NO973107L

NO973107L - Programmerte celledödgener og proteiner

Info

Publication number: NO973107L
Application number: NO973107A
Authority: NO
Inventors: Junying Yuan; Masayuki Miura
Original assignee: Gen Hospital Corp
Priority date: 1995-01-04
Filing date: 1997-07-03
Publication date: 1997-08-26
Also published as: FI972821A0; US6087160A; MX9705039A; NO973107D0; AU4747296A; CA2209526A1; JPH11500304A; US20030124105A1; EP0808169A4; IL116671A0; FI972821A; EP0808169A1; WO1996020721A1

Description

Foreliggende oppfinnelse er fra det faglige området molekylær biologi relatert til kontroll av programert celledød.

Celledød oppstår som et normalt aspekt i dyreutviklingen samt i vevshomeostasen og elding (Glucksmann, A., Biol. Ree. Cambridge Philos. Soc. 26:59-86 (1950)); Ellis et al, Dev. 112:591-603 (1991); Vaux et al, Cell 76:777-779 (1994)). Naturlig forekommende celledød regulerer celleantallet, letter morfogenesen, fjerner skadelige eller ellers unormale celler og eliminerer celler som allerede har utført deres funksjon. En slik regulert celledød blir oppnådd gjennom en endogen cellulær mekanisme med selvmord, betegnet programert celledød eller apoptosis (Wyllie, A.H. i Cell Death in Biology and Pathology, Bowen and Lockshin, eds. Chapman and Hall (1981), sider 9-34).

Programert celledød eller apoptosis oppstår når en celle aktiverer dette indre kodete selvmordsprogramet som et resultat av enten indre eller eksterne signaler. De morofologiske karaktertrekkene til apoptose innbefatter plasmamembranblæredannelse ("blebbing"), kondensasjon av nukleoplasma og cytoplasma og degradering av kromo-somalt DNA med inter-nukleosomale intervaller. (Wyllie, A.H. i Cell Death in Biology and Pathology, Bowen and Lockshin, eds., Chapman and Hall (1981), sidene 9-34). I mange tilfeller ser genekspresjon ut til å være nødvendig for programert celledød på grunn av at døden kan bli forhindret av inhibitorer av RNA eller proteinsyntese (Cohen et al, J. Immunol. 32:38-42 (1984); Stanisic et al, Invest. Uroi. 16:19-22 (1978); Martin et al, J. Cell Biol. 106:829-844 (1988)).

Genetisk kontroll av programert celledød er blitt gransket av arbeidet på programert celledød i nematoden C. elegans. Programert celledød er karakteristisk og omfattende i løpet av C. elegans utviklingen. Av 1090 somatiske celler dannet i løpet av utviklingen av hermafroditt gjennomgår 131 programert celledød. Når observert med Nomarski mikroskop følger de morfologiske forandringene til disse døende cellene en karakteristisk sekvens. (Sulston et al, Dev. Biol. 82:100-156 (1977); Sulston et al, Dev. Biol. 100:64-119(1983)).

Fjorten gener er blitt identifisert og disse virker i forskjellige trinn av den genetiske reaksjonsveien til programert celledød I C. elegans (Hedgecock et al, Science 220:1277-1280 (1983); Ellis et al, Cell 44:817-829 (1986); Ellis et al, Dev. 112:591-603 (1991); ellis et al, Genetics 112:591-603 (1991b); Hengartner et al, Nature 356:494-499 (1992); Ellis et al, Dev. 112:591-603 (1991)). To av disse genene, ced-3 og ced-4 spiller vesentlige roller ved enten initiering eller utøvelse av celledødprogrammet. Resissive mutasjoner i disse genene forhindrer nesten alle celledødsfall som normalt oppstår i løpet av C. elegans utviklingen.

ced-4 koder for et nytt protein som blir uttrykt primært iløpet av embryogenesen, perioden hvor de fleste programerte celledødsfallene oppstår (Yuan et al, Dev. 116:309-320 (1992)). 549 aminosyresekvensen til ced-4, utledet fra cDNA og genomiske kloner, inneholder to regioner som er lik den kalsium-binende domenen kjent som EF-hand (Kretsinger, 1987), men det er fortsatt ikke klarlagt om kalsium spiller en rolle når det gjelder å regulere ced-4 eller programert celledød i C. elegans.

En oppnåelse av funksjonmutasjon i ced-4 forhindrer normal programert celledød, mens mutasjoner som inaktiverer ced-9 er dødelige. Dette tyder på at ced-9 virker ved å undertrykke programerte celledødgener i celler som normalt ikke gjennomgår programert celledød (Hengartner, M. et al, Nature 356:494-499 (1992)). ced-9 genet koder for et proteinprodukt som har felles sekvenslikhet med pattedyr proto-onkogenet og celledødsupressor bcl-2 (Hengartner, M. et al, Cell 76:665-676 (1994)). Dødelig-heten til ced-9 tap av funksjonmutasjoner kan bli undertrykt ved mutasjoner i ced-3 og ced-4 som indikerer at ced-9 virker ved å undertrykke aktiviteten til ced-3 og ced-4.

Genetiske mosaikkanalyser indikerer at ced-3 og ced-4 sannsynligvis virker på en celle-autonom måte i døende celler og dette tyder på at de kan være cytotoksiske proteiner og/eller kontrollerer visse cytotoksiske proteiner i prosessen med programmert celledød (Yuan, J. et al, Dev. Bio. 138:33-41 (1990)).

Celledød oppstår også i pattedyr, nedd-2 er et musegen som blir fortrinnsvis uttrykt iløpet av tidlig embryonisk hjerneutvikling (Kumar et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. 185:115-1161 (1992)). På grunn av at mange neuroner dør iløpet av tidlig embryonisk hjerneutvikling er det mulig at nedd-2 er et celledødgen. nedd-2 mRNA blir nedregulert I voksen hjerne (Kumar et al, Biochem. & Biophys. Res. Comm. 185:1155-1161 (1992), Yuan et al, Cell 75:641-752 (1993)).

bcl-2

bcl-2 er et onkogen kjent for å inhibere programert celledød og å bli overuttrykt i mange follikulære og B-celle lymfomer. Overekspresjon av bcl-2 som et resultat av kromosomal translokasjon oppstår i 85 % av follikulære og 20 % diffuse B-celle

lymfomer, Fukuhara et al, Cancer Res. 39:3119 (1979); Levine et al, Blood 66:141

(1985); Yunis et al, N. Engl. J. Med. 316:79-84 (1987).

Overekspresjon av bcl-2 beskytter eller forsinker forløpet av apaptotisk celledød i forskjellige vertebralcelletyper samt i C. elegans (Vaux et al, Science 258:1955-1957

(1992); Nunez et al, J. Immun. 144:3602-3610 (1990); Vaux et al, Science 258:1955-1957 (1992); Sentman et al, Cell 67:879-888 (1992); Strasser et al, Cell 67:889-899

(1991)). Ekspresjon av bcl-2 i nematoden C. elegans er blitt vist å delvis forhindre programert celledød. bcl-2 er følgelig funksjonelt lik C. elegans ced-9 gen (Vaux et al, Science 258:1955-1957 (1992); Hengartner et al, Nature 356:494-499 (1992)).

Intertøukin-ip omdannende enzym

Interleukin 1 p omdannende enzym (ICE) er en substrat-spesifikk cysteinprotease som spalter inaktiv 31 KD prointerleukin-ip ved Aspl ^-Ala^ ^ ^, frigjør et karboksy-terminalt 153 aminosyrepeptid for produsere modent 17,5 kD interleukin-lp (IL-lp)

(Kostura et al, Proe. Nati. Acad. Sei., USA 86:5227-5231 (1989); Black et al, FEBS

Lett. 247:386-390 (1989); Cerretti et al, Science 256:97-100 (1992); Thomberry et al, Nature 356:768-774 (1992)): IL-ip er et cytokin involvert i mediering av et bredt spekter av biologiske responser inkludert betennelse, septisk sjokk, leging av sår, hematopoiese og vekst av visse leukemier (Dinarello, CA. Blood 77:1627-1652 (1991); diGiovine et al, Today 11:13 (1990)). En spesifikk inhibitor av ICE, crmA genproduktet til kukoppervirus, forhindrer den proteolytiske aktiveringen av IL-1 p (Ray et al, Cell 69:597-604 (1992)) og inhiberer vertsinflammatorisk respons (Ray et al, Cell 69:597-604 (1992)). Kukoppervirus som bærer et deletert crmA gen kan ikke undertrykke den inflammatoriske responsen til kyllingembryoer og resulterer i en reduksjon i antall virusinfiserte celler og fører til mindre skade på verten (Palumbo et al, Virology 171:262-273 (1989)). Denne observasjonen inkiderer viktigheten av ICE når det gjelder å tilveiebringe den inflammatoriske responsen.

Tumornekrosefaktor

Tumornekrosefaktor-a (TNF-a) er et pleiotrofisk tumoricidalt cytokin (Tracey, K.J. et al, Ann. Rev. Cell. Biol. 9:317-343 (1993)). En av de spesielle funksjonene til TNF-a er å indusere apoptose av transformerte celler. Når det gjelder ikke-transformerte celler kan TNF-a også indusere apoptose i nærvær av metabolske inhibitorer (Tracey, K.J. et al Ann. Rev. Cell. Biol. 9:317-343 (1993)). Apoptose indusert av TNF-a blir også undertrykket av bcl-2.

En av de mest omfattende studerte funksjonene til TNF-a er cytotoksisiteten på mange forskjellige tumorcellelinjer in vitro (Laster, S.M. et al, J. Immunol. 141:2629-2634

(1988)). Mekanismen for celledød indusert av TNF har derimot stor sett vært ukjent. HeLa celler uttrykker hovedsakelig p55 TNF reseptoren som antas å være ansvarlig for celledødsignalisering (Englemann, H. et al, J. Biol. Chem. 265:14497-14504 (1990); ThomaB. et al, J. Exp. Med. 172:1019-1023 (1990)).

HeLa celler blir lett drept av TNF-a i nærvær av metabolsk inhibitor cykloheksimid (CHX). Celledød indusert av TNF-a/CHX viser DNA fragmentering og cytolyse, som er vanlige trekk ved apoptose (White, E. et al. Mol. Cell. Biol. 12:2570-2580 (1992)). Ekspresjon av adenovirus E1B 19K proteinet, som er funksjonelt lik bcl-2, inhiberer apoptose indusert av TNF i HeLa celler (White, E. et al, Mol. Cell. Biol. 12:2570-2580

(1992)).

I foreliggende oppfinnelse er ced-3 genet blitt klonet og sekvensert og aminosyresekvensen til proteinet som blir kodet av dette genet er beskrevet. Strukturell analyse av ced-3 genet viste at det er likt enzymet interleukin 1P omdannende enzym ("ICE") og at overekspresjon av murint interleukin ip omdannende enzym ("mICE") forårsaker programert celledød i virveldyrceller. Basert på disse resultatene er det krevd en ny fremgangsmåte for kontrollering av programert celledød i virveldyr ved å regulere aktiviteten til ICE.

Aminosyresekvensen til ced-3 ble også funnet å være lik et annet murint protein, nedd-2 som blir detektert iløpet av den tidlige embryoniske hjerneutviklingen, en periode hvor mange celler dør. Resultatene tyder på at ced-3, ICE og nedd-2 er medlemmer av en genfamilie som virker slik at den forårsaker programert celledød.

Et nytt celledødgen, mIch-2 (murin Ice-ced-3 homolog), er blitt oppdaget og som ser ut til å være fra samme familie som ced-3, ICE og nedd-2. mIch-2 kan skjeldnes fra andre tidligere identifiserte celledødgener ved at det blir fortrinnsvis uttrykt i thymus og morkaken til vertebrater. Oppfinnelsen er følgelig også rettet mot et nylig oppdaget gen, mIch-2, som blir fortrinnsvis uttrykt i thymus og morkaken og som koder for et protein som forårsaker programert celledød. Foreliggende oppfinnelse er følgelig rettet mot både mIch-2 gensekvensen og proteinet kodet av mIch-2. Også omfattet er vektorer som uttrykker mIch-2 og vertceller tranformerte med slike vektorer. Oppfinnelsen omfatter også en fremgangsmåte for regulering av celledød ved uttrykking av mIch-2.

En sammenligning av nukleotidsekvensene til ced-3, mICE, human ICE ("hICE"), nedd-2 og mIch-2 indikerer at de er medlemmer av en genfamilie som fremmer programert celledød. Identifikasjon av denne familien letter isolering av det nylig oppdagede celledødgenet Ice-ced 3 homolog-1 (Ich-1).

Ich-1 er homologt med andre celledødgener beskrevet ovenfor og spesielt nedd-2.

Basert på dets struktur og tilstedeværelse av DNA kodende for QACRG sekvensen karakteristisk for det aktive sentret til celledødgenene ble Ich-1 identifisert som et nytt medlem av ced-3/ICE familien. Foreliggende oppfinnelse er følgelig rettet mot både Ich-1 gensekvensen og proteinet kodet av Ich-1. Også omfattet er vektorer som

uttrykker Ich-1 og vertceller transformert med slike vektorer. Alternative spleise-resulterer i to forskjellige Ich-1 mRNA arter. Oppfinnelsen omfatter følgelig også disse artene, proteiner produsert fra disse, vektorer inneholdende og som uttrykker genene, og anvendelsene beskrevet heri.

Oppfinnerene har også identifisert et annet medlem av ICE/ced-3 familien, Ich-3. Ich-3 har minst to alternative spleiseprodukter. Et full lengde cDNA av et av disse fra et musethymus cDNA bibliotek er blitt identifisert. Det koder for et protein med 418 aminosyrer som er 38 % identisk med mICE, 42 % identisk med mIch-2, 25 % med Ich-1 og 24 % identisk med C. elegans ced-3.

Oppfinnelsen er følgelig rettet mot genomiske eller cDNA nukleinsyrer som har genetiske sekvenser som koder for ced-3, mIch-2, Ich-1 og Ich-3. Oppfinnelsen tilveiebringer også vektorer og ekspresjonsvektorer inneholdende slike genetiske sekvenser, vertceller transformerte med slike vektorer og ekspresjonsvektorer, rekombinant nukleinsyre eller proteiner dannet i slike vert/vektorsystemer og funksjonelle derivater av disse rekombinante nukleinsyrene eller proteinene. Anvendelse av isolerte gener eller proteiner for det formålet å regulere, og spesielt fremme celledød er også en del av oppfinnelsen.

Oppfinnelsen er også rettet mot en fremgangsmåte for kontrollering av programert død av virveldyrceller ved regulering av aktiviteten til interleukin 1 p omdannende enzym.

En slik regulering kan inhibere den enzymatiske aktiviteten, f.eks gjennom anvendelse av spesifikke antiproteaser så som crmA, for å forhindre celledød. På denne måten kan det være mulig å utvikle cellelinjer som forblir levedyktig i kultur i en utvidet tidsperiode eller i det uendelige. Visse celler kan bare bli opprettholdt i kultur dersom de blir dyrket i nærvær av vekstfaktorer. Ved blokkerende celledød kan det være mulig å danne slike cellevekstfaktorer uavhengig. Alternativt kan ICE aktiviteten bli øket for å fremme celledød. En slik øket aktivitet kan bli anvendt i cancerceller for å antagonisere defekten av onkogener så som bcl-2.

Foreliggende oppfinnelse er også basert på oppdagelsen av at TNF-a aktiverer endogen ICE aktivitet i HeLa celler og TNF-a indusert apoptose blir undertrykket av crmA, som kan spesifikt inhibere ICE-mediert celledød. Visse utførelsesformer ifølge oppfinnelsen er følgelig basert på aktivering av ICE/ced-3-mediert celledødreaksjonsvei til TNF-a.

Beskrivelse av figurene

Figur 1 og IA:

Genetiske og fysiske kart ti ced-3 regionen på kromosom IV

Figur 1 viser det genetiske kartet til C. elegans i regionen nær ced-3 hvor cosmidklonene representerer denne regionen er angitt under kartet. nP33, nP34, nP35, nP36 og nP37 er restriksjonsfragment lengdepolymorfismer (RFLP) mellom Bristol og Bergerac vill type C. elegans stammene. C43C9, W07H6 og C48D1 er de tre cosmidklonene testet for oppnåelse av ced fenotypen til ced-3 (n717) dyr. Evnen som hvert cosmidklon har til å oppfange ced-3 mutanter og fraksjonen av uavhengig oppnådde transgene linjer som ble oppfanget er indikert til høyre på figuren (+, oppfanget; -, ingen oppfanging; se tekst for data). Resultatene indikerer at ced-3 er innbefattet i cosmid C48D1.

