Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowych pieciopeptydów o ogólnym wzorze Tyr-A-Gly-Phe-B-X-Y,w którym A oznacza grupe D-aminokwasu, majaca jako boczny lancuch niz¬ szy rodnik alkilowy lub tioalkilowy, B oznacza gru¬ pe aminokwasu lub grupe cyklicznego iminokwa- su, które to grupy maja nizszy rodnik alkilowy ja¬ ko boczny lancuch, X oznacza atom tlenu albo gru¬ pe NH i Y oznacza atom wodoru lub nizszy rodnik alkilowy, jak równiez pochodnych tych zwiazków i ich soli.Skróty stosowane w opisie i zastrzezeniach dla okreslenia aminokwasów, peptydów, ich pochodnych i ich podstawników, jak równiez dla oznaczenia po¬ lozenia aminokwasów obecnych w peptydach, sa zgodne z zaleceniami IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature [Biochemistry 5,2,485 (1966); 6, 322(1967); J. Biol. Chem. 241, 2491(1966); 242, 555(1967); 247, 977(1972)].Trzyliterowe skróty aminokwasów maja nastepu¬ jace znaczenie: Ala = alanina Gly = glicyna Ile = izoleucyna Leu = leucyna Nie = norleucyna = kwas ksylowy-1 Sam taki skrót oznacza aminokwas w konfigu¬ racji L (za wyjatkiem nieczynnej Gly), podczas gdy aminokwasy w konfiguracji D sa w kazdym wy- Met Phe Pro Tyr = metionina = fenyloalaning = prolina = tyrozyna 2-aminopentanokarbo- 10 15 25 padku oznaczone za pomoca litery D, np. D-Met oznacza D-metionine.Lacznik stojacy przed lub za skrótem oznacza brak atomu wodoru w grupie a-aminowej albo imi- nowej, lub tez brak grupy hydroksylowej w grupie a-karboksylowej. Zgodnie z tym, alanina = Ala = = H-Ala-OH; karbobenzoksyalanina = ZAla, ponie¬ waz Z = karbobenzoksy, a ester metylowy alani¬ ny = Ala-OMe, poniewaz Me = metyl.Zgodnie z tym przyjetym systemem skrótów, za¬ równo Gly-Phe-Nle jak i H-Gly-Phe-Nle-OH ozna¬ czaja glicylo-L-fenyloalanylo-L-norleucyne. Amino- kwasowe skladniki sa numerowane zaczynajac od grupy aminowej w polozeniu koncowym i zgodnie z tym, posrednia grupe Gly trójpeptydu Tyr-Gly- -Gly oznacza sie Gly2, zas grupe Gly w koncowej grupie karboksylowej oznacza sie Gly8.Poza tym w opisie stosuje sie nastepujace skróty: Z = grupa benzyloksykarbonylowa = karbobenzo¬ ksyIowa Boc = grupa Ill-rzed. butyloksykarbonylowa OTCP = grupa 2,4,5-trójchlorofenoksylowa OPCP = grupa pieciochlorofenoksylowa ONP = grupa 4-nitrofenoksylowa Et = rodnik etylowy Wiadomo, ze naturalna Met-encefalina o wzorze Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-OH i Leuencefalina o wzo¬ rze Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-OH, w których Met-en¬ cefalina odpowiada fragmentowi 61-65 p-lipotropi- ny, dzialaja podobnie do morfiny [J. Hughes i wspól- 114062114062 3 4 pracownicy: Nature 258, 577(1975)]. To dzialanie po¬ wyzszych zwiazków podobne do dzialania morfiny przejawia sie w tym, ze oba te zwiazki dzialaja in vitro jak leki makowcowe. Jednakze ich aktywnosc in vivo jest watpliwa.Znieczulajace dzialanie, charakterystyczne dla morfiny, stwierdzono jednoznacznie tylko w przy¬ padku fragmentów 0-lipotropiny majacych wyzsza liczbe czlonów, takich jak fragmenty 61-67 i 61-91 [L. Graf i wspólpracownicy: Nature (1976) w toku publikowania].Do chwili obecnej nie wytworzono zadnych po¬ chodnych pieciopeptydowych albo analogów, któ¬ rych aktywnosc in vitro bylaby wyzsza od aktyw¬ nosci Met-encefaliny czy nawet mniej aktywnej Leu-encefaliny [L. Terenius i wspólpracownicy: Biochem. Biophys. Res. Commun. 71, 175(1976)], al¬ bo której dzialanie znieczulajace mozna byloby udo¬ wodnic jednoznacznie.Wynalazek ma na celu umozliwienie wytwarza¬ nia pieciopeptydów i pochodnych pieciopeptydów, które równiez in vivo przejawiaja aktywnosc po¬ dobna do aktywnosci morfiny.Stwierdzono, ze przez przeksztalcenie czasteczki znanych encefalin, polegajace na wymianie grup aminokwasowych Gly2 i Leu5 albo Met5, mozna wy¬ twarzac pieciopeptydy i pochodne pieciopeptydów majace dzialanie znieczulajace równorzedne dzia¬ laniu morfiny.Stwierdzono takze, ze korzystnie jest zastepowac grupe Gly* grupa D-aminokwasu majaca nizszy ro¬ dnik alkilowy albo tioalkilowy jako boczny lancuch, a grupe Leu5 