Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowych cennych farmaceutycznie pochodnych ftalazonu-1 o wzorze 1. W belgijskim opisie patentowym nr 787139 po¬ dano, ze alkoksykarbonylo-4-hydroksymetyloftala- zony-l wykazuja wysoka aktywnosc w leczeniu krwotoków, zakrzepów i -stwardnienia tetnic. Ba¬ dania szlaków metabolicznych u zwierzat i bada¬ nia kliniczne u ludzi dowiodly, ze 7-etokteykartoo- nylo-4-hydroksymetylo-(ftalazon-l po podaniu zwie¬ rzetom i ludziom metabolizowany jest do odpo¬ wiedniej pochodnej 7-karboksylowych, w wyniku czego czas jego dzialania biologicznego jest sto¬ sunkowo krótki. Stwierdzono, ze III.rz.butoksykar- bonylo-4-hydroksymetyloftalazon-l jest oporny na metaboliczna degradacje i wykazuje przedluzona aktywnosc biologiczna w porównaniu z odpowie¬ dnimi pochodnymi alkoksykarbonylowymi o pro¬ stym lancuchu alkilowym. Pochodne in.rz.toutoksykarbonylo-4-hydroksyme- tyloftalazonu-1 mozna otrzymywac sposobem opi¬ sanym w powyzszym belgijskim opiaie patento¬ wym i przedstawionym na schemacie. W sposobie tym grupa 4-karboksylowa estryfikuje sie otrzy¬ mujac grupa III*rzJbutoksykarbonylowa, z której po odszczepieniu otrzymuje sie grupe hydroksyme- tylowa. Poniewaz otrzymywanie estrów 111-rz.bu- tylowych jest procesem skomplikowanym i kosz¬ townym w skali przemyslowej, sposób przedsta- wiony na schemacie, nie nadaje sie do zastosowa¬ nia produkcyjnego. Stwierdzono, ze zwiazki o wzorze 1 mozna wy¬ twarzac w skali przemyslowej stosujac bardziej dogodny sposób, polegajacy na tym, ze w pierw¬ szym etapie otrzymuje sie etoksykarbonylo-4-hy- droksymetyloftalazon-l wedlug sposobu opisanego w belgijskim opisie patentowym. Nastepnie otrzy¬ many zwiazek hydrolizuje sie i acyluje, otrzymu¬ jac zwiazek o wzorze 2 lub 4, które z kolei mozna przeksztalcac w ester Itt-rz.butylowy, stosujac spo¬ sób wedlug wynalazku. Tak wiec, zwiazki o wzorze 1 wytwarza Sie poddajac zwiazek o wzorze % w którym R ozna¬ cza grupe acylowa, korzystnie acetylowa, proplo- nylowa lub benzoilowa reakcji z izobutylenem, w obecnosci katalizatora, a nastepnie otrzymany zwiazek o wzorze 3, w którym R posiada znacze¬ nie podane powyzej, hydrolizuje sie otrzymujac zwiazek o wzorze 1. Powyzsze zwiazki mozna rów¬ niez otrzymywac przeksztalcajac zwiazek o wzo¬ rze 2 w zwiazek o wzorze 4, w którym R ma znaczenie podane powyzej, a X oznacza atom Chlo¬ rowca, a nastepnie poddajac zwiazek O Wzorze 4 reakcji z Ill-rz.butanolem w obecnosci kataliza¬ tora oraz hydrolizujac otrzymany zwiazek o wzo¬ rze 3 do zwiazku o Wzorze 1. W tescie na doswiadczalne stwardnienie tetnic wywolywane podawaniem oholestrolu stwierdzono, 100 990100 990 3 ze zwiazki o wzorze 1 wykazuja aktywnosc w za¬ pobieganiu stwardnienia tetnic i hamuja odklada¬ nie sie cholesterolu na sciankach tetnic. Moc ich jest przy tym ipnad trzy razy wieksza niz po¬ chodnych etoksykarbonylowych. Zwiazki otrzyma¬ ne