PL116413B2 - Process for the preparation of novel water-soluble derivatives of staphylococcine - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych rozpuszczalnych w wodzie acylowanych pocho¬ dnych stafllokokcyny w postaci chlorowodorków. Stafilokokcyna jest substancja nalezaca do grupy bakte- riocyn hamujacych wzrost róznych bakterii chorobotwórczych, w szczególnosci szeregu bakterii opornych na dzialanie znanych antybiotyków, zwlaszcza gronkowców.Zakazenia gronkowcami stanowia jeden z powazniejszych problemów w lecznictwie, bowiem powoduja bardzo wiele komplikacji w leczeniu pooperacyjnym, w poloznictwie i innych, jak równiez zakazenia te stwarzaja szereg powaznych problemów w praktyce weterynaryjnej.Sposób wytwarzania substancji o dzialaniu bakteriobójczym zwanej stafilokokcyna, opisany zostal w polskich opisach patentowych nr 70632 oraz nr 105 748.Ze wzgledu na bardzo slaba rozpuszczalnosc w wodzie stafilokokcyna moze miecograniczone zastosowa¬ nie. Substancja otrzymywana sposobem wedlug polskiego opisu patentowego nr 70 632wykazywala wpraw¬ dzie pewna rozpuszczalnosc w wodzie, wynikajaca z duzej zawartosci soli mineralnych, jadnakze zawartosc substancji nieorganicznych, glównie chlorku sodowego i soli wolframowych, oznaczonych jako popiól po spaleniu, wynosila okolo 40%.W przypadku ewentualnego usuniecia soli mineralnych nastepowalo znaczne pogorszenie rozpuszczal¬ nosci w wodzie. Ponadto cukry wystepujace w preparacie, w ilosci okolo 5%, nalezy traktowac jako zanieczyszczenia. Równiez nierozpuszczalna substancje otrzymuje sie sposobem wedlug polskiego opisu patentowego nr 105 748.Na podstawie znajomosci skladu aminokwasowego stafllokokcynystwierdzono mozliwosc otrzymaniajej pochodnych na drodze acylowania wystepujacych w czasteczce grup funkcyjnych w postaci soli z kwasem chlorowodorowym. Okazalo sie, ze otrzymane sposobem wedlug niniejszego wynalazku chlorowodorki pochodnych stafllokokcyny charakteryzuja sie bardzo dobra rozpuszczalnoscia w wodzie tworzac roztwory wlasciwe. Uzyskane na drodze procesu acylowania pochodne stafllokokcyny w postaci chlorowodorków, przy zachowaniu antybiotycznych wlasciwosci substancji,wykazuja bardzo dobra rozpuszczalnosc w wodzie w stezeniach 50mg/ml i powyzej. Otrzymanie wodnego roztworu substancji antybiotycznej umozliwia zastosowaniejej w wielu postaciach farmaceutycznych, jak równiez znacznie ulatwiadalszyprocesoczszcza- nia przy sporzadzaniu form farmaceutycznych do podawania droga pozajelitowa, przy których wymagana jest zwlaszcza jalowosc preparatów.2 116413 Sposób wytwarzania pochodnych stafilokokcyny wedlug niniejszego wynalazku polega na zawieszeniu stafilokokcyny w suchym, aprotycznym rozpuszczalniku organicznym, taki jak dwumetyloacetamid, po czym do zawiesiny dodaje sie katalityczna ilosc N-metylomorfoliny i przy mieszaniu w temperaturze ponizej temperatury pokojowej, wkrapla nadmiar chlorku kwasowego stanowiacego srodek acylujacy oraz jedno¬ czesnie donor chlorowodoru. Powolne uwalnianie sie chlorowodoru, w trakcie zachodzacej reakcji, pozwala na otrzymywanie soli z chlorowodorem preparatu bialkowego bez jednoczesnego rozkladu czasteczek bialka.Po zakonczeniu reakcji, to jest po calkowitym rozpuszczeniu zawiesiny mieszanina reakcyjna, saczy sie i przy równoczesnym mieszaniu wlewa do rozpuszczalnika organicznego, takiego jak aceton lub metyloetylo- keton, po czym nastepuje wytracenie produktu w postaci osadu. Osad odsacza