PL102824B1 - Sposob wytwarzania heterologicznych przeszczepow arterii - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia heterologicznych przeszczepów arterii, w któ¬ rym uwalnia .sie zwierzece arterie od otaczajacej je tkanki, podwiazuje sie jedwabiem ich odgale¬ zienia boczne, oddziela sie tkanke miesniowa i wlókna elastyczne na drodze rozkladu proteoli¬ tycznego, a otrzymane w ten sposób rurki kola¬ genowe usieciowuje sie poprzecznie. Znane jest zastepowanie wadliwych arterii trze¬ ma metodami poprzez: a) stosowanie zyl autologicznych, b) stosowanie przeszczepów z tworzyw sztucznych, c) stosowanie przeszczepów heterologicznych ar¬ terii. Wielka zaleta zastepowania wadliwych arterii autologicznymi zylami jest ich 'bezwarunkowa zgodnosc immunologiczna, poniewaz przeszczep po¬ chodzi z organizmu tego samego pacjenta. Jednakze niekorzystnie oddzialuje tutaj fakt, ze zyly /na przyklad Vena sphena magna/ uzy¬ skuje sie dopiero po zmudnej operacji, przy któ¬ rej potrzebne sa liczne ciecia, które stwarzaja dodatkowe ryzyko, zwiazane z operowaniem pa¬ cjenta. Przeszczepy protetyczne z tworzyw sztucznych nie nasuwaja równiez zastrzezen pod wzgledem immunologicznym i mozna je miec zawsze w re¬ zerwie. Jednakze nie nadaja sie one do wszczepia¬ nia w miejscach, gdzie znajduja sie stawy, po¬ niewaz wiaze sie to z duzym ryzykiem. Heterologiczne przeszczepy naczyniowe na sku¬ tek nizej wymienionych wlasciwosci okazaly sie bardzo cenne. Daja sie one bardzo dobrze zszy¬ wac i mozna je wytwarzac prawie w kazdej po¬ trzebnej dlugosci i srednicy. Przez zszywanie ra¬ zem kilku krótszych odcinków mozna otrzymywac przeszczepy o dowolnej dlugosci. Poniewaz do wszczepienia tych heterologicznych protez naczy¬ niowych wystarcza 2 lub 3 naciecia skóry, ryzy¬ ko zwiazane z operacja jest bardzo niewielkie i dlatego mozna je stosowac równiez w przypad¬ kach bardzo zagrozonych pacjentów (nadcisnienie, niewydolnosc serca, cukrzyca itd/. Znane jest z opisów patentowych Stanów Zjed¬ noczonych Ameryki nr 2 900 644 i nr 3 098 480 o- trzymywanie heterologicznych przeszczepów arterii w nastepujacy sposób. Arterie, korzystnie tetnice szyjne, pobrane przy uboju ssaków o odpowiedniej wielkosci, jak na przyklad cielat lub jalówek, sa wkladane do zim¬ nego roztworu fizjologicznego soli kuchennej i transportowane z rzezni do laboratorium. Nastep¬ nie naturalne naczynia /krwionosne) sa uwalniane z otaczajacej je tkanki, a ich boczne odgalezienia sa podwiazywane jedwabiem. Otrzymany w ten sposób preparat nie nadaje sie jednak do transplatacji, poniewaz znajdujaca sie w sciance naczynia tkanka miesniowa, a takze elastyczne wlókna beda wywolywaly reakcje od¬ rzucenia przeszczepu. Z tego wzgledu konieczne 102 824102 3 jest wyeliminowanie wywolujacej taka reakcje tkanki ze scianek naczynia. 