sposobem wedlug wynalazku zapobiegaja tak¬ ze zwiekszaniu sie krzepliwosci krwi i tworzeniu skrzeplin wywolywanych przez podawanie chole¬ sterolu lub adrenaliny. I w tym przypadku moc nowych zwiazków jest piec razy wyzsza niz po¬ chodnych etoksykarbonylowych. Nowe zwiazki za¬ pobiegaja wiec bardziej skutecznie skracaniu czasu krzepniecia krwi oraz wywolywanemu przez dwu- fosforan adenozyny zwiekszaniu zlepiania sie ply¬ tek krwi u ludzi. Ponadto stwierdzono, ze nowe zwiazki sa zdol¬ ne do obnizania i normalizowania podwyzszonego cisnienia krwi, co zostalo udowodnione w tescie u szczurów z samoistnym nadcisnieniem. Natomiast pochodne etoksykarbonylowe nie wykazuja zau¬ wazalnej aktywnosci wobec podwyzszonego cisnie¬ nia krwi u szczurów. Aktywnosc nowych zwiazków mozna przypisac ich dzialaniu hamujacemu w sto¬ sunku do fosfodwuesterazy cyklicznego AMP, co zostalo zilustrowane testem biologicznym przed¬ stawionym w dalszej czesci opisu. Zwiazki wytworzone sposobem wedlug wynalaz¬ ku sa wiec przydatne w leczeniu choroby nadcis- nieniowej, stwardnienia tetnic i zakrzepów. Sa one takze przydatne w leczeniu schorzen wywolywa¬ nych zaburzeniami w przemianach cyklicznego AMP, na przyklad ,chorób rakowych, zaburzen umyslowych i neurologicznych, zaburzen hormo¬ nalnych oraz chorób serca. Zwiazki wyjsciowe stosowane w sposobie we¬ dlug wynalazku mozna otrzymywac ze zwiazków opisanych w belgijskim opisie patentowym nr 787139. Na przyklad, na drodze hydrolizy 7-eto- ksykarbonylo-4-hydroksymetyloftalazonu-l i na¬ stepnie acylowania 'bezwodnikiem lub chlorkiem kwasowym otrzymuje sie 4-acylooksymetylo-7-kar- boksyftalazon-1, analogiczny do zwiazku o wzo¬ rze 2. Odpowiednia grupa acylowa jest grupa ace- tylowa. Reakcje pomiedzy zwiazkiem o wzorze 2 i izo- butylenem prowadzi sie w rozpuszczalniku, takim jak dioksan lub czterowodorofuran. Izobutylen sto¬ suje sie w nadmiarze molarnym. Korzystnie jest stosowac stezony kwas siarkowy jako katalizator reakcji. Proces prowadzi sie w autoklawie cisnie¬ niowym, mieszajac w temperaturze 0—60°C. Reakcje pomiedzy zwiazkiem o wzorze 4 i III- -rz.-butanolem prowadzi sie bez uzycia rozpusz¬ czalnika, stosujac nadmiar absolutnego III-rz.-bu- tanolu. Do mieszaniny reakcyjnej korzystnie jest dodawac katalizator lub srodek wiazacy chlorowo¬ dór, na przyklad dwumetyloaniline, pirydyne, ko- lidyne lub magnez. Reakcje prowadzi sie w tem¬ peraturze 0—150°C, korzystnie w temperaturze wrzenia Ill-rz.-butanolu. Grupe acylowa w zwiazku o wzorze 3, otrzyma¬ na podanymi wyzej sposobami odszczepia sie sto¬ sujac czesciowa hydrolize "malym nadmiarem zasa¬ dy, takiej jak wodorotlenek lub weglan potasowy. Otrzymuje sie zwiazek o wzorze 1. Produkty re- 60 65 akcji wydziela sie i oczyszcza stosujac znane spo¬ soby, podane w przykladach w dalszej czesci opi¬ su. ' Zwiazki otrzymane sposobem wedlug wynalazku mozna podawac bezposrednio lub w postaci