PL100791B1 - Sposob intensyfikacji produkcji kwasu cytrynowego metoda fermentacyjna - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób intensyfikacji produkcji kwasu cytrynowego metoda fermentacyjna.

Kwas cytrynowy jest stosowany w wielu galeziach przemyslu, miedzy innymi w przemysle spozywczym do wyrobu napojów chlodzacych, produktów cukierniczych, jako srodek konserwujacy zywnosc, jako przeciw- utleniacz w przemysle spozywczym, jako dodatek smakowy do leków i wyrobu proszków musujacych. Nadto sluzy do regeneracji kotlów parowych w elektrocieplowniach, do oczyszczania kominów fabrycznych, moze byc takze wykorzystany do produkcji detergentów.

Dotychczas kwas cytrynowy wytwarzany jest glównie na drodze fermentacji weglowodanów przy uzyciu aktywnych szczepów Aspergillus niger. Podstawowymi surowcami do wytwarzania kwasu cytrynowego sa sacharoza, uzyta w podlozu syntetycznym lub roztwory melasy. Weglowodany, wystepujace w podlozu fermentacyjnym o stezeniu 10-18%, zostaja wciagu 7-10 dni zamienione w kwas cytrynowy z wydajnoscia 40-80%, przy czym proces ten przebiega dwuetapowo. Okres produkcji kwasu cytrynowego jest poprzedzony faza wzrostu grzybni. Przejsciu grzybni z fazy wzrostu do fazy produkcji towarzyszy czesto niemal calkowite wyczerpanie zródla azotu i fosforu. Efekty procesu zaleza od aktywnosci uzytego szczepu, skladu pozywki, pH, temi»eratury i innych warunków hodowli. Proces fermentacji prowadzony jest dwoma sposobami, a mianowicie powierzchniowym oraz wglebnym. W sposobie powierzchniowym grzybnia producyjna rosnie na powierzchni podloza, umieszczonego w specjalnych do tego celu przeznaczonych tacach, podczas gdy w procesie wglebnym, prowadzonym w fermentorach, grzybnia rozwija sie w calej objetosci plynu w postaci luznych splatków lub niewielkich konglomeratów.

Badania nad intensyfikacja procesu produkcji kwasu cytrynowego ida w kierunku zwiekszenia efektywnej przemiany substratu w kwas cytrynowy i skrócenia czasu fermentacji. Uzyskuje sie to przez stosowanie nowych wysokowydajtiych szczepów Aspergillus niger oraz optymalizacje warunków prowadzenia procesu, na przyklad przez wzbogacenie podloza substancji o dzialaniu stymulujacym proces biosyntezy kwasu cytrynowego.

Znanych jest szereg substancji, stosowanych jako stymulatory produkcji kwasu cytrynowego, mianowicie alkohole, aminokwasy, oleje i zwiazki powierzchniowo-czynne, autolizat drozdzowy oraz fluorki.2 100 791 Stymulatory w postaci alkoholi opisane sa w czasopismie amerykanskim ,Journal of Applied Microbiolo- gy" 1, 1—14 (1953) oraz czasopismach japonskich „Hakko Kyokaishi", 19,435,1961 i „Kogyo Kogaku Zasshi", 64, 2027, 1961. Aminokwasy znane sa z opisów patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr nr 2476159 i 3372094 oraz czasopisma „Zentralblatt fir Bakteriologie" II, 119, 1, 37, 1965, natomiast oleje i zwiazki powierzchniowo-czynne znane sa z opisu patentowego japonskiego nr 10965 i opisu brytyjskiego nr 1145520 oraz z czasopisma „Journal of General Microbiology" 43, 1, 71, 1966. Autolizat drozdzowy opisany jest w czasopismie japonskim „Kogyo Kogaku Zasshi" 66, 6, 1963 oraz w opisie patentowym Czechoslowacji nr 113640, zas stymulator w postaci fluorków opisany jest w czasopismach „Naturwissenschaften" 53, 9, 226, 1966 i „Journal of General Microbiology" 43,1, 71,1966.