albo Met5 odpowiednio grupa amino¬ kwasu albo cyklicznego iminokwasu, z których ka¬ zda ma jako boczny lancuch nizszy rodnik alkilo¬ wy, lub pochodna estrowa albo amidowa takiej grupy.Zgodnie z tym, przedmiotem wynalazku jest spo¬ sób wytwarzania nowych pieciopeptydów i pocho¬ dnych pieciopeptydów o ogólnym wzorze Tyr-A- -Gly-Phe-B-X-Y, w którym A, B, X i Y maja wy¬ zej podane znaczenie jak równiez ich soli, polega¬ jacy na tym, ze aminokwas majacy jako lancuch boczny nizszy rodnik alkilowy, albo cykliczny imi- nokwas majacy jako lancuch boczny nizszy rodnik alkilowy, lub tez pochodna estrowa albo amidowa jakiegokolwiek z tych aminokwasów, kondensuje sie metoda stosowana w chemii peptydów z kolej¬ no nastepujacymi po sobie fragmentami aminokwa¬ sów i/albo peptydów majacych przy koncowej gru¬ pie aminowej grupe zabezpieczajaca, która mozna odszczepiac i w razie potrzeby, otrzymany jako pro¬ dukt posredni peptyd, zabezpieczony w koncowej grupie aminowej, przeprowadza sie w pochodna estrowa lub aminowa i w razie potrzeby, po usu¬ nieciu grupy zabezpieczajacej, przeprowadza sie otrzymany produkt w sól z kwasem.Dzialanie nowych zwiazków podobne do dziala¬ nia morfiny podano w tabeli I w zestawieniu z dzia¬ laniem Met-encefaliny i morfiny. Próby te prowa¬ dzono metoda D,Amour i Smith [J. Pharm. Ther. 72, 74(1941)] i Chermat i Simon [J. Pharmacol. (Pa¬ ryz) 0, 489(1975)].Badania te wykazaly, ze w przeciwienstwie do Met-encefaliny, dzialanie nowych zwiazków podo¬ bne do dzialania morfiny wystepuje równiez in vi- vo i niektóre z tych zwiazków maja aktywnosc wyz¬ sza nawet od aktywnosci morfiny, stosowanej jako substancja porównawcza i której aktywnosc przy¬ jeto za 100.Tabela I Dzialanie nowych zwiazków podobne do dzialania morfiny Nr przykladu I II III IV .V VIII VII XI VI IX X Substancja porów¬ nawcza 1 » tt Zwiazek Tyr-A--Gly-Phe-B-X-Y -A- -D-Ala- -D-Ala- -D-Met- -D-Ala- -D-Ala- -D-Nle- -D-Met- -D-Ala- -D-Ala- -D-Met- -D-Met- B-X-Y -Nle-O-H -Nle-O-Me -Nle-O-H -Ile-O-H -Pro-O-H -Pro-O-H -Pro-Ó-H -Pro-NH-H -Pro-NH-Et -Pro-NH-Et -Pro-NH-H Tyr—Gly-Gly-Phe- -Met-OH morfina Aktywnosc in vivo 2 ' 2 2 2 i 24 100 133 390 1690 1690 5000 0 100 Sposób wedlug wynalazku zilustrowano w przy¬ kladach, które nie ograniczaja zakresu wynalazku.Podane w przykladach wartosci R* oznaczano metoda chromatografii cienkowarstwowej na zelu krzemionkowym (Kieselgel G, produkcji firmy Re- anol, Budapeszt), stosujac nastepujace mieszaniny rozpuszczalników: 1. chloroform — metanol (9 :1) 2. octan etylu—pirydyna—kwas octowy—woda (240 : 20 : 6 :11) 3. octan etylu—pirydyna—kwas octowy—woda (120 : 20 : 6 :11) 4. octan etylu—pirydyna—kwas octowy—woda (60 :20 : 6 :11) 5. octan etylu—pirydyna—kwas octowy—woda (30 : 20 : 6 :11) Roztwory odparowywano pod zmniejszonym cis¬ nieniem na lazni wodnej o temperaturze 40°C. Ami¬ nokwasy analizowano w peptydach za pomoca ana¬ lizatora typu JLC-SAN, po calkowitej hydrolizie za pomoca 6n HCl w ciagu 24 godzin w temperaturze 110°C.Przyklad I. Wytwarzanie L-tyrozylo-D-alany- loglicylo-L-fenyloalanylo-L-norleucyny.Stadium 1. Ester metylowy benzyloksykarbonylo- -L-fenyloalanylo-L-norleucyny. 4,8 g (10 milimoli) Z-Phe-OTCP [J. Pless i R. A.Boissonas: Helv. Chim. Acta 46, 1609(1963)] i 2 g (11 milimoli) H-Nle-Ome. HCl [H/M. Flowers i W.S. Reith: Biocem. J. 53, 657(1953)] rozpuszcza sie w 10 ml pirydyny, dodaje 1,2 ml (11 milimoli) N- -metylomorfoliny i pozostawia w spokoju na okrfes 3 godzin, po czym mieszanine odparowuje sie, po¬ zostalosc rozpuszcza w 50 ml mieszaniny octanu ety- 10 15 20 25 30 35 40 4» 50 55 60114062 5 6 lu z woda (1 : 1), faze organiczna plucze sie In kwa¬ sem solnym i woda, suszy nad siarczanem sodo¬ wym i odparowuje. Pozostalosc rozciera sie z ete¬ rem, przesacza, przemywa eterem i suszy, otrzymu¬ jac 3,6 g (85% wydajnosci teoretycznej) podanego wyzej estru metylowego o temperaturze topnienia 123—124°C; R\ 0,89—0,93.Stadium 2. Ester metylowy benzyloksykarbonylo- glicylo-L-fenyloalanylo-L-norleucyny. 