kom¬ pozycji farmaceutycznych, takich jak proszki, ta¬ bletki, granulki, kapsulki, oplatki, zawiesiny i inne formy do stosowania doustnego, oraz w postaci zawiesin, roztworów i innych form do stosowania pozajelitowego. Skuteczna ilosc zwiazku o wzorze 1 w pojedynczej dawce zalezy od konkretnej po¬ trzeby i wynosi zazwyczaj 0,1—80% calosci. Zwia¬ zek o wzorze 1 mozna wiec stosowac w dowolnym stezeniu, w dawkach dziennych, wynoszacych 1— —100 mg na kilogram wagi ciala. Jako nosnik lub rozcienczalnik mozna stosowac dopuszczalna w farmacji substancje ciekla lub sta¬ la, przy czym do nosników zalicza sie takze adju- wanty. Do cieklych nosników nalezy na przyklad woda destylowana do iniekcji, izotoniczny roztwór chlprku sodowego, roztwór Ringera, roztwór Loc- ke'a, glikol polietylenowy, alkohol etylowy glikol propylenowy gliceryna i oleje roslinne. Nosnikami stalymi moga byc na przyklad chlorek sodowy, glikoza, laktoza skrobia, alkohol cetylowy, maslo kakaowe. Testy biologiczne. Dzialanie zwiazków wytwo¬ rzonych sposobem wedlug wynalazku zapobiegaja¬ ce in vitro zlepianiu sie plytek krwi ludzkiej. Zwiazki otrzymane sposobem wedlug wynalaz¬ ku zapobiegaja zlepianiu sie plytek krwi ludzkiej wywolywanemu* podawaniem in vitro dwufosfora- nu adenozyny (ADP) lub adrenaliny. Próbki ludzkiego osocza cytrynianowego bogate¬ go w plytki krwi inkubuje sie w ciagu 200 se¬ kund, w temperaturze 37°C, z 1/10 objetosci nasy¬ conego roztworu chlorku sodowego zawierajace¬ go rózne ilosci badanego zwiazku. Do mieszaniny dodaje sie 3 mikromole ADP lub 1 |xg/ml adrena¬ liny. Natezenie pierwotnego i wtórnego zlepiania sie mierzy sie stosujac aparat do pomiaru zlepia¬ nia sie plytek, typu Chrono-Log, Model 300. Natezenie zlepiania sie plytek, wywolywanego w kazdej próbce za pomoca ADP lub adrenaliny, porównywano kazdorazowo z natezeniem dla prób¬ ki inkubowanej z roztworem chlorku sodowego. Wielkosc hamowania zlepiania sie plytek wyra¬ zano jako stosunek procentowy natezenia zlepiania przy stosowaniu nowego zwiazku oraz roztworu chlorku sodowego. Natezenie pierwotnego i wtórnego zlepiania sie plytek mierzono stosujac sposób opisany przez Ya- mazaki, Sano i wspólpracowników w pracy, która bedzie opublikowana pod tytulem „Platelet Func- tions in Thromboembolic Disorders" w Thrombosis et Diatheses Haemorrhagica. Sposób powyzszy jest takze podany w odnosnikach literaturowych do powyzszej pracy. Jak wynika z danych z tablicy 1, zwiazek otrzy¬ many sposobem wedlug wynalazku hamuje pier¬ wotne zlepianie sie wywolywane przez ADP lub adrenaline z aktywnoscia porównywalna do aktyw¬ nosci 4-hydroksymetyloftalazonu-l (belgijski opis patentowy nr 787 138) oraz 7-etoksykarbonylo-4-hy-100 990 6 droksymetyloftalazonu-1 (belgijski opis patentowy nr 787 139). Jednakze zwiazek otrzymany sposo¬ bem wedlug wynalazku hamuje o wiele lepiej wtórne zlepianie w porównaniu z powyzszymi zwiazkami. Tak