Fogir IA er et restriksjonskart av C48D1 subklonene. C48D1 ble spaltet med BamHI og selv-ligert for å danne subklon C48D1-28. C48D1-43, pJ40 og pJ107 ble dannet ved delvis spaltning av C48D1-28 med Bglll. pJ7,5 og pJ7,4 ble dannet ved ExoIII delesjon av pJ107. Disse subklonene ble analysert for oppfanging av ced fenotypen til ced-3(n717) dyr (+, oppfanging; -, ingen oppfanging, -/+, svak oppfanging). Antallene i parantesene indikerer fraksjonen av uavhengig oppnådde transgene linjer som ble oppfanget. Det minste fragmentet som fullstendig oppfanger ced-3 mutant fenotype var 7,5 kg pJ7,5 subklonet.

Figur 2,2A(i),-2A(v), 2B og 2C:

Genomisk organisering, nukleotidsekvens og avledet aminosyresekvens til ced-3 Figur 2 viser den genomiske sekvensen til ced-3 regionen oppnådd fra plasmid pJ107. Den avledete aminosyresekvensen til ced-3 er basert på DNA sekvensen til ced-3 cDAN pJ87 og på andre eksperimenter beskrevet i teksten og i eksperimentelle prosedyrer. 5' enden til pJ87 inneholder 25 bp av poly-A/T-sekvensen (ikke vist), som sannsynligvis skyldes kloningen på grunn av at den ikke er tilstede i den genomiske sekvensen. Det sannsynlige stansetet til translasjonen er merket med en pil. SLI spleiseakseptorsetet til ced-3 transkriptet er satt i boks. Posisjonene til 12 ced-3 mutasjonene er vist. Gjentatte elementer er indikert som piler over de relevante sekvensene. Nummerene til venstre indikerer nukleotidposisjoner, begynnende med start av pJ107. Nummerene under aminosyresekvensen indikerer kodonposisjonene. Fem typer med ufullstendige gjentakelser ble funnet: gjentakelse 1, også funnet I fem-1 (Spence et al, Cell 60:981-990 (1990)) og hlh-1 (Krause et al, Cell 63:907-919 (1990)); gjentakelse 2, ny, gjentakelse 3, også tilstede i lin-12 og feml, gjentakelse 4, også tilstede i lin-12; og gjentakelse 5, ny. Nummerene på sidene av figuren indikerer nukleotidposisjoner, begynnende med start til pJ107. Nummerene under aminosyresekvensen indikerer kodonposisjonene. Figur 2A(i) - figur 2A(iv) inneholder sammenligninger av de gjentatte elementene i ced-3 med de gjentatte elementene i genene ced-3, fem-1 hlh-1, lin-12, glp-1 og kosmidene B0303 og ZK643 (se tekst for referanser). Når det gjelder inverterte gjentakelser, ble hver arm til gjentakelsen ("for" eller "rev" for "forover" eller "bakover") ble sammenlignet med begge dets partnere og med individuelle armer til de andre gjentakelsene. 2A(i): gjentakelse 1; 2A(ii): gentakelse 2; 2A(iii): gjentakelse 3; 2A(iv): gentakelse 4, og 2A(v): gjentakelse 5. De forskjellige ced-3 sekvenser som fremkommer av sammen-ligningene er forskjellige gjentakelser av det samme gjentatte elementet. Nummerene !ia!, !Ib" osv er forskjellige gjentakelser av den samme klassen av gjentatt element. Figur 2B viser beliggenhetene til intronene (liner) og eksoner (åpne bokser) og ced-3 genet samt posisjonene til 12 ced-3 mutasjonene som er blitt analysert. Den serinrike regionen, trans-spleiset leder (SLI), mulig start på translasjonen (ATG) og poly-adenylering (AAA) sete er også indikert. Figur 2C viser cDNA sekvensen og den avledete aminosyresekvensen til ced-3 oppnådd fra plasmid pJ87.

Figur 3 og 3A:

Sammenligning av strukturen til ced-3 proteinet og hICE proteinet

Figur 3 viser en sammenligning av de strukturelle trekkene til ced-3 med de til hICE genet. De antatte proteinene som tilsvarer hICE proenzymet og ced-3 er representert. Det aktive setet i hICE og det antatte aktive setet i ced-3 er indikert med svarte rektangler. De fire kjente spaltningssetene i hICE som flankerer de prosesserte hICE subenhetene (p24, som ble detektert i lave mengder når hICE var renset (Thornberry et al, (1992), p20 og plO) og to konserverte antatte spaltningsseter i ced-3 er vist med heltrukne linjer og koblede med stiplede linjer. Fem andre potensielle spaltningsseter i ced-3 er vist med skråstreker. Posisjonene til aspartat (D) residiene ved potensielle spaltningsseter er vist nedenfor hvert diagram. Figur 3A inneholder en sammenligning av aminosyresekvensene til ced-3 fra C. elegans, C. briggsae og C. vulgaris med hICE, mICE og muse nedd-2. Aminosyrene er nummerert til høyre for hvert protein. Skråstreken indikerer gap i sekvensen dannet for å muliggjøre optimal sammenstilling. Residiene som er konservert blant mer enn halv-parten av proteinene er satt i boks. Missense ced-3 mutasjoner er indikert over sammen-ligningsblokkene som viser residiet i mutant ced-3 og det allele navnet. Stjerner indikerer potensielle aspartat spaltningsseter i ced-3. Sirklene indikerer kjente aspartat selv-spaltningsseter i hICE. Residier indikert uthevet tilsvarer høyt konserverte pentapeptid inneholdende aktivt cystein.

Figur 4:

Konstruksjon av ekspresjonskassettene til mICE-IacZ og ced-3-lacZ fusjonsgener

Figur 4 viser flere ekspresjonskassetter anvendt for studering av de cellulære effektene av ICE og ced-3 ekspresjonen. Kassettene er som følger: pPactMlOZ inneholder intakt mICE koblet til E. coli lacZ genet (mICE-lacZ). pPactMl 1Z inneholder p20 og plO subenhetene til mICE fusjonert til E. coli lacZ genet (P20/P10-lacZ). ppactM19Z inneholder P20 subenheten til mICE koblet til E. coli lacZ genet (P20-lacZ). pP actM12Z inneholder PlO subenheten til mICE koblet til E. coli lacZ genet (PlO-lacZ), p Pactced38Z inneholder C. eleganse ced-3 genet koblet til lacZ genet (ced-3-lacZ). pJ485 og pPacteced37Z inneholder en Gly til Ser mutasjon ved det aktive domenpeptidet

"QACRG" I mICE og ced-3 respektivt. pPactM17Z inneholder en Cys til Gly mutasjon ved det aktive domen pentapeptidet "QACRG" i mICE. pactPgal' er et kontrollplasmid

(Maekawa et al, Oncogene 6:627-632 (1991)). Alle plasmidene anvender actinpromoteren.

Figur 5:

Genetiske reaksjonsveier til programert celledød I Nematode C elegans og i virveldyr.

I virveldyr blokkerer bcl-2 aktiviteten til ICE for derved å forhindre programert

celledød. Enzymatisk aktivi ICE forårsaker virveldyr celledød. I C. elegans blokkerer ced-9 virkningen til ced-3/ced-4. Aktiv ced-3 sammen med aktiv ced-4 forårsaker celledød.

Figur 6:

mIch-2 cDNA sekvensen og avledet aminosyresekvens.

Figur 6 viser nukleotidsekvensen til mIch-2 cDNA sekvensen og aminosyresekvensen avledet derfra.

Figur 7 og 7A:

mIch-2 aminosyresekvensen

Figurene 7 og 7A inneholder en sammenligning av aminosyresekvensene til mICE, hICE, mIch-2 og ced-3.

Figur 8:

Potensiell QACRG kodende region i muse nedd2 cDNA

Leserammen foreslått av Kumar et al (Biochem. & Biophys. Res. Comm. 185:1155-1161 (1992)) er b. I leseramme a er en potensiell QACRG kodende region streket under.

Figur 9 og 9A:

Sammenligning av aminosyresekvensene til ced-3, hICE og Ich-1

Figur 9 inneholder en sammenligning av aminosyresekvensene til ced-3 og Ich-1. Det er en 52 % likhet mellom sekvensene og en 28 % identitet. Figur 9A inneholder en sammenligning av aminosyresekvensene til hICE og Ich-1. Det er en 52 % likhet mellom sekvensene og en 27 % identitet.

Figur 10A:

cDNA sekvensen til Ich-1^og den avledete aminosyresekvensen til Ich-lj^ proteinproduktet.

Antatt aktiv domene er streket under.

Figur 10B:

cDNA sekvensen til Ich-1 § og den avledete aminosyresekvensen til Ich-ljj proteinproduktet.

Intronsekvensen er streket under.

Figur 11A:

Alternativ spleising av Ich-1 mRNA

Eksonene er vist i kolonner. Intron er vist i en linje. Nukleotidene ved ekson-intron grensene er vist.

Figur 1 IB

Skjematisk diagram av to alternative spleisede Ich-1 transkripter og Ich-lL og Ich-lg proteiner.

Peptidet merket med X kan ikke bli translatert in vivo. De åpne leserammene og proteinene er vist i kolonner. Utranslaterte regioner og introner er vist i linjer. Posisjonene til Ich-1 § og Ich-1 l stoppkodonene er vist på transkriptdiagrammet som "stop". Aminosyresekvensene i Ich-1 § som er forskjellige fra Ich-lL er skraverte.

Figur 12A:

En sammenligning av Ich-1 proteinsekvensen med muse nedd-2 protein, hICE protein, mICE protein og C. elegans ced-3 protein.

Aminosyrene er nummerert til høyre for hver sekvens. En hvilken som helst residie i nedd-2, hICE, mICE og ced-3 som er identisk med Ich-1 er uthevet. To punkt-mutasjoner dannet ved seterettet mutagense er merket øverst på sekvensen.

Figur 12B:

En skjematisk sammenligning av de strukturelle trekkene til Ich-lL°S MCE.

Det aktive setet til hICE og det antatte aktive setet til Ich-lL er vist. Fire kjente spaltningsseter til hICE og potensielle spaltningsseter til Ich-lL er merket.

Figur 13:

Stabil ekspresjon av Ich-1§forhindret celledød og rotte-1 celler indusert ved serumfjerning.

Stabile transfektanter til rotte-1 celler som uttrykker bcl-1, crmA eller Ich-1§ble sammenlignet som beskrevet i eksperimentelle prosedyrer. Uavhengig Ich-1 §-positive og Ich-1 s-negative kloner ble anvendt. Ved tid 0 ble eksponensielt voksende celler vasket med serumfritt DMEM og døde celler ble telt over tid ved trypanblåfarving.

Figur 14:

cDNA sekvens og antatt Ich-3 proteinsekvens

Antatt første Met er merket med en prikk.

Figur 15: Sammenligning av aminosyresekvensene til Ich-3 med hICE, mIch-2, Ich-1

og ced-3.

Figur 16:

Suppresjon av TNF-indusert cytotoksisitet ved overekspresjon av CrmA

Resultatene er fra tre separate eksperimenter ved hver tilstand utført dobbelt.

Definisjoner

Nedenfor ble et antall betegnelser anvendt i rekombinant DNA (rDNA) teknologi eller i forskningsområder for programert celledød og disse blir anvendt i stor grad. For å tilveiebringe en klar og ensartet forståelse i beskrivelsen og kravene, inkludert rammen som blir gitt til slike angivelser, blir følgende definisjoner gitt.

Gen. En DNA sekvens inneholdende et templat for en RNA polymerase. RNA transkribert fra et gen kan eller behøver ikke å kode for et protein. RNA som koder for et protein blir betegnet messenger RNA (mRNA). Et gen kan derimot også omfatte ikke-transkriberte regulatoriske sekvenser inkludert, men ikke begrenset til, slike sekvenser som enhancere, promotere og poly-A addisjonssekvenser.

Et "komplementært DNA" eller "cDNA" gen innbefatter rekombinante gener syntetisert ved revers transkripsjon av mRNA og hvor intervenerende sekvenser (introner) er blitt fjernet. cDNA kan derimot også innbefatte en hvilken som helst komplementær del av en hvilken som helst gensekvens. Komplementet kan f.eks bli syntetisert, og behøver ikke å ekskludere DNA sekvensen som ikke er tilstede i naturlig forekommende mRNA.

Kloningsvektor. Et plasmid eller fag DNA eller annen DNA sekvens som har evne til å replikere autonomt i en vertcelle, og som erkarakterisert vedett eller et lite antall endo-nukleasegjenkjenningsseter hvor slike DNA sekvenser kan bli spaltet på en bestemt måte uten tap av en essensiell biologisk funskjon til bæreren, og hvori DNA kan bli spleiset for å tilveiebringe replikasjon og kloning. Kloningsvektoren kan videre inneholde en markør egnet for anvendelse for identifikasjon av cellene transformert med kloningsbæreren. Markører, f.eks, er tetracyklinresistens eller ampicillinresistens. Betegnelsen "kloningsbærer" blir noen ganger anvendt for "kloningsvektor".

Ekspresjonsvektor. En vektor som ligner en kloningsvektor med som har evne til å uttrykke et gen som har blitt klonet deri, etter transformering inn i en vert. Det klonede genet blir vanligvis plassert under kontroll (dvs operabelt koblet til) visse kontrollsekvenser så som promotersekvenser. Kontrollsekvenser vil variere avhengig av om vektoren er konstruert for å uttrykke det operabelt koblede genet i en prokaryot eller eukaryot vert og kan i tillegg inneholde transkripsjonelle elementer så som enhancer-elementer termineringssekvenser, vev-spesifisitetselementer og/eller translasjons-indikasjon og termineringsseter.

Programert celledød. Prosessen hvor celledød er genetisk programert. Programert celledød muliggjør at organismene eliminerer celler som har virket med et utviklings-messig formål, men som ikke lenger er fordelaktig.

Funksjonelt derivat. Et "funksjonelt derivat" til mIch-2, Ich-1 (Ich-lL°8Ich-1 s) eller Ich-3 er et protein, eller DNA kodende for et protein, som har en biologisk aktivitet som er vesentlig lik den biologiske aktiviteten til den ikke-rekombinante. Et funksjonelt derivat kan inneholde post-translasjonelle modifikasjoner så som kovalentlig koblet karbohydrat, avhengig av nødvendigheten av slike modifikasjoner for utførelse av en spesifikk funksjon. Betegnelsen "funksjonelt derivat" skal innbefatte "fragmenter", "varianter", "analoger" eller "kjemiske derivater av et molekyl". Derivatet beholder minst en av de naturlig forekommende funksjonene til opphavsgenet eller proteinet. Funksjonen kan være en hvilken som helst av regulatoriske genfunksjoner eller hvilke som helst av funksjonene til det endelige prosesserte proteinet. Aktivitetsgraden til funksjonen behøver ikke å være kvantitativ identisk dersom den kvalitative funksjonen er vesentlig lik.

Fragment. Et "fragment" refererer til en vhilken som helst subgenetisk sekvens av molekylet, så som peptidkjemen eller en variant av peptidkjernen.

Foreliggende oppfinnelse vedrører isolert DNA kodende for ced-3 til C. elegans, mlch-2, Ich-1 og Ich-3. Oppfinnelsen omfatter også nukleinsyrer som har cDNA sekvensen til ced-3, mIch-2, Ich-1 og Ich-3. Oppfinnelsen omfatter også relaterte sekvenser i andre arter som kan bli isolert uten omfattende eksperimentering. Trivielle variasjoner i de krevde sekvensene og fragmentene avledet fra full-lengde genomisk og cDNA gener er omfattet av oppfinnelsen. Oppfinnelsen omfatter også proteinsekvenser som blir kodet av ced-3, mIch-2, Ich-1 og Ich-3. Det er å bemerke at Ich-1 omfatter både Ich-1§og Ich-lL-

ced-3

Den genomiske sekvensen til det krevde genet kodende for ved-3 er vist i figur 2. Genet inneholder 7.656 basepar og inneholder 7 introner varierende i størrelser fra 54 basepar til 1.195 basepar. De fire største intronene samt sekvensene 5' for startkodonet inneholder gjentatte elementer hvor noen er tidligere blittkarakteriserti ikke-kodende regioner til andre C. elegans gener så som fem-1 (Spence et al, Cell 60:981-990 (1990)) og hlh-I (Krause et al, Cell 63:907-919 (1990)). En sammenligning av de gjentatte elementene i ced-3 med tidligere karakteriserte gjentatte elementer er vist i figurene 2A(i) - 2A(v). START kodonet til ced-3 er metionin i posisjon 2232 av den genomiske sekvensen vist i figur 2.

cDNA sekvensen til ced-3 vist i figur 2C. cDNA er 2.482 basepar i lengde med en åpen leseramme kodende for 503 aminosyrer og 493 basepar til 3' utranslatert sekvens. De siste 380 baseparene til 3' sekvensen er ikke vesentlig for ekspresjon av ced-3.