Wiekszosc z wymienionych stymulatorów nie znalazla szerszego zastosowania, poniewaz zwiazki te ujawniaja swa dzialalnosc aktywujaca tylko dla wybranych szczepów plesni i scisle okreslonych warunków fermentacjic Nadto stosowanie wiekszosci z tych zwiazków jest ograniczone ze wzgledu na wysoka ich cene oraz duze stezenia, w których sa stosowane, a takze toksycznosc niektórych z nich.

Sposób intensyfikacji produkcji kwasu cytrynowego metoda fermentacyjna wedlug wynalazku, polega na tym, ze w fazie wzrostu grzybni po uprzednim przygotowaniu pozywki fermentacyjnej i zaszczepieniu jej kielkujacymi konidiami Aspergillus niger dodaje sie do podloza fermentacyjnego stymulatora w postaci zieleni brylantowej w ilosci 0,1—0,2Mg/l ml podloza. Proces fermentacji prowadzi sie w ciagu 5,5-6 dni. Nastepnie po zakonczeniu oddziela sie w znany sposób grzybnie od przefermentowanego podloza i wyodrebnia gotowy produkt.

Dodanie w sposobie wedlug wynalazku zieleni brylantowej powoduje ograniczenie wzrostu grzybni, a tym samym eliminacje niekorzystnej nadprodukcji biomasy, przy jednoczesnym wzmozeniu jej aktywnosci kwaso- twórczej.

Dzieki dodaniu zieleni brylantowej jako stymulatora biosyntezy kwasu cytrynowego uzyskuje sie w stosunku do znanych sposobów zwiekszenie wydajnosci procesu o 1,3-11,7%, skrócenie czasu fermentacji o 1 -1,5 doby, wzrost aktywnosci kwasotwórczej grzybni o 20-70% oraz obnizenie produkcji biomasy o 2—40%.

Nadto dzieki zmniejszeniu plonu biomasy ulegaja obnizeniu naklady energetyczne na mieszanie i napowietrzanie srodowiska fermentacyjnego0 Sposób wedlug wynalazku ilustruja blizej podane nizej przyklady, nie ograniczajac jego zakresu.

Przyklad I. Przygotowano podloze mineralne o skladzie: sacharoza 100 g, siarczan amonu 2 g, kwasny fosforan potasu 0,2 g, siedmiowodny siarczan magnezu 0,2 g, pH = 2,4 ustalone kwasem solnym, woda wodociagowa do 11. Podloze to w ilosci 150 ml umieszczono w kolbach plaskodennych o pojemnosci 11 i poddano pasteryzacji, po czym szczepiono je 7,5-godzinna zawiesina kielkujacych konidiów Aspergillus niger B-64-5 o konidiach czarnych. Hodowle prowadzono w temperaturze 30°C w ciagu 7 dni na wytrzasarce wahadlowej o amplitudzie 5 cm i czestotliwosci 150 ruchów/minute. Po 24 godzinach hodowli dodawano do jednej partii kolb po 1,5/zg zieleni brylantowej, pozostawiajac druga partie bez dodatku tego stymulatorac W czasie fermentacji kontrolowano przyrost kwasowosci ogólnej suchej substancji grzybni oraz sklad jakosciowy kwasów organicznych metoda chromatografii bibulowej. Wyniki fermentacji zestawiono w tabeli I.

Z tabeli I wynika, ze w wyniku fermentacji, prowadzonej przy uzyciu szczepu Aspergillus niger B-64-5, dodatek zieleni brylantowej powoduje intensywniejsza i zwiekszona produkcje kwasu cytrynowegoc Przy uzyciu stymulatora proces syntezy kwasu cytrynowego zostal zakonczony juz po szesciu dniach z wydajnoscia 65%, podczas gdy w próbach bez zieleni brylantowej trwal siedem dni, dajac 58,9% wydajnosci bezwodnego kwasu cytrynowego w stosunku do dodanego cukru. Zastosowanie stymulatora pozwolilo wiec na skrócenie procesu o jedna dobe i podwyzszenie wydajnosci o 6%. Ponadto zielen brylantowa ograniczyla wzrost biomasy badanego szczepu z 0,83 g do 0,66 g suchej substancji na 100 rnl podloza, czyli o 20%. Grzybnia, rosnaca w obecnosci stymulatora, wykazuje wyzsza aktywnosc kwasotwórcza, wynoszaca w szóstym dniu fermentacji 9,42 g kwasu cytrynowego na 1 g grzybni, podczas gdy w próbach bez dodatku tego zwiazku wynosila 6,78 g. Wzrost aktywnosci wynosil wiec 28%. Fermentacja w obecnosci stymulatora odznaczala sie wysoka czystoscia, to znaczy w wyniku analizy chromatografii bibulowej nie stwierdzono innych kwasów poza cytrynowym.