wiec, zwiazek wedlug wynalazku hamuje wtórne zlepianie, wywolywane przez ADP lub adrenaline, w sposób statystycznie znaczacy w stezeniu 1—2,5 pg/ml, podczas gdy 7-etoksykarbo- nylo-4-hydroksymetyloftalazon-l wykazuje dziala¬ nie hamujace dopiero w stezeniu 5—10 [.ig/ml. Dzialanie zwiazków wytworzonych sposobem we¬ dlug wynalazku polegajace na hamowaniu fosfo- dwuesterazy cyklicznego ADP w sciankach tetnic królików i plytkach krwi ludzkiej. Zwiazki wytworzone sposobem wedlug wynalaz¬ ku wykazuja okreslony efekt hamujacy wobec fosfodwuesterazy cyklicznego AMP w sciankach tetnic królików i plytkach krwi ludzkiej. Material skladajacy sie z warstwy srodkowej i blony wewnetrznej scianek tetnicy królików lub bogatego w plytki osocza krwi ludzkiej, homoge¬ nizuje sie i wiruje. Supernatant inkubuje sie z cyklicznym adenozyno^^-fosforanem adenozyny (AMP), znaczonym trytem i róznymi ilosciami ba¬ danego zwiazku. Mieszanine po inkubacji oczyszcza sie na drodze chromatografii kolumnowej. Frakcje zawierajace nukleotydy oznacza sie ilosciowo, stosujac cieczo¬ wy licznik scyntylacyjny. W tablicy 1 przedstawiono dzialanie hamujace nowych zwiazków wobec fosfodwuesterazy cyklicz¬ nego AMP. Dane w tablicy przedstawiaja ilosc zwiazku potrzebna dla zahamowania w 50% fosfo¬ dwuesterazy cyklicznego AMP. Jak wynika z danych z tablicy 2, nowe zwiazki bardziej aktywnie hamuja dwufosfoeteraze niz teofilina, kofeina lub dotychczas znane zwiazki. Oznacza to, ze nowe zwiazki zwiekszaja stezenie cyklicznego AMP w plytkach i sciankach tetnic. Tablica 2 1 Zwiazek 7-etoksykarbonylo-4- -hydroksymetylofta- lazon-1 (kontrola) Kofeina (kontrola) Teofilina (kontrola) 7-III-rz.-butoksykar- bonylo-4-hydroksy- metyloftalazon-1 Plytki krwi ludzkiej 57 350 91 22 I50 w mikromolach 1 scianka tetnicy królików blona wew¬ netrzna 52 — 127 13,4 warstwa srodkowa 144 460 155. 1 48 blic nia pl / ierwot 4 8,9±3,( ,7+l,i 8,9±3,< 4,5±2,< 2,4+3,J 6,2 ±2,1 2,9±5,( 7,0+5,: 1,9±5,2 0,5±5,( 2,3+5,^ 8,6±7,( 7,2±5,i 0,l+7,i 2,5+8,( zlepiaj 30wan zlepia lkubo^ doweg 50 55 AR Tablica 1 Wielkosc hamowania zlepiania plytek krwi ludzkiej in vitro Zwiazek 1 Kwas acetylosalicylowy (kontrola) 4-hydroksymetyloftalazon-l (kontrola) 7-etoksykarbonylo-4-hy- droksymetyloftalazon-1 (kontrola) 7-III-rz.butoksykarbonylo- -4-hydroksymetyloftala- zon-1 ^g/ml 2 300 80 40 300 80 40 80 40 2,5 Ilosc przypad¬ ków 3 14 14 14 12 ADP 3 ^M pierwotne 4 108,9+3,6 95,7+1,8 98,9+3,4 84,5+2,0*) 82,4+3,2 86,2±2,5 62,9±5,0**) 77,0+5,1**) 81,9±5,2**) 90,5±5,6 72,3+5,4 88,6+7,6 87,2±5,8 90,1+7,8 92,5+8,0 wtórne 75,5+5,9**) 70,2+10,1*) 78,0±9,9*) 68,3±3,8 64,9+6,7 72,0+6,8 ,7±0,4**) 58,6+7,6**) 67,1+6,3*) 84,9±6,3*) 57,5+3,0 57,0+5,9**) 51,4+6,1 62,3±5,8**) 98,1 ±8,3 Ilosc przypad¬ ków 6 adrenalina 1 ^g/ml pierwotne 7 107,5±2,6 95,6±5,2 105,7±3,3 85,4±3,1*) 92,3±6,0 98,8±5,9 81,9+6,5*) 92,9±16,9 97,0±4,1 105,8±6,9 102,8±7,9 96,5±8,2 