PL115426B2 - Process for deposition of glycoside hydrolases on chitin carrier - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazkujest sposób osadzania hydrolaz glikozydów na nosniku chitynowym.Jak podaja W.L.Stanley, G.G.Watters, S.H.Kelly, A.G.Olson - „Glucoamylase Immobilized on Chitin with Ghiteraldehyd", Biotechnology and Biosnginoering vol. XXNol January 1978; W.L.Stanley, G.G.Watters, B.Chem., J.M.Marcer - „Lactaze and Other Enzymos M Bonnd to Chitin with Glutaraldehyda", Biotechnology and Biosnginoering vol. XII, 315-326, 1975; W.L.Stanley, G.G.Watters, J.W.Finley- „Romoval of Chill Heve from Baer with Pepsin Immobilized on Chitin", Biotechnology and Bioenginoering vol. XIX, 1895-1897,1977; Takafami Kucuwii, Masetaka Tsuji, Kiycahi Haynschi Nobuza Tsumara - „Preparation and some Proparties of Chitisen Bound Enzymoe", Agrucultural and Biological Chemistiy No,41/10/1977, sposób osadzania enzymów takich jak: laktoza, fosfotaza kwasowa, pepaina, izomeraza glukozowa, trypsyna glukoamylaza itp. na nosniku chitynowym polega na dzialaniu na chityne 0,1-0,3% roztworem wodnym srodka sieciujacego w postaci aldehy¬ du glutarowego oraz roztworem wodnym enzymu pozostawiajac mieszanine w temperaturze 20°C na okres okolo godziny, okresowo mieszajac, a nastepnie obnizeniu temperatury do 4°C utrzymujac ja przez 12 godzin, po czym usuwaniu nadmiaru enzymu przez przemycie destylowana woda.Niedogodnoscia opisanego sposobu jest koniecznosc uzycia srodka sieciujacego, posredniczacego w procesie wiazania bialka enzymatycznego grupami funkcyjnymi nosnika chitynowego, który powoduje czesciowa densa- turacje enzymu, w wyniku czego nastepuje spadek aktywnosci enzymu dochodzacy zaleznie od jego rodzaju niekiedy do 90%.Sposób osadzania hydrolaz glikozydów na nosniku chitynowym wedlug wynalazku polega na tym, ze enzymy osadza sie na nosniku chitynowym w roztworze wodnym bez udzialu srodków sieciujacych, a proces prowadzi sie w temperaturze 20°C przez 1 godzine, przy okresowym mieszaniu, a nastepnie obniza temperature do temperatuiy +4°C utrzymujac ja przez okolo 1 dobe, przy czym chityne otrzymuje sie z odpadów po przerobie kryla dzialajac na nie 20—25% roztworem kwasu solnego w stosunku 1:20, w temperaturze pokojowej, przez 2 godziny, po czym calosc saczy i przemywa destylowana woda az do uzyskania obojetnego odczynu a nastepnie dodaje 5—25% roztworu wodorotlenku potasu, w stosunku 1:20, miesza przez 2 godziny,w tempera-2 115 426 tuize 90-105°C ponownie saczy i przemywa destylowana woda, az do uzyskania obojetnego odczynu, nastepnie korzystnie przemywa sie dwukrotnie metanolem, suszy w temperaturze 105°C i miele. Stosuje sie enzymy posia¬ dajace zdolnosc wiazania sie z chityna, korzystnie a i j3 amylaze,glikoamylaze, izomeraze glukozowa, inwertaze.W czasie badan okazalo sie nieoczekiwanie, ze w odpowiednio prowadzonym procesie obróbki chityny zachodzi uaktywnienie niezacetylowanych polarnych grup funkcyjnych 2-amino-2-dezoksy-0-glukozy, które wystepuja w jednakowych odstepach, wzdluz czasteczki chityny i przypadaja na 5 lub 6 jednostek monomeru.Uaktywnione grupy funkcyjne za pomoca 20-25% roztworu kwasu solnego i 5-25% wodorotlenku potasu, latwo wiaza bialko enzymatyczne, co umozliwia zwiazanie enzymu z chityna w srodowisku wodnym, a zatem osadzanie hydrolaz glikozydów na chitynie mozna przeprowadzic bez udzialu srodka sieciujacego.Otrzymane w srodowisku wodnym preparaty diastazy, maja znacznie wyzsza aktywnosc w porównaniu z preparatami otrzymanymi z udzialem srodka sieciujacego (aldehydti glutarowego), szczególnie przy wiekszych zawartosciach enzymu co pokazane jest w wykresie I, na którym krzywa 1 obrazuje aktywnosc preparatów diastaza - chityna, o róznej zawartosci enzymu w srodowisku wodnym, natomiast krzywa 2 obrazuje aktywnosc preparatów diastaza-chityna, o róznej zawartosci enzymu w srodowisku 0,1% aldehydu glutarowego.Podczas osadzania diastazy w srodowisku wodnym, nie wystepuje spadek jej aktywnosci lub jest on mini¬ malny, czego dowodem jest bilans ilosci diastazy osadzonej i diastazy w przesaczu. Przy proporcji chityny do