I tillegg til å omfatte genomiske og cDNA sekvenser til ced-3 fra C. elegans omfatter foreliggende oppfinnelse også relaterte sekvenser i andre nematodearter som kan bli isolert uten unødig eksperimentering. Oppfinnerene har f.eks vist at ced-3 genene fra C. briggsae og C. vulgaris kan bli isolert ved anvendelse av ced-3 cDNA fra C. elegans som en probe (se eksempel 1).

Oppfinnelsen omfatter også proteinprodukter fra ced-3 genet, genvarianter, derivater og relaterte sekvenser. Som uledet fra DNA sekvensen er ced-3 503 aminosyrer i lengde og inneholder en serin-rik midtregion på omtrent 100 aminosyrer. Aminosyresekvensen omfattende den krevde ced-3 er vist i figur 2 og figur 2C. En sammenligning av ced-3 til C. elegans med angitte ced-3 sekvenser fra de relaterte nematodeartene C. briggsae og C. vulgaris indikerer at den ikke-serin-rike regionen er betydelig konservert og at den serin-rike regionen er mere variabel. Den ikke-serin-rike delen av ced-3 er også homolog med hICE. De C-terminale delene av både ced-3 og hICE ligner muse nedd-2. Resultatene tyder på at ced-3 virker som en cysteinprotease når det gjelder å kontrollere begynnelsen av programert celledød i C. elegans og at medlemmer av ced-3/ICE/nedd-2 genfamilien virker i programert celledød i mange forskjellige arter.

mIch-2

cDNA sekvensen og avledet aminosyresekvens til mIch-2 er vist i fiugur 6. mIch-2 viser som ventet homologi med både hICE og mICE samt C. elegans ced-3 (se figur 7 og 7A). I kontrast til andre celledødgener som er blitt identifisert blir mIch-2 fortrinnsvis uttrykt i thymus og morkake. Eksempel 3 beskriver hvordan genet ble oppnådd ved screening av et musethymus cDNA bibliotek med en DNA probe avledet fra hICE under betingelser med lav stringens. Aminosyresekvensen og cDNA sekvensen vist i figur 6 er gitt og foretrukne fremgangsmåter for oppnåelse av mIsh-2 genet (enten genomisk eller cDNA) er beskrevet nedenfor.

Ich-1

nedd2, hICE, mIch-2 og ced-3 er alle medlemmer av den samme genfamilien. Dette tyder på at nye gener kan bli isolert basert på deres homologi med identifiserte familiemedlemmer.

Ich-1 er en 1456 basepar i lengde og inneholder en åpen leseramme med 435 aminosyre (figur 10A). C-terminal 130 aminosyrer til Ich-1 er over 87 % identiske med muse nedd2. Ich-1 inneholder en mye lengre åpen leseramme og har pentapeptid QACRG

som er det aktive sentret til proteinene fra ced-3/ICE familien. Resultatene indikerer at cDNA isolert av Kumar et al kanskje ikke er blitt syntetisert fra et fullstendig prosessert mRNA og at 5' 1147 baseparene som Kumar et al rapporterte for nedd2 cDNA kan representere sekvensen til et intron. Sekvensen rapportert av Kumar et al inneholder en region som potensielt kan kode for QACRG men disse aminosyrene blir kodet for i en annen leseramme enn den som er indikert av Kumar et al (figur 8). Dette tyder på at Kumar har gjort en feil ved kloningen.

De kodende regionene til nedd2 og Ich-lL er meget homologe. Aminosyresekvensen til avledet Ich-lL protein har 28 % identitet med ced-3 og 27 % identitet med hICE (figurene 9, 9A).

Ich-1 mRNA blir alternativt spleiset i to forskjellige former. En mRNA art kodet for et proteinprodukt med 435 aminosyrer, betegnet Ich-lL,som inneholder aminosyre-sekvenshomologi med både P20 og PlO subenhetene til hICE samt hele ced-3 (28 % identitet). Det andre mRNA koder for en 312 aminosyreforkortet versjon av Ich-1, betegnet Ich-lg, som terminerer 21 aminosyreresidier etter QACRG aktive domenen til Ich-1. Ekspresjon av Ich-lL°8Ich-1S har motsatte effekter på celledød. Overekspresjon av Ich-lL induserer rotte-1 fibroblastceller til å dø i kultur, mens overekspresjon av Ich-1§undertrykker Rat-1 celledød indusert ved serumdeprivasjon. Resultatene heri tyder på at Ich-1 kan spille en viktig rolle i både positiv og negativ regulering av programert celledød i vertebrate dyr.

Ich-3

Ich-3 ble identifisert basert på dets sekvenshomologi med hICE og andre isolerte ICE homologer. På grunn av at Ich-3 klonen isolert ved PCR bare inneholder den kodende regionen for den C-terminale halvdelen av Ich-3 ble et musethymus cDNA bibliotek screenet ved anvendelse av Ich-3 innskuddet. Blant 2 millioner kloner som er blitt screenet ble 9 positive kloner isolert. Sekvensen heri er fra en klon som inneholder den fullstendig kodende regionen for Ich-3 genet.

Fremgangsmåter for fremstilling

ced-3

Det er mange standardprosedyrer for kloning av gener som er velkjente innenfor fagområdet og som kan bli anvendt for å oppnå ced-3 genet (se f.eks Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2nd edition, vol 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), I eksempel 1 er det gitt en detaljert beskrivelse på t foretrukne prosedyrer. Den første foretrukne prosedyren krever ikke tilgjengeligheten av ced-3 gensekvensinformasjon og er basert på en fremgangsmåte beskrevet av Ruvkun et al (Molekular Genetics of Caenorhabditis Elegans Heterochromic Gene lin-14 121:501-516 (1988)). Bristol og Bergerac stammene til nematoden blir krysset og restriksjons-fragmentlengde polymorfismekarlegging blir utført på DNA fra resulterende innavlet stamme. Restriksjonsfragmenter nært koblet til ced-3 er identifisert og deretter anvendt som prober for å screene kosmidbibliotek for kosmider som inneholder hele eller en del av ced-3 genet. Positive kosmider blir injisert inn i en nematodestamme hvori ced-3 er blitt mutert. Kosmider inneholdende aktive ced-3 gener blir identifisert ved deres evne til å oppfange ced-3 mutant fenotype.

En annen metode for kloning av ced-3 gener bygger på sekvensinformasjon som er blitt beskrevet heri. DNA prober blir konstruert basert på sekvensen til ced-3 genet til C. elegans. Disse probene blir merket og anvendt for å screene DNA bibliotek fra nematoder eller andre arter. Prosedyrer for å utføre slik kloning og screening er beskrevet mere fullstendig nedenfor i sammenheng med kloning og ekspresjon av mlch-2, Ich-1 og Ich-3, og er velkjent innenfor fagområdet (se f.eks Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2nd edition (1988)). Når hybridiseringene blir utført under betingelser med høy stringens blir gener identifisert som inneholder sekvenser tilsvarende nøyaktig den til proben. På denne måten kan den nøyaktig samme sekvensen som beskrevet av oppfinnerene heri bli oppnådd. Alternativt kan hybridiseringene bli utført under betingelser med lav stringens for å identifisere gener i andre arter som er homologe med ced-3, men som inneholder strukturelle variasjoner (se eksempel 1 for en beskrivelse på hvordan slike hybridiseringer kan bli anvendt for å oppnå ced-3 gener fra C. briggsae og C. vulgaris).

Resultatene i eksempel 2 demonstrerer at produktene av celledødgener kan bli tolerert

av celler forutsatt at de blir uttrykt i lave nivåer.

Derfor kan ced-3 bli oppnådd ved inkorporering av ced-3 DNA beskrevet ovenfor inn i hvilke som helst av et antall ekspresjonsvektorer som er velkjente innenfor fagområdet og overføring av disse vektorene inn i hensiktsmessige verter (se Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, vol. 3 (1988)). Som beskrevet nedenfor i sammenheng med ekspresjon av mIch-2, Ich-1 og Ich-3 kan ekspresjonssystemer bli anvendt hvor celler blir dyrket under betingelser hvor et rekombinant gen ikke blir uttrykt, og etter at celler når en ønsket tetthet, kan ekpsresjon bli indusert. På denne måten kan tendensen som celler har til å uttrykke ced-3 til å dø bli omgått.

mIch-2, Ich-1 og Ich-3

DNA kodende for mIch-2, Ich-1 og Ich-3 kan bli oppnådd fra enten genomiske DNA eller fra cDNA. Genomisk DNA kan innbefatte naturlig forekommende introner. Slikt genomisk DNA kan bli oppnådd i assosiasjon med 5' promotorregionen til sekvenser og/eller med 3' transkripsjonen termineringsregion. Slik genomisk DNA kan bli oppnådd i assosiasjon med de genetiske sekvensene som koder for 5' ikke-translatert region til mIch-2, Ich-1 og Ich-3 og Ich-3 mRNA og/eller med genetiske sekvenser som koder for 3' ikke-translatert region. I den grad en vertcelle kan gjenkjenne transkripsjonen og/eller translasjonelle regulatoriske signaler assosiert med ekspresjon av mRNA og protein kan 5' og/eller 3' ikke-transkriberte regioner av det native genet, og/eller 5' og/eller 3' ikke-translaterte regioner av mRNA bli oppnådd og anvendt for transkripsjonen og translasjonen regulering.

Genomisk DNA kan bli ekstrahert og renset fra en hvilken som helst celle inneholdende musekromosomer ved hjelp av velkjente metoder (f.eks se Guide to Molecular Cloning Techniques, S.L. Berger et al, eds. Academic Press (1987)). Alternativt kan mRNA bli isolert fra en hvilken som helst celle som uttrykker genene, og anvendt for å produsere cDNA ved hjelp av velkjente metoder (Id). Foretrukne kilder for mIch-2 er thymus eller morkakeceller. mRNA kodende for hvilken som helst av proteinene kan bli anriket ved teknikker som vanligvis blir anvendt for å anrike mRNA preparater for spesifikke sekvenser, så som sukrosegradientsentrifugering, eller begge.

For kloning inn i en vektor blir DNA dannet som beskrevet ovenfor (enten humant genomisk DNA eller fortrinnsvis cDNA) blir tilfeldig spaltet eller enzymatisk spaltet,

og ligert inn i hensiktsmessige vektorer for å danne et rekombinant genbibliotek. En DNA sekvens kodende for proteinet eller dets funksjonelle derivater kan bli skutt inn i DNA vektoren i henhold til konvensjonelle teknikker. Teknikker for slike mani-puleringer er beskrevet i Sambrook et al, supra, og er velkjente innenfor fagområdet.

I en foretrukket metode blir oligonukleotidprober spesifikke for genet konstruert fra cDNA sekvensene vist I figurene 6,10A, 10B og 14. Oligonukleotidet kan bli syntetisert ved hjelp av velkjente metoder (se f.eks Synthesis and Application of DNA and RNA, S.A. Narang, ed. Academic Press, San Diego, CA (1987)) som en probe for å identifisere og isolere det klonede genet ved teknikker som er velkjente. Teknikker for nukleinsyrehybridisering og klonidentifikasjon er beskrevet av Maniatis, T et al (I: Molekular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY (1982)) og av Hames, B.D. (I: Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press Washington, DC (1985)). Medlemmer av ovennevnte genbibliotek som er blitt funnet til å ha evne til en slik hybridisering blir deretter analysert for å bestemme grad og naturen til de kodende sekvensene som de inneholder. For å lette deteksjon av ønsket kodende sekvens blir ovennevnte DNA probe merket med en detekterbar gruppe. Denne gruppen kan være et hvilket som helst materiale som har en detekterbar fysisk eller kjemisk egenskap. Slike materialer er velkjente innenfor fagområdet for nukleinsyrehybridisering og en hvilken som helst markør nyttig i slike metoder kan bli anvendt i foreliggende oppfinnelse. Spesielt nyttige er radioaktive markører, så som 32P, 3H, 14C, 35S, 125IP eller lignende. En hvilken som helst radioaktiv markør kan bli anvendt som tilveiebringer et tilstrekkelig signal og har en tilstrekkelig halveringstid. Oligonukleotidet kan bli radioaktivt merket, f. eks ved "nick-tranlasjon" ved hjelp av velkjente metoder, som f.eks beskrevet i Rigby, P.J.W. et al, J. Mol. Biol. 113:237 (1977) eller ved T4 DNA polymeraseerstatningssyntese som beskrevet i f.eks Deen, K.C. et al, Anal. Biochen. 135:456 (1983).

Oligonukleotidprober kan bli merket med en ikke-radioaktiv markør så som biotin, et enzym eller en fluorescentgruppe. Se f.eks Leary, J.J. et al, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 80:4045 (1983); Renz, M. et al, Nucl. Acids Res. 12:3435 (1984); og Renz, M. EMBO

J. 6: 817(1983).

For Ich-1 var isoleringen vist i eksemplene som følger. To primere ble anvendt i polymerasekjedereaksjonen for å amplifisere nedd2 cDNA fra embryoinsk dag 15 musehjerne cDNA (Sambrook et al, Mulecular Cloning, a Laboratory Manual, vol 3

(1988)). En primer hadde sekvensen ATGCTAACTGTCCAAGTCTA og den andre primeren hadde sekvensen TCCAACAGCAGGAATAGCA. cDNA amplifisert på denne måten ble klonet ved anvendelse av standardmetoder. Klonet muse nedd2 cDNA ble anvendt som en probe for å screene et humant føtalt hjerne cDNA bibliotek oppnådd fra Stratagene. Slike metoder for screening og isolering av kloner er velkjent innenfor fagområdet (Maniatis, T. et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY (1982)); Hames, B.D. et al, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington DC (1985)). En humant nedd-2 cDNA klon ble isolert og koder for et protein som er mye lenger enn muse nedd-2 og som inneholder aminosyresekvenser homologe med hele hICE og ced-3. Den isolerte klonen ble gitt navnet Ice-ced 3 homolog eller Ich-1.

Ich-1 cDNA kan bli oppnådd ved anvendelse av nukleinsyresekvensinformasjonen gitt i figurene 10A eller 10B. DNA prober konstruert fra denne sekvensen kan bli merket og anvendt for å screene humane genbibliotek som beskrevet heri. Også som beskrevet heri kan Ich-1 bli klonet inn i ekspresjonsvektorer og uttrykt i systemer hvor vertcellene blir dyrket under betingelser hvor rekombinante gener ikke blir uttrykt og etter at cellene når en ønsket tetthet blir ekspresjon indusert. På denne måten kan tendensen som celler som uttrykker Ich-1 har til å dø bli omgått.

En metode for å danne Ich-3 er som følger. mRNA ble isolert fra embryonisk dag 14 museembryoer ved anvendelse av Invitrogen's microfast track mRNA isoleringssett. Isolert mRNA ble revers transkribert for å danne templatet for PCR amplifikasjon. Degenerte PCR primere var: cICEB

{TG(ATCG)CC(ATCG)GGGAA(ATCG)AGGTAGAA} og cICEAs

{ATCAT(ATC)ATCCAGGC(ATCG)TGCAG(AG)GG}. PCR syklusene ble satt opp som følger: 1,94°C, 3 min; 2,94°C, 1 min; 3,48°C, 2 min; 4,72°C, 3 min; 5. returnering il "2" 4 sykluser; 6,4°C, 1 min; 7,55°C, 2 min; 8,72°C, 3 min; 9. returnering til "6" 34 sykler; 10,72°C, 10 min; 11. ende. En slik PCR dannet et bånd på omtrent 400 bp, den antatte størrelsen på ICE homologer. PCR produktene ble klonet inn i T-hale blunt-endet pBSKII plasmidvektor (Stratagene). Plasmider som inneholder et innskudd ble analysert ved DNA sekvensering.

