniroljR. W trakcie biosyntezy pH kształtuje się w sposób naturalny w zakresie 4,5 - 6,5.

Practo k°ńcz^y Rę, ^gdy Hczba zarotoików wynosi 10’ - Ί0^1θ w ¹ cm’ ^brzeczki^, z taójrych większość stanoRą zarodniki koRdialne.

Po zakończeniu biosyntezy, biomasę Resza się z nośnikiem, filtruje i suszy w t = 35 40°C. Preparat rozdrabie się i standaryzuje. Wysuszony produkt z nośnikiem zawiera 10¹° ^- 10¹’ ^za^rodⁿikó^w w 1 ^g, w tolsz^ ci^ągu z przewagą za^frdnikó^w k^oni^dialny^ch, któro przechowywane w temperaturze 4°C utrzymują aktywność infekcyjną ponad 10 Reaięcy.

Przykład II. Inoculum przygorwnmjR jak w przykładzie I azczepi się 20 dm pożywki irrdukcyjnej w tanku fermentacyjnym o składzie wagowym glukoza lub sacharoza

159 685

1,0 - 2,09^, azotan amonu 0,39(, namok kukiu-ydzian 1,0%, fosforan potasu I zas. 0,S%, siarczan magnezu 0,1%, chlorek potasu 0,5%, aminokwasy 0,(01%, olej słonecznilowy 0,1%, woda destylowana do 100%. PH pożywki naturalne po sterylizacji 5,0 - 6,0.

Proces biosyntezy i suszenia biomasy prowadzi się Jak w przykładzie I·

Przykład III. Hodowla wieloetapowa.

£ta^{p 1} - ^pos^e^wo^wy. Inoculim ^zygotrnnuiym ja^k w przykładzie I srozepi aię ²⁰ dm^P pożywki posiewowej w tanku fermentacyjnym o składzie wagowym: sacharoza 0,5%, ekstrakt drożdżowy 1,0%, namok kukurydziany 0,1%, aminokwasy 0,01%, olej słonecznikowy 0,1%, woda destylowana do 100%. PH pożywki naturalne po sterylizacji 5,6 - 5,8.

Do zaszczepienia ^{20 d}m^r podłtaa posiewowej używa się inoculum w Uotai 2 ^dm^J kultury wyłiodowanej w torbach. tadowlę w lantach posiewowych prowadzi się w ^t = ^{26 - 28}°C przy stałym mieszaniu w ciągu 24 h. W trakcie biosyntezy hodowlę się napowietrza sprężonym po3 3 wietrzem, którego przepływ wyrosi 0,6 - 0,8 dm powwetrza na 1 dm kultury i na 1 min. przy nadciśnieniu 0,05 - 0,06 MPa.

Po zakończeniu hodowU pH materiału posiewowego wynosi 4,0 - 4,4.

Etap 2 - posiewowy· Kultura Baneria baasiana wyhodowana w etapie 1 - posiewowym stanowi inoculim do zaszczepienia 14⁰ <dm^P poź^ki w fermentorze. Sk^ła^d ptaywki i. parametry procesu jak w etapie 1 - posiewowym.

Etap 3 - posiewowy. Kultura Baauveria bassiana wyhodowana w etapie 2 - posiewowym staa nowi inoculim do zaszczepienia 1,4 m pożywki w feimentorze. Skład pożywki i paramtry procesu jak w etapie 2 - posiewowym.

Etap 4 - produkcyjny. Kultura Beauveria bassiana wyhodowana w etapie 3 - posiewowym o stanowi inoculim do zaszczepienia 9 ir pożywki produkcyjnej przygotowanej w tanku fermentacyjnym. Skład pożywki jak w przykładzie I lub II.

Proces biosyntezy prowadzi się w t = 26 - 28°C przy stałym mieszaniu w ciągu 68 - 72 h

W trakcie biosyntezy hodowlę się napoowetrza sprężonym powietrzem, którego przepływ wynosi 3 3

0,4 - 0,8 dm powietrzt na 1 dm- kultury i na 1 min., przy nadciśnieniu 0,05 - 0,06 MPa. Nadmiar piany gasi się olejem słonecznioowym. W trakcie biosyntezy pH kształtuje się w sposób naturalny w zakresie 4,5 - 6,5. Proces kończy się, gdy liczba spo zarodników wynosi 10θ - 10^1θ w ¹ cm^P brze^^l^^, z kt^ór^ych wi^ększość stanowią zaradnU! konidialne.

Po zakończeniu biosyntezy, biomasę m,esza się z nośnikiem, filtruje i suszy w t = 35 40°C. Preparat rozdrabnia się i standaryzuje. Wysuszony produkt z nośnikiem zawiera 10- 10 zarodników w 1 g z przewagą zarodników konidialnych, które przechovywane w temperaturze 4°C utrzymują swoją aktywność infekcyjną ponad 10 żesięcy.

Claims (4)

1. ^Sposób wytwarzania entomopatogennego ^pre^paratu zawierającego zarodniki grzyba Beauveria tossiana, znamienny tym, że azczep świeżo ^przepasażowany ^przez stonkę ziemniaczaną namnato się w wieloetppowych [przemysłowych hodowlach wgłębnych, na ^podłożach zawierających źródła węgla, azotu i soli mineralnych ^przy aeracji ^pożywki.

2. ^Sposó^b według zastrz. ^znamienny tym, ^że w celu utrzymania względnie judwyższenia ^patogenności^, szczep 3eauverua tossiana reizoluje się z porażonych mtoików stonki ziemniaczanej i zatozpiecza się ^poprzez liofilizację z zastosowaniem mleka Difco jako ^śro^dka ochronnego.

³· ^Sposób według zastrz. ¹, znamienny tym, to kulturę inoculac^yjną ^przygotowuje się w tołbowych ^ho<3owlach wgłębnych na wytrząsarce otoctowej w czasie 48 h_s stosując pożywto o skłatoie wagowym; sacliaroza 0,5%, eltstrakt drożdżowy 1,<%, aminokwasjr 0,1%, olej słonecznikowy 0,1%, wo<ia destylowana ^do ¹⁰0%.

4. Sposói» według zastrz. ^znamienny tym, żie w wieloetopowych totowlach kultury Beauveria tiassiana dla stadiów ^posiewowych stoeuje się ^pożywkę o sicładzie wagowym; s^acharoza ⁰,5%, etotrato drożdżowy 1,0%„ namok kukurydziany aminokwasy ⁰s01%^,l olej słonecznikowy ⁰,1%, woda tostylowana to WO^ ^dla stadirmi protokcyjnego stosuje się ^po^żywki o skłatoie wagowym; ^glukoza lub sacharoza 1,0 - ²,(%, azotan amonu ^pe^pton ⁰,5%, fosforan potasu I zas. 0,5%, siarczan magnezu 0,2%, chórek potasu ⁰,5%^, aminokwasy °,001%, olej słonecznikowy ⁰,1%, woto tostytowana to WCęS, lub glukoza lub sacharoza ^1,0 - ²,<%, azotan amonu ⁰,^%, namolc kukurydziany 1,(%, fosforan ^potasu I zas. ⁰,2%^, siarczan magnezu 0,1%, chlorek potasu 0,5%, aminokwas^y 0,001%, olej słonecznikowy ⁰,1%, woda tostylowana to 1⁰0%.