roztworu diastazy o stezeniu 1 mg/cm3, wynoszacej 1:200, uzyskano nastepujace wyniki,jak podaje tabela I.Tabela I Poczatkowa ilosc diastazy w roztworze 10 Ilosc enzymu osadzonego 3,80± w przesaczu po osadzeniu 5,70+ Suma (2+3) 9,5 Dosc enzymu osadzonego na 1 g chityny 7,6 % oznaczonej ilosci enzymu 1:4 95,0 1 Wartosci podane w rubryce 2 sa srdnia 20 oznaczen, a w rubryce 3 srednia 8 oznaczen.Natomiast zastosowanie srodka sieciujacego - aldehydu glutarowego, nawet przy jego minimalnym steze¬ niu 0,1% powoduje zmniejszenie aktywnosci enzymu spowodowane denaturacja bialka.W tabeli II przedstawiono porównanie aktywnosci wyrazonej jako szybkosc procesu hydrolizy substratu dla kilku enzymów osadzonych na chitynie przy pomocy aldehydu glutarowego o stezeniu 0,1% oraz bez jego udzialu wg proponowanej metody.Tabela II Rodzaj enzymu Amylaza Inwertaza Glukoamylaza Aktywnosc — szybkosc hydrolizy (mg/min) bez udzialu srodka sieciujacego 1,56 31,2 1,86 w obecnosci 0,1% aldehydu glutarowego 0,65 22,7 1,19 Zmniejszenie aktywnosci enzymu % 58,4 27,3 36,1 | Sily wiazania bialka enzymatycznego w tworzacym sie kompleksie enzym — chityna sa slabo, lecz wystar¬ czajaco odporne na dzialanie wody. Preparat diastazy zwiazany z chityna przemywany woda w stosunku 1:105 wykazuje spadek aktywnosci tylko o 15%.Stwierdzono równiez, ze chityna stosowana jako nosnik nie moze byc odbarwiana acetonem, poniewaz powoduje on zmniejszenia aktywnosci preparatu po pózniejszym osadzeniu enzymu. Nie stwierdzono natomiast szkodliwego wplywu przemywania chityny alkoholem metylowym.Zaleta wynalazku jest uzyskanie preparatów osadzonego enzymu o wyzszej aktywnosci, co umozliwia prowadzenie procesów z wieksza wydajnoscia. Ponadto istnieje mozliwosc wykorzystania odpadów powstajacych podczas przerobu kryla, które z trudnoscia poddaja sie naturalnej utylizacji biologicznej.Przyklad. Do Ig odpadów po odskorupianiu kryla dodaje sie 20 cm3 22% kwasu solnego i miesza w temperaturze 20°C przez 2 godziny. Nastepnie saczy i przemywa woda destylowana az do uzyskania odczynu115426 3 obojetnego. Nastepnie do osadu dodaje sie 20 cm3 28% wodorotlenku potasu i miesza przez 2 godziny w tempe¬ raturze 90°C, saczy i przemywa destylowana woda az do otrzymania odczynu objetnego. Otrzymana chityne suszy sie w temperaturze 105° C i miele w mlynku udarowym.Do 1 g tak otrzymanej chityny dodaje sie 200 cm3 1% roztworu a amylazy i pozostawia w temperaturze 20°C na 1 godzine okresowo mieszajac, a nastepnie obniza temperature do 4°C utrzymujac ja przez 10 godzin, a nadmiar enzymu usuwa sie przez przemycie destylowana woda.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób osadzania hydrolaz glikozydów na nosniku chitynowym w temperaturze 20°C przez 1 godzine a nastepnie w temperaturze 4°C okolo 1 dobe, znamienny tym, ze enzymy osadza sie na nosniku chitynowym z uaktywnionymi grupami funkcyjnymi za pomoca 20-25% roztworu kwasu solnego i 5-25% roztworu wodorotlenku potasu, w roztworze wodnym. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako enzymy stosuje sie a i 0 amylaze, glukoamy- laze, izomeraze glukozowa, inwertaze. 4*y A - ilosc dlaitttj w nlalt rakcyjntj. • - ilosc ctltyoj.ITIRBS I.115 426 % hydrolizy A •krobii.A - ilosc diastaay • reakcyjnej.S - Ilosc chltyny. 20 i » 40 •100% mus n.Prac. Poligraf. UP PRL naklad 120+18 Cena 45 zl PL

Claims (2)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób osadzania hydrolaz glikozydów na nosniku chitynowym w temperaturze 20°C przez 1 godzine a nastepnie w temperaturze 4°C okolo 1 dobe, znamienny tym, ze enzymy osadza sie na nosniku chitynowym z uaktywnionymi grupami funkcyjnymi za pomoca 20-25% roztworu kwasu solnego i 5-25% roztworu wodorotlenku potasu, w roztworze wodnym.
2. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako enzymy stosuje sie a i 0 amylaze, glukoamy- laze, izomeraze glukozowa, inwertaze. 4*y A - ilosc dlaitttj w nlalt rakcyjntj. • - ilosc ctltyoj. ITIRBS I.115 426 % hydrolizy A •krobii. A - ilosc diastaay • reakcyjnej. S - Ilosc chltyny. 20 i » 40 •100% mus n. Prac. Poligraf. UP PRL naklad 120+18 Cena 45 zl PL