94,6±4,5 98,9±4,7 wtórne 8 62,7±10,7**) 46,6±7,9**) 45,0±7,8**) 60,2+8,0*) 69,2±7^ 85,9±10,1 33,0±7,1**) 71,7±13,5*) 82,1±9,5 80,8+13,9 102,2+12,4 63,6+13,2**) 65,5±6,8 69,2±7,2**) *) B<0,05 **) P<0,01 Natezenie zlepiania sie plytek z osocza cytryniano- wego inkubowanego z badanym zwiazkiem Wielkosc hamowania = Natezenie zlepiania sie plytek z osocza cytrynia- nowego inkubowanegov z nasyconym roztworem chlorku sodowego100 MO Zwiazek (dawka 50 mg/kg) 4-hydroksymetyloftalazon-l 7-etoksykarbonylo-4-hydroksy- metyloftal*zom-l Tablica 3a Cisnienie krwi wyjsciowe 1*3 178 1 178 165 3 179 176 6 180 180 24 182 179 48 184 184 Tablica 3b 7.III.rz.butoksykarbonylo-4-hydroksymetyloftalazon-l Dawka w mg/kg » 12,6 3,1 0,78 cisnienie krwi */• obnizenia cisnienie krwi •/o obnizenia Cisnienie krwi •/o obnizenia cisnienie krwi •/• obnizenia Cisnienie krwi i •/< jego obnizenia czas w godzinach po podaniu wyjsciowe 183 178 187 190 1 165 9,8 177 0,6 183 2,1 180 ,3 3 165 9,8 158 IW 167 ,7 163 14,2 6 143 21,9 140 21,4 140 ,1 163 14,2 24 173 ,5 160 ,1 173 7,5 180 ,3 48 168 8,2 1617 6,2 183 2,1 188 1,1 Doswiadczenia prowadzono stosujac metode Hi- daka i Shibuya, która bedzie opublikowana w Bio- chemical Medicine, pod tytulem „A New Assay of Cyclic Nucleotide Phosphodiesterase and its Application do Humans". Obnizenie cisnienia przez zwiazki wytworzone sposdbem wedlug wynalazku u szczurów z samo¬ istnym nadcisnieniem. Zwiazki wytworzone sposobem wedlug wynalaz¬ ku wykazuja jedyny w swoim rodzaju efekt w stosunku do szczurów o samoistnym nadcisnieniu. Samoistnie nadcisnieniowe szczury hoduje sie sto¬ sujac selektywne rozmnazanie osobników z tego samego gniazda, wykazujacych samoistne nadcis¬ nienie. Okresla sie je jako genetycznie nadcisnie¬ niowe. Przyjmuje sie, ze samoUrtnie nadcisnienio¬ we szczury wykazuja bliskie podobienstwo do nad¬ cisnienia u ludzi i moga byc stosowane w testach na to schorzenie. 4-Hydroksymetyloftalazon-l oraz 7-etoksykarbo- nylo-4-hydroksymetyloftalazon-l nie wykazuja zna¬ czacego dzialania obnizajacego cisnienie, podczas podawania dootrzewnowego i doustnego w daw¬ kach do 50 mg/kg. Natomiast nowe zwiazki wy¬ kazuja uderzajaco silny efekt obnizania cisnienia podczas podawania dootrzewnowe lub doustnie w dawkach 0,78—50 mg/kg. Zostalo to przedstawio¬ ne w tablicy 3 to. W tescie na cisnienie krwi stosowano nadci&nie- niowe samoistnie szczury o wadze 210-~a50 g i wieku 13—15 tygodni* Badane zwiazki podawano ' dootrzewnowo. Wszystkie dane w tablicy 3 a i 3 b sa danymi srednimi dla trzech s«zurów. Test na toksycznosc: Wyniki testu na toksycznosc (IA|) nowego zwitku oraz dotychczas znanych zwiazków przed¬ stawione sa w tablicy 4. Test przeprowadzano na myszach, przy podawaniu doustnym. Uzyskane re¬ zultaty wykazuja, ze badane zwiazki sa porówny¬ walnie nietoksyczne. Tablica 4 4-hydroksymetyloftalazon-l 7-etoksykarbonylo-4-hydroksy- metyloftalazon-1 