5,55 g (13 milimoli) Z-Phe-Nle-Ome (stadium 1 przykladu I) rozpuszcza sie w 100 ml metanolu i u- wodornia w obecnosci palladowego katalizatora. Po zakonczeniu reakcji (Rf 0,23—0,25) odsacza sie ka¬ talizator, przesacz odparowuje, pozostalosc rozpu¬ szcza w 25 ml pirydyny, dodaje 4,66 g (12 milimoli) Z-Gly-OTCP [J. Pless i R. A. Boissonas: Helv. Chim.Acta 46, 1609 (1963)] i odstawia mieszanine na okres 3 godzin.Nastepnie mieszanine odparowuje sie, pozostalosc rozciera z eterem, przesacza, plucze eterem i suszy otrzymujac 5,28 g (91% wydajnosci teoretycznej) es¬ tru podanego w tytule, topniejacego w temperatu¬ rze 110—112°C; Rf 0,80^0,90.Stadium 3. Wytwarzanie estru metylowego ben- zyloksykarbonylo-L-tyrozylo-D-alanyloglicylo-L- -fenyloalanylo-L-norleucyny. 1,93 g (4 milimole) Z-Gly-Phe-Nle-OMe (stadium 3 przykladu I) rozpuszcza sie w 30 ml metanolu i uwodornia w obecnosci palladowego katalizatora.Po zakonczeniu reakcji (Rf 0,10—0,20) odsacza sie katalizator, odparowuje przesacz, pozostalosc roz¬ puszcza w 8 ml pirydyny, dodaje 1,6 g (4 milimole) Z-D-Ala-OTCP [synteza tego zwiazku jest identycz¬ na z synteza L-izomeru, podana przez J. Pless i R. A. Boissonas w Helv. Chim. Acta 46, 1609 (1963)] i pozostawia mieszanine na okres 3 godzin.Nastepnie mieszanine odparowuje sie, pozostalosc rozciera z eterem, przesacza, przemywa eterem i su¬ szy. Otrzymany produkt (Rf 0,67—0,70) rozpuszcza sie w 50 ml mieszaniny metanolu z woda i dwu- metyloformamidem (1:1:1) i uwodornia w obec¬ nosci palladowego katalizatora. Po zakonczeniu re¬ akcji (R f 0,24—0,29) odsacza sie katalizator, pozosta¬ losc rozpuszcza w 8 ml pirydyny, dodaje 1,75 g (3,5 milimola) Z-Tyr-OTCP[J. Pless i R. A. Boissonas: Helv. Chim. Acta 46, 1609 (1963)] i pozostawia na okres 5 godzin.Nastepnie mieszanine odparowuje sie, pozostalosc rozpuszcza w 30 ml octanu etylu, plucze woda, su¬ szy nad siarczanem sodowym i odparowuje. Pozo¬ stalosc rozciera sie mieszanina eteru z n-heptanem (1 : 1), przesacza, przemywa taka sama mieszanina i suszy. Otrzymuje sie 2,0 g (80% wydajnosci teo¬ retycznej) estru o temperaturze topnienia 195°C (kurczy sie w temperaturze 190°C); Rf 0,73—0,78.Stadium 4. L-tyrozylo-D-alanyloglicylo-L-fenylo- alanylo-L-norleucyna. 1,15 g (1,6 milimola) estru Z-Tyr-D-Ala-Gly-Phe- -Nle-OMe, otrzymanego w sposób podany w sta¬ dium 3, miesza sie z mieszanina 4 ml metanolu i 2 ml acetonu, po czym zmydla zawiesine za pomoca 0,5n wodorotlenku sodowego w obecnosci ftaleiny tymolowej jako wskaznika.Gdy wiazanie wodorotlenku sodowego ustaje, mieszanine rozciencza sie 10 ml wody i wytrzasa z 3 porcjami po 5 ml octanu etylu. Roztwory w oc¬ tanie etylu odparowuje sie, otrzymujac 0,3 g (26% wydajnosci teoretycznej) zabezpieczonego estru pie- 5 ciopeptydu. Wodna faze zakwasza sie 0,5n kwasem siarkowym, wytracony osad (Rf 0,25—0,35) miesza z 50 ml 80% kwasu octowego i zawiesine uwodor¬ nia w obecnosci palladowego katalizatora, przy czym podczas tej reakcji stala substancja ulega rozpusz- 10 czeniu. Po zakonczeniu uwodorniania odsacza sie katalizator, przesacz odparowuje i pozostalosc roz¬ ciera z okolo 4 ml zimnej wody. Otrzymany kry¬ staliczny produkt odsacza sie, przemywa zimna wo¬ da i suszy, otrzymujac 0,47 g (70% wydajnosci te- 15 oretycznej) . L-tyrozylo-D-alanyloglicylo-L-fenylo- alanylo-L-norleucyny; Rf 0,19—0,23.Analiza aminokwasów: Gly = 1,0, Ala = 1,02, Nie = 1,02, Tyr = 0,98, Phe = 1 (podstawa porów¬ nawcza). 20 Przyklad II. Wytwarzanie chlorowodorku estru metylowego L-tyrozylo-D-alanyloglicylo-L-fe- nyloalanylo-L-norleucyny. 0,36 g (0,5 milimola) Z-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Nle- -OMe (patrz stadium 3 przykladu I) miesza sie z 30 ml 80% kwasu octowego i uwodornia w obecnosci palladowego katalizatora. Po zakonczeniu reakcji odsacza sie katalizator, odparowuje przesacz i po¬ zostalosc rozpuszcza w 1 ml In metanolowego roz¬ tworu kwasu solnego i nastepnie rozciencza eterem.Wytracony osad odsacza sie, przemywa eterem i su¬ szy. Otrzymuje sie 0,3 g (93% wydajnosci teorety¬ cznej) zadanego chlorowodorku estru peptydowego: Rj 0,55—0,60. 