sie, przemywa rozpuszczalni¬ kiem organicznym i suszy. Zawartosc zanieczyszczen, na które skladaja sie substancje nieorganiczne wynosi okolo 1% i ponizej. Sposób prowadzenia procesu gwarantuje zachowanie pierwotnego ciezaru czasteczko¬ wego 10000-30000. Zawartosc cukrów w opisanych nowych pochodnych waha sie od 25 do 40mcg/mgijest w przyblizeniu o 25-30% nizsza niz w wyjsciowych preparatach stafilokokcyny.Toksycznoscpochodnych oznaczanych przy uzyciu myszy stada cutbred Ipf: SWISS przy podawaniu dozylnym 1% roztworu wodnego i oznaczona jako LDso wynosi od 130 do 200mgAg.W ponizszej tablicy I przedstawiono wartosci najmniejszych stezen hamujacych MIC (mcg/mg) rozpu¬ szczalnych w wodzie soli pochodnych stafilokokcyny, otrzymanych: z kompleksu acylowanego chlorkiem piwaloilu (A), ze stafilokokcyny acylowanej chlorkiem piwaloilu (B), ze stafilokokcyny acylowanej chlor¬ kiem o-chlorobenzoilu (C) w stosunku do stafilokokcyny wyjsciowej (D) wobec 13 wybranydi szczepów bakteryjnych.Tablica I Minimalne stezenia hamujace (MIC) badanych bakteriocyn Lp. Drobnoustrój 1 Staph. aureus IAW 150 2 Staph. aureus 209 P 3 Staph. aureus 5664 4 Staph. aureus 1451 5 Staph. aureus 1469 6 Staph. aureus 1491 7 Staph. aureus 989 8 Staph. aureus 14/26 9 Staph. aureus 23 10 Staph. aureus 3613 U Micrococ. pyog. 8244 12 Micrococ. pyog. 8588 13 Micrococ. flavus 10240 A 1,57 50,0 100,0 50,0 100,0 100,0 100,0 25,0 12,5 100,0 50.0 50,0 1,57 B 6,25 50,0 12,5 25,0 25,0 25,0 12,5 3,13 12,5 12,5 6,25 0,2 C 0,2 12,5 50,0 12,5 25,0 25,0 25,0 6,25 6,25 12,5 12,5 12,5 0,2 D 0,05 6,25 12,5 6,25 25,0 12,5 12,5 3,13 1,57 6,25 3.13 6,25 0,025 Wyzsze wartosci MIC dla pochodnej otrzymanej z acylowania kompleksu stafilokokcyny wynikaja ze znacznie nizszej aktywnosci, wyrazonej iloscia jednostek w miligramie substancji, oznaczonej wobec testo¬ wego szczepu Micrococ. flavus ATCC 10240 (szczep bakteryjny stosowany do standardowych oznaczen stafilokokcyny). Aktywnosc kompleksu stafilokokcyny z siarczanem amonu i alunem glinowo-potasowym jest S-6 razy nizsza od aktywnosci stafilokokcyny, stosowanej jako substrat. Dobra rozpuszczalnosc w wodzie pozwala na rozszerzenie dróg i sposobów podawnia leku, zarówno w lecznictwie ludzkim jak i w weterynarii.116413 3 Tablica II Rozpuszczalnosc w wodzie i soli fizjologicznej pochodnych stafilokokcyny (w temperaturze 23°C) Pochodna A B C Stafllokokcyna Woda mg/ml 60 100 100 1 Roztwór soli fizjologicznej mg/ml 55 100 95 2 Znaczenie symboli A, B, C podano w tablicy I.Przyklad I. Wytracony z brzeczki pofermentacyjnej i wysuszony kompleks stafilokokcyny z siarcza¬ nem amonu i alunem glinowo-potasowym w ilosci 3g zawieszono w 25 ml suchego dwumetyloformamidu.Do zawiesiny dodano 1 mikrokrople N-metylomorfoiiny i przy mieszaniu w temperaturze 5°C wkroplono 3 ml chlorku piwaloilu w 3ml dwumetyloacetamidu. Zawiesina ulega rozpuszczeniu w ciagu 30 minut. Po reakcji acylowania w temperaturze 5°C w ciagu dalszych 30 minut roztwór przesaczono bezposrednio do 300 ml acetonu. Wydzielony osad odsaczono, przemyto 3 razy po 25 ml acetonu i suszono w eksykatorze prózniowym na P2O5. Otrzymano 2,2g jasnokremowego osadu, który rozpuszczono w 20 ml wody, oczy¬ szczono weglem aktywnym i uzyskany roztwór poddano liofilizacji. Koncowa wydajnosc zwiazku wynosi 2,1 g. Substancja rozpuszcza sie w wodzie w stezeniu co najmniej 50 mg/ml. Aktywnosc wobec testowego szczepu Micrococ. flavus ATCC 10240 wynosi 1500j/ml. Zawartosc