DK142044B - Fremgangsmaade til fremstilling af heterologe arterietransplantater - Google Patents

Description

(11) FREMLÆGGELSESSKRIFT 11)-2044 DANMARK (=1) Int el.» A 61 F 1/00 (21) Ansøgning nr. 5Ο45/75 (22) Indleveret den 10. n0V. 1975 lltjlj (23) ^15^89 10. nov. 1975 ΧΪ«' (44) Ansøgningen fremlagt og 00 fremleeggelseeekriftet offentliggjort den lo. &Ug. 19 80

DIREKTORATET FOR

PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET (39) Prioritet be3ær8t fra den

11. nov. 1974, 2453365, DE

(71) SOLCO BASEL AG, Aeschenvorstadt 48, Basel, CK.

(72) Opfinders Heribert Schmitz, Befang l46g, CH-9043 Trogen, CH: Walter Stoecklln, Elgenrain 28, CK-4107 Ettingen, CH.

(74) Fuldmægtig under sagens behandling:

Internationalt Patent »Bureau.______ (54) Fremgangsmåde til fremstilling af heterologe art er le trans plant at er.

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af heterologe arterietransplantater, ved hvilken man befrier dyriske arterier for omgivende væv, ombinder de afgrenende kollateraler med silke, fjerner muskelvævet og de elastiske fibre ved proteolytisk spaltning og tværbinder de opnåede kollagenslanger.

Til erstatning af defekte arterier har der hidtil principielt stået tre fremgangsmåder med følgende tre arterieproteser til rådighed: a) autologe vener b) plastimplantater c) heterologe arterietransplantater.

Selvom alle tre fremgangsmåder kan notere visse gode resulta- 142044 2 ter, er de hidtidige resultater imidlertid utilstrækkelige.

En stor fordel ved at erstatte en defekt arterie med en autolog vene er den immunologiske uskadelighed, da transplantatet stammer fra patientens legeme. Uheldigt virker det dog her, at venen (f.eks. Vena saphena magna) først må opnås ved en besværlig operation, hvorved det er nødvendigt med flere indsnit, som for truede patienter udgør en yderligere operationsrisiko.

Plastproteser er ligeledes immunologisk uskadelige og kan desuden holdes i reserve. Derimod egner de sig ikke til uden risiko at slå bro over led.

Heterologe kartransplantater har vist sig værdifulde på grund af følgende egenskaber. De har meget gode syegenskaber og kan fremstilles i næsten enhver nødvendig længde og med den nødvendige diameter. Ved sammensyning af kortere protesestykker kan let fremstilles protesestykker af vilkårlig længde. Da det til transplantation af disse heterologe karproteser er tilstrækkeligt med 2-3 hudsnit, er operationsrisikoen meget ringe, og de er derfor også egnede til stærkt truede patienter (hypertoni, cardial insufficiens, diabetes mellitus osv.).

Heterologe arterietransplantater er hidtil blevet fremstillet på følgende måde.

De navnlig ved slagtning af pattedyr af egnet størrelse, som f.eks. kalve og kvæg, udtagne arterier, fortrinsvis carotider, nedlægges i kold fysiologisk kogsaltopløsning og transporteres fra slagtehuset til laboratoriet. Her befries de native kar for omgivende væv, og kollateralerne ombindes med silke.

Det på denne måde opnåede præparat er dog ikke transplanterbart, da det i karvæggen værende muskelvæv samt de elastiske fibre ville fremkalde en antigen-antistof-reaktion (afstødningsreaktion).

Af denne grund er det nødvendigt at fjerne dette antigent virkende væv fra karret. Dette sker ved inkubering af arterien i en enzymopløsning, navnlig en pufret ficinopløsning. Ficin er et proteolytisk, dvs. et proteinspaltende enzym, som udvindes af vilde figner. Der kan dog også anvendes andre proteolytiske enzymer, såsom trypsin og papain. Om disse proteolytiske enzymer er det kendt,at de ikke kan nedbryde arteriernes kollagenskelet.

Ved inkubering af de endnu muskelvæv og elastisk væv indeholdende arterier i ficinopløsningen opnår man en proteolytisk spaltning af disse antigent virkende vævsdele. Til den proteolytiske spaltningsproces er det som ved enhver enzymatisk proces nødvendigt 142044 3 at indstille på den optimale pH-værdi.

Efter inkubering i enzym- eller ficinopløsningen udvaskes de proteolytisk behandlede kreatur- eller kalvearterier godt med destilleret vand, og den enzymatiske reaktion afbrydes ved indføring i en natriumchloritopløsning af bestemt koncentration i et bestemt tidsrum.