Przyklad II. Przygotowano podloze mineralne o skladzie, opisanym w przykladzie I. Do badan uzyto szczep Aspergillus niger ZNU-170 o konidiach bezowych. Warunki hodowli, jak i dawka zieleni brylantowej byly takie same, jak w przykladzie I. Wyniki fermentacji zestawione sa w tabeli II.

Dzialanie zieleni brylantowej na szczep Aspergillus niger ZNU-170 bylo podobne jak na szczep Aspergillus niger B-64-5„ Proces fermentacyjny skrócony zostal o jedna dobe, wydajnosc kwasu cytrynowego ulegla wzrostowi z dotychczasowej 32,6% do 39,7%, czyli zwiekszyla sie o 7,1%. Jednoczesnie stwierdzono obnizenie produkcji biomasy z 1,87 do 1,26 g suchej substancji na 100 ml podloza, to znaczy o 33% przy jednoczesnym wzroscie aktywnosci grzybni o 1,41 g kwasu cytrynowego na 1 g suchej substancji grzybni, czyli o 70%. Kwasy uboczne w tym procesie nie wystepowaly.100 791 Tabela I Wplyw zieleni brylantowej, na produkcje kwasu cytrynowego i wzrost Aspergillus niger B-64-5, przy czym zielen brylantowa podano w mikrogramach na 1 mililitr podloza, kwasowosc w mililitrach 0,1 n NaOH na 2 mililitry podloza, sucha substancje grzybni w gramach na 100 mililitrów podloza, wydajnosc w procentach, liczona w gramach kwasu cytrynowego bezwodnego na 1 gram sacharozy, aktywnosc grzybni w procentach, liczona w gramach kwasu cytrynowego bezwodnego na 1 gram grzybni suchej substancji. _¦ Oznaczenie Kwasowosc Sucha substancja Wydajnosc Aktywnosc grzybni Zielen brylantowa 0 0,1 0 0,1 0 0,1 0 0,1 1 - - 0,08 0,08 - - - - 2 2 2 0,36 0,30 6,4 6,4 1,78 2,13 Dni fermentacji 3 4,5 ,6 0,65 0,52 14,4 18,0 2,22 3,46 4 ,2 12,1 0,79 0,63 32,6 39,0 4,13 6,19 ,9 17,8 0,80 0,67 50,9 57,0 6,36 8,50 6 17,6 ,2 0,83 0,69 56,3 65,0 6,78 9,42 7 18,4 ,0 0,83 0,66 58,9 64,0 7,09 9,70 Tabela II Wplyw zieleni brylantowej na produkcje kwasu cytrynowego i wzrost Aspergillus niger ZNU-170, przy czym zielen brylantowa podano w mikrogramach na 1 mililitr podloza, kwasowosc w mililitrach 0,1 n NaOH na 2 mililitry podloza, sucha substancje grzybni w gramach na 100 mililitrów podloza, wydajnosc w procentach, liczona w gra¬ mach kwasu cytrynowego bezwodnego na 1 gram sacharozy, aktywnosc grzybni w pro¬ centach, liczona w gramach kwasu cytrynowego bezwodnego na 1 gram grzybni suchej substancji.

Oznaczenie Kwasowosc Sucha substancja grzybni Wydajnosc Aktywnosc grzybni Zielen brylantowa 0 0,1 0 0,1 0 0,1 0 0,1 Dni fermentacji 3 3,8 4,2 1,24 0,84 12,02 13,4 0,98 1,59 6 ,2 12,4 1,87 1,26 32,6 39,7 1,74 3,15 7 11,1 12,4 1,84 1,21 ,5 39,7 1,93 3,28 Przyklad III. Do podloza o skladzie podanym, jak w przykladzie I, dodano po 1 i 4 dniu fermentacji zielen brylantowa w ilosci po 0,ljLig/l ml podloza. Po drugim dodaniu stezenie zwiazku wynosilo 0,2/ig. Warunki hodowli odnosnie skladu podloza i parametrów hodowli wstrzasanej byly analogiczne, jak w przykladzie I.