35 Przyklad III. Wytwarzanie L-tyrozylo-D-me- tionyloglicylo-L-fenyloalanylo-L-norleucyny. 1,8 g (3,7 milimoli) Z-Gly-Phe-Nle-OMe (patrz stadium 2 przyklad I) rozpuszcza sie w 30 ml meta¬ nolu i uwodornia w obecnosci palladowego katali- 40 zatora. Po zakonczeniu reakcji (R* 0,10—0,20) odsa¬ cza sie katalizator, odparowuje przesacz, pozosta¬ losc rozpuszcza w 4 ml pirydyny, dodaje 1,56 g (3,65 milimoli) Boc-D-Met-OTCP (W. Broadbend i wspólpracownicy: J. Chem. Soc. 1967, 1632) i po- 45 zostawia roztwór na okres 5 godzin.Nastepnie mieszanine odparowuje sie, pozostalosc rozciera z mieszanina eteru i n-heptanu (1 : 1), od¬ sacza, przemywa taka sama mieszanina i suszy.Otrzymany produkt (Rf 0,70—0,75) traktuje sie 5 50 ml 2n roztworu kwasu solnego w octanie etylu i po¬ zostawia na okres 30 minut, po czym rozciencza heptanem, odsacza osad, przemywa go n-heptanem i suszy pod zmniejszonym cisnieniem w obecnosci wodorotlenku potasu. Otrzymany produkt ^1,5 g, 55 Rf 0,17—0,27) miesza sie z mieszanina 2 ml pirydy¬ ny i 2 ml dwumetyloformamidu, do zawiesiny do¬ daje 1,6 g (3 milimole) Boc-Tyr-OTCP [D. A. Jones i wspólpracownicy: J. Org. Chem. 38, 2865 (1973)] i 0,7 ml <6 milimoli) N-metylomorfoliny i miesza 60 az do uzyskania roztworu, który pozostawia sie na noc.Nastepnie steza sie mieszanine pod zmniejszo¬ nym cisnieniem, rozciencza 30 ml octanu etylu i 30 ml 0,5n kwasu siarkowego. Organiczny roztwór plu- 85 cze sie 0,5n kwasem siarkowym i woda, suszy nad114062 7 8 siarczanem sodowym i odparowuje. Pozostalosc roz¬ puszcza sie w 5 ml acetonu i zmydla In wodoro¬ tlenkiem sodowym w obecnosci ftaleiny tymolowej jako wskaznika. Po zakonczeniu reakcji roztwór zakwasza sie 0,5 n kwasem siarkowym i wytrzasa z octanem etylu. Roztwór w octanie etylu odparo¬ wuje sie, do pozostalosci dodaje 10 ml 2n roztworu kwasu solnego w octanie etylu i miesza. Po uply¬ wie 30 minut otrzymana zawiesine rozciencza sie 10 ml wody i wodna faze zobojetnia sie N-metylo- morfolina, a nastepnie chlodzi, odsacza krystalicz¬ ny produkt, przemywa go mala iloscia zimnej wo¬ dy i suszy. Otrzymuje sie 1,13 g (60% wydajnosci teoretycznej) L-tyrozylo-D-metionyloglicylo-L-feny- loalanylo-L-norleucyny; R3 0,3—0,4.Analiza aminokwasów: Gdy = 0,98; Met = 0,98; Nie = 1,0; Tyr= 0,96; Phe = 1 (podstawa porówna¬ wcza).Przyklad IV. Wytwarzanie L-tyrozylo-D-ala- nyloglicylo-L-fenyloalanylo-L-izoleucyny.Stadium 1: Glicylo-L-fenyloalanylo-L-izoleucyna. 1,95 g (7 milimoli) H-Phe-Ile-OH [J. T. Hill i Wl F.Dunn: J. Med. Chem. 12, 737 (1969)] miesza sie w 10 ml pirydyny i do otrzymanej zawiesiny dodaje 0,98 ml (7 milimoli) trójetyloaminy i 2,72 g (7 mili¬ moli) Z-Gly-OTCP, po czym miesza sie az do uzys¬ kania roztworu, który pozostawia sie na noc.Nastepnie mieszanine odparowuje sie, pozostalosc rozpuszcza w 50 ml octanu etylu i dodaje 0,5n kwa¬ su siarkowego tak, aby wartosc pH wodnej fazy wy¬ nosila 2—3. Faze organiczna plucze sie woda i za¬ warty w roztworze peptyd N-benzyloksykarbony- lowy ekstrahuje 3 porcjami po 20 ml 5% roztworu wodoroweglanu sodowego. Polaczone wyciagi za¬ kwasza sie 0,5n kwasem siarkowym, wytracony peptyd ekstrahuje octanem etylu i odparowuje wy¬ ciag. Pozostalosc (R\ 0,5—0,6) rozpuszcza sie w 60 ml metanolu i uwodornia w obecnosci palladowego katalizatora.Po zakonczeniu uwodorniania odsacza sie katali¬ zator, przemywa go kwasem octowym, laczy po¬ pluczyny z przesaczem i odparowuje. Pozostalosc rozciera sie z eterem, odsacza, przemywa eterem i suszy pod zmniejszonym cisnieniem w obecnosci wodorotlenku potasowego. Otrzymuje sie li,87 g (90% wydajnosci teoretycznej) trójpeptydu L-tyro- zylo-D-alanyloglicylo-L-fenyloalanylo-L-izoleucyiny; Rj 0^3a—0,45.Stadium 2: D-alanyloglicylo-L-fenyloalanylo-L- -izoleucyna. ¦ . . • . 