'Nastepuje to poprzez inkubacje w roztworze enzymatycznym, szczegól¬ nie w ^buforowanym roztworze iicyny. Ficyna jest fermentem proteolitycznym, czyli rozkladajacym 5 bialko, otrzymywanym z dzikich fig. Moga byc jed¬ nak uzywane takze i inne enzymy proteolityczne, jak trypsyna i papaina. Wiadomo, ze te enzymy proteolitycznie nie sa w stanie spowodowac roz¬ kladu kolagenowego szkieletu arterii. Poprzez in- 10 kubacje arterii, zawierajacych jeszcze tkanke mies¬ niowa i elastyczne wlókna, uzyskuje sie „wytra¬ wienie" tych antygenowo dzialajacych skladników tkanki. Przy tym procesie „wytrawiania", jak przy kazdym procesie enzymatycznym konieczne jest i5 nastawienie optymalnej wartosci pH roztwory. Po inkubacji w roztworze fermentu wzglednie ficyny poddane proteolizie arterie cielece, wzgled¬ nie krowie zastaja dokladnie przemyte woda de¬ stylowana, a nastepnie przez Wprowadzenie ich 20 do roztworu chlorynu sodowego o okreslonym ste¬ zeniu i przetrzymywanie w nim przez pewien o- kreslony czas nastepuje zatrzymanie reakcji enzy¬ matycznej. Material pozostaly po takim traktowaniu stano- 25 wi wylacznie szkielet kolagenowy, istniejacy we wszystkich arteriach. ¦¦ Otrzymana rurka kolagenowa nie dziala juz antygenowo, ale jeszcze nie nadaje sie do tran¬ splantacji, poniewaz nie posiada ona wymaganej M szczelnosci i stabilnosci. Szczelnosc i stabilnosc uzyskuje sie poprzez gar¬ bowanie rurki kolagenowej, a mianowicie przez umieszczenie jej na pewien okreslony czas w zbu- forowanym roztworze garbujacym. 35 Dobrymi do tego celu garbnikami okazaly sie dotychczas skrobia dwualdehydowa, glioksal i po- liakroleina, mozna jednak stosowac do tego takze i inne garbniki, jak na przyklad aldehyd mrów¬ kowy, celuloze dwualdehydowa, aldehyd glutaro- 40 wy i inne. Zachodzacy przy tym proces jest okres¬ lany jako sieciowanie poprzeczne. Sprawdzanie szczelnosci nastepuje poprzez nadmuchiwanie spre¬ zonym powietrzem do cisnienia 240 mm Hg, przy czym arterie zanurza sie^ wwodzie. 45 W ten sposób otrzymane „protezy naczyniowe" sa naciagane nastepnie na prety metalowe o od¬ powiedniej srednicy i wkladane do zamykanych rurek szklanych, zawierajacyen roztwór odpowied¬ ni do sterylizacji. Sterylizacja ta trwa 14 dni i w moze przebiegac na przyklad w roztworze konser¬ wujacym przy temperaturze' 37°C, utrzymywanej przez umieszczenie w inkubatorze. Wystetylizowa- ne protezy naczyniowe pozostaja w rurkach szkla¬ nych az do chwili ichuzycia. 55 W tym samym sposobie wytwarzania wystepuje proces statyczny, to znaczy, ze proteoliteczny roz¬ klad tkanki i sieciowanie poprzeczne przebiegaja statycznie. Przy przeszczepach, wytwarzanych w ten sposób 6q nie zostalo wyraznie uwzglednione to, ze kolagen, to jest istniejaca jeszcze po rozkladzie substancja szkieletowa, moze niesc ze soba pewne immuno¬ logiczne trudnosci szczególnie, gdy przy zwyklym statycznym wytwarzaniu nie zostaje usuniety ^ 4 wszystek silnie lub umiarkowanie immunogenny material, zwlaszcza retikulina. Statyczna obróbka materialu wyjsciowego, po¬ bieranego ze zwierzat, niesie ze soba zwiekszone niebezpieczenstwo zanieczyszczenia zarodkami ma¬ terii i tym samym mozliwosc zakazenia wytwa¬ rzanych arterii, przez co nastepuje zmiana na nie¬ korzysc sytuacji immunologicznej. Wynalazek niniejszy opiera sie na odkryciu, ze zastosowanie heterologicznych przeszczepów, otrzy¬ mywanych ze zwierzecych arterii krwionosnych, daje tym lepsze, trwale rezultaty, czym mlodsze sa zwierzeta uzyte do tego celu. Ponadto zostalo stwierdzone, ze wspomniane wa¬ dy znanego sposobu wytwarzania heterologicznych przeszczepów w arterii moga byc wyeliminowa¬ ne, gdy. proteolityczny rozklad tkanki i sieciowa¬ nie substancji szkieletowej przeprowadza sie w sposób ciagly, wzglednie dynamiczny to znaczy, ze obróbka ta jest