Ich-3 cDNA kan også bli oppnådd ved anvendelse av nukleinsyresekvensinformasjon gitt I figur 14. DNA prober konstruert fra denne sekvensen kan bli merket og anvendt for å screene humane genbibliotek som som beskrevet heri. Også som diskutert heri kan Ich-3 bli klonet inn i ekspresjonsvektorer og uttrykt i systemer hvor vertcellene blir dyrket under betingelser hvor rekombinante gener ikke blir uttrykt og, etter at cellene når en ønsket tetthet, blir ekspresjon indusert.

Fremgangsmåtene diskutert heri har evne i å identifisere genetiske sekvenser som koder for mIch-2, Ich-1 og Ich-3. For å ytterligere karakterisere slike genetiske sekvenser og for å produsere rekombinant protein er det ønskelig å uttrykke proteiner som disse sekvensene koder for.

For å uttrykke et hvilket som helst av genene heri eller deres derivater er transkripsjonene og translasjonelle signaler som kan gjenkjennes av en hensiktsmessig vert nødvendig. Klonede kodende sekvenser, oppnådd ifølge metodene beskrevet heri, kan bli operabelt koblet til sekvenser som kontrollerer transkripsjonen ekspresjon i en ekspresjonsvektor og introdusert inn i en vertcelle, enten prokaryot eller eukaryot for å produsere rekombinant protein eller et funksjonelt derivat derav. Avhengig av hvilken tråd av sekvensen som er operabelt koblet til sekvensene som kontrollerer transkripsjonen ekspresjon er det også mulig å uttrykke antisens RNA eller et funksjonelt derivat - derav.

Ekspresjon av proteinet i forskjellige verter kan resultere i forskjellige posttransla-sjonelle modifikasjoner som kan endre egenskapene til proteinet. Foreliggende oppfinnelse omfatter fortrinnsvis ekspresjon av mIch-2, Ich-1 og Ich-3 eller et funksjonelt derivat derav, i eukaryote celler, og spesielt pattedyr, insekt og gjærceller. Spesielt foretrukne eukaryote verter er pattedyrceller enten in vivo eller vevskultur. Pattedyrceller tilveiebringer post-translasjonelle modifikasjoner som er like eller identiske med de som finnes i nativt protein. Foretrukne pattedyrvertceller innbefatter rotte-1 fibroblaster, musebenmarg avledete mastceller, musemastceller udødeliggjort med Kirsten sarcoma virus, eller normale musemastceller som er blitt samdyrket med muse-fibroblaster (Razin et al, J. of Immun. 132:1479 (1984); Levi-Schaffer et al, Proe. Nati. Acad. Sei. (USA) 83:6485 (1986) og Reynolds et al, J. Biol. Chem. 263:12783-12791

(1988)).

Et nukleinsyremolekyl, så som DNA, sies å "ha evne til å uttrykke" et polypeptid dersom det inneholder ekspresjonskontrollsekvenser som inneholder transkripsjonen regulatorisk informasjon og slike sekvenser er "operabelt koblet" til nukleotidsekvensen som koder for polypeptidet.

En operabel binding er en binding hvor en kodende sekvens blir koblet til en regulatorisk sekvens (eller sekvenser) på en slik måte at ekspresjon av den kodende sekvensen blir plassert under innvirkning eller kontroll av den regulatoriske sekvensen. To DNA-sekvenser (f.eks den kodende sekvensen til protein og en promoter) sies å være operabelt koblet dersom induksjon av promoterfunskjonen resulterer i transkripsjon av den kodende sekvensen og dersom naturen til bindingen mellom de to sekvensene ikke (1) resulterer i introduksjon av en ramme-skift mutasjon; (2) interfererer med evnen som regulatoriske sekvenser har til å lede ekspresjon av den kodende sekvensen, antisens RNA eller protein; eller (3) interfererer med evnen som det kodende sekvenstemplatet har til å bli transkribert av promoterregionsekvensen. En promoterregion vil følgelig være operabelt koblet til en DNA sekvens dersom promoteren har evne til å påvirke transkripsjonen til den DNA sekvensen.

Den nøyaktige naturen til de regulatoriske regionene nødvendig for genekspresjon kan variere mellom arter eller celletyper, men skal generelt innbefatte, 5' ikke-transkriberende og 5' ikke-translaterende (ikke-kodende) sekvenser involvert i initiering av transkripsjon og translasjon, så som TATA boks, cappingsekvens, CAAT sekvens og lignende. Spesielt vil slike 5' ikke-transkriberende kontrollsekvenser innbefatte en region som inneholder en promoter for transkripsjonen kontroll av det operabelt koblede genet.

Ekspresjon av proteinene ifølge oppfinnelsen i eukaryote verter krever anvendelse av regulatoriske regioner som er funksjonelle slike verter, og fortrinnsvis eukaryote regulatoriske systemer. Mange forskjellige transkripsjonene og translasjonelle regulatoriske sekvenser kan bli anvendt, avhengig av naturen til den eukaryote verten. Transkripsjonene og translasjonelle regulatoriske signaler kan også bli avledet fra de genomiske sekvensene til vimser som infiserer eukaryote celler, så som adenovirus, bovint papillomavirus, simianvirus, herpesvirus eller lignende. Disse regulatoriske signaler blir fortrinnsvis assosiert med et bestemt gen som har evne til ekspresjon i høyt nivå i vertcellen.

I eukaryoter, hvor transkripsjonen ikke er koblet til translasjon, kan kontrollregionene tilveiebringe et initiatormetionin (AUG) kodon, avhengig av om den klonede sekvensen inneholder et slikt metionin. Slike regioner vil generelt innbefatte en promoterregion som er tilstrekkelig for å lede initiering av RNA syntesen i vertcellen. Promotere fra heterologe pattedyrgener som koder for mRNA med evne til translasjon er foretrukket, og spesielt, sterke promotere så som promoteren for actin, collagen, myosin osv, kan bli anvendt forutsatt at de også virker som promotere i vertcellen. Foretrukne eukaryote promotere innbefatter promoteren til musemetallothionein I gen (Hamer, D. et al, J. Mol. Appl. Gen. 1:273-288 (1982)); TK promoteren til herpesvirus (McKnight, S. Cell 31:355-265 (1982)); SV40 tidlig promoter (Benoist, C: et al, Nature (London) 290:304-310 (1981)); i gjær, gjær gal4 genpromoteren (Johnston, S.A. et al, Proe. Nati. Acad. Sei. (USA) 79:6971-6975 (1982); Silver, P.A. et al, Proe. Nati. Acad. Sei. (USA) 81:5951-5955 (1984)) eller en glykolytisk genpromoter kan bli anvendt.

Det er kjent at translasjon av eukaryot mRNA er initiert ved kodonet som koder for første metionin. Av denne grunn er det foretrukket å forsikre at bindinge mellom en eukaryot promoter og en DNA sekvens som koder for proteinene ifølge oppfinnelsen eller funksjonelle derivater derav ikke inneholder noen intervenerende kodoner som har evne for å kode for et metionin. Tilstedeværelse av slike kodoner resulterer enten i dannelse av et fusjonsprotein eller en ramme-skiftmutasjon.

Om ønskelig kan et fusjonsprodukt av proteinene bli konstruert. For eksempel kan sekvensen kodende for proteinene bli koblet til en signalsekvens som vil muliggjøre sekresjon av proteinet fra, eller innbefatning av proteinet i en bestemt vert. Slike signal-sekvenser kan bli konstruert med eller uten spesifikke proteaseseter slik at signalpeptid-sekvensen har evne til påfølgende fjerning. Alternativt kan den native signalsekvensen for dette proteinet bli anvendt.

Transkripsjonen initieringsregulatorsignaler kan bli valgt som muliggjør for ekspresjon eller aktivering, slik at ekspresjon av operabelt koblede gener kan bli modulert. Av interesse er regulatoriske signaler som er temperaturfølsomme slik at ved variering av temperaturen kan ekspresjonen bli undertrykt eller initiert, eller bli utsatt for kjemisk regulering, f.eks metabolitt.

Om ønskelig kan ikke-traskriberte og/eller ikke-translaterte regioner 3' for sekvensen kodende for proteinene bli oppnådd ifølge ovennevnte kloningsmetoder. 3' ikke-transkribert region kan bli tilbakeholdt for transkripsjonen termineringsregulatoriske sekvenselementer; 3' ikke-translatert region kan bli tilbakeholdt for translasjonen termineringsregulatoriske sekvenselementer, eller for de elementene som leder polyadenyleringen i eukaryote celler. Hvor nativekspresjonskontrollsignaler ikke virker tilfredsstillende i en vertcelle kan funksjonelle sekvenser bli substituert.

Vektorene ifølge oppfinnelsen kan videre omfatte andre operabelt koblede regulatoriske elementer så som enhancersekvenser, eller DNA elementer som utviser vevs eller celle-typespesifikk ekspresjon på et operabelt koblet gen.

For å transformere en pattedyrcelle med DNA konstruksjoner ifølge oppfinnelsen er mange vektorsystemer tilgjengelige, avhengig av om det er ønskelig å sette inn DNA konstruksjonen inn i vertcellekromosomalt DNA, eller muliggjøre at den eksisterer i ekstrakromosomal form. Dersom den proteinkodende sekvensen og en operabelt koblet promoter blir introdusert inn i en mottaker eukaryot celle som et ikke-replikerende DNA (eller RNA) molekyl kan ekspresjon av proteinet oppstå gjennom transielt ekspresjon av den introduserte sekvensen.

I en foretrukket utførelsesform kan genetiske stabile transformanter bli konstruert med vektorsystemer, eller transformasjonsystemer hvorved mIch-2, Ich-1 eller Ich-3 DNA blir integrert inn i vertskromosomet. En slik integrasjon kan oppstå de novo innenfor cellen eller, i en mest foretrukket utførelsesform, ved hjelp av en kotransformert vektor som funksjonelt innskyter seg selv inn i vertskromosomet, f.eks, retrovirale vektorer, transposons eller andre DNA elementer som fremmer integrasjon av DNA sekvensene i kromosomene.

Celler som har stabilt integrert det introduserte DNA inn i deres kromosomer blir selektert ved også å introdusere en eller flere markører som muliggjør seleksjon av vertceller som inneholder ekspresjonsvektoren i kromosomet, f.eks kan markøren tilveiebringe biocidresistens, f.eks resistens overfor antibiotika, eller tungmetaller, så som kobber, eller lignende. Det selekterbare markørgenet kan enten bli direkte koblet til DNA gensekvensene som skal bli uttrykt, eller introdusert inn i samme celle ved ko-transfeksjon.

I en annen utførelsesform blir den innførte sekvensen inkorporert inn i et plasmid eller viral vektor som har evne til autonom replikasjon i mottakerverten. En hvilken som helst av de forskjellige vektorene kan bli anvendt for dette formålet. Faktorer av vikitghet ved selektering av et bestemt plasmid eller en viral vektor innbefatter: lettheten hvorved mottakercellene som inneholder vektoren kan bli gjenkjent og selektert fra de mottakercellene som ikke inneholder vektoren; antall kopier av vektoren som er ønskelig i en bestemt vert; og om det er ønskelig å kunne "skyttel" vektorer mellom vertceller og forskjellige arter.

Foretrukne eukaryote plasmider innbefatter de som er avledet fra bovin papillomavirus, vaccinia virus, SV40 og i gjær, plasmider inneholdende 2 mikronsirkler, osv eller deres derivater. Slike plasmider er velkjente innenfor fagområdet (Botstein, D. et al Miami Wntr. Symp. 19:265-274 (1982); Broach, J.R. I: The Molecular Biology of the Ueast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, side 445-470 (1981); Broach, J.R. Cell 28:203-204 (1982); Bollon, D.P. et al, J. Clin. Hematol. Oncol. 10:39-48 (1980); Maniatis, T: I: Cell Biology: A Comprehensive Treatise, vol. 3 Gene Expression, Academic Press, NY sider 563-608

(1980)), og er kommersielt tilgjengelige.

Når vektoren eller DNA sekvensen inneholdende konstruksjonene blir dannet for ekspresjon blir DNA konstruksjonene innført i en hensiktsmessig vertcelle ved hvilke som helst av forskjellig egnede metoder, inkludert transfeksjon. Etter introduksjon av vektoren blir mottakercellene dyrket i et medium som selekterer for vekst av vektor-inneholdende celler. Ekspresjon av klonede gensekvenser resulterer i produksjon av protein eller i produksjon av et fragment av dette proteinet. Denne ekspresjonen kan foregå kontinuerlig i de transformerte cellene, eller på en kontrollerbar måte, f.eks, ekspresjon som følger induksjon av differensiering av transformerte celler (f.eks ved administrasjon av bromdeoksyuracil til neuroblastomceller eller lignende). Sistnevnte er foretrukket for ekspresjon av proteinene ifølge oppfinnelsen. Ved dyrking av cellene under betingelser hvor proteinene ikke blir uttrykt kan celledød unngås. Når det oppnås høy celletetthet kan ekspresjon av proteinet bli indusert og rekombinant høstet øye-blikkelig før døden oppstår.

Uttryksprotein blir isolert og renset i henhold til konvensjonelle prosedyrer, så som ekstraksjon, presipitasjon, gelfiltreringskromatografi, affinitetskromatografi, elektro-forese eller lignende.

mIch-2, Ich-1 og Ich-3 sekvenser, oppnådd ifølge fremgangsmåtene ovenfor, vil tilveiebringe sekvenser som ikke bare koder for proteiner, men som også tilveiebringer transkripsjon av mIch-2, Ich-1 og Ich-3 antisens RNA; antinsens DNA sekvensen vil være den sekvensen som finnes på den motsatte tråd av tråden som transkriberer

mRNA. Antisens DNA tråden kan også bli operabelt koblet til en promoter i en ekspresjonsvektor slik at transformasjonen med denne vektoren resulterer i en vert som har evnen til å uttrykke antisens RNA i den transformerte cellen. Antisens DNA og RNA kan bli anvendt for å reagere med endogent mIch-2, Ich-1 og Ich-3 DNA eller RNA på en måte som inhiberer eller represserer transkripsjonen eller translasjonen av genene på en meget spesifikk måte. Anvendelse av antisensnukleinsyre for å blokkere genekspresjon er beskrevet i Lichtenstein, C. Nature 333:801-802 (1988).

Fremgangsmåter for anvendelse

ced-3

ced-3 genet (som ced-3 homologer og andre medlemmer av ced-3 genfamilien) kan bli anvendt til mange forskjellige formål. Deler av genet kan bli anvendt som en probe for identifisering av gener homologe med ced-3 i andre nematodestammer (se eksempel 1) samt i andre arter (se eksemplene 2 og 3). Slike prober kan også bli anvendt for å bestemme om ced-3 genet eller homologer av ced-3 kan bli uttrykt i cellene.

Celledødgener vil bli anvendt for utvikling av terapeutiske metoder for sykdommer og tilstanderkarakterisert vedcelledød. Blant sykdommer og tilstander som potensielt kan bli behandlet er neurale og muskulære degenerative sykdommer, myokardial infarkt, slag, viralt indusert celledød og aldring. Oppdagelse av at ced-3 er relatert til ICE tyder på at celledødgenet kan spille en viktig rolle i betennelse (IL-1 p er kjent for å være involert i inflammatorisk respons). Terapeutiske midler basert på ced-3 og relatert celledødgener kan følgelig også bli utviklet.

mIch-2, Ich-1 og Ich-3

mIch-2, Ich-1 og Ich-3 vil samme anvendelser som de som er beskrevet i sammenheng med ced-3 (ovenfor) og ICE (se nedenfor). Gensekvenser kan bli anvendt for å konstruere antisens DNA og RNA oligonukleotider, som igjen kan bli anvendt for å forhindre programert celledød i thymus eller morkakeceller. Teknikker for inhibering av ekspresjon av gener ved anvendelse av antisens DNA eller RNA er velkjente innenfor fagområdet (Lichtenstein, C. Nature 333:801-802 (1988)). Deler av krevd DNA sekvens kan også bli anvendt som prober for å bestemme ekspresjonsnivået. Proteinet kan likeledes bli anvendt for å danne antistoffer som kan bli anvendt ved analysering av cellulær ekspresjon.