Proces fermentacyjny prowadzony byl ze szczepem Aspergillus niger B-64-5, w ciagu 6 dni.

W obecnosci dwukrotnie wprowadzonego stymulatora do hodowli, wydajnosc kwasu cytrynowego po 6 dniach wynosila 68%, podczas gdy bez jego dodatku po tym czasie wynosila 56,3% i dopiero po 7 dniach osiagnela wartosc 58,9%. Dwukrotne wprowadzenie stymulatora spowodowalo ponadto znaczny spadek wzrostu grzybni z 0,83 g suchej substancji w 100 ml podloza do 0,49 g suchej substancji/100 ml, czyli o 41%. Jednoczes¬ nie wzrosla jej aktywnosc kwasotwórcza, osiagajac w szóstym dniu procesu wartosc 13,9 g kwasu cytrynowe¬ go/l g suchej substancji grzybnio W procesie fermentacji bez stymulatora aktywnosc osiagnela w tym samym czasie wartosc 6,78 g kwasu cytrynowego na sucha substancje grzybni. Wzrost aktywnosci w tym przypadku wynosil 105%.

Przyklad IV. Przygotowano podloze melasowe o skladzie: melasa buraczana, rozcienczona woda wodociagowa do zawartosci 10% sacharozy, 0,003% KH2P04, 0,0008% ZnS04*7HaO, 0,08% K^Fe/CN/*, pH = 6,5. 150 ml podloza melasowego wlewano do 11 plaskodennych kolb, które szczepiono zawiesina konidiów Aspergillus niger B-64-5 po 7,5 godzinnej inkubacji i hodowano na wytrzasarce wahadlowej o amplitu¬ dzie 6 cm i 150 ruchów/l minute, w temperaturze 30°C w ciagu 6 dni. Po 48 godzinach hodowli do czesci kolb dodano zieleni brylantowej w ilosci 0,133jug/l ml podloza, pozostale próby bez dodatku stymulatora sluzyly jako hodowle kontrolne.4 100 791 Dodatek stymulatora do podloza melasowego zwiekszyl zdolnosci produkcyjne szczepu Aspergillus niger B-64-5. Wydajnosc kwasu cytrynowego wzrosla z 49,9% (hodowla kontrolna) do 51,2%, czyli o 1,3%. Wzrost biomasy natomiast obnizyl sie z 1,08 g suchej substancji/100 ml podloza (hodowla kontrolna) do 0,95 g suchej substancji/100 ml, czyli o 12%. Aktywnosc grzybni wzrosla z 4,62 jednostek do 5,8 czyli o 16%. Proces produkcji kwasu cytrynowego byl praktycznie zakonczony po szesciu dniach, podczas gdy bez dodatku stymulatora fermentacja trwala 7 dnu W jego obecnosci uzyskano takze wyzsza czystosc fermentacji, nie stwierdzono obecnosci kwasów towarzyszacych, podczas gdy w próbach bez dodatku stymulatora obecne byly slady kwasu szczawiowego, jablkowegoi glukonowego.

Przyklad V. W podlozu melasowym, o skladzie oraz warunkach, podanych w przykladzie IV, hodo¬ wano szczep Aspergillus niger ZNU-170 o bezowych konidiach. Zielen brylantowa dodano zostala analogicznie, jak w przykladzie IV, po 48 godzinach hodowli w ilosciach 0,133/ig/l ml podloza. Kolby, do których nie dodano stymulatora, sluzyly jako hodowle kontrolne. Proces produkcji kwasu cytrynowego prowadzono, jak w przykladzie IV i zakonczono po 6 dniach. Po zakonczeniu procesu stwierdzono, ze nastapil wzrost wydajnosci kwasu cytrynowego z 33,3% do 35,3% czyli o 2%. Zmniejszanie biomasy grzybni wynosilo z 1,28 g/100 ml do 1,13 g/100 ml podloza, natomiast aktywnosc grzybni wzrosla o 3,17 jednostek. Nie stwierdzono takze obecnosci kwasów towarzyszacych.

