CN116617460B - 一种体外内皮化血管植入物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种体外内皮化血管植入物及其制备方法和应用，涉及生物医药技术领域。本发明利用3D打印构建辅助血管植入物体外内皮化的支架与固定器，通过物理翻转血管植入物和化学交联修饰的方法构建了生物友好型人工血管，可实现高效内皮细胞粘附，并通过翻转复位，在静态培养与动态冲刷相结合的培养条件下构建了高效体外内皮化的心血管植入物，有效克服血栓形成，促进了工程血管的早期抗凝与长期通畅。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体为一种体外内皮化血管植入物及其制备方法和应用。
背景技术
据WHO最新统计，全球心血管疾病的发病率和死亡率逐年攀升。随着中国老龄化进程加快，心血管疾病也成为老龄社会的高发病。血管移植依然是治疗心血管疾病的最终有效手段。然而能够用于冠脉搭桥、外周血管损伤替代等所需的口径小于4mm的小口径血管移植物至今没有可用产品。原因是移植后极易发生血栓形成和内膜增生而导致移植失败。国外科学家提出组织工程血管被认为是21世纪小口径血管替代物的突破口，但是小口径组织工程血管血栓形成依然是制约临床应用的关键。
目前工程血管仍然存在基质降解速度过快、平滑肌重建障碍或异常的内膜增生和血管狭窄等问题，内皮细胞作为血管内膜的主要细胞群体，在防止凝血的同时，也起到了抑制平滑肌异常增生，维持血管稳态的功能。小口径工程血管的内皮重建对血管植入物的早期与长期通畅有着至关重要的作用，工程血管内皮化通常分为体内内皮化和体外内皮化两种方案。在临床上，小口径工程血管通常对长度亦有一定要求，对于长度大于5cm的工程血管，在体内皮化的方案则不再适宜，此时需要内皮种子细胞进行体外内皮化。有研究表明，内皮这一类高代谢高耗氧量的细胞，在体外内皮化过程中，由于过小的血管口径限制导致物质交换与氧气匮乏，形成缺氧微环境，严重限制了小口径工程血管体外内皮化的效率。因此，小口径工程血管如何实现长段小口径工程血管体外内皮化并维持血管稳态，成为亟待解决的挑战。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种体外内皮化血管植入物的制备方法，可使血管植入物实现高效的体外内皮化，有效克服血栓形成，促进了工程血管的早期抗凝与长期通畅。
本发明还提供了一种用于血管植入物体外内皮化的生物反应系统，该系统可使血管植入物内外膜翻转，提供静态培养与动态冲刷相结合的培养条件，实现血管植入物的高效体外内皮化。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种体外内皮化血管植入物的制备方法，包括如下步骤：将血管植入物内外膜翻转；用EDC-NHS将胶原交联在所述血管植入物内膜上，获得胶原修饰的血管植入物；在所述胶原修饰后的血管植入物内膜表面接种内皮细胞静置培养后翻转复位，先于培养基中静态培养，再用培养基动态冲刷培养血管植入物，得到体外内皮化的血管植入物。
优选地，所述血管植入物口径为1～4mm，长度为0.5～20cm。
优选地，所述静态培养培养基为1640完全培养基，培养时间为45～60h；所述动态冲刷培养基为1640完全培养基，培养时间为45～60h。
优选地，所述血管植入物内外膜翻转方式为：将血管植入物一端结扎，另一端固定于血管支架上并翻转，使血管植入物内膜向外，外膜向内，血管植入物除结扎部分在血管支架内部外，其余部分全部翻转固定于血管支架表面，固定血管植入物内膜避免滑脱，获得内外膜翻转的血管植入物。
优选地，所述内皮化血管植入物翻转复位方式为：使用芯棒勾住留在血管支架内部的线结，缓慢退出线结与芯棒，使覆盖于血管支架表面的血管逐渐后退，并从血管支架内部中空通道将血管植入物缓慢退出。