Deler av mIch-2, Ich-1 og Ich-3 gener beskrevet ovenfor kan bli anvendt for å bestemme ekspresjonsnivået til proteinene (mIch-2 i thymus eller morkakeceller samt i andre vev og organer). Slike metoder kan være nyttige for å bestemme om disse cellene har gjennomgått en neoplastisk transformasjon. Prober basert på gensekvenser kan bli anvendt for å isolere lignende gener som er involvert i celledød. En del av genet kan bli anvendt i homologe rekombinasjonseksperimenter for å reparere defekte gener i celler eller, alternativt, å utvikle musestammer som mangler genet. Antisenskonstruksjoner kan bli transfektert inn i celler, ifølge native cellulære ekspresjonsmønstere til hvert gen (morkake eller thymusceller for mIch-2, f.eks) for å kunne utvikle celler som kan bli opprettholdt i kultur i forlengede tidsperioder eller i det uendelige. Alternative antisenskonstruksjoner kan bli anvendt i cellekultur eller in vivo for å blokkere celledød.

Proteinet kan bli anvendt for å danne polyklonale eller monoklonale antistoffer ved anvendelse av standardteknikker som er velkjente innenfor fagområdet (Klein, J. Immunology: The Science of Cell-Noncell Discrimination, John Wiley & Sons, N.Y.

(1982); Kennett et al, Monoclonal Antibodies, Hybridoma; A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, N.Y. (1980); Campbell, A. "Monoclonal Antibody Technology", I: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology 13, Burdon et al. Eds. Elseiver, Amsterdam (1984); Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory N.Y. (1988)). Slike antistoffer kan bli anvendt i analyser for å bestemme ekspresjonen av genene. Renset protein kan virke som standard i slike analyser.

Basert på sekvensene ifølge figur 6 kan prober bli anvendt for å bestemme om mIch-2 genet eller homologer av mIch-2 blir uttrykt i cellene. Slike prober kan bli anvendt i analyser for korrelering av mIch-2 ekspresjon med cellulære betingelser, f.eks neoplastisk transformasjon, samt for det formål å isolere andre gener som er homologe med mIch-2.

mIsh-2 vil bli anvendt for utvikling av terapeutiske metoder for sykdommer og tilstanderkarakterisert vedcelledød. Sykdommer og tilstander som potensielt kan bli behandlet innbefatter neurale og muskulære regenerative sykdommer, hjerteinfarkt,

slag, viralt indusert celledød og aldring.

Antisensnukleinsyrer basert på sekvensene vist i figur 6 kan bli anvendt for å inhibere mIch-2 ekspresjon. Slik inhibisjon vil være nyttig for blokkering av celledød i dyrkede celler.

mIch-2 kan bli anvendt for å danne polyklonale eller monoklonale antistoffer ved anvendelse av fremgangsmåtene som er velkjente innenfor fagområdet (se ovenfor). Antistoffet kan bli anvendt i analyser for å bestemme ekspresjonen av mIch-2. Renset mIch-2 kan virke som standard i slike analyser.

Basert på sekvensene i figurene 10A og 10B kan prober bli anvendt for å bestemme om Ich-1 genet eller homologer av Ich-1 blir uttrykt i cellene. Slike prober kan bli anvendt i analyser for korrelering av Ich-1 ekspresjon med cellulære betingelser, f.eks neoplastisk transformasjon, samt for det formålet å isolere andre gener som er homologe med Ich-1.

Ich-1 vil bli anvendt for utvikling av terapeutiske metoder for sykdommer og tilstanderkarakterisert vedcelledød. Sykdommer og tilstander som potensielt kan bli behandlet innbefatter neurale og muskulære degenerative sykdommer, hjerteinfarkt, slag, viralt indusert celledød og aldring.

Antisensnukleinsyrer basert på sekvensene vist i figurene 10A og 10B kan bli anvendt for å inhibere Ich-1 ekspresjonen. En slik inhibisjon vil være nyttig for blokkering av celledød i dyrkede celler.

Ich-1 proteinet kan bli anvendt for å danne polyklonale eller monoklonale antistoffer

ved anvendelse av metoder som er velkjente innenfor fagområdet (se ovenfor). Antistoffer kan bli anvendt i analyser for å bestemme ekspresjonen av Ich-1. Renset Ich-

1 vil virke som standard i slike analyser.

Basert på sekvensen i figur 14 kan prober bli anvendt for å bestemme om Ich-3 eller homologer av Ich-3 blir uttrykt i cellene. Slike prober kan bli anvendt i analyser for korrelering av Ich-3 ekspresjon med cellulære betingelser, f.eks neoplastisk transformasjon, samt for det formålet å isolere andre gener som er homologe med Ich-3.

Ich-3 vil bli anvendt for utvikling av terapeutiske metoder for sykdommer og tilstanderkarakterisert vedcelledød. Sykdomer og betingelser som potensielt kan bli behandlet innbefatter neurale og muskulære degenerative sykdommer, hjerteinfarkt, slag, viralt indusert celledød og elding.

Antisensnukleinsyrer basert på sekvensen vist i figur 14 kan bli anvendt for å inhibere Ich-3 ekspresjon. En slik inhibisjon vil være nyttig for blokkering av celledød i dyrkede celler.

Ich-3 proteinet kan bli anvendt for å danne polyklonale eller monoklonale antistoffer ved anvendelse av metoder som er velkjente innenfor fagområdet (se ovenfor). Antistoffer kan bli anvendt i analyser for å bestemme ekspresjon av Ich-3. Renset Ich-3 kan virke som standard i slike analyser.

Fremgangsmåte for forhindring av programert celledød i virveldyrceller ved inhibering av den enzymatiske aktiviteten til ICE

Foreliggende oppfinnelse er rettet mot forhindring av programert død av virveldyrceller ved inhibering av virkningen av ICE. Detaljert strukturell analyse utført på ced-3 genet fra C. elegans viste en homologi med human og munn ICE som er spesielt sterk ved den QACRG aktive domenen til hICE (se figur 3A).

For å bestemme om ICE virker som et celledødgen i virveldyr ble mICE genet klonet, skutt inn i en ekspresjonsvektor og deretter transfektert inn i rotteceller. En nære korrelasjon ble funnet mellom ICE ekspresjon og celledød (se eksempel 2).

Ytterligere støtte for funksjonen til ICE som et celledødgen ble oppnådd fra inhibisjons-studier. For å bestemme om celledød kan bli forhindret ved inhibering av den enzymatiske virkningen til ICE ble cellelinjer etablert som produserer et høyt nivå crmA. Når disse cellene ble transfektert med mICE ble det oppdaget at en stor prosentandel av cellene som uttrykker mICE opprettholdt en frisk morfologi og gjennomgikk ikke programert celledød (eksempel 2 heri).

Bevis på at ICE har en fysiologisk rolle som et virveldyrcelledødgen ble også oppnådd ved å undersøke celler omkonstruert for å overuttrykke bcl-2, et onkogen kjent for å inhibere programert celledød og å bli overuttrykt i mange follikulære og B celle lymfomer. Det ble oppdaget at celler som uttrykker bcl-2 ikke gjennomgikk celledød til tross for høyt nivå av ICE ekspresjon (eksempel 2 heri). Disse resultatene tyder på at bcl-2 kan fremme malignhet ved inhibering av virkningen av ICE.

Mange metoder på spesifikk regulering av virkningen av ICE for å kontrollerte programert celledød i virveldyr er omfattet av foreliggende oppfinnelse. Dette vil innbefatte anvendelse av ikke bare inhibitorer spesifikke for ICE, f.eks crmA, eller inhibitorer beskrevet av Thornberry et al (Nature 356:768-774 (1992)), men også metoder som spesifikt forhindrer ekspresjon av ICE genet. Antisens RNA eller DNA bestående av nukleotidsekvenser komplementære med ICE og som har evne til å inhibere transkripsjonen eller translasjonen av ICE hører inn under rammen av foreliggende oppfinnelse (se Lichtenstein, C. Nature, 333:801-802 (1988)).

Evnen til å forhindre virveldyrprogramert celledød kan anvendes for utvikling av celler som kan bli opprettholdt i en uendelig tidsperiode i kultur. For eksempel kan celler som overuttrykker crmA bli anvendt som verter for uttrykking av rekombinante proteiner. Evnen til å forhindre programert celledød kan muliggjøre at cellene lever uavhengig av normalt nødvendige vekstfaktorer. Det har blitt oppdaget at mikroinjisering av crmA mRNA eller en crmA-uttrykkende nukleinsyrekonstruksjon inn i cellene muliggjør at kyllingsympatetiske neuroner lever in vitro etter fjerning av neural vekstfaktor.

Fremgangsmåter for å fremme programert celledød i virveldyrceller ved øking av indusering av aktiviteten til ICE

Ekspresjon av ICE kan bli øket for å forårsake programert celledød. For eksempel kan homolog rekombinasjon bli anvendt for å erstatte en defekt region av et ICE gen med dets normale motpart. Reguleringsnivået som kan endres for manipulering til enten økning eller reduksjon av ekspresjon av ICE innbefatter DNA, RNA eller protein. Genomisk DNA, f.eks, kan bli mutert ved innføring av selekterte DNA sekvenser introdusert inn i genomet ved homolog rekombinasjon. En hvilken som helst ønsket mutasjon kan bli innført in vitro og, gjennom generstatning, kan enten dekodende eller regulatoriske sekvenser til genet bli manipulert. Ekstrakromosomalt DNA med hensiktsmessig gensekvens kan også bli innført i celler for å konkurrere med det endogene produktet. På RNA nivå kan antisens RNA molekylene bli innført, samt RNA som har mere eller mindre affinitet for det translasjonelle apparatet eller større eller mindre tendens til å bli transkribert. På proteinnivå kan proteinmotstykker bli konstruert som har en høyere eller lavere aktivitet.

I tillegg til å lede reguleringen, og spesielt en økning i genekspresjon av ICE, eksisterer også muligheten for indirekte regulering ved regulering av de cellulære komponentene som enten induserer eller undertrykker ekspresjonen av ICE. Oppfinnerene har f.eks oppdaget at TNF-a induserer et program for celledød via aktivering av hICE genetiske sekvenser. Et ytterligere regulasjonsnivå er det for modulering av ekspresjon av TNF-a og dets funksjonelle motparter. En hvilken som helst cellulær komponent som regulerer programert celledød ved hjelp av ICE/ced-3 reaksjonsveien kan i seg selv bli regulert i steden for direkte regulering av ICE genet. Reguleringen kan oppstå ifølge en hvilken som helst av metodene diskutert ovenfor. Genene i bcl-2 familien, p53 og gener som blir regulert av p53 (så som p21), proteinene i ras reaksjonsveien (ras, raf 14-3-3), Fas og proteinene i cytotoksiske T-cellergranuler (så som granzym B) kan alle lede og inn-direkte innvirke på aktiviteten ti ICE familien. Reguleringen kan følgelig også oppstå ved hjelp av hvilke som helst av disse genene og andre slike reaksjonsveier. På denne måten kan det være mulig å forhindre unkontrollert vekst av visse maligne celler.

Fremgangsmåter for å øke ICE aktiviteten kan bli anvendt for å drepe uønskede organismer så som parasitter. crmA er et viralt protein som er viktig for kukopper-infeksjon. Dette tyder på at forhindring av celledød kan være viktig for vellykket infeksjon og at fTemming av ICE ekspresjon kan tilveiebringe et middel for blokkering av infeksjon. Aktivering av ICE familiegener kan bli anvendt for å eliminere cancerceller eller andre uønskede celler. Forhindring av celledød ved inaktivering av ICE familien av genene kan forhindre neuronale degenerative sykdommer, så som Alzheimers sykdom, amylotrofisk lateral sclerose og celledød assosiert ved slag, ischemisk hjerteskade og elding.

Det er mange generelle beskrivelser i foreliggende oppfinnelse og de samme vil bli ytterligere beskrevet med referanse til visse spesifikke eksempler som er gitt heri for å beskrive oppfinnelsen. Alle referansene som er sitert i beskrivelsen er inkorporert i sin helhet som referanse.

EKSEMPEL 1

Eksperimentelle prosedyrer

Generelle metoder og stammer

Teknikker anvendt for dyrking av C. elegans er blitt beskrevet av Brenner (Brenner, S. Genetics 77:71-94 (1974)). Alle stammene blir dyrket ved 20°C. Vill-type foreldre-stammene var C. elegans varieteten Bristolstamme N2, Bergeracstammen EM 1002 (Emmons et al, Cell 32:55-65 (1983)), C. briggsae og C. vulgaris. De genetiske markørene anvendt er beskrevet nedenfor. Disse markørene er tidligere blitt beskrevet (Brenner, S. Genetics 77:71-94 (1974)); og Hodgkin et al, Genetics in the Nematode Caenorhabditis Elgens (Wood et al, eds) side 491-584, Cold Spring Harbor, New York

(1988)). Genetisk nomenklatur følger standardsystemet (Horvitz et al, Mol. Gen. Genet. 175:129-133 (1979)).

LG I: ced-1 (ei 735); unc-54 (r323)

LG VI: unv-31 (e928), unc-39 (el91), ced-3 (n717, n718, ni040, ni 129, ni 1634,

ni 164, ni 165, nl286, nl949, n2426, n2430, n2433), unc-26 (e205), dpy-4 (el 166)

LG V: eg-l(n986); unc-76 (e911)

LG X: dpy-3(e27)

Isolering av ytterligere alleler av ced-3

En ikke-komplementeringsscreening ble konstruert for å isolerer nye alleler av ced-3. På grunn av at dyr heterozygote for ced3(n717) in trans for en mangel er levedyktige (Ellis et al, Cell 44:817-829 (1986)), var det ventet at dyr som bærer et fullstendig tap av funksjonmutant ced-3 allel i trans for ced-3(n717) vil være levedyktige selv om homozygoter for allelet var ikke levedyktige. EMS mutageniserte egl-1 L4 hanner ble parret med ced3(n717 unc-26(e205); egl-l(n487); dpy-3(e27) hermafroditter, egl-1 ble anvendt som en markør i denne screeningen. Dominante mutasjoner i egl-1 forårsaker to hermafroditt-spesifkke neuroner, HSN, for å gjennomgår programert celledød (Trent et al, Genetics 104:619-647 (1983)). HSN er nødvendig for normal egglegging, og egl-1 (n986) hermafroditter, som maglner HSN er eggleggingsdefekte (Trent et al, Genetics 104:619-647). Den mutante fenotypen til egl-1 blir undertrykt i en ced-3; egl-1 stamme på grunn av at mutasjonene i ced-3 blokkerer programert celledød. egl-1 hanner ble mutagenisert med EMS og krysset med ced3(n717) unc-26(e205); egl-l(n487); dpy-3(e27). De fleste krysningsavkommene var eggleggingsdefekte på grunn av de var heterozygote for ced-3 og homologe for egl-1. Skjeldne eggleggende kompetente dyr ble plukket og de dyrene er kandidater for å inneholde nye ced-3 alleler. Fire slike dyr ble isolert fra omtrent 10.000 Fl kryssavkom av EMS-mutageniserte dyr. Disse nye mutasjonene ble gjort homozygote for å bekrefte at de bærer mutasjonene til ced-3.

RFLP kartlegging

To kosmidbibliotek ble omfattende anvendt i dette arbeidet - et Sau3A I delspaltnings-genomisk bibliotek med 7.000 kloner i vektoren pHC79 og Sau3A I delspaltnings- genomisk bibliotek med 6.000 i vektoren pJB8 (Coulson et al, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 83:7821-7835 (1986).

Bristol (N2) og Bergerac (EMI002) DNA ble spaltet med forskjellige restriksjons-enzymer og probet med forskjellige kosmider for å se etter RFLP. nP33 er en Hindlll Rf LP detektert ved "høyre" ende av Jc8. "Høyre" ende av Jc8 ble dannet ved spaltning av Jc8 med EcoRI og selv-ligering. nP34 er en Hindlll RFLP detekgert ved "venstre" ende av Jc8. Den "venstre" enden av Jc8 ble dannet ved spaltning av Jc8 med Sali og selvligering. nP36 og nP37 er begge Hindlll RFLP detektert ved henholdsvis T10H5 og B0564.