Det efter denne behandling tilbageblevne materiale består af det i arterien i sig selv tilstedeværende kollagenskelet. Dette kollagenrør er, selvom det ikke mere virker antigent, dog ikke egnet til en transplantation, da det ikke har den nødvendige tæthed og stabilitet.

Tætheden og stabiliteten opnås ved en garvning af kollagenslangen og nærmere angivet ved, at man indfører kollagenslangen i en pufret garveopløsning i et bestemt tidsrum. Sam garvestoffer har dial-dehydstivelse, glyoxal og polyacrolein hidtil vist sig fordelagtige, men der kan dog hertil også anvendes yderligere garvestoffer, såsom formaldehyd, dialdehydcellulose, glutaraldehyd m.m. Den herved forløbende proces betegnes som "tværbinding". Afprøvning af tætheden sker ved belastning af karret med trykluft indtil et tryk på 240 mm Hg, hvorunder arterierne er neddyppet i vand.

De på denne måde opnåede karproteser trækkes på lumenadækvate, glasstave og anbringes i tillukkelige glasrør, som til sterilisation indeholder en passende opløsning. Sterilisationstiden andrager 14 dage, og sterilisationen kan f.eks. foregå i en konserveringsopløsning ved 37°C i en inkubator. De steriliserede karproteser forbliver i glasrør, indtil de skal anvendes.

Ved denne kendte arbejdsmåde er der tale om en statisk fremgangsmåde, dvs. den proteolytiske spaltning og tværbindingen foretages statisk, dvs. ved nedlægning af arterierne i de pågældende opløsninger. Fremgangsmåder til fremstilling af arterietransplantater af den beskrevne art er f.eks. angivet i USA-patentskrifterne nr. 2.900.644 og 3.093.439.

Ved de på denne måde fremstillede transplantater tages der ikke udtrykkeligt hensyn til, at kollagenet, dvs. den efter nedbrydningen endnu foreliggende skeletsubstans, kan medføre visse immunologiske vanskeligheder, navnlig når ikke alt akut eller subakut immuno-gent materiale, navnlig reticulin, er blevet fjernet ved den sædvanlige statiske fremstilling.

Den statiske behandling af udgangsarterierne medførte også en forøget fare for forurening med kim og en undertiden ubemærket infek- 4 U2044 tion af arterierne, hvorved den immunologiske situation ændres i u-gunstig retning.

Ifølge opfindelsen har det vist sig, at de nævnte ulemper ved de kendte fremgangsmåder til fremstilling af heterologe arterietransplantater kan undgås ved en fremgangsmåde af den indledningsvis angivne art, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man udfører den proteolytiske spaltning og..tværbindingen dynamisk, dvs. lader arterierne gennemstrømme af de ved den proteolytiske spaltning og tværbindingen anvendte opløsninger.

Ved den dynamiske arbejdsmåde ifølge opfindelsen sikres en fuldstændig behandling af frem for alt arteriernes indvendige hulrum.

Desuden muliggør den dynamiske fremgangsmåde en forbindelse af arterierne ved hjælp af koblingsstykker, som f.eks. glasrør, der samtidig kan forbinde et i princippet vilkårligt stort antal arterier og dermed sikrer en fuldstændig ensartethed hos slutmaterialet.

Eli yderligere fordel ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen består i, at de efter hinanden følgende reaktionstrin, dvs. proteoly-tisk spaltning, vaskning, afbrydelse af den proteolytiske spaltning, vaskning, tværbinding og vaskning, ved passende styring kan udføres kontinuerligt efter hinanden.'

En hensigtsmæssig udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen består således i, at man udfører de nødvendige reaktionstrin, såsom proteolytisk spaltning og tværbinding, kontinuerligt efter hinanden ved hjælp af et egnet gennemstrømningsapparat.

Tfølge opfindelsen er det endvidere hensigtsmæssigt, at man til yderligere forenkling lader et stort antal arterier, som på passende måde er anbragt ved siden af hinanden, gennemstrømme af den pågældende opløsning.

Sammenfattende kan det siges, at der ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen opnås en protese, der i immunologisk henseende er i høj grad uskadelig og derfor egner sig særlig godt til erstatning af defekte arterier.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses nærmere ved hjælp af de efterfølgende eksempler.

5

U2QU

Eksempel 1

Forberedelse af arterierne til den kemiske præparering.

I slagtehuset samlede kalvearterier (carotis) af så stor længde som muligt transporteres i isafkølet, fysiologisk kogsaltopløsning (0,9%) til laboratoriet. Der befries de for omgivende væv, og de afgrenende kollateraler ombindes med silke (000 usteril).