popiolu 1,29%, wilgoci — 6,7%, chlorowodoru 6,15%, zawartosc azotu calkowitego 16,07% oraz zawartosc azotu amoniakalnego 4,74% (w przeliczeniu na preparat bialkowy) pH 1% roztworu wodnego 2,56.Przykladu. Do zawiesiny 5g stalilokokcyny w 40 ml dwumetyloacetamidu dodano katalityczna ilosc N-metylomorfoliny i w temperaturze 5°C wkroplono przy mieszaniu4ml chlorku piwaloilu w4mldwumety¬ loacetamidu. Po mieszaniu wciagu godziny w temperaturze 5°C roztwór przesaczono dwukrotnie przezgesty saczek i przy intensywnym mieszaniu wlano do 500 ml ketonu metyioetylowego. Wydzielony osad odsa¬ czono, przemyto 3 razy po 30ml acetonu i suszono nad P2O5 w eksykatorze prózniowym. Otrzymano 3,4g kremowego produktu o aktywnosci wobec Micrococ. flavus ATCC 10240 wynoszacej 9200j/mg. Rozpu¬ szczalnosc w wodzie — co najmniej 50mg/ml. Zawartosc popiolu 1,03%, wilgoci 5,23%, chlorowodoru 3,2%; zawartosc azotu calkowitego 13,4% oraz zawartosc azotu amoniakalnego 1,89% (w przeliczeniu na preparat bialkowy) pH 1% roztworu wodnego 2,93.Przyklad III. Powtórzono postepowanie z przykladu II w miejsce chlorku piwaloilu 4ml chlorku o-chlorobenzoilu. Otrzymano 3,6 g kremowego produktu. Rozpuszczalnosc w wodzie wynosila co najmniej 50mg/ml. Aktywnosc pochodnej wobec Micrococ. flavus ATCC 10240 wynosila 8950j/mg. Zawartosc popiolu 1,00%, wilgoci 6,3%, chlorowodoru 3,45%; zawartosc azotu calkowitego 13,8% oraz zawartosc azotu amoniakalnego 2,27% (w przeliczeniu na preparat bialkowy), pH 1% roztworu wodnego 2,70.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowych rozpuszczalnych w wodzie pochodnych stafilokokcyny, znamienny tym, ze nierozpuszczalna w wodzie stafilokokcyne lub jej kompleks z siarczanem amonu i alunem glinowo- potasowym poddaje sie reakcji acylowania zchlorkiem kwasowym w rozpuszczalniku organicznym, wczasie 60 minut, w temperaturze 5°C, po czym produkt wydziela sie metoda wytracania w rozpuszczalniku organicznym i suszy. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze reakcje prowadzi sie w suchym, aprotycznym rozpuszczal¬ niku organicznym, takim jak dwumetyloacetamid lub dwumetyloformamid. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako chlorek kwasowy stosuje sie chlorek piwaloilu lub o-chlorobenzoilu. 4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze do wytracania rozpuszczalnej pochodnej stafilokokcyny z mieszaniny reakcyjnej stosuje sie rozpuszczalnik organiczny, taki jak aceton lub keton metyloetylowy. PL

Claims (4)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowych rozpuszczalnych w wodzie pochodnych stafilokokcyny, znamienny tym, ze nierozpuszczalna w wodzie stafilokokcyne lub jej kompleks z siarczanem amonu i alunem glinowo- potasowym poddaje sie reakcji acylowania zchlorkiem kwasowym w rozpuszczalniku organicznym, wczasie 60 minut, w temperaturze 5°C, po czym produkt wydziela sie metoda wytracania w rozpuszczalniku organicznym i suszy.
2. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze reakcje prowadzi sie w suchym, aprotycznym rozpuszczal¬ niku organicznym, takim jak dwumetyloacetamid lub dwumetyloformamid.
3. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako chlorek kwasowy stosuje sie chlorek piwaloilu lub o-chlorobenzoilu.
4. 4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze do wytracania rozpuszczalnej pochodnej stafilokokcyny z mieszaniny reakcyjnej stosuje sie rozpuszczalnik organiczny, taki jak aceton lub keton metyloetylowy. PL