本发明还提供了一种所述制备方法获得的体外内皮化血管植入物。
本发明还提供了一种用于血管植入物体外内皮化的生物反应系统，所述生物反应系统包括血管支架1、支架底座2、芯棒7和血管植入物固定器13；所述血管支架1为中空结构，便于所述芯棒7通过；所述支架底座2设置有连接棒4，通过连接所述血管支架1一端的连接插孔3固定血管支架1；所述血管植入物固定器13内部设置有储液池12，并在两端分别设置有接口15连通所述储液池12。
优选地，一所述接口15通过硅胶软管11连接蠕动泵9，另一接口15通过硅胶软管11连接培养基存储瓶14形成动态培养液路。
优选地，所述血管支架1、支架底座2、芯棒7、血管植入物固定器13通过3D打印制备得到。
本发明还提供了一种所述体外内皮化血管植入物的制备方法或所述的血管植入物或所述生物反应系统在制备小口径工程血管中的应用。
相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
1、本发明利用物理改善血管内膜空间结构与化学交联增强细胞粘附以及血管植入物机械强度的方式，通过直接翻转血管内外膜并修饰胶原，构建了高效体外内皮化的血管植入物，可维持血管早期通畅。
2、本发明制备得到了用于构建快速体外内皮化的血管植入物支架、芯棒与血管生物反应器，实现一步原位血管植入物内皮化与静态、动态冲刷培养，快速高效制备体外内皮化小口径血管植入物。
3、本方法所使用的胶原、3D打印材料与血管植入物基质安全性和生物相容性均较高。利用胶原纳米颗粒机械强度大、承压能力强和生物相容性好的特点，通过化学交联将胶原交联于心血管植入物本体表面，可实现内皮细胞的高效粘附、提高血管植入物承压、增强顺应性与抗血流冲刷能力，延长心血管植入物通畅的有效期。
附图说明
图1为本发明实施例中用于血管植入物翻转以及内皮化所需的血管支架的示意图，其中：1为血管支架；2为支架底座；3为连接插孔；4为连接棒；
图2为本发明实施例的血管植入物翻转制作过程示意图，其中：1为血管支架；2为支架底座；3为连接插孔；4为连接棒；5为血管植入物本体；6为线结；7为芯棒；8为血管植入物本体内膜面；
图3为本发明实施例的血管植入物固定器与动态培养液流线路示意图，其中：5为血管植入物本体；9为蠕动泵；10为蠕动泵连接头；11为硅胶软管；12为储液池；13为血管植入物固定器；14为培养基存储瓶；15为接口；
图4为本发明实施例的血管植入物翻转后接种荧光标记内皮细胞正面结果图，其中图中标尺为250μm；
图5为本发明实施例的血管植入物翻转后接种荧光标记内皮细胞侧面结果图，其中图中标尺为250μm；
图6为本发明实施例的血管植入物固定器与动态培养液流线路实物图；
图7为本发明实施例的血管植入物翻转后接种内皮细胞并静态培养48小时后血管内膜HE染色图；
图8为本发明实施例的血管植入物翻转后接种内皮细胞并静态培养48小时后翻转复位静态培养实物图；
图9为本发明实施例的血管植入物翻转后接种内皮细胞并静态培养48小时后翻转复位静态培养实物扫描电镜观察图；
图10为本发明实施例的血管植入物完成体外内皮化后移植大鼠颈总动脉手术实物图；
图11为本发明实施例的血管植入物体外内皮化并移植大鼠颈总动脉后1个月血管植入物内膜实物扫描电镜观察图；
图12为本发明实施例的血管植入物体外内皮化并移植大鼠颈总动脉后1个月后植入物多普勒超声结果图；
图13为本发明实施例血管植入物和天然血管细胞极性分析结果图；
图14为本发明实施例血管植入物和脱细胞血管血栓形成结果图；
图15为本发明实施例血管植入物和脱细胞血管血流速度结果图。
具体实施方式
本发明提供了一种体外内皮化血管植入物的制备方法，包括如下步骤：将血管植入物内外膜翻转；用EDC-NHS将胶原交联在所述血管植入物内膜上，获得胶原修饰的血管植入物；在所述胶原修饰后的血管植入物内膜表面接种内皮细胞静置培养后翻转复位，先于培养基中静态培养，再用培养基动态冲刷培养血管植入物，得到体外内皮化的血管植入物。在本发明中，血管植入物翻转复位后，经过静态培养平衡内皮细胞稳态后，经历培养基液流动态冲刷，使得细胞极性重新排布，血管顺应性与血流动力学相适应，实现体外高效内皮化，有效克服血栓形成，促进血管长期通畅。