1,68 g (5 milimoli) H-Gly-Phe-Ile-OH (patrz sta¬ dium 1 przykladu IV) miesza sie z 5 ml pirydyny, dodaje, 0,7 ml (5 milimoli) trójetyloaminy i 2,02 (5 milimoli) Z-D-Ala-OTCP, miesza az do uzyskania roztworu i pozostawia na noc.Nastepnie mieszanine poddaje sie obróbce opisa¬ nej w stadium 1 i pozostalosc po odparowaniu (R* 0,50—0,55) rozpuszcza sie w 50 ml 80% kwasu oc¬ towego i uwodornia w obecnosci palladowego kata¬ lizatora. Po zakonczeniu reakcji odsacza sie kata¬ lizator, przemywa go kwasem octowym, popluczyny laczy z przesaczem i odparowuje. Pozostalosc roz¬ ciera sie z eterem, odsacza, przemywa eterem i su¬ szy pod zmniejszonym cisnieniem w obecnosci wo¬ dorotlenku potasowego. Otrzymuje sie 1,7 g (84% wydajnosci teoretycznej) czteropeptydu H-D-Ala- -Gly-Phe-Ile-OH; R* 0,10—0,15.Stadium 3: L-tyrozylo-D-alanyloglicylo-L-fenylo- <5 alanylo-L-izoleucyna. l 1,22 g (3 milimole) H-D-Ala-Gly-Phe-Ile-OH (patrz stadium 2 przykladu IV) miesza sie z piry¬ dyna, dodaje 0,42 ml (3 milimole) trójetyloaminy i 1,48 g (3 milimole) Z-Tyr-OTCP i miesza az do 10 uzyskania roztworu, który pozostawia sie na noc.Nastepnie mieszanine poddaje sie obróbce opisa¬ nej w stadium 1 i otrzymana pozostalosc po odpa¬ rowaniu (Rf 0,55—0,60) rozpuszcza sie w 50 ml 80% kwasu octowego i uwodornia w obecnosci pallado- 15 wego katalizatora. Po zakonczeniu reakcji odsacza sie katalizator, przemywa go kwasem octowym, la¬ czy popluczyny z przesaczem, odparowuje, pozosta¬ losc rozciera z eterem, odsacza, przemywa eterem i suszy pod zmniejszonym cisnieniem w obecnosci 20 wodorotlenku potasowego. Otrzymuje sie 1,4 g (60% wydajnosci teoretycznej) zadanego pieciopeptydu; R? 0,08—0,12.Analiza aminokwasów: Gly =* 1,0; Ala *¦ 1,0; Nie =1,02; Tyr= 0,96; Phe = 1 (podstawa porów¬ nawcza).Przyklad V. Wytwarzanie L-tyrozylo-D-ala- nyloglicylo-L-fenyloalanylo-L-proliny.Stadium 1: Glicylo-L-fenyloalanylo-L-prolina. 5,25 g (20 milimoli) H-Phe-Pro-OH [S. Bajusz i T. 20 Lazar: Acta Chim. Acad. Sci. Hung. 48, 111 (1966)] miesza sie z 20 ml pirydyny, dodaje 2,8 ml (20 mili¬ moli) trójetyloaminy i 7,77 g (20 milimoli) Z-Gly- -OTCP, miesza az do uzyskania roztworu i pozo¬ stawia na noc. 35 Nastepnie mieszanine poddaje sie obróbce opisa¬ nej w stadium 1 przykladu IV, pozostalosc po od¬ parowaniu (Rj 0,5—0,6) rozpuszcza w 100 ml meta¬ nolu i uwodornia w obecnosci palladowego katali¬ zatora. Po zakonczeniu reakcji odsacza sie katali¬ zator, przemywa go metanolem, laczy popluczyny z przesaczem i odparowuje. Pozostalosc krystalizu¬ je sie z eteru, odsacza, przemywa eterem i suszy, otrzymujac 5,43 g (85% wydajnosci teoretycznej) za- 45 danego trójpeptydu; Rj 0,31—0,38.Stadium 2: D-alanyloglicylo-L-fenyloalanylo-L.- prolina. 3,2 g (10 milimoli) H-Gly-Phe-Pro-OH (patrz sta¬ dium 1 przykladu V) miesza sie z 10 ml pirydyny M i nastepnie dodaje 1,4 ml (10 milimoli) trójetylo¬ aminy i 4,03 g (10 milimoli) Z-D-Ala-OTCP i mie¬ sza sie az do uzyskania roztworu, który pozosta¬ wia sie na noc. Postepujac dalej w sposób opisany w stadium 1 przykladu IV, otrzymana pozostalosc u po odparowaniu (R3 0,42—0,52) rozpuszcza sie w 80 ml metanolu i uwodornia w obecnosci palladowego katalizatora. Po zakonczeniu reakcji odsacza sie ka¬ talizator, przemywa go metanolem, popluczyjiy la¬ czy z przesaczem i odparowuje. Pozostalosc rozciera 60 sie z eterem, odsacza, przemywa eterem i suszy, o- trzymujac 3,2 (82% wydajnosci teoretycznej) zada¬ nego czteropeptydu; rJ 0,07—0,11.Stadium 3: benzyloksykarbonylo-L-tyrozylo-D- -alanyloglicylo-L-fenyloalanylo-L-prolina. w 3,12 g <8 milimoli) H-D-Ala-Gly-Phe-Pro-OH114062 9 10 (patrz stadium 2 przykladu V) miesza sie z 15 ml pirydyny, dodaje 1,12 ml (8 milimoli) trójetyloami¬ ny i 3,95 g (8 milimoli) Z-Tyr-OTCPi miesza az do uzyskania roztworu, który pozostawia sie na noc l nastepnie poddaje obróbce opisanej w stadium 1 przykladu IV. Pozostalosc po odparowaniu rozcie¬ ra sie z eterem, odsacza, przemywa eterem i suszy otrzymujac 4,4 g (80% wydajnosci teoretycznej) za¬ danego pieciopeptydu; Rj! 0,3—0,4.Stadium 4: L-tyrozylo-D-alanyloglicylo-L-fenylo- alanylo-L-prolina.Roztwór 2,06 g (3 milimole) Z-Tyr-D-Ala-Gly-Phe- -Pro-H (patrz stadium 3 przykladu V) w miesza¬ ninie 40 ml metanolu i 10 ml dwumetyloformami- du uwodornia sie w obecnosci palladowego katali¬ zatora. Po zakonczeniu reakcji odsacza sie