przeprowadzana za pomoca przeplywajacego strumienia kazdego z uzywanych roztworów, a nie przez zanurzenie. Wynalazek dotyczy ysposobu wytwarzania hete¬ rologicznych przeszczepów arterii, w którym uwal¬ nia sie zwierzece arterie od otaczajacej je tkanki, podwiazuje sie jedwabiem ich odgalezienia, od¬ dziela sie tkanke miesniowa i wlókna elastyczne / na drodze rozkladu proteolitycznego, a otrzymane w ten sposób rurki kolagenowe poddaje sie siecio¬ waniu poprzecznemu, przy czym, zgodnie z wyna¬ lazkiem stosuje sie arterie pobrane z mozliwie' najmlodszych zwierzat, a proteolityczny rozklad i sieciowanie poprzeczne prowadzi sie w sposób dy¬ namiczny. Przez takie ciagle lub dynamiczne oddzialywanie zgodnie ze sposobem wedlug wynalazku zostaje za¬ gwarantowana zupelna obróbka arterii, zwlaszcza od strony wewnetrznej. Równoczesnie sposób dynamiczny pozwala na la¬ czenie poszczególnych odcinków arterii na przy¬ klad za pomoca rurek szklanych, które moga jednoczesnie laczyc ze soba dowolnie duza liczbe arterii, a tym samym gwarantuja zupelna jedno¬ rodnosc gotowego materialu transplantacyjnego. Dalsza zaleta sposobu wedlug wynalazku jest to, ze nastepujace po sobie kolejne fazy obróbki takie jak trawienie, przemywanie, zatrzymywanie reak¬ cji trawienia, przemywanie, sieciowanie poprzecz¬ ne i przemywanie moga byc przeprowadzane w sposób Ciagly przez zastosowanie odpowiedniego sterowania. * Poprzez sposób wedlug wynalazku, to znaczy przez uzycie arterii, pochodzacych od mozliwie naj¬ mlodszych zwierzat i przez dynamiczne prowadze¬ nie procesu obróbki, zwlaszcza rozkladu proteoli¬ tycznego i sieciowania poprzecznego, uzyskuje sie protezy arterii, które w znacznie wiekszyrn stop¬ niu nie budza zastrzezen pod wzgledem immuno¬ logicznym i tym samym szczególnie dobrze nadaja sie do zastosowania wadliwych arterii. Ponizsze przyklady wyjasniaja blizej wynalazek bez ograniczania jego zakresu. Przyklad I. Wstepne przygotowanie arterii do chemicznego preparowania: Pobrane w rzezni,5 mozliwie dlugie arterie cielat /tetnice szyjne/ zo¬ staly przetransportowane do laboratorium w ochlo¬ dzonym ponizej zera roztworze fizjologicznym soli kuchennej /0,9°/o/. Tam uwolniono je z otaczaja¬ cej je tkanki, a odgalezienia boczne podwiazano « jedwabiem /niesterylizowane nitki nr 000/. Tak przygotowane wstepnie arterie zostaly uzy¬ te bezposrednio do preparowania chemicznego. Przyklad II. Przygotowanie skrobi dwual- dehydowej. 1 1(6,2 g skrobi kukurydzianej /suchej masy, przy materiale zawierajacym wode odpowiednio wie¬ cej/, zmieszano ze 100 ml wody destylowanej. Do tej bialej zawiesiny wkraplano przez okres 1 go¬ dziny roztwór 23y5 g metanadjodanu sodowego w 1{ 300 ml wody destylowanej przy jednoczesnym mie¬ szaniu, a po wkropleniu calosci roztworu mieszano jeszcze dalsze 18 godzin przy temperaturze okolo °C. Roztwór ten zostal nastepnie przefiitrowa- ny przez filtr prózniowy, zas pozostalosc przeplu- 2t kano dokladnie szesc razy, uzywajac za kazdym razem 50 ml wody destylowanej. Ostatnia woda z przemycia powinna byc wolna od jodanu. Pozo¬ stalosc przeplukano jeszcze na koniec 100 ml ace¬ tonu, aby uniknac tworzenia sie zrogowacialego 25 produktu. Pozostalosc suszono nastepnie pod próz¬ nia w temperaturze 40°C przez '24 godziny. Uzysk: 117,2 g /1(5,7 g suchej masy/ Przyklad III. Ten przyklad przedstawia che¬ miczne preparowanie arterii sposobem dynamicz- 30 nym wedlug wynalazku. Aparatura do wykonywa¬ nia tego preparowania jest pokazana "na fig. 1. Material wyjsciowy: 20 arterii /przygotowanych wedlug przykladu 1/. W zlewce o pojemnosci 1*0 1 przygotowano roz- 35 # twór ficyny: 7,5 1 zdejonizowanej wody /podgrzanej do 30°C/. 