在本发明的具体实施例中，所述用EDC-NHS将胶原交联在血管植入物内膜上的方法为：通过2mM 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺(EDC)和5mM N-羟基丁二酰亚胺(NHS)孵育血管植入物，室温孵育10～20分钟后，血管植入物转移至4mg/ml胶原溶液中4℃交联过夜，随后以PBS清洗20～30h，获得胶原修饰的血管植入物。
在本发明的具体实施例中，所述内皮细胞包括人脐静脉内皮细胞或人诱导多能干细胞来源内皮细胞。在本发明的具体实施例中，所述内皮细胞培养至融合75％，消化并离心重悬为细胞悬液，将所述细胞悬液调整至5×105～5×106个/ml后再进行接种。在本发明的具体实施例中，所述接种方法为：将固定密度的内皮细胞悬液均匀地滴加于所得的胶原修饰的血管植入物内膜表面，3min后将EGM2内皮培养基加至刚好没过血管植入物，静置2h；将胶原修饰的血管植入物翻转180°后再次接种所述内皮细胞悬浮液，加入培养基至没过血管植入物，静置培养48h。
在本发明中，所述血管植入物口径优选为1～4mm，长度优选为0.5～20cm；所述血管植入物口径更优选为2～3mm，长度更优选为0.8～10cm。在本发明中，为避免机体强烈的免疫排斥，先脱去离体血管中的细胞、核酸和脂肪，获得血管基质材料。在本发明的具体实施例中，用1640培养基稀释胰酶为0.05％浓度并在37℃的条件下消化处理血管20～30min去除细胞，之后用RNase、DNase及脂肪酶去除核酸和脂肪从而获得只有胶原和弹力纤维的血管基质材料。在本发明中，将血管植入物制作成小口径心血管植入物，可解决小口径血管移植后失败率高的临床问题。一般小口径组织工程血管的长度在0.5～20cm，可满足血管移植等临床应用的需求。
在本发明中，所述静态培养培养基为1640完全培养基，培养时间为45～60h；所述动态冲刷培养基为1640完全培养基，培养时间为45～60h。在本发明的具体实施例中，所述静态培养包括如下步骤：以1640完全培养基灌洗血管植入物管腔，随后于1640完全培养基优选地培养45～60h；所述循环动态培养包括如下步骤：静态培养后，用1640完全培养基优选地以10～20ml/min流速动态冲刷血管植入物45～60h即可；所述静态培养包括如下步骤：以1640完全培养基灌洗血管植入物管腔，随后于1640完全培养基更优选地培养48h；所述循环动态培养包括如下步骤：静态培养后，用1640完全培养基更优选地以15ml/min流速动态冲刷血管植入物48h即可。
在本发明中，所述血管植入物内外膜翻转方式为：将血管植入物一端结扎，另一端固定于血管支架上并翻转，使血管植入物内膜向外，外膜向内，血管植入物除结扎部分在血管支架内部外，其余部分全部翻转固定于血管支架表面，固定血管植入物内膜避免滑脱，获得内外膜翻转的血管植入物。在本发明的具体实施例中，优选以5-0丝线固定血管植入物内膜避免滑脱，获得内外膜翻转的心血管植入物。随后通过血管支架上含有的连接插孔与支架底座的连接棒将固定有内外膜翻转血管植入物的血管支架与支架底座进行固定。
在本发明中，所述内皮化血管植入物翻转复位方式为：使用芯棒勾住留在血管支架内部的线结，缓慢退出线结与芯棒，使覆盖于血管支架表面的血管逐渐后退，并从血管支架内部中空通道将血管植入物缓慢退出。在本发明的具体实施例中，所述内皮化血管植入物翻转复位方式为：使用眼科镊固定血管支架，另一只眼科镊夹持芯棒，使芯棒勾住留在支架内部的线结，缓慢退出线结与芯棒，使覆盖于血管支架表面的血管植入物逐渐后退，并从血管支架内部中空通道将血管植入物缓慢退出，用眼科剪减掉丝线结扎部分。