katali¬ zator, przemywa go mieszanina metanolu z dwu- metyloformamidem (1 : 1), popluczyny laczy z prze¬ saczem i odparowuje. Pozostalosc rozciera sie z eter rem, odsacza, przemywa i suszy, ponownie rozpu¬ szcza w 4 ml metanolu i wytraca octanem etylu.Osad odsacza sie, przemywa octanem etylu i suszy, otrzymujac 1,16 g (70% wydajnosci teoretycznej) L- tyrozylo-D-alanyloglicylo-L-fenyloalanylo-L-proli- ny; R\ 0,3—0,4.Analiza aminokwasów: Pro = 1,02; Gly = 1,0; Ala = 0,98; Tyr = 1,0; Phe = 1 (podstawa porówna¬ wcza).Przyklad VI. Wytwarzanie etyloamidu L-ty- rozylo-D-alanylo-glicylo-L-fenyloalanylo-L-proliny. 0,7 g (1 milimol) Z-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Pro-OH (patrz stadium 3 przykladu V) rozpuszcza sie w 2 ml dwumetyloformamidu, dodaje 0,1 g (1,24 mili- mola)_ chlorowodorku etyloaminy, 0,17 ml (1,24 mili- mola) trój etyloaminy i 0,21 g (1 milimol) dwucyklo- heksylokarbodwuimidu i pozostawia na okres 1 dnia, po czym przesacza, rozciencza 30 ml octanu etylu i plucze roztwór 0,5n roztworem kwasu siarkowego, woda, 5% roztworem wodnym wodoroweglanu so¬ dowego i woda, a nastepnie suszy i odparowuje.Pozostalosc (Rf 0,80—0,85) rozpuszcza sie w 30 ml metanolu i uwodornia w obecnosci palladowego ka¬ talizatora.Po zakonczeniu reakcji odsacza sie katalizator, przesacz odparowuje, pozostalosc rozciera z eterem, odsacza, plucze eterem i suszy. Otrzymuje sie 0,43 g (75% wydajnosci teoretycznej) pieciopeptydu po¬ danego w tytule; R* 0,34^0,44.Przyklad VII. Wytwarzanie chlorowodorku L-tyrozylo-D-metionyloglicylo-L-fenyloalanylo-L- -proliny.Do zawiesiny 0,96 g (3 milimole) H-Gly-Phe-Pro- -OH (patrz stadium 1 przykladu V) w 5 ml pirydy¬ ny dodaje sie 0,42 ml (3 milimole) trójetyloaminy i 1,27 ml (3 milimole) Boc-D-Met-OTCP i miesza do uzyskania roztworu. Roztwór ten pozostawia sie na noc, po czym poddaje obróbce opisanej w stadium 1 przykladu IV i do pozostalosci po odparowaniu (Rf 0,30—0,35) dodaje sie 10 ml 2n kwasu solnego w octanie etylu i miesza. Po uplywie 30 minut mie¬ szanine rozciencza sie n-heptanem, odsacza, prze¬ mywa osad n-heptanem i suszy pod zmniejszonym cisnieniem w obecnosci wodorotlenku potasowego.Otrzymany produkt (Rj 0,1-6^0,24) miesza sie z 5 ml pirydyny, dodaje 0,84 ml (6 milimoli) trójetyloaminy i 1,32 g (2,5 milimole) Boc-Tyr-OPCP i miesza az do uzyskania roztworu. Roztwór ten pozostawia sie na noc, po czym poddaje obróbce w sposób opisa- 5 ny w stadium 1 przykladu IV, pozostalosc po od¬ parowaniu rozpuszcza sie w 10 ml 2n kwasu sol¬ nego w octanie etylu, miesza w ciagu 30 minut, ioz- ciencza 10 ml octanu etylu, odsacza, przemywa oc¬ tanem etylu i suszy. Otrzymuje sie 1,14 g (70% wy- lc dajnosci teoretycznej) chlorowodorku L-tyrozylo-D- -metionyloglicylo-L-fenyloalanylo-L-proliny; R4 od 0,35—0,45.Analiza aminokwasów: Pro = 0,98; Gly = 1,0; Met = 0,95; Tyr = 1,0; Phe = 1 (podstawa porów- 15 nawcza).P r z y k.l a d VIII. Wytwarzanie chlorowodorku L-tyrozylo-D-norleucyloglicylo-L-fenyloalanylo-L- -proliny.Stosujac jako produkt wyjsciowy 0,96 g (3 mili- 20 mole) H-Gly-Phe-Pro-OH (patrz stadium 1 przykla¬ du V) postepuje sie w sposób opisany w przykla¬ dzie VII, lecz stosujac zamiast 1,27 g Boc-D-Met- -OTCP 1,06 g (3 milimole) Boc-D-Nle-ONP [R.-Roc- chi i wspólpracownicy: J. Am, Chem. Soc. 91, 492 25 (1969)]. Otrzymuje sie 1,18 g (75% wydajnosci teore¬ tycznej) chlorowodorku pieciopeptydu podanego w tytule; R4 0,35—0,45.Analiza aminokwasów: Pro -= 1,0; Gly = 1,0; Nie — 1,05; Tyr = 0,98; Phe = 1 (podstawa porów- nawcza). - Przyklad IX. Wytwarzanie etyloamidu L-ty- rozylo-D-metionyloglicylo-L-fenyloalanylo-L-pro- liny.Stadium 1: szczawian etyloamidu glicylo-L-feny- ioalanylo-L-proliny. 