Kimlinjetransformasjon

Prosedyren anvendt for mikroinjeksjon følger hovedsakelig den til A. Fire (Fire, A. EMBO J. 5:2673-2680 (1986)). Kosmid DNA ble to ganger CsCl på gradient renset. Miniprep DNA ble anvendt når deleterte kosmider ble injisert og ble dannet fra 1,5 ml overnatt bakteriell kultur i superkraft. Superkraft ble dannet ved kombinering av 12 g Bacto tryptone, 24 g gjærekstrakt, 8 ml 50 % glyserol og 900 ml H2O. Blandingen ble autoklavert og deretter ble 100 ml 0,17 M KH2PO4og 0,72 M K2HPO4tilsatt. Den bakterielle kulturen ble ekstrahert ved alkaliske lyseringsmetoder som beskrevet i Maniatis et al (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY 1983)). DNA ble behandlet med Rnase A (37°C, 30 minutter) og deretter med protease K (55°C, 30 minutter). Prepareringen ble fenol- og deretter kloroform-ekstrahert, presipitert to ganger (først i 0,3 M Na acetat og deretter i 0,1 MK acetat, pH 7,2), og resuspendert i 5 1 injeksjonsbuffer som beskrevet av A. fire (Fire, A, EMBO J. 5:2673-2680 (1986)). DNA konsentrasjonen for injeksjon var i et område på 100 jig til 1 mg pr ml.

Alle transformasjonseksperimentene anvendte ced-l(el735); unc-31(e928); ced-3(n717) stammer, unc-31 ble anvendt som en markør for kotransformasjon (Kim et al, Genes & Dev. 4:357-371 (1990)). ced-1 var tilstede for å lette scoring av ced-3 fenotypen. Mutasjonene i ced-1 blokkerer prosessen for celledød som gjør at formene til de døde cellene vedvarer mye lengre enn i vill-type (Hedgecock et al, Science 220:1277-1280

(1983)). ced-3 fenotypen ble registrert som antall døde celler tilstede i hodet til unge LI dyr. Kosmid C10D8 eller plasmidsubklonene til C10D8 ble blandet med C14G10 (unc-31 (+)-inneholdende) i et forhold på 2:1 eller 3:1 for å øke sjansene for at en Unc-31 (+) transformant vil inneholde kosmidet eller plasmidet som blir testet. Vanligvis ble 20-30 dyr injisert i et ekspreiment. Ikke-Unc Fl avkom til injiserte dyr ble isolert 3 til 4 dager senere. Omtrent 1/2 til 1/3 av ikke-Unc avkommene overførte ikke-Unc fenotypen til F2 og etablerte en linje av transformantene. Det unge LI avkommet til slike ikke-Ung transformanter ble undersøkt for antall døde celler tilstede i hodet ved anvendelse av Nomarski optikk.

Bestemmelse av ced-3 transkripsjonsinitieringssete

To primere,

Pexl: (5'GTTGCAACTGCTTTCACGATCTCCCGTCTCT3') og

Pex2: (5TCATCGACTTTTAGATGACTAGAGAACATC3') ble anvendt for primerekstensjon. Primerene for RT-PCR var:

SLI (5'GTTTAATTACCCAAGTTTGAG3') og

LOG-5 (5'CCGGTGACATTGGACACTC3'). Produktene ble reamplifisert ved anvendelse av primerene SLI og oligolO (5'ACTATTCAACACTTG3'). Et produkt med ventet lengde ble klonet inn i PCR1000 vektor (Invitrogen) og sekvensert.

Bestemmelse og analyse av DNA sekvens

For DNA sekvensiering ble serie delesjoner dannet ifølge prosedyren utviklet av Henikoff (Heinkoff, S. Gene 28:351-359 (1984)). DNA sekvensene ble bestemt ved anvendelse av sequenase og protokoller oppnådd fra US Biochemicals med mindre modifikasjoner.

ced-3 amionsyresekvensen ble sammenlignet med aminosyresekvensene i GenBank, PIR og SWISS-PROT databaser fra National Center for Biotechnology Information (NCBI) ved anvendelse av blast netverk service.

Kloning av ced-3 gener fra andre nematodearter

C. briggsae og C. vulgaris ced-3 gener ble isolert fra tilsvarende faggenomiske bibliotek ved anvendelse av ced-3 DNA subklon pJl 18 innskutt som en probe under lave stringensbetingelser (5 x SSPE, 20 % formamid, 0,02 % Ficoll, 0,02 % BSA. 0,02 % polyvinylpyrrolidon og 1 % SDS) ved 40°C over natt og vasket i 1 x SSPE og 0,5 % SDS to ganger ved romtemperatur og to ganger ved 42°C i 20 minutter hver gang.

Resultater

ced-3 er ikke vesentlig for levedyktighet

Alle tidligere beskrevne ced-3 alleler ble isolert i screeninger konstruert for å detektere levedyktige mutanter hvor programert celledød ikke oppsto (Ellis et al, Cell 44:817-829

(1986)). Slike screeninger kan systematisk ha ced-3 mutasjoner med feilklasser som resulterer i ikke-levedyktighet. På grunn av at dyrene med genotypen ced-3/mangel er levedyktige (Ellis et al, Cell 44:817-829 (1986)), ble et ikke-komplementasjons-screeningsskjema konstruert som ville muliggjøre isolering av ressisive letale alleler av ced-3. Fire nye ced-3 alleler (ni 163, ni 164, ni 165 og nl286) ble oppnådd og disse var levedyktige som homozygoter. Disse nye allelene ble isolert ved en frekvens på omtrent 1 i 2500 mutageniserte haploide genomer, omtrent frekvensen som var ventet for dannelse av null mutasjoner i et gjennomsnittlig C. elegans gen (Brenner, S, Genetics 77:71-94 (1974); Meneely et al, Genetics 92:99-105 (1990); Greenwald et al, Genetics 96:147-160(1980)).

Disse resultatene tyder på at dyr som mangler ced-3 genaktivitet er levedyktige. Under-søkelser av denne hypotesen har ved molekylære analyser vist at tre ced-3 mutasjoner er nonsens mutasjoner som prematurt terminerer ced-3 translasjonen og en endrer et høyt konservert spleiseakseptorsete (se nedenfor). Disse mutasjonene vil bli ventet å eliminere ced-3 aktiviteten fullstendig. Basert på disse betrakningene er det blitt konkludert at ced-3 genaktiviteten er ikke vesentlig for levedyktighet.

ced-3 er innbefattet i et 7,5 kb genomisk fragment

ced-3 ble klonet ved anvendelse av metoden til Ruvkun et al. (Mokecular Genetics of the Caenorhabditis elegans Heterochronic Cene lin-14 121:501-516 ( 1988)). (For ytterligere detaljer se eksperimentelle prosedyrer). C. elegans Bristol stamme N2 inneholder 30 dispergerte kopier av det transposerbare elementet Tel, mens Bergerac stammen inneholder mer enn 400 kopier ( Emmons et al, Cell 32:55-65 (1983); Finney, M. Ph.D. Thesis, "The Genetics and Molecular Biology of unc-86, a Caenorhabditis elegans Cell Lineagte Gene", Cambridge, MA (1987)). Ved kryssing av Bristol og Bergeracstammene ble en serie rekombinante innavlingsstammer dannet hvor det kromosomale materialet for det meste er avledet fra Bristolstammen med varierende mengder Bergerac-spesifikt kromosom IV-avledet materiale i regionen til ced-3 genet. Ved probing av DNA fra disse stammene med plasmid pCe2001 som inneholder Tel

(Emmons et al, Cell 32:55-65 (1983), ble et 5,1 kb EcoRI Tel-inneholdende restriksjonsfragment spesifikk for Bristolstammen (restriksjonsfragmentlengdepoly-morfisme nP35) og nært koblet til ced-3 ble identifisert.

Kosmider som inneholdt dette 5,1 kb restriksjonsfragmentet ble identifisert og det ble oppdaget at disse kosmidene overlapper et eksisterende kosmid kontig som er blitt definert som en del av C. elegans genomprosjektet (Coulson et al, Proe. Nati. Acad. Sei. 83:7821-7825 (1986). Fire andre Bristol-Bergerac restriksjonsfragmentlengdepoly-morfismer ble definert av kosmider i denne kotig (nP33, np34, nP36, nP37). Ved kartlegging av disse restriksjonsfragmentpolymorfismene med hensyn på genene unc-30, ved-3 og unc-26, den fysiske nærheten ble orientert med hensyn på det genetiske kartet og regionen inneholdende ced-3 genet ble innsnevret til et intervall som ble dekket av tre kosmider (figur 1).

På southern blot viste tre av tre + Berg ung-26 rekombinanter Bristol nP33 mønsteret mens to av to ced-3 + Berg rekombinanter viste Bergeracmønsteret (data ikke vist). nP33 er kartlagt meget nære eller til høyre for unc-26. For nP34 viste to av to ced-3 + Berg rekombinanter og to av tre + Berg unc-26 rekombinanter Bergeracmønsteret; en

av tre + Berg unc-26 rekombinanter viste Bristolmønsteret (data ikke vist). Den genetiske avstanden mellom ced-3 og unc-26 er omtrent 0,2 mu. nP34 er følgelig kartlagt mellom ced-3 og unc-26 omtrent 0,1 mu til høyre for ced-3. Lignende eksperimenter kartla nP35, 5,1 kb Bristol spesifikk Tel element, til omtrent 0,1 mu til høyre for ced-3.

For å kartlegge n36 og n37 ble Bristol unc-30 ved-3/++ hanner krysset med Bergerac hermafroditter. Fra avkommet av heterozygotene med genotype unc-30 ced-3 (Bristol)/ ++ (Bergerac), Unc-30/non-ced-3 og non-Unc-30/ced-3 ble dyrene plukket og DNA ble dannet fra disse stammene. nP36 ble kartlagt nære opp til eller til høyre for Unc-30 på grunn av at to av to unc-30 + Berg rekombinanter viste Bristol mønsteret og to av to + Berg ced-3 rekombinanter viste Bergerac mønsteret (data ikke vist). Likeledes blir nP37 kartlagt veldig nære eller til høyre for unc-30 på grunn av at fire av fire + Berg ced-3 viste Bergerac mønster og seks av seks unc-30 + Berg rekominanter viste Bristol mønsteret (data ikke vist). Disse eksperimentene innsnevret regionen inneholdende ced-3 genet til et intervall som blir dekket av de tre kosmidene (figur IA).

Kosmider som var kandidater for å inneholde ced-3 genet ble mikroinjisert (Fire, A. EMBO J. 5:2673-2680 (1986)) inn i ced-3 mutante dyr for å teste for oppfanging av den mutante fenotypen. Kosmidet G14G10, som inneholder villtype unc-31 genet og et kandidat kosmid ble koinjisert inn i ced-l(el375); unc-31(e928) ced-3(n717) hermafroditter. Ikke-unc avkom ble isolert og observert for å undersøke om ikke-unc fenotypen ble overført til den neste generasjonen og dermed etablerte en linje av transformerte dyr. Unge LI avkom av slike transformantlinjer ble undersøkt for tilstedværelse av celledød ved anvendelse av Nomarski optikk for å se om ced-3 fenotypen var komplementert (se eksperimentelle prosedyrer). Kosmid C14G10 alene utviser ikke ced-3 aktivitet når injisert inn i en ced-3 mutant.

unc-31 ble anvendt som markør for kotransfomrasjon (Kim et al, Genes & Devel. 4:357-371 (1990)). ced-1 var tilstede for å tilveiebringe scoring av ced-3 fenotypen. Mutasjoner i ced-1 blokkerer innbefatningsprosessen med programert celledød og forårsaker at mengden av døde celler vedvarer mye lenger enn i villtypen (Hedgecock et al, Science 220:1277-1280 (1983)). Tilstedeværelse av en død celle indikerer at en celle har gjennomgått programert celledød. ced-3 fenotypen ble registrert som antall døde celler tilstede i hodet i unge LI dyr.

Som indikert i figur 1, av tre kosmider som ble injisert (C43C9, W07H6 og C48D1) oppfanget bare C48D1 ced-3 mutant fenotype. Både ikke-unc transformerte linjer som er oppnådd, nlsl og nEx2 ble oppfanget. LI ced-1 dyr inneholder et gjennomsnitt av 23 celleskrotter i hodet, og LI ced-1; ced3 dyr inneholdt et gjennomsnitt på 0,3 celleskrotter i hodet. (Ellis et al, Cell 44:817-829 (1986)). I kontrast til dette inneholdt ced-1; unc-31 ced-3; nlsl; og ced-1; unc31 ced-3; nEx2 dyr et gjennomsnitt av 16,4 og 14,5 celleskrotter i hodet. Fra disse resultatene ble det konkludert at C48D1 inneholder ced-3 genet.

For å lokalisere ced-3 mer nøyaktig i kosmidet C48D1 ble dette kosmidet subklonet og subklonene testet for deres evne til å oppfange ced-3 mutant fenotype (figur IA). Fra disse eksperimentene ble ced-3 lokalisert til et DNA fragment på 7,5 kb (pJ7,5).

Et 2,8 kb ced-3 transkript blir uttrykt primært iløpet av embryogenesen og uavhengig av ced-4 funksjonen

7,6, kg pJ107 subklonen til C48D1 (figur IA) ble anvendt som en probe i et northen blot til polyA+ RNA avledet fra vill-type C. elegans stamme N2. Denne proben hybridiserte til et 2,8 kb transkript. Til tross for at dette transkriptet er tilstede i 11 forskjellige EMS-induserte ced-3 mutante stammer har påfølgende stammer vist at alle 11 testede ced-3

mutante alleler inneholder mutasjoner i genomisk DNA som koder for dette mRNA (se nedenfor) og etablerer dermed et RNA som et ced-3 transkript.

Det utviklingsmessige transkripsjonsmønsteret til ced-3 ble bestemt ved hybridisering av et northern blot av et RNA fra dyr ved forskjellige stadier av utviklingen med ced-3 cDNA subklon pJl 18 (se nedenfor), ced-3 transkriptet ble funnet å være mest forekommende iløpet av embryogenesen når det meste av programert celledød oppstår, men ble også detektert iløpet av LI til og med L4 larvalstadiene. Det er tilstede i relativt høye nivåer i unge voksne.

På grunn av at ced-3 og ced-4 begge er nødvendig for programert celledød i C. elegans og på grunn av at begge blir høyt uttrykt iløpet av embryonisk utvikling (Yuan et al, Dev. 116:309-320 (1992)), eksisterer muligheten av en av genene kan regulere mRNA nivået til den andre. Tidligere studier har vist at ced-3 ikke regulerer ced-4 mRNA nivåene. (Yuan et al, Dev. 116:309-320 (1992)). For å bestemme om ced-4 regulerer ced-3 mRNA nivåene ble et northern blot av RNA dannet fra ced-4 mutante embryoer probet med ced-3 DNA subklon pJl 18. Det ble oppdaget at mengden og størrelsen på ced-3 transkriptet var normalt i ced-4 mutantene ni 162, n 1416, ni 894 og ni920. ced-4 ser ikke ut til å påvirke stasjonær fasenivåene til ced-3 mRNA.

ced-3 DNA og genomiske sekvenser

For å isolere ced-3 cDNA kloner ble ced-3 genomisk DNA pJ50 (fig IA) anvendt som en probe for å screene et cDNA bibliotek fra C. elegans villtypestammen N2 (Kim et al. Genes & Dev. 4:357-371 (1990)). 2,5 kb cDNA klon pJ87 ble isolert på denne måten. På northern blot hybridiserte pJ87 til et 2,8 kb transkript og på southern blot, hybridiserte det bare til bånn hvorpå pJ40 hybridiserer (data ikke vist). pJ87 representerer følgelig et mRNA transkript fullstendig kun fra pJ40 som kan oppfange ced-3 mutant fenotype når mikroinjisert inn i ced-3 mutante dyr. For å bekrefte at pJ87 inneholder ced-3 cDNA ble en rammeskiftmutasjon I Sali setet til pJ40 utført og dette tilsvarer Sali setet i pJ87 cDNA. Konstruksjoner inneholdende rammeskiftmutasjonen oppfanget ikke ced-3 fenotypen når mikroinjisert inn i ced-3 mutante dyr (6 trans-formante linjer; data ikke vist), dette tyder på at ced-3 aktiviteten var blitt eliminert ved mutagenisering av en region av genomisk DNA som tilsvarer pJ87 cDNA.

DNA sekvensen til pJ87 er vist i figur 2C. pJ87 inneholder et innskudd av 2428 bp med en åpen leseramme med 503 aminosyrer. Den har 953 bp av 3' utranslatert sekvens og ikke alle er essensielle for ced-3 ekspresjonen; genomiske konstruksjoner som ikke inneholder 380 bp av 3'-meste regionen (pJ107 og dets derivater, se fig IA) hadde evne til å oppfange ced-3 mutant fenotype. cDNA endende med en poly-A sekvens som tyder på at den fullstendige 3' enden av ced-3 transkriptet er tilstede.