本发明还提供了一种所述制备方法获得的体外内皮化血管植入物。本发明获得的血管植入物实现体外内皮化，可有效克服血栓形成，促进血管长期通畅。本发明将血管植入物制作成小口径血管植入物，可解决小口径血管移植后失败率高的临床问题，能够满足血管移植等临床应用的需求。
本发明提供了一种用于血管植入物体外内皮化的生物反应系统，所述生物反应系统包括血管支架1、支架底座2、芯棒7和血管植入物固定器13；所述血管支架1为中空结构，便于所述芯棒7通过；所述支架底座2设置有连接棒4，通过连接所述血管支架1一端的连接插孔3固定血管支架1；所述血管植入物固定器13内部设置有储液池12，并在两端分别设置有接口15连通所述储液池12。本发明中，所述血管支架1和芯棒7起到了翻转血管的作用，在将血管植入物内膜翻转后，为内皮细胞提供了广阔的物质交换和氧气交换的空间，并便于直接定量接种内皮细胞。在本发明中，所述储液池12为血管植入物固定器13内部的无盖长方体槽结构，储液池空间长度与血管植入物等长。储液池12用于承载血管植入物并盛放EGM2培养基，防止血管植入物干燥失水，并提供营养环境。
在本发明中，一所述接口15通过硅胶软管11连接蠕动泵9，另一接口15通过硅胶软管11连接培养基存储瓶14形成动态培养液路。
在本发明中，所述血管支架1、支架底座2、芯棒7、血管植入物固定器13通过3D打印制备得到。
在本发明的具体实施例中，所述血管支架1的制备方法为：测量血管植入物内外径与长度，通过三维建模构建中空的与血管内外径匹配的血管支架模型，并通过DLP 3D打印机构建用于固定及翻转血管内外膜的血管支架1；
在本发明的具体实施例中，所述芯棒7的制备方法为：测量所述血管植入物内外径与长度，通过三维建模构建直径为所述血管支架1内径1/3的钝性芯棒三维模型，并通过DLP3D打印机构建用于协助固定及翻转血管内外膜的芯棒7。在本发明的具体实施例中，所述芯棒7为实心圆柱体，一端为防滑手柄，用于抓持；另一端为与芯棒7比芯棒直径大1～2mm的圆形钩体，用于推送血管植入物5或拉丝线绳结将血管植入物5翻转回来。
在本发明的具体实施例中，所述血管植入物固定器13的制备方法为：根据血管植入物的内径与长度，3DsMax三维建模构建直径与血管植入物等长，接口15外径与血管植入物内径相等的血管植入物固定器13，并连接血管植入物固定器接口15、蠕动泵9、蠕动泵接头10、等口径硅胶软管11、培养基存储瓶14，形成动态培养液路。在本发明中，所述血管植入物固定器13是一个开口的长方体容器，其内部为储液池12，两端有开孔与接口15连接。
本发明还提供了一种所述体外内皮化血管植入物的制备方法或所述的血管植入物或所述生物反应系统在制备小口径工程血管中的应用。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1构建辅助心血管植入物体外内皮化生物反应系统
1)测量所述血管植入物内外径与长度，通过3DsMax三维建模软件构建中空的与血管内外径匹配的血管支架1模型，并通过DLP 3D打印机构建用于固定及翻转血管内外膜的血管支架1与支架底座2。
2)测量所述血管植入物内外径与长度，通过3DsMax三维建模构建直径为所述血管支架1内径1/3的钝性芯棒7三维模型，并通过DLP 3D打印机构建用于协助固定及翻转血管内外膜的芯棒7。
3)根据血管植入物的内径与长度，用3Dsmax与3D打印机构建血管植入物固定器13，血管植入物固定器13包括储液池12、壁、与血管植入物固定器接口15。储液池12为血管植入物固定器13内部的无盖长方体槽结构，储液池空间长度与血管植入物等长，宽度为3cm，高3cm，壁厚3mm。接口15为从血管植入物固定器13壁上延伸并贯通的硬质管道接口，内部中空，表面带有防滑螺纹，其储液池内部一端用于连接血管植入物，储液池外部一端用于连接等口径硅胶软管11。