75 g ficyny — lp/o 7,5 g LV+/-cysteiny—1PA. Po przelaniu roztworu ficyny do cylindra szkla- 40 nego nastawiono pH roztworu na 6,0 za pomoca cytrynianu sodowego, a nastepnie wstawiono roz¬ twór do kapieli wodnej o temperaturze 4&—50°C. Nastepnie przy zamknietych zaworach zaciskowych ,6 zassano roztwór ficyny za pomoca pompy przez 45 przewód 1 i przepompowano do dzwona rozdziel¬ czego 4, laczacego sie z przewodami, prowadzacy¬ mi do arterii 7. Z chwila calkowitego napelnie¬ nia dzwona rozdzielczego roztworem ficyny zam¬ knieto zawór zaciskowy 5, a otwarto zawory 6 i ^ 'przepompowywano roztwór ficyny przy stalej tem¬ peraturze wewnetrznej 36°C w ciagu 3 godzin. Nastepnie wypompowano roztwór ficyny i od¬ stawiono kapiel wodna. Po odpompowaniu roz¬ tworu ficyny doprowadzono przewodem 2 zdejoni- 55 zowana wode i wielokrotnie przeplukano ta wo¬ da. Po odprowadzeniu wody pluczacej przewodem 3 doprowadzono poprzez przewód 2 roztwór 93,7 gramów chloranu sodowego /SOP/o-/ w 7,5 1 zdejo¬ nizowanej wody /co odpowiada l°/o stezeniu roz- 60 tworu/, odpowietrzono caly uklad jak poprzednio i przepompowywano ten roztwór w ciagu 18 go¬ dzin. Nastepnie odpompowano roztwór chloranu sodowego przez przewód 3 i jeszcze faz przeplu¬ kano zdejonizowana woda tak, jak poprzednio. w 824 6 Potem przez przewód 2 zostal wlany roztwór 975 g skrobi dwualdehydowej /przygotowanej we¬ dlug przykladu 2/ w 7(500 ml wody /1^36%/ zbu- forowany wodoroweglanem sodowym na pH=8,8, przepompowywany przez 24 godziny, po czym od¬ pompowano ten roztwór przez przewód 3 i wielo¬ krotnie przeplukano zdejonizowana woda, jak po¬ przednio. Przy uzyciu pompki aparatu do pomiaru cisnie- nia krwi sprawdzono kazda arterie przy cisnieniu wewnetrznym, wynoszacym 240 torów. W tym celu nadmuchane arterie zanurzono w wodzie. Nie¬ szczelne miejsca obwiazano jeszcze, tam gdzie to bylo mozliwe, jedwabiem. Arterie uznane jako i dobre zostaly naciagniete na pret szklany, wstawio¬ ne do rurki szklanej zatopionej z jednej strony, która nastepnie napelniono roztworem etanolu w wodzie destylowanej /50/50°/o obj./ z dodatkiem 1M tlenku propylenu oraz zamknieto za pomoca gumowego korka i tasmy izolacyjnej.- Tak przygo¬ towane arterie zostaly zakonserwowane przez u- mieszczenie na 14 dni w inkubatorze o temperatu¬ rze 37°C. Przyklad IV. Preparowanie chemiczne bylo takie samo, jak w przykladzie 3 z ta róznica, ze dla spowodowania enzymatycznego rozkladu zby¬ tecznej tkanki uizyto zamiast iM-ego roztworu fi¬ cyny, nastawionego na pH=6,0, roztwór trypsyny 0,2?/*, nastawiony na pH=7,8 przy uzyciu fosfo- ranowo-cytrynianowego srodka buforowego. Przyklad V. Preparowanie chemiczne bylo takie samo, jak w przykladzie, 3 z ta róznica, ze zamiast l^P/c-go roztworu skrobi dwualdehydo¬ wej uzyto roztwór glioksalu, nastawiony na pH=8,8 przy uzyciu il0%-go' wodoroweglanu sodowego /37,5 g glioksalu w 7500 ml wody/ dla sieciowa¬ nia .poprzecznego. PL PL PL PL PL PL PL