For å bekrefte DNA sekvensen oppnådd fra ced-3 cDNA og å studere strukturen til ced-

3 genet ble den genomiske sekvensen til ced-3 genet fra plasmid pJ107 bestemt. Innskuddet i pJ107 er 7656 bp i lengde (fig 2).

For å bestemme beliggenheten og naturen til 5' enden av ced-3 transkriptet ble en kombinasjon av primerekstensjon og amplifikasjon ved anvendelse av polymerasekjedereaksjon (PCR) anvendt. To primere, Pexl og Pex2, ble anvendt for primerekstensjon. Pexl reaksjonen ga to hovedband, mens Pex2 reaksjonen ga bare ett bånd. Pex2 båndet tilsvarer i størrelse med med det mindre båndet fra Pexl reaksjonen og er i samsvar når det gjelder lengden med et mulig transkript som blir trans-spleiset til en C. elegans spleiseleder (Bektesh et al, Genes & Dev. 2:1277-1283 (1988)) ved en konsensusspleiseakseptor ved posisjon 2166 av den genomiske sekvensen. Naturen til det større Pexl båndet er uklart.

For å bekrefte disse observasjonene ble villtype total RNA reverstranskribert og deretter amplifisert ved anvendelse av primerene SLI og log-5 etterfulgt av reamplifikasjon ved anvendelse av primeren SLI og oligolO. Et produkt med ventet størrelse ble klonet inn i PCR 1000 vektoren (Invitrogen) og sekvensert. Sekvensen oppnådd bekreftet tilstedeværelse av en ced-3 message trans-spleiset til SLI ved posisjon 2166 av den genomiske sekvensen. Disse eksperimentene tyder på at et ced-3 transkript blir trans-spleiset til C. elegans spleiselederen SLI (Bektesh et al, Genes & Dev. 2:1277-1283 (1988)) ved en konsensus spleiseakseptor i posisjon 2166 av den genomiske sekvensen. Basert på disse observasjonene ble det konkludert at startkodonet til ced-3 er metionin kodet i posisjon 2232 av den genomiske sekvensen og at ced-3 har en lengde på 503 aminosyrer.

Antatt ced-3 er hydrofilt (256/503 residier er ladete eller polare) og inneholder ikke noen innlysende potensielle trans-membrandomener. En region av ced-3 er rik på seriner: fra aminosyre 107 til aminosyre 205, 32 med 99 aminosyrer er serinresidier.

Sekvensene til 12 EMS-induserte ced-3 mutasjoner (tabell 1) ble bestemt. Åtte er missensmutasjoner, tre er nonsens mutasjoner og en endrer et konservert G ved spleise akseptorsetet til intron 6. Ni av disse 12 mutasjonene endrer residier innenfor de siste 100 aminosyrene til proteinet, og ingen oppstår innenfor den serinrike regionen.

Nukleotid og kodonposisjoner tilsvarer nummereringen i fig 2.

For å identifisere funksjonelt viktige regioner av ced-3 ble de genomiske sekvensene til ced-3 genene fra de relaterte nematodeartene C. briggsae og C. vulgaris klonet og sekvensert. Sekvenssammenligning av tre ced-3 gener viste at de relativt ikke-serinrike regionene til proteinene er mere konserverte enn de serin-rike regionene (fig 3A) alle 12 EMS-induserte ced-3 mutasjonene endret residiene som blir konservert blant de tre artene. Disse resultatene tyder på at den ikke-serin-rike regionen er viktig for ced-3 funksjonen og at den serin-rike regionen er enten uviktig eller at residiene i den er funksjonelt overfløding.

ced-3 proteinet er likt med pattedyr ICE og nedd-2 proteinene

En granskning av GenBank, PIR og SWISS-PROT databasene viste at ikke-serin-rike regioner til ced-3 er like hICE og mICE (fig 3A). De mest sterkt konserverte regionene blant proteinene vist i figur 3A består av aminosyrene 246-360 til ced-3 og aminosyrene 166-287 til hICE: 49 residier er identiske (43 % identitet). Aktive setecystein til hICE er beliggende ved cystein 285 (Thornberry et al, Nature 356:768-774 (1992)). Fem amino- syrepeptidet (QACRG) rundt dette aktive cysteinet er det lengste konserverte peptidet blandt mICE og hICE og ced-3.

hICE består av to subenheter (p20 og plO) som ser ut til å bli proteolytisk spaltet fra et enkelt proenzym til det modne enzymet (Thornberry et al, Nature 356:768-774 (1992)). To spaltningsseter i proenzymet, Asp-Ser i posisjonene 103 og 297 til hICE, blir konservert i ced-3 (posisjon 131 og 371).

Den C-terminale delen av ced-3 og plO subenheten til hICE er likt med proteinproduktet til murint nedd-2 gen. ced-3, nedd-2 og hICE er 27 % identisk (fig 3A). nedd-2 inneholder ikke QACRG peptidet ved det aktive setet til hICE og mICE (fig 3A). 7 av de 8 punktmutasjonene som ble analysert (n718, nl040, ni 129, ni 164, n2430, n2426 og n2433) resulterer i alterneringer av aminosyrer som er konservert eller halvkonservert blant de tre nematode ced-3 proteinene, hICE og nedd-2. Mutasjonen n2433 innfører en Gly til Ser forandring nære ved antatt aktiv cystein (fig 2, tabell 1).

Genene ced-3 og ced-4 er bare gener kjent for å være nødvendig for programert celle-død i C. elegans. (Ellis et al, Cell 44:817-829 (1986)). Genetiske og molekylære studier har vist at ced-3 genet har en del fellestrekk med ced-4 (se Yuan et al, Dev. 116:309-320

(1992)). Som ced-4 er ced-3 ikke nødvendig for levedyktighet. Det ser ut til å inneholde sekvensen for et enkelt mRNA som blir uttrykt for det meste i embryoet, stadiet hvorved de fleste programerte celledødsfall oppstår. Akkurat som ced-3 genfunksjonen ikke er nødvendig for ced-4 genekspresjonen (Yuan et al, Dev. 116:309-320 (1992)), er ced-4 genfunksjonen ikke nødvendig for ced-3 genekspresjonen. Disse to genene ser ikke ut til å kontrollere programert celledød ved å virke sekvensielt i en regulatorisk transkripsjonen kaskade. Ulikt ced-4 (Yuan et al, Dev. Biol. 138:33-41 (1992)) blir ced-3 uttrykt i et vesentlig nivå i unge voksne. Denne observasjonen tyder på at ced-3 ekspresjonen ikke er begrenset til celler som gjennomgår programert celledød.

ced-4 aminosyresekvensen er ny. To regioner viser likhet med EF-hand motivet, som binder kalsium (Yuan et al, Dev. 116:309-320 (1992)). Av denne grunn er det blitt foreslått at ced-4 proteinet, og følgelig, programert celledød i C. elegans, kan bli regulert av kalsium, ced-3 inneholder en region med 99 aminosyrer som inneholder 32 seriner. På grunn av at seriner har felles fosforyleringsseter (Edelman et al, Ann. Rev. Biochem. 56:567-613 (1987)), kan ced-3 og følgelig, programert celledød i C. elegans

bli regulert ved fosforylering. Fosforylering er tidligere blitt foreslått å virke i celledød (McConkey et al, J. Immunol. 145:1227-1230 (1990)). McConky et al har vist at flere

midler som hever cytosolisk cAMP nivåer induserer tymocytdød. Dette tyder på at proteinkinase A kan mediere celledød ved fosforylering av visse proteiner. Til tross for at den nøyaktige sekvensen til den serin-rike regionen varierer blant tre Caenorhabditis arter som er studert er det relativt høye antallet seriner konservert i C. elegans, C. briggsae og C. vulgaris. Ingen av mutasjonene i ced-3 påvirker den serin-rike regionen. Disse observasjonene er i samsvar med hypotesen om at tilstedeværelse av seriner er mere viktig enn den nøyaktige aminosyresekvensen innenfor denne regionen.

Mye mer viktig enn tilstedeværelse av den serin-rike regionen i ced-3 er likheten mellom ikke-serin-rike regioner til ced-3 og hICE og mICE.

Karboksyhalvdelen av ced-3 er regionen som er mest lik ICE. Et område med 115 residier (aminosyrene 246-360 til ced-3) er 43 % identisk mellom ced-3 og hICE. Denne regionen i ICE inneholder et konservert pentapeptid QACRG (posisjonene 361-365 til ced-3) som omgir aktivt cystein. Spesifikk modifikasjon av denne cysteinen i hICE resulterer i fullstendig tap av aktivitet (Thornberry et al, Nature 356:768-774 (1992)). ced-3 mutasjon n2433 endrer konservert glysin i dette pentapeptidet og eliminerer ced-3 funksjonen. Dette tyder på at dette glysinet er viktig for ced-3 aktiviteten og er en indre del av det aktive setet til ICE. Det er interessant at mens mutasjonene n718 (posisjon 67 ifølge ced-3) og ni 040 (posisjon 27 til ced-3) eliminerer ced-3 funksjonen in vivo inneholder de endringer i de konserverte residiene som ligger utenfor den modne P20 subenheten til hICE (Thornberry et al, Nature 356:768-774 (1992)). Disse residiene kan ha en ikke-katalytisk rolle i både ced-3 og ICE funksjonen, f.eks kan de opprettholde en riktig konformasjon for proteolytisk aktivering. hICE forløperen (p45) blir proteolytisk spaltet ved 4 seter (Asp 103, Asp 119, Asp297 og Asp316) for å danne p24, p20 og plO (Thornberry et al, Nature 356:768-774 (1992)). Minst to av spaltningssetene blir konservert i ced-3. Dette indikerer at ced-3 proteinet blir prosessert.

Denne likheten mellom ced-3 og ICE tyder på at ced-3 virker som en cysteinprotease som kontrollerer programert celledød ved proteolytisk aktivering eller inaktivering av et substratprotein. Et substrat for ced-3 kan være produktet av ced-4 genet som inneholder 6 Asp residier. Disse kan bli målsøkt til ced-3 (Asp25, Aspl51, Aspl85, Aspl92, Asp459 og Asp541). Alternativt kan ced-3 direkte forårsake celledød ved proteolytisk spaltning av visse proteiner eller subcellulære strukturer som er helt avgjørende for cellelevedyktigheten.

ced-3 og ICE er en del av en ny proteinfamilie. Thornberry et al foreslår at sekvensen GDSPGI posisjon 287 til hICE ligner et GX(S/C)XG motiv som finnes i serin og cystein proteaseaktive seter (Nature 356:768-774 (1992)). I de tre nematode ced-3 proteinene som er blitt undersøkt er bare første glysin konservert, og i mICE er S/C ikke tilstede. Dette tyder på at ced-3ACE familien har liten sekvenslikhet med kjente proteasefamilier.

Likhet mellom ced-3 og ICE tyder ikke bare på at ced-3 virker som en cysteinprotease, men også at ICE virker i programert celledød i virveldyr. Det er blitt observert at etter at murine peretoneale makrofager blir stimulerte med lipopolysakkarider (LPS) og indusert og gjennomgått programert celledød ved eksponering for ekstracellulært ATP, blir moden aktiv IL-1 p frigjort i kultursupernatanten. Når cellene blir skadet ved skraping blir IL-1 P frigjort eksklusivt som inaktiv proform (Hogoquist et al, Proe. Nati. Acad. USA 88:8485-8489 (1991)). Disse resultatene tyder på at ICE blir aktivert ved induksjon av programert celledød. ICE transkriptet er blitt detektert i celler som ikke danner IL-lp (Cerretti et al, Science 256:97-100 (1992)) og dette tyder på at andre ICE substrater eksisterer. Dette tyder på at ICE vil mediere programert celledød ved spaltning av et substrat som er forskjellig fra IL-1 p.

Karboksyterminale deler av både ced-3 og plO subenheten til hICE ligner proteinet som blir kodet av nedd-2. På grunn av at nedd-2 mangler det QACRG aktive domenet kan det virke slik at det regulerer ICE eller ICE lignende p20 subenheter. Det er interessant at fire ced-3 mutasjoner endrer residier konservert mellom nedd-2 og ced-3. nedd-2 genekspresjonen er høy iløpet av den embryoniske hjerneutviklingen når en slik programert celledød oppstår. Disse observasjonene tyder på at nedd-2 virker i programert celledød. C. elegans gen ced-9 beskytter celler fra å gjennomgå programert celledød ved direkte eller indirekte antagonisering av aktivitetene til ced-3 og ced-4 (Hengartner et al, Nature 356:494-499 (1992)). bcl-2 påvirker også forløpet av apoptotisk celledød. Dersom hICE eller en annen ced-3/ICE familiemedlem er involvert i virveldyrprogramert celledød kan bcl-2 virke ved å modulere dets aktivitet. Det faktum at bcl-2 er et dominant onkogen tyder på at hICE og andre ced-3/ICE familiemedlemmer kan bli resissive onkogener. Eliminering av slike celledødgener vil forhindre normal celledød og fremme malignhet, akkurat som overekspresjon av bcl-2.

EKSEMPEL 2

Muse ICE homologe (mICE) fra et musethymus cDNA bibliotek (Stratagene) ble klonet ved lav stringenshybridisering ved anvendelse av hICE som en probe. Klonet er identisk med klonet isolert av Nett et al (J. Immun 149:3245-3259 (1992)) med unntakelse av at basepar 166 er en A og koder for Asn i steden for Asp. Dette kan være en DNA poly-morfisme på grunn av at klonet ble avledet fra en B6/CBAF1J (C57Black x CBA) et cDNA stamme bibliotek (Stratagen) mens Nett et al klonen ble avledet fra et WEH13 cDNA bibliotek (Stratagene). Påfølgende eksperimenter har vist at denne variasjonen er ikke i en region som er vesentlig for ICE funksjonen (se nedenfor).

Et forbigående ekspresjonsystem ble utviklet for å bestemme om overekspresjon av mICE dreper cellene. mICE cDNA ble fusjonert med E. coli lac-Z genet og plassert under kontroll av kylling (3-actin promoteren (fig 4). For å teste funksjonen til subenhetene, P20 og PlO, som blir prosessert fra et forløperpeptid, ble to ytterligere fusjonsgener dannet (P20/P10-lacZ og PlO-lacZ).

Konstruksjonene, vist i figur 4, ble transfektert inn i rotte-1 cellene ved kalsiumfosfat-presipitering. 24 timer etter transfeksjonen ble cellene fiksert og X-gal ble tilsatt. Friske levende rotteceller er flate og godt festet til platene, mens døende celler er runde og flyter ofte inn i mediet. Etter 3 timers fargeutvikling var de fleste blå cellene transfektert med intakt mICE-lacZ eller P20/P10-lacZ runde. De fleste blå cellene transfektert med PlO-lacZ eller kontroll lac-Z konstruksjonen var derimot normale flate celler (tabell 2). Lignende resultater ble oppnådd med NG 108-15 neuronale celler (ikke vist).

Tabell 2 Overekspresjon av mICE forårsaker at Rat-1 cellene gjennomgår programert celledød

Konstruksjonene vist i figur 4 ble forbigående transfektert inn i Rat-1 celler, Rat-1 celler som uttrykker bcl-2 (Rat-l/bcl-2) eller Rat-1 celler som uttrykker crmA (Rat-l/crmA).

24 timer etter transfeksjon ble cellene fiksert og farget med X-gal i 3 timer. Data vist er prosentandeler av runde blå celler blant totale antall blå celler. Data ble samlet fra minst tre forskjellige eksperimenter.