实施例2构建心血管植入物本体
在无菌条件下，从250-300g SD大鼠中提取颈总动脉，生理盐水冲洗血液，分离取出颈总动脉的外层结缔组织，然后剪成长0.5～1cm的小段血管。
用1640培养基稀释胰酶为0.05％浓度并在37℃的条件下消化处理血管30min去除细胞，之后用RNase、DNase及脂肪酶去除核酸和脂肪从而获得只有胶原和弹力纤维的血管基质材料。其中，血管基质材料的口径为1～4mm，以保证制备获得口径符合要求的小口径心血管植入物。
实施例3构建胶原修饰的心血管植入物本体
将实施例2获得的心血管植入物一端结扎，留下线结，另一端固定于实施例1制备得到的血管支架上并翻转，使内膜向外，外膜向内，血管植入物除结扎部分在支架内部外，其余部分全部翻转固定于支架表面。具体实施步骤为：将修建整齐的血管植入物以丝线结扎一端，并留下与血管等长的线头，使用芯棒7使得线头穿过支架1内部，并使大部分血管植入物置于支架内部，剩余部分保留在支架外。使用显微镊翻转血管植入物使其内外膜翻转并包裹于支架1表面，随后使用显微镊轻轻提拉翻转部分，同时以芯棒轻推线结部分使血管植入物完全翻转并包裹于支架1表面。并以5-0丝线固定内膜避免滑脱，获得内外膜翻转的心血管植入物。随后通过血管支架上的连接插孔与血管支架底座连接棒将内膜翻转的心血管植入物、血管支架、支架底座进行固定。
通过2mM 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺(EDC)和5mM N-羟基丁二酰亚胺(NHS)孵育步骤2获得的内外膜翻转的心血管植入物，室温孵育15分钟后，血管植入物转移至4mg/ml胶原溶液中4℃交联过夜，随后以PBS清洗24h，获得胶原修饰的血管植入物本体。
实施例4构建体外内皮化心血管植入物
1)人脐静脉内皮细胞(HUVEC)培养：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mLEGM2培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4～6mLEGM2完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜(或将细胞悬液加入6cm皿中)，培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。待细胞密度达80％～90％，即可进行传代培养，弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1～2次，加1～2ml消化液(0.25％Trypsin～0.53mMEDTA)于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1～2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10％血清的完全培养基终止消化。轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1～2mLEGM2培养液后吹匀，获得细胞悬液。
2)将HUVEC调整至5×106个/ml，均匀地滴加于实施例2所得的胶原修饰的血管植入物本体内膜表面，3min后将EGM2培养基加至刚好没过血管，静置2h后，重复操作1)，将胶原修饰的血管植入物本体上下翻转180°后再次接种，加入培养基至没过血管，静置培养48h。
3)静置培养完成后，将接种内皮细胞的血管植入物翻转复位，具体操作为：眼科镊固定血管支架，另一只眼科镊夹持芯棒，使芯棒勾住留在支架内部的线结，缓慢退出线结与芯棒，使覆盖于支架表面的血管逐渐后退，并从支架内部中空通道将血管植入物缓慢退出，用眼科剪减掉丝线结扎部分，以1640完全培养基轻柔灌洗血管腔，使管腔充盈，随后于1640完全培养基培养48h，连接血管植入物固定器接口，将血管接入动态培养液路，以15ml/min流速动态冲刷48h后，获得内皮化的心血管植入物。