Przyklad VI. Wfermentorze o pojemnosci roboczej 2,51 wyposazonym w mieszadlo turbinowe i system napowietrzajacy w postaci belkotki, prowadzono hodowle szczepu Aspergillus niger B-64-5 na podlozu mineralnym o skladzie, jak w przykladzie I, utrzymujac stezenie tlenu na poziomie 60%. Podloze szczepiono 7,5 godzinna zawiesina kielkujacych konidiów. Po 18 godzinach hodowli do podloza dodawano zielen brylanto¬ wa w ilosci 0,1/ig/l ml podloza. Dla kontroli prowadzono identyczny cykl fermentacyjny bez dodatku stymulatora. Wyniki fermentacji zestawiono w tabeli DI. Zastosowanie stymulatora, jak wynika z tabeli III, w hodowli wfermentorze pozwolilo na zwiekszenie wydajnosci procesu z 49 do 53%, skrócenie czasu fermen¬ tacji do 1,5 doby, obnizenie produkcji biomasy z 0,97 g/100 ml do 0,83 g/100 ml podloza, czyli o 14% oraz zwiekszenie aktywnosci grzybni z 5,05 do 6,4 g kwasu cytrynowego/l g suchej substancji. Dzieki obnizeniu plonu biomasy grzybni ulegaja obnizeniu naklady energetyczne na mieszanie i napowietrzanie srodowiska fermentacyjnego. Optymalne warunki natleniania osiagane sa przy zredukowanej szybkosci obrotów mieszadla i zredukowanej ilosci doprowadzanego powietrza. Stosowane parametry napowietrzania i mieszania w prowa¬ dzonych fermentacjach w podlozu mineralnym dla szczepu B-64-5 w próbie bez i ze stymulatorem przedsta¬ wiono w tabeli III. Jak widac z tabeli III, zastosowanie zieleni brylantowej pozwolilo na obnizenie szybkosci obrotów mieszadla w glównej fazie fermentacji, czyli od 4-6 dnia o 100-150 obrotów/minute i zmniejszenie ilosci doprowadzanego powietrza o 0,1 l/objetosc robocza fermentora na 1 minute, poczawszy od trzeciego dnia fermentacji.

Tabela III Parametry napowietrzania i mieszania, stosowane w hodowli w feimentoize szczepu Aspergillus niger B-64-5, przy czym sucha substancje gnybni podano w gramach na 100 mililitrów podloza, szybkosc obrotów mieszadla w obrotach na minute, ilosc doprowadzanego powietrza w litrach na minute. ^powietizawlitrach na minute.

^^^"^" Doby fermentacji Oznaczenia 0 1 2 3 4 5 6 7 Sucha substancja próbabez - - 0,62 0,88 0,97 1,05 1,06 1,05 gizybni stymulatora próba ze stymulatorem - - 0,49 0,77 0,86 0,91 0,91 Szybkosc obrotów próba bez stymulatora 200 300 700 800 800 800 800 800 mieszadla próba ze stymulatorem 200 300 600 650 650 650 650 Ilosc doprowadzanego próbabez 0,6 1,0 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 powietrza stymulatora próba ze stymulatorem 0,6 1,0 1,1 1,1 1,1 1,1 1,1100 791 5

Claims (1)

1. Zastrzezenie patentowe Sposób intensyfikacji produkcji kwasu cytrynowego metoda fermentacyjna na podlozu fermentacyjnym mineralnym i melasowym, zaszczepionym kielkujacymi konidiami Aspergillus niger, znamienny tym, ze w fazie wzrostu grzybni dodaje sie do podloza fermentacyjnego zieleni brylantowej jako stymulatora, w ilosci 0,1—0,2jUg/l ml podloza, po czym po zakonczeniu fermentacji oddziela sie w znany sposób grzybnie od przefermentowanego podloza i wyodrebnia gotowy produkt,