CN114644993A - 高耐盐的盐单胞菌及其促进盐碱地植物生长的微生物原位生态修复方法 - Google Patents

高耐盐的盐单胞菌及其促进盐碱地植物生长的微生物原位生态修复方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种高耐盐的盐单胞菌，菌种名称：Halomonas taeanensis GRINM1，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：武汉大学内，保藏日期：2020年11月5日，保藏登记号：CCTCC NO：M 2020681。本发明的菌株耐盐性能优异，为盐单胞菌属，菌种为杆菌，菌落呈乳白色，表面光滑，湿润，有光泽，呈球状。在高浓度有机物以及高盐度环境下适应和生存能力强，生长速度快；该菌可用于改良高盐度盐碱地，降低其对植物的毒害，是高中重度盐碱地的优质植物促生菌。本发明进一步提供了该菌用于盐碱地治理的工艺。

Description

高耐盐的盐单胞菌及其促进盐碱地植物生长的微生物原位生 态修复方法
技术领域
本发明涉及环境微生物领域，特别是涉及一种高耐盐的盐单胞菌(Halomonastaeanensis)GRINM1、其培养方法以及促进盐碱地植物生长的微生物原位生态修复方法和应用。
背景技术
土壤盐碱化问题是目前全球最严重的环境问题之一，因此盐碱地的改良与利用一直是国际研究热点和难点。过量的盐度、过大的碱度及不良的土壤物理性状，均会抑制盐碱地周边植物生长，导致区域生态恶化。在一些耐盐碱植物根际，蕴藏着大量有益微生物资源，有些菌株本身具有较高的耐盐能力，同时可显著提高植物的耐盐能力，并具有促生、防病、抗衰老等作用，应用于植物根际可大幅度提高作物的耐盐、抗旱性和生物产量，从而达到改善和利用盐碱地的目的。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的第一个目的是提供一种高耐盐的盐单胞菌，该菌可对高盐度土壤植物进行促生。
本发明的第二个目的是提供一种筛选高耐盐的盐单胞菌的培养基。
本发明的第三个目的是提供一种分离高耐盐的盐单胞菌的固体培养基。
本发明的第四个目的是提供一种富集高耐盐的盐单胞菌的方法。
本发明的第五个目的是提供一种高耐盐的盐单胞菌促进盐碱地植物生长的微生物原位生态修复方法。
为了实现上述目的，本发明提供一种高耐盐盐单胞菌，该菌的分类命名为：Halomonas taeanensis GRINM1，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址：武汉大学内，保藏日期为：2020年11月5日，保藏号为：CCTCC NO：M 2020681。
本发明还提供一种筛选以及富集上述的盐单胞菌的培养基，该培养基配方为：NaCl 150g，乳酸钠3.5g，NH4Cl 1.0g，Na2SO4 1.0g，MgSO4 0.1g，K2HPO4 0.5g和CaCl2 0.1g溶于1L蒸馏水中，调整pH为7.0-7.2。
本发明还提供一种分离上述的盐单胞菌的培养基，该培养基配方为：NaCl 100g，乳酸钠3.5g，NH4Cl 1.0g，Na2SO4 1.0g，MgSO4 0.1g，K2HPO4 0.5g和CaCl2 0.1g溶于1L蒸馏水中，121℃高温灭菌。
本发明还提供一种用于富集培养上述的高耐盐的盐单胞菌的方法，将如权利要求1所述的高耐盐的盐单胞菌接种入如上述的培养基中，在25-35℃的培养温度下，摇床培养3-5天，培养至菌浓度达到108个/mL。
本发明还提供一种利用上述盐单胞菌促进盐碱地植物生长的微生物原位生态修复方法，将所述盐单胞菌的菌种，采用上述的方法进行富集培养至菌浓度须达108个/mL后，接种至盐碱地。
优选地，接种盐碱地的接种量为每m3面积300-400L。
本发明的盐单胞菌Halomonas taeanensis GRINM1可以通过代谢产生胞外聚合物(EPS)的方式在土壤中形成团聚体，从而增强土壤透气性，降低过高的盐度对于植物的毒害作用；还可以通过转换土壤内部的有机质，合成有益于植物生长的蛋白质和氨基酸。因此应用具有植物促生作用的耐盐菌，不仅可以有效实现土壤排盐，而且能够有效调节和促进盐碱地植物的生长，对盐碱地生态修复有着重要的意义。
本发明所用盐单胞菌的菌种分离自浙江舟山的高盐污泥。
本发明的盐单胞菌(Halomonas taeanensis)GRINM1具有如下特点：为好氧菌，菌种为杆菌，菌体大小为0.8-1.0×1.0-3.0μm。革兰氏染色为阳性，能运动，有鞭毛，位置因菌种而异，周身或极端。在含盐量15％的培养基中能够生长，菌落为乳白色，直径在1-3mm，表面光滑，湿润，有光泽，菌落为圆形。菌种生长的pH范围为3.0～9.0，最适pH为6.5-8.0；最适生长温度为25℃-35℃；在含有10％-15％NaCl时生长最好，为好氧菌，其最适生长溶解氧浓度为1.5-3mg/L。菌种可以利用乳酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠、乙醇、丙酮，在乳酸钠和柠檬酸钠中生长最好，在高盐度的土壤中能够对植物进行促生。
本发明的有益效果在于：
本发明提供一株高耐盐的盐单胞菌，该盐单胞菌可以对盐碱地进行原位修复，使得盐碱地的地质条件得到修复，适于植被生长。
附图说明
图1为本发明所提供的盐单胞菌的菌落图。
图2为本发明所提供的盐单胞菌的进化树图。
图3为本发明所提供的盐单胞菌用于盐碱地的效果比较图。
具体实施方式
下面将对本发明的实施例进行详细、完善的描述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
本发明提供一种盐单胞菌，该菌的分类命名为：Halomonas taeanensis GRINM1，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址：武汉大学内，保藏日期为：2020年11月5日，保藏号为：CCTCC NO：M 2020681。
筛选及富集用培养基：NaCl 150g，乳酸钠3.5g，NH4Cl 1.0g，Na2SO4 1.0g，MgSO40.1g，K2HPO4 0.5g和CaCl2 0.1g溶于1L蒸馏水中，调整pH为7.0-7.2。
分离用固体培养基：NaCl 100g，乳酸钠3.5g，NH4Cl 1.0g，Na2SO4 1.0g，MgSO40.1g，K2HPO4 0.5g，CaCl2 0.1g和琼脂20g，溶于1L蒸馏水中，调整pH为7.0-7.2，121℃高温灭菌。
实施例1：耐盐菌株的分离与鉴定
取浙江杭州舟山盐碱地高盐度土壤10g于200mL已经过121℃高温高压灭菌的去离子水中，在100rpm，30℃恒温摇床中培养，制得菌悬浊液。
所得菌悬浊液按10％接种量接种于筛选用培养基中，在100rpm，30℃培养3天。
将3天筛选得到的高耐盐菌液接种于121℃高温高压灭菌的分离用固体培养基中，多次接种，分离得到单菌落。该菌菌落照片如图1所示，可以看出，该菌的菌落为乳白色，直径在1-3mm，表面光滑，湿润，有光泽，菌落为圆形。挑取单菌落进行划线培养，分离得到一株具有高耐盐度的菌株。
16S rDNA鉴定：通过16S rDNA序列分析，该菌株与盐单胞菌(Halomonastaeanensis)相似度达到99％，命名为盐单胞菌(Halomonas taeanensis)GRINM1，并进行保藏。分析盐单胞菌(Halomonas taeanensis)GRINM1的进化树图如图2所示。
实施例2
将鉴定出的盐单胞菌(Halomonas taeanensis)GRINM1菌种以相对于所制备培养基的体积5％的接种量接种入富集培养基中，在25-35℃的培养温度下，摇床培养3-5天，测量细菌培养液在600nm处的吸光值，得到的OD600的数值如果在0.6-0.8之间，通过显微镜计数，其菌种浓度在108个/mL。
实施例3：高盐耐受性盐单胞菌用于盐碱地治理
修复盐碱地盐分多在2％以上，最高处可达3％-4％，主要以氯化物、硫酸盐和硅酸盐为主，pH值在9.0-10.5。耕层土壤含盐1.0-1.5％，表层有盐结皮和盐霜，有机质含量较低，在0.63-0.65％范围内，全氮含量0.03-0.05％，氮磷比例失调，表层未见大面积植被生长。
采用本发明所述富集培养基，对该盐单胞菌进行扩大培养，扩大培养接种菌浓度108个/mL，接种体积为培养体积的1％，扩大培养后菌浓度须达108个/mL；
在修复区将扩大培养后的菌液，喷淋至高盐度盐碱地即可，每平米喷淋量不低于300L，最高为400L，分多次喷淋，每次50L，共需6-8次。
在本实施例中采用每次50L喷淋6次的操作。
对照区喷淋量与次数同修复区一致，喷淋所用液体为当地自来水。
在盐碱地修复区和对照区均种植苜蓿，喷淋60天后修复效果对比见图3。
从图3可以看出，修复前盐碱地未生长植物，而喷洒本发明提供的高耐盐的盐单胞菌后60天后，苜蓿已经正常长出，而对照区未喷洒本发明提供的高耐盐的盐单胞菌，苜蓿未见长出，这说明经过本发明提供的高耐盐的盐单胞菌的原位修复，盐碱地的地质条件得到修复，可以适于植被生长。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (6)