血管植入物翻转后接种荧光标记内皮细胞表征：
按实施例3所述步骤，得到修饰的血管植入物后，按本实施例步骤1)～3)复苏培养转染红色荧光蛋白的人脐静脉内皮细胞，并接种于血管表面，培养48h后，以倒置荧光显微镜在568nm波长通道下观察血管表面。根据图4和图5可以看出，细胞均匀粘附于血管内膜。
血管植入物翻转后接种内皮细胞培养48小时后血管内膜HE染色：
将本实施例获得内皮化的心血管植入物，在动态冲刷完成后，用PBS清洗，并于多聚甲醛中固定4h。随后以PBS清洗，并用眼科剪剪开血管腔，暴露内膜，将血管展开，铺平固定于透明硅胶垫上，苏木精染色5分钟，流水冲洗。5％乙酸分化1分钟，流水冲洗，用吸管滴加乙酸，分化后流水冲洗。伊红染色1分钟，70％、80％、90％、100％酒精脱水各30秒，二甲苯5分钟，可以在通风橱自然晾干再封片，约5分钟。滴上中性树胶，封片，避免气泡产生，并将血管置于显微镜下观察。根据图7可以看出，血管内膜细胞分布均匀，细胞核分布方向一致，细胞排列整齐，证明内皮细胞成功接种于血管植入物内膜。
体外内皮化血管植入物扫描电镜表征：
将本实施例获得的内皮化血管植入物，在动态冲刷完成后，以PBS清洗，并于戊二醛中固定24h。随后以PBS清洗，并用眼科剪剪开血管腔，暴露内膜，将血管展开，铺平固定于导电胶表面。随后以乙醇和叔丁醇梯度脱水，喷金处理后于电镜下观察血管植入物内膜内皮细胞，根据图9可以看出，血管植入物内膜有内皮细胞粘附并生长，内皮细胞紧紧贴附于血管植入物内膜表面，并呈现出增殖与迁移的趋势，表明内皮细胞在血管植入物内膜生长良好。
实施例5体外内皮化血管植入物移植
将实施例4获得的体外内皮化血管植入物，在动态冲刷完成后，立即保存于1640培养基内，并在冰盒上作为移植供体备用。受体为雄性成年裸大鼠(Nude-Rat，250-300g)。大鼠以1％戊巴比妥麻醉后，对颈部备皮消毒，并切开皮肤，分离胸锁乳突肌暴露左侧颈总动脉，行左侧颈总动脉移植。逐层关闭肌肉、皮肤，并消毒，肌注抗生素三天，防止感染，见图10。对照为裸大鼠的右侧颈总动脉(天然血管)。
体外内皮化血管植入物移植术后30天多普勒超声表征：
将获得的内皮化血管植入物植入裸大鼠30天后，以1％戊巴比妥麻醉，并用超声多普勒观察左颈总动脉通畅性与血流速度。根据图11可以看出，移植内皮化血管30天后，裸大鼠移植侧颈总动脉血管通畅，多普勒超声信号清晰，测量血流速度约为40-80cm/s，与对侧自体颈总动脉流速一致。
体外内皮化血管植入物移植术后30天扫描电镜表征：
将获得的内皮化血管植入物植入裸大鼠30天后，人道处死大鼠，并以肝素生理盐水灌注后，取出血管并以多聚甲醛固定4h。PBS清洗后，并于戊二醛中固定24h。随后以PBS清洗，并用眼科剪剪开血管腔，暴露内膜，将血管展开，铺平固定于导电胶表面。随后以乙醇和叔丁醇梯度脱水，喷金处理后于电镜下观察血管植入物内膜内皮细胞。根据图12可以看出，移植后30天，血管内膜被内皮细胞覆盖，内膜表面无血栓与红细胞粘附，表明血管在植入30天内仍染保持内皮化，并发挥抗凝抗血小板粘附的功能。
对比例1
脱细胞血管移植：脱细胞血管来源于250-300g雄性SD大鼠左侧颈总动脉，自上端自颈内颈外分支处、下端主动脉分支处截取，脱细胞及血管处理的步骤同实施例2。
移植过程：受体为雄性SD大鼠，250-300g。大鼠以0.3％戊巴比妥钠麻醉；仰面固定大鼠，暴露颈部并备皮消毒；分离左侧颈总动脉，以6-0丝线于血管胸锁乳突肌下缘4mm处双线结扎；从两处结扎点中间离断血管；以丝线牵引血管穿过事先制备好的特氟龙套管，并以袖套法翻转血管并固定；近心端远心端分别固定翻转血管后，以肝素生理盐水冲洗并保持抗凝；将脱细胞血管套在翻转后血管上，并以5-0丝线结扎固定；先后松开远心端-近心端动脉夹，整理血管，观察血流有无异常；逐层吻合伤口，并碘伏消毒。