De således forberedte arterier anvendes direkte til den kemiske præparering.

Eksempel 2

Fremstilling af dialdehydstivelse.

16,2 g majsstivelse (tørvægt, ved vandholdigt materiale tilsvarende mere) omrøres med 100 ml destilleret vand. Til denne hvide suspension dryppes under omrøring i løbet af 1 time en opløsning af 23,5 g natriummetaperiodat i 300 ml destilleret vand, hvorefter der omrøres videre i 18 timer ved ca. 25°C.

Suspensionen filtreres nu ved sugefiltrering, og remanensen vaskes grundigt 6 gange med 50 ml destilleret vand pr. gang. Det sidste vaskevand skal være iodatfrit (kaliumiodidstivelsespapir).Remanensen vaskes tilsidst yderligere med 100 ml acetone til forhindring af dannelsen af et hornagtigt produkt. Remanensen tørres i vakuum ved 40°C i 24 timer. Udbytte: 17,2 g (15,7 tørvægt).

Eksempel 3

Dette eksempel viser den kemiske præparering af arterierne ved den dynamiske fremgangsmåde ifølge opfindelsen. Et apparat til udførelse af fremgangsmåden er vist på tegningen.

Udgangsmateriale: 20 arterier (forberedt ifølge eksempel 1).

Arterierne bindes til gaffelformede fordelingsrør.

I et 10 liter bægerglas tilberedes ficinopløsningen: 7.5 liter deioniseret vand (foropvarmet til 30°C) 75 g ficin = 1% 7.5 g L-(+)-cystein = l%e.

Med 1 N natriumcitratopløsning indstilles den i en glascylinder fyldte ficinopløsning på pH 6,0 og stilles i et vandbad af 45-50°C.

Med lukkede klemhaner (6) suges ficinopløsningen derefter af en pumpe gennem en ledning (1) og pumpes til tilledninger (7) til arterierne og en fordelingsklokke (4). Såsnart fordelingsklokken er fyldt med ficinopløsning, lukkes en klemhane (5), og klemhanerne (6) åbnes, og 142044 6 nu gennempumpes ficinopløsningen i 3 timer ved en konstant indvendig temperatur på 38°C.

Derefter bortsuges ficinopløsningen, og vandbadet fjernes. &en-nem en ledning (2) tilføres der deioniseret vand, og der skylles liere gange med deioniseret vand. Efter frasugning af skyllevandet gennem en ledning (3) tilføres der gennem ledningen (2) en opløsning af 93,7 g natriumchlorit (80%) i 7,5 liter deioniseret vand (svarende til en 1%'s opløsning), og der udluftes som ovenfor, og opløsningen gennempumpés i 18 timer ved stuetemperatur. Derefter frasuges natri-umchloritopløsningen gennem ledningen (3), og der skylles endnu engang med deioniseret vand som ovenfor.

Gennem ledningen (2) påfyldes der nu en opløsning af 97,5 g dialdehydstivelse (fremstillet ifølge eksempel 2) i 7500 ml vand (= 1,35%) og pufret med natriumhydrogencarbonatopløsning til pH 8,8, hvilken opløsning gennempumpes i 24 timer og bortsuges gennem ledningen (3), hvorefter der skylles flere gange med deioniseret vand som ovenfor.

Med pumpen i et blodtrykmåleapparat afprøves nu hver arterie til et indre tryk på 240 torr. I denne forbindelse neddyppes den opblæste arterie i et vandbad. Utætte steder ombindes om muligt med silke.

De arterier, der findes gode, trækkes på en glasstav og stilles i et i den ene ende tilsmeltet glasrør, som påfyldes en opløsning af ethanol/destilleret vand (50/50 vol-%) + 1% propylenoxid og lukkes med gummiprop og isolerbånd. De således præparerede arterier konserveres i 14 dage ved 37°C i en inkubator.

Eksempel 4

Man foretager kemisk præparering af arterier på analog måde som i eksempel 3 med den forskel, at der til den enzymatiske nedbrydning i stedet for den 1%'s til pH 6,0 indstillede ficinopløsning anvendes en 0,2%'s med phosphat-citrat-puffer til pH 7,8 indstillet trypsinop-løsning.

Eksempel 5

Man foretager kemisk præparering af arterier på analog måde som i eksempel 3 med den forskel, at der i stedet for den 1,3%'s dialde-hydstivelsesopløsning anvendes en 0,5%'s med 10%'s natriumhydrogen-carbonatopløsning til pH 8,8 pufret glyoxalopløsning (37,5 g glyoxal til 7500 ml vand) til tværbindingen.