1.一株高耐盐的盐单胞菌，其特征在于，该菌的分类名称为：Halomonas taeanensisGRINM1，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，地址：武汉大学内，保藏日期为：2020年11月5日，保藏号为：CCTCC NO：M 2020681。
2.一种用于筛选以及富集如权利要求1所述的高耐盐的盐单胞菌的培养基，其特征在于，该培养基配方为：NaCl 150g，乳酸钠3.5g，NH4Cl 1.0g，Na2SO41.0g，MgSO4 0.1g，K2HPO40.5g和CaCl2 0.1g溶于1L蒸馏水中，调整pH为7.0-7.2。
3.一种用于分离培养权利要求1所述的高耐盐的盐单胞菌的固体培养基，其特征在于，该培养基配方为：NaCl 100g，乳酸钠3.5g，NH4Cl 1.0g，Na2SO4 1.0g，MgSO4 0.1g，K2HPO40.5g，CaCl2 0.1g和琼脂20g，溶于1L蒸馏水中，调整pH为7.0-7.2,121℃高温灭菌。
4.用于富集培养权利要求1所述的高耐盐的盐单胞菌的方法，其特征在于，将如权利要求1所述的高耐盐的盐单胞菌接种入如权利要求2所述的培养基中，在25-35℃的培养温度下，摇床培养3-5天，培养至菌浓度达到108个/mL。
5.一种利用权利要求1所述的高耐盐的盐单胞菌促进盐碱地植物生长的微生物原位生态修复方法，其特征在于，将权利要求1所述盐单胞菌的菌种，采用如权利要求4所述的方法进行富集培养后，接种至盐碱地。
6.如权要求5所述的方法，其特征在于，接种盐碱地的接种量为每m3面积300-400L。
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