根据图13可以看出，天然血管与体外内皮化血管移植大鼠左侧颈总动脉30天的细胞极性分析，结果表明体外内皮化血管内皮细胞排列与细胞极性分布规律，接近天然血管。
根据图14可以看出，天然血管、脱细胞血管与体外内皮化血管移植大鼠左侧颈总动脉30天的血栓数量统计。相比于对照组脱细胞血管，体外内皮化的血管具有更少的血栓形成，表明体外内皮化血管植入物具有更优异的抗栓抗血小板能力。
根据图15可以看出，天然血管、脱细胞血管与体外内皮化血管移植大鼠左侧颈总动脉30天的血流速度统计，相比于对照组脱细胞血管，体外内皮化的血管血流速度与天然血管相近，表明其血流动力学接近自体的天然血管。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种体外内皮化血管植入物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将血管植入物内外膜翻转；用EDC-NHS将胶原交联在所述血管植入物内膜上，获得胶原修饰的血管植入物；在所述胶原修饰后的血管植入物内膜表面接种内皮细胞静置培养后翻转复位，先于培养基中静态培养，再用培养基动态冲刷培养血管植入物，得到体外内皮化的血管植入物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述血管植入物口径为1～4mm，长度为0.5～20cm。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述静态培养培养基为1640完全培养基，培养时间为45～60h；所述动态冲刷培养基为1640完全培养基，培养时间为45～60h。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述血管植入物内外膜翻转方式为：将血管植入物一端结扎，另一端固定于血管支架上并翻转，使血管植入物内膜向外，外膜向内，血管植入物除结扎部分在血管支架内部外，其余部分全部翻转固定于血管支架表面，固定血管植入物内膜避免滑脱，获得内外膜翻转的血管植入物。
5.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，所述内皮化血管植入物翻转复位方式为：使用芯棒勾住留在血管支架内部的线结，缓慢退出线结与芯棒，使覆盖于血管支架表面的血管逐渐后退，并从血管支架内部中空通道将血管植入物缓慢退出。
6.权利要求1～5任意一项所述制备方法获得的体外内皮化血管植入物。
7.一种用于血管植入物体外内皮化的生物反应系统，其特征在于，所述生物反应系统包括血管支架(1)、支架底座(2)、芯棒(7)和血管植入物固定器(13)；所述血管支架(1)为中空结构，便于所述芯棒(7)通过；所述支架底座(2)设置有连接棒(4)，通过连接所述血管支架(1)一端的连接插孔(3)固定血管支架(1)；所述血管植入物固定器(13)内部设置有储液池(12)，并在两端分别设置有接口(15)连通所述储液池(12)。
8.根据权利要求7所述的生物反应系统，其特征在于，一所述接口(15)通过硅胶软管(11)连接蠕动泵(9)，另一接口(15)通过硅胶软管(11)连接培养基存储瓶(14)形成动态培养液路。
9.根据权利要求7所述的生物反应系统，其特征在于，所述血管支架(1)、支架底座(2)、芯棒(7)、血管植入物固定器(13)通过3D打印制备得到。
10.权利要求1～5任意一项所述体外内皮化血管植入物的制备方法或权利要求6所述的血管植入物或权利要求7～9任意一项所述生物反应系统在制备小口径工程血管中的应用。
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