3,7 g (13 milimoli) Pro-NH-Et [S. Shinagawa i M.Fujino: Chem. Pharm. Buli. 23, 229 (1975)] rozpusz¬ cza sie w 50 ml metanolu i uwodornia w obecnosci • palladowego katalizatora'. Po zakonczeniu reakcji (RJ 0,2—0,3) odsacza sie katalizator, przemywa go metanolem, popluczyny laczy sie z przesaczem i od¬ parowuje. Pozostalosc rozpuszcza sie w 10 ml dwu¬ metyloformamidu, dodaje 3,9 g (13 milimoli) Z-Phe- 45 -OH, 1,75 g (13 milimoli) 1-hydroksybenzotriazolu i 2,7 g (13 milimoli) dwucykloheksylokarbodwuimidu i mieszanine pozostawia na noc, po czym odparo¬ wuje.Pozostalosc rozpuszcza sie w 50 ml octanu etylu 50 i przemywa kolejno 5% roztworem wodnym wodo¬ roweglanu sodowego, woda, 0,5n kwasem siarko¬ wym i ponownie woda. Faze organiczna suszy sie nad siarczanem sodowym i odparowuje. Otrzymany produkt (R2 0,63—0,68) rozpuszcza sie w 50 ml me- 55 tanolu i uwodornia w obecnosci palladowego kata¬ lizatora. Po odsaczeniu kataliztaora odparowuje sie metanolowy roztwór i pozostalosc (Rj 0,1—0,2) roz¬ puszcza sie w 10 ml pirydyny, dodaje 2,09 g (10 milimoli) Z-Gly-OTCP i pozostawia na noc. 60 Nastepnie mieszanine odparowuje sie, pozostalosc rozpuszcza w 50 ml octanu etylu, plucze 0,5n kwa¬ sem siarkowym, suszy organiczny roztwór nad siar¬ czanem sodowym i odparowuje. Pozostalosc rozpu¬ szcza sie w 50 ml metanolu, uwodornia w obecnosci 65 palladowego katalizatora, odsacza katalizator i od-114062 11 12 parowuje przesacz. Otrzymana pozostalosc rozpusz¬ cza sie w mieszaninie 2 ml etanolu i 2 ml octanu etylu, dodaje 0,9 g (10 milimoli) kwasu szczawio¬ wego i rozciencza mieszanine 50 ml octanu etylu.Wytracony osad odsacza sie, przemywa octanem etylu i suszy, otrzymujac 2,7 g (62% wydajnosci te¬ oretycznej) produktu podanego w tytule, topnieja¬ cego w temperaturze 98—100°C; Rj 0,4—0,5.Stadium 2: etyloamid L-tyrozylo-D-metionylogli- cylo-L-fenyloalanylo-L-proliny. 0,9 g (2 milimole) szczawianu etyloamidu trójpep- tydu otrzymanego w sposób opisany w stadium 1 rozpuszcza sie w 3 ml pirydyny, dodaje 0,86 g (2 milimole) Boc-D-Met-OTCP i 0,56 ml (4 milimole) trójetyloaminy i pozostawia mieszanine na noc, po czym odparowuje, pozostalosc rozpuszcza w 30 ml octanu etylu, przemywa 0,5n kwasem siarkowym, suszy nad siarczanem sodowym i odparowuje. Po¬ zostalosc (Rj t),80—0,85) traktuje sie 10 ml 3n kwasu solnego w octanie etylu i po uplywie 30 minut roz¬ ciencza 30 ml n-heptanu, odsacza wytworzony osad, przemywa go n-heptanem i suszy pod zmniejszonym cisnieniem w obecnosci wodorotlenku potasu. Otrzy¬ many produkt rozpuszcza sie w 5 ml pirydyny, do¬ daje 1,06 g (2 milimole) Boc-Tyr-OFCP i 0,56 ml (4 milimole) trójetyloaminy i pozostawia na noc.Nastepnie mieszanine odparowuje sie, pozostalosc rozpuszcza w 50 ml octanu etylu, plucze 0,5n kwa¬ sem siarkowym, suszy nad siarczanem sodowym i odparowuje. Pozostalosc (Rj 0,85—0,90) rozpusz¬ cza sie w 3 ml kwasu trójfluorooctowego i po uply¬ wie 30 minut roztwór zawierajacy osad odparowuje sie, pozostalosc rozciera z mieszanina octanu etylu i benzenu (1 :1). Otrzymany produkt rozpuszcza sie w mieszaninie 5 ml 10% wodnego roztworu weglanu sodowego i 50 ml octanu etylu. Wodna faze wytrza¬ sa sie z 3 porcjami po 10 ml octanu etylu, polaczo¬ ne roztwory w octanie etylu suszy sie nad siarcza¬ nem sodowym i odparowuje.Pozostalosc rozciera sie z mieszanina n-heptanu i octanu etylu (1: 1), odsacza, przemywa osad taka sama mieszanina i nastepnie samym n-heptanem i Suszy. Otrzymuje sie 1,02 g (80% wydajnosci teo¬ retycznej) podanego w tytule etyloamidu pieciopep- tydu Rj M&—0,55.Analiza aminokwasów: Pro — 1,0; Gly = 1,0; Met =0,98; Tyr = 1,02; Phe = 1 (podstawa porów¬ nawcza).Przyklad X. Wytwarzanie amidu L-tyrozylo- -D-metionyloglicylo-L-fenyloalanylo-L-proliny.Do zawiesiny 0,96 g (3 milimole) H-Gly-Phe-Pro- -OH (patrz stadium 1 przykladu V) w 5 ml pirydy¬ ny dodaje sie 0,42 ml (3 milimole) trójetyloaminy i 1,27 g (3 milimole) Boc-D-Met-OTCP i miesza sie az do uzyskania roztworu. Roztwór ten pozostawia sie na noc i nastepnie poddaje obróbce opisanej w stadium 1 przykladu IV.Do pozostalosci po odparowaniu (Rf 0,30—0,35) do¬ daje sie 10 ml 2n roztworu kwasu solnego w octa¬ nie etylu i miesza w ciagu 30 minut, po czym roz¬ ciencza n-heptanem, odsacza, przemywa osad n- -heptanem i suszy pod zmniejszonym cisnieniem w obecnosci wodorotlenku potasowego. Otrzymany produkt (Rf 0,16—0,24) miesza sie z 5 ml pirydyny, dodaje 0,84 g (6 milimoli) trójetyloaminy i 1,32 g (2,5 milimola) Boc-Tyr-OPCP i miesza az do uzys¬ kania roztworu. Roztwór ten pozostawia sie na noc, po czym poddaje obróbce opisanej w stadium 1 . 