7-III-rz.butoksykarbonylo-4- -hydroksymetyloftalazon-1 LDgo (mg/kg) 45 50 55 65 Sposób wedlug wynalazku ilustruja nastepujace przyklady, które jednak nie Ograniczaja zakresu jego stosowania. Przyklad I. Otrzymywanie 4-acetoksymety- lo-7-III.rz.butoksykarbonyloftalazonu-l. 1. W grubosciennej rurze szklanej umieszcza sie 1,2 g 4-acetoksymetylo-7-karboksyftalazonu-l o temperaturze rozkladu 252—253°C i 50 ml dioksa¬ nu. Calosc ochladza sie w mieszaninie suchego lo¬ du i acetonu, a nastepnie dodaje sie 12 ml izotou- tylenu i 4 ml stezonego kwasu siarkowego, mie¬ szajac za pomoca mieszadla magnetycznego. Rure zamyka sie i zawartosc miesza w ciagu 10 godzin w temperaturze pokojowej, po czym wylewa sie do */t roztworu wodnego weglanu sodowego i ekstra¬ huje octanem etylu* Ekstrakt octanowy suszy sie siarczanem magnezu i odparowuje* Pozostalosc re- krystalizuje sie z etanolu i otrzymuje 750 mg 4- -acetoksymetylo-7-HIjz.butoksykarbonyloftalazonu- -1 o temperaturze topnienia 202—«03°C. Widmo w podczerwieni w bromku potasowym: 1740, 1720, 1660, 1360, 1295, 1240, 1160, 1120 i 1035 cm"1, Mieszanine 2 g 4-acetoksymetylo-7-karboksyfta-100 1190 lazonu-l oraz 200 ml destylowanego chlorku tio- nylu ogrzewa sie lagodnie w ciagu 3 godzin w temperaturze 70—80°^. Nadmiar chlorku tionylu usuwa sie pod zmniejszonym cisnieniem, dodaje ml bezwodnego benzenu, odparowuje pod zmniej¬ szonym cisnieniem i dodaje 30 ml absolutnego Ill.rz.butanolu. Nastepnie do roztworu dodaje sie mieszajac 2,2 ml dwumetyloaniliny i calosc ogrze¬ wa sie w temperaturze wrzenia w ciagu 30 godzin, zabezpieczajac od dostepu wilgoci. Rozpuszczalnik odparowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem, a pozostalosc alkalizuje sie wodnym roztworem we¬ glanu sodowego i ekstrahuje octanem etylu. Eks¬ trakt octanowy suszy sie i odparowuje rozpuszczal¬ nik. Pozostalosc rekrystalizuje sie z etanolu. Otrzy¬ muje sie 1,2 g 4-acetoksymetylo-7-III-rz.-butoksy- karbonyloftalazonu-1 o temperaturze topnienia 202—203°C. Widmo w podczerwieni jest takie sa¬ mo jak widmo produktu z punktu 1. Otrzymywanie 7-III.rz.-butoksykarbonylo-4-hydro- ksymetyloftalazonu-1. Do roztworu 1,8 g wodorotlenku potasowego w 150 ml etanolu dodaje sie 3,4 g 4-acetoksymetylo- -7-III.rz.-butoksykarbonyloftalazonu-l. Calosc mie¬ sza sie w temperaturze pokojowej w ciagu 3 go¬ dzin, a nastepnie wysyca dwutlenkiem wegla. Mie¬ szanine zateza sie pod zmniejszonym cisnieniem, a pozostalosc wylewa do wody i ekstrahuje octa¬ nem etylu. Ekstrakt octanowy suszy sie i odparo¬ wuje rozpuszczalnik. Pozostalosc rekrystalizuje sie z etanolu i n-heksanu. Otrzymuje sie 2,8 g 7- -III.rz.butoksykarbonylo-4-hydroksymetyloftalazo- nu-1 o temperaturze topnienia 270—272°C. Widmo w podczerwieni w bromku potasowym: 3500 (sze¬ rokie pasmo), 1730, 1660, 1370, 1310, 1270, 1162, 1130, 1030 cm-1. Widmo masowe: jon masowy 276 M+, 220, 203 i 191. PL PL PL PL PL PL