5 przykladu IV.Pozostalosc po odparowaniu rozciera sie z n-hep¬ tanem, Odsacza, przemywa n-heptanem i suszy. O- trzymany Boc-Tyr-D-Met-Gly-Phe-Pro-OH (Rj od 0,60—0,66) rozpuszcza sie w 5 ml dwumetyloforma- 10 midu, dodaje 0,52 g (2,5 milimola) dwucykloheksylo- karbodwuimidu i 0,4 g (2,5 milimola) soli amonowej 1-hydroksybenzotriazolu, otrzymanej przez sporza¬ dzenie roztworu 1-hydroksybenzotriazolu w stezo¬ nym roztworu wodnym amoniaku (0*5 g/ml), roz- !5 cienczenie go acetonem, odsaczenie otrzymanych krysztalów, przemycie ich acetonem i wysuszenie.Mieszanine reakcyjna pozostawia sie na noc, po czym przesacza, odparowuje, pozostalosc rozpusz¬ cza w chlorku metylenu, plucze 5% roztworem wo- 20 doroweglanu sodowego, suszy nad siarczanem so¬ dowym i odparowuje.Pozostalosc (Rj 0,53—0,58) rozpuszcza sie w 10 ml kwasu trójfluorooctowego, pozostawia na okres 30 minut w temperaturze pokojowej, po czym od¬ parowuje i pozostalosc (R\ 0,50—0,60) suszy pod zmniejszonym cisnieniem w obecnosci wodorotlen¬ ku potasowego. Otrzymany produkt rozpuszcza sie w 30—40 ml mieszaniny chloroformu i n-butanolu (3:1) z dodatkiem 5—7 ml wody, wodna faze zobo¬ jetnia stalym wodoroweglanem sodowym, ekstrahu¬ je podana wyzej mieszanina chloroformu z n-buta- nolem, po czym laczy organiczne fazy i odparowu¬ je.Pozostalosc rozciera sie z n-heptanem, otrzymujac 1,25 g amidu L-tyrozylo-D-metionyloglicylo-L-feny- loalanylo-L-proliny. Produkt ten, badany metoda D* 'Amour i Smith [J. Pharm. Ther. 72, 74 (1941)] i me¬ toda Cherma i Simon [J. Pharmacol. (Paryz) 6, 489 (1975)] wykazuje in vivo aktywnosc 50 razy wiek- 40 sza od aktywnosci morfiny.Analiza aminokwasów: Pro = 1,0; Gly = 1,0; Met = 1,0; Tyr = 0,98; Phe = 1 (podstawa porów¬ nawcza). 45 Przyklad XI. Wytwarzanie amidu L-tyrozy- lo-D-alanyloglicylq-L-fenyloalanylo-L-proliny.Do roztworu 2,06 g (3 milimole) Z-Tyr-D-Ala-Gly- -Phe-Pró-ÓH (patrz stadium 3 przykladu V) w 5 ml dwumetyloformamidu dodaje sie 0,46 g (3 milimole) M soli amonowej 1-hydroksybenzotriazolu i 0,62 g (3 milimole) dwucykloheksylokarbodwuimidu i pozo¬ stawia mieszanine na noc, po czym przesacza i od¬ parowuje. Pozostalosc po odparowaniu rozpuszcza sie w 5% roztworze wodoroweglanu sodowego, su- M szy nad siarczanem sodowym i odparowuje.Pozostalosc (Rj 0,60-^0,65) rozpuszcza sie w 40—50 ml metanolu i uwodornia w obecnosci palla¬ dowego katalizatora. Po zakonczeniu reakcji (R* 0,33—0,38) odsacza sie katalizator, przesacz odparo- 60 wuje i pozostalosc rozciera z eterem. Otrzymuje sie 1,2 g (70% wydajnosci teoretycznej) amidu L»-tyró* zylo-D-alanyloglicylo-Ln-fenyloalanylo-L-proliny. .Analiza aminokwasów: Pro = 1,0; Gly =* 1,0; Ala = 1,0; Tyr= 0,97; Phe = 1 (podstawa porówna- « wcza).114062 1S 14 Zastrzezenie patentowe Sposób wytwarzania nowych pieciopeptydów o ogólnym wzorze Tyr-A-Gly-Phe-B-X-Y,w którym A oznacza grupe D-aminokwasu majaca jako bocz¬ ny lancuch nizszy rodnik alkilowy lub tioalkilowy, B oznacza grupe aminokwasu lub cyklicznego imi- nokwasu, z których kazda ma jako boczny lancuch nizszy rodnik alkilowy, X oznacza atom tlenu lub grupe NH, a Y oznacza atom wodoru lub nizszy rodnik alkilowy, lub ich pochodnych estrowych lub aminowych lub soli, znamienny tym, ze aminokwas majacy jako lancuch boczny nizszy rodnik alkilo-^ wy, albo cykliczny iminokwas majacy jako boczny lancuch nizszy rodnik alkilowy, albo pochodna es¬ trowa lub amidowa któregokolwiek z takich kwa¬ sów, kontiensuje sie metodami stosowanymi w che¬ mii peptydów kolejno z fragmentami aminokwasów i/albo peptydów zawierajacymi przy koncowej gru¬ pie aminowej grupe zabezpieczajaca, która moze byc odszczepiana i ewentualnie peptyd zabezpie¬ czony przy koncowej grupie aminowej, przeprowa¬ dza sie w jego pochodna estrowa albo aminowa i e- wentualnie, po usunieciu grupy zabezpieczajacej, wytwarza sie sól otrzymanego zwiazku z kwasem. PL