Fremgangsmåter: a: Konstruksjon av bcl-2 ekspresjonsvektor (pJ425): pJ415 ble konstruert ved først å innsette 5', 400 bp Nglll/BamHI crmA fragmentet inn i BamHI setet til pBabe/puro vektoren og deretter innsetting av gjenværende 1 kb BamHI crmA fragment inn i 3' BamHI setet i sensretning. b: Konstruksjon av bcl-2 ekspresjonsvektor (pJ436): pJ436 ble kosntruert ved innsetting av et EcoRI/Sall bcl-2 fragment inn i EcoRI/Sall setene til pBabe/puro vektoren, c: Etablering av Rat-1 cellelinjer som overuttrykker crmA og bcl-2: pJ415 og pJ436 ble elektroporert inn I ¥ CRE retroviralt pakkende celler (Danos et al, Proe. Nati. Acad. Sei (USA) 85:6460-6464 (1988)) ved anvendelse av et BioRad elektroporasjonsapparat. Supernatant enten fra over natt forbigående transfekterte ^CRE celler eller fra stabile linjer av *PCRE celler som uttrykker enten crmA eller bcl-2 ble anvendt for å infisere Rat-1 celler over natt i nærvær av 8 |ag/ml polybren. Resistente celler ble selektert ved anvendelse av 30 jag/ml puromycin i omtrent 10 dager. Resistente kolonier ble klonet og undersøkt for ekspresjon ved anvendelse av både northern og western blots, bcl-2 antistoffer var fra S.J. Korsmeyer og fra DAKO. crmA antiserum ble dannet ved immunisering av kaniner med et E. coli uttryket crmA fusjonsprotein (pJ434. pJ434 ble dannet ved innsetting av et EcoRI/Sall fragment av crmA cDNA inn i EcoRI/Sall setene til pET21a (Novagen) og fusjonsproteinet ble uttrykt i E. coli BL21 (DE3) stammen. Multiple linjer som uttrykker enten bcl-2 eller crmA ble undersøkt for supresjon av mICE indusert celledød og alle viste lignende resultater.

Når cellene ble farget med rhodamin-koblet anti-P galaktosidaseantistoff og Hoechst fargestoff ble det funnet at P-galaktosidase-positive runde celler hadde kondenserte, fragmenterte kjerner. Slike kjerner indikerer programert celledød. Når observert med et elektronmikroskop var X-gal reaksjonsproduktet elektrontett og dette muliggjør at celler som uttrykker mICE-lacZ blir skjeldne fra andre celler (Snyder et al, Cell 68:33-51

(1992)). Cellene som uttrykker det chimeriske genet viste kondensert kromatin og membranblæredannelse. Dette er karakteristisk for celler som gjennomgår programert celledød (Wyllie, A.H. i Cell Death in Biology and Pathology, 9-34 (1981); Oberhammer et al, Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 89:5408-5412 (1992); Jacobson et al, Nature 361:365-369 (1993)). Resultatene indikerer at overekspresjon av mICE induserer programert celledød og at induksjonen avhenger av både P20 og PlO subenhetene.

Når fargeutvikling i rotte-1 celler transfektert med mICE-lacZ eller P20/P10-lacZ blir latt forløpe i 24 timer blir et større antall av flate celler blå. Dette resultatet indikerer at celler tolerer lavere nivåer av ICE aktivitet.

Dersom mICE er en virveldyrhomolog av ced-3 kan det hende at ced-3 også kan forårsake celledød i virveldyr. Denne hypotesen ble testet ved å danne en ced-3-lacZ fusjonkonstruksjon og undersøkelse av dets evne til å forårsake celledød ved anvendelse av analysen som beskrevet ovenfor. Som ventet forårsaket ekspresjon av ced-3 død i Rat-1 celler (tabell 2).

Dersom mICE virker på en lignende måte som ced-3 vil mutasjoner som eliminerer ced-3 aktiviteten i C. elegans også eliminere aktiviteten i virveldyr. Denne hypotesen ble testet ved mutering av Gly residiet i den pentapeptide aktive domenen til hICE, QACRG til Ser. Det ble oppdaget at denne mutasjonen eliminerer evnen som både mICE og ced-3 har til å forårsake rottecelledød i Rat-1 celler (tabell 2).

crmA inhiberer spesifikt ICE aktiviteten (Ray et al, ovenfor). For å demonstrere at celledød assosiert med overekspresjon av mICE er forårsaket av den enzymatiske aktiviteten til mICE ble Rat-1 cellene infisert med en pBabe retroviral konstruksjon (Morgenstern et al, Nucl. Acids Res. 18:3587-3596 (1990)) som uttrykker crmA og cellelinjer ble identifisert som produserer høye nivåer crmA. Når mICE-lacZ konstruksjonen ble transfektert inn i disse cellelinjene ble det oppdaget at en stor prosentandel blå celler hadde en frisk, flat morfologi (tabell 2). I tillegg, fører en punktmutasjon som forandrer Cys residiet i aktiv sete pentapeptidet QACRG til en Gly til eliminering av evnen som mICE har til å forårsake celledød (konstruksjon p|3actM17Z, figur 4, tabell 2). Dette resultatet indikerer at den proteolytiske aktiviteten til mICE er vesentlig for dets evne til å drepe celler.

bcl-2 kan også forhindre eller inhibere celledød (Vaux et al, Nunez et al, Strasser et al, Sentman et al, ovenfor. Rat-1 celler ble infisert med pBabe retroviral konstruksjon som uttrykker bcl-2. Transfeksjon av mICE-lacZ fusjonskonstruksjon inn i cellelinjer som overuttrykker bcl-2 viste at en høy prosentandel blå celler nå var friske (tabell 2).

Celledød indusert ved overekspresjon av mICE kan følgelig bli undertrykt av bcl-2. Dette resultatet indikerer at celledød indusert ved overekspresjon av mICE sannsynligvis blir forårsaket av aktivering av en normal programert celledødmekanisme. Resultatene tyder alle på at virveldyrene har en genetisk reaksjonsvei med programert celledød som ligner den til C. elegans (figur 5).

EKSEMPEL 3

Som beskrevet ovenfor er det ventet at genene i ICE/ced-3 familien virker iløpet av initiering av programert celledød. For å identifisere ytterligere medlemmer av denne genfamilien ble cDNA kodende for hICE anvendt for å screene et musethymus cDNA bibliotek (Stratagene) under betingelser med lav stringens. Ved anvendelse av denne prosedyren ble et nytt gen identifisert og betegnet mIch-2 (se figur 6 for cDNA sekvens og avledet aminosyresekvens til mIch-2).

Figurene 7 og 7A viser at proteinet som blir kodet av mIch-2 inneholder signifikant homologi med hICE, mICE og ced-3. Sekvenshomologi indikerer at mIch-2, som mICE, er et virveldyrecelledødgen.

Northern blot analyser viser at ekspresjon av mIch-2, ulikt mICE, som hovedsakelig blir uttrykt iløpet av den embryoniske utviklingen, er begrenset til thymus og morkaken, områder hvor celledød ofte oppstår. I tillegg ble det funnet at ekspresjon av mIch-2 i thyms kan bli indusert av deksametason, et middel som forårsaker thymusregresjon. Det blir følgelig konkludert at mIch-2 er et thymus/morkakespesifikt virveldyrcelledødgen.

EKSEMPEL 4

Omfattende celledød oppstår i det utviklende nervesystemet (Oppenheim, R.W. Ann. Rev. Neurosci. 145:453-501 (1991)). Mange neuroner dør i løpet av perioden med synapsedannelse. I løpet av denne kritiske perioden avhenger overlevelsen av neuronene på evnen til neuraltrofiske faktorer. Overlevelsen av isolerte primære neuroner in vitro avhenger hovedsakelig av tilstedeværelse av slike trofiske faktorer (Davies, A.M. Development 100:185-208 (1987)). Fjerning av slike faktorer induserer neuronal celledød, vanligvis i løpet av 48 timer. Død i sympatetiske neuroner og sensoriske neuroner hvor overlevelsen avhenger av en eller flere medlemmer av nervevekstfaktor-familien (nervevekstfaktor, hjerne-avledet neurotrofisk faktor og neutrofin-3) kan bli forhindret ved mikroinjeksjon av en bcl-2 ekspresjonsvektor (Garcia I. et al, Science 258:302-304 (1993); Allsopp et al, (1993)). For å undersøke om genene i ICE/ced-3 familien er involvert i neuronal celledød ble evnen som crmA (som inhiberer ICE) har til å inhibere død av kyllingdorsalrot ganglioniske neuroner indusert ved fjerning av NGF. Det ble oppdaget at mikroinjeksjon av en ekspresjonsvektor inneholdende crmA inhiberer død av DRG neuroner like effektivt som bcl-2 ekspresjonsvektoren (Gagliardini, V. et al, Science 263:826-828 (1994)). Dette resultatet demonstrerer at genene i ICE/ced-3 familien spiller en rolle når det gjelder å regulere neuronal celledød i løpet av utviklingen.

EKSEMPEL 5

Resultater

Kloning av Ich-1

Proteinproduktet til C. elegans celledødgenet, ced-3, er homologt med produktet til musegenet, nedd-2. nedd-2 cDNA i databanken har en åpen leseramme på 171 aminosyrer og har lange 3' og 5' utranslaterte regioner. Dette 171 aminosyre nedd-2 proteinet inneholder ikke den aktive domenen QACRG av ICE og ced-3 proteinene og er homolog bare med PlO subenheten til pattedyr ICE og den C-terminale delen av ced-3. Ved analysering av nedd-2 cDNA oppdaget oppfinnerene at det inneholder en sekvens som kan potensielt kode for et QACRG pentapeptid, men at sekvensen er i en annen leseramme. Oppfinnerene betraktet muligheten av at nedd-2 cDNA isolert av Kumar et al inneholder andre kloningsformer og at et annet nedd-2 transkript koder for et protein som er homologt med både P20 og PlO subenhetene til ICE.

En muse nedd-2 probe ble dannet ved polymerasekjedereaksjon (PCR). Ved anvendelse av denne proben ble tre cDNA bibliotek screenet. Et museembryonisk dag 11,5 cDNA bibliotek fra CLONTECH (en million kloner screenet), et humant føtalt hjerne cDNA bibliotek fra James Gusella's laboratorium (10 millioner kloner screenet), og et humant føtalt hjerne cDNA bibliotek fra Stratagene (en million kloner screenet). De lengste positive cDNA klonene ble oppnådd fra Stratagene DNA biblioteket. Fra Stratagene biblioteket ble to cDNA arter (pBSH37 og pBSH30) identifisert som koder for to nært beslektede proteiner som er homologe med muse nedd-2 (figurene 10-12).

Innskuddet til pBSH37 (2,5 kb) koder for et protein med 435 aminosyrer som inneholder aminosyresekvenslikheter med både P20 og PlO subenhetene til hICE og hele ced-3. Innskuddet til pBSH30 (2,2 kb) har en åpen leseramme med 512 aminosyrer og inneholder ytterligere 61 bp et basepar etter sekvensen kodende for QACRG. Dette forårsaker en tidlig terminering av proteintranslasjonen. Northern blot analyser viser at ekspresjonen av dette humane genet er forskjellig fra ekspresjonen av nedd-2 (Kumar et al) og sekvensene ble følgelig gitt nye navn Ich-lj^ (pBSH37) (figur 10A) og Ich-lg (pBSH30 (figur 10B).

En sammenligning av cDNA sekvensens viste at Ich-1 § cDNA er forskjellig fra Ich-lL ved 5' enden, rundt begynnelsen av translasjonsinitieringen og ved tilstedeværelse av et ytterligere intron i midten av Ich-lg cDNA (figur 1 IB). Den første forskjellen er ved begynnelsen av den kodende regionen. Antatte første metionin til Ich-lg er 15 aminosyrer nedstrøms fra den første metioninen til Ich-1 l; første 35 bp Ich-lg er forskjellig fra Ich-lL °8 innbefatter et stoppkodon (figurene 10A og 10B). PCR analyse ved anvendelse av primere spesifikke for første 35 bp til Ich-1 og Ich-lg spesifikt intron (se nedenfor) og human morkake cDNA som templat, amplifiserte et DNA fragment med antatt størrelse. Dette tyder på at 35 bp Ich-1 g-spesifikk sekvens ikke er en spesiell kloningsform og er tilstede i endogen Ich-lg mRNA.

Den andre forskjellen er distal for den aktive domenen QACRG. Ich-lg begynner å være forskjellig fra Ich-lL et basepar etter den kodende regionen til det aktive setet QACRG. Forskjellen er forårsaket av et 61 bp innskudd som resulterer i et terminerings-kodon 12 aminosyrer nedstrøms fra innskuddet. De siste to identiske baseparene til Ich-lg og Ich-lL er AG som er den generelle eukaryotiske spleisedonor konsensus-sekvensen (Mount, 1982).

For å eliminere muligheten av at 61 bp innskuddet i pBSH30 er et resultat av ufullstendig RNA prosessering ble begge formene av murin Ich-1 klonet fra voksen musehjerne mRNA ved PCR ved anvendelse av primere som flankerer innskuddssetet som beskrevet (ekspreimentell del). De resulterende 233 og 172 bp fragmentene (figur 1 IB) ble klonet separat og sekvenser. Tre murine Ich-lL og to murine Ich-lg kloner ble sekvensert. Sekvenseringen bekreftet at murin Ich-lg inneholder det samme 61 bp innskuddet som i human Ich-lg ved samme posisjon (figur 1 IA).

Kylling Ich-1 fra et embryoinsk kylling cDNA bibliotek (Clontech) ble også klonet ved anvendelse av en kylling Ich-1 probe oppnådd ved PCR (se eksperimell del). To kloner ble isolert. En koder for Ich-lL°8den andre koder for Ich-lg som inneholder et 62 bp innskudd ved samme posisjon. DNA sekvensen til 62 bp innskuddet er 72 % identisk med det til human og murin Ich-1§og forårsaker også prematur terminering av proteintranslasjonen. Det ekstra baseparet i intronet til kylling Ich-lg forårsaker at aminosyresekvensen til de siste 41 aminosyrene til kylling Ich-lg er forskjellig fra human og murin Ich-lg; men forkorting av proteinet kan være det viktige punktet.

For å undersøke opprinnelsen til 61 bp innskuddet i murint og humant Ich-lg ble muse-genomisk Ich-1 DNA klonet. Analyser viste at 61 bp er fra et intron hvor sekvensen er identisk i human og muse Ich-1. Forskjellene mellom Ich-lg og Ich-lL er forårsaket ved alternativ spleising fra to forskjellige 5' spleisedonorsekvenser. De første to baseparene til 61 bp intronet og de to baseparene etter 61 bp intronet er GT (figur 1 IA). Denne sekvensen er 100 % konservert generell eukaryotisk spleisedonorkonsensussekvens (Mount, 1982). DNA sekvensen ved 31 spleiseakseptorsetet er AG. Denne sekvensen er 100 % konservert eukaryotisk spleiseakseptorsekvens (figur 1 IA). DNA sekvensene ved spleisegrensen er følgelig fullstendig i samsvar med alternativ spleising av Ich-lg.

Som resultat av innskudd av et intron mellom de kodende regionene blir den åpne leserammen til Ich-lg delt inn i to: det første koder for et 312 aminosyrepeptid homologt med P20 subenheten til hICE. Den andre koder for et 235 aminosyrepeptid som er homologt med en del av P20 subenheten og PlO subenheten til hICE. Den andre er nesten identisk med muse nedd-2 (figur 1 OB). Dataene tyder på at bare den første åpne leserammen blir translatert i cellene. Et skjematisk diagram av Ich-lL°8Ich-lg er vist i figur 1 IB.

Ich-lL inneholder likheter med både ICE (27 % identitet og 52 % likhet) og ced-3 (28

% identitet og 52 % likhet) (figurene 12A og 12B). Homologi melom Ich-1 og ced-3, Ich-1 og ICE er omtrent lik.

Ich-1 blir uttrykt i mange ved og THP-1 celler som uttrykker interleukin-ip omdannende enzym.

For å karakterisere funksjonen til Ich-1 ble ekspresjonsmønsteret til Ich-1 undersøkt. Northern blot analyser av human føtalt hjerte, hjerne, lunge, lever og nyrevev ble utført ved anvendelse av innskudd ifølge pBSH37 som en probe. Proben hybridiserer til både Ich-lg og Ich-lL transkriptene. Analyser viste at 4 bp Ich-1 mRNA blir uttrykt ved de samme lave nivåer i alle vev som er undersøkt. Når det samme northern blotet (full stendig strippet for tidligere prober) ble analysert ved anvendelse av Ich-lg 61 bp intronet som en probe (som hybridiserer bare til Ich-lg transkriptet), ble det vist at Ich-1 g blir uttrykt i en større mengde i embryonisk hjerte og hjerne enn i lunge, lever og nyre. Dette resultatet demonstrerer at i embryonisk lunge, lever og nyre blir Ich-1 l uttrykt i høyre grad enn Ich-lg. I northern blot analyser av voksen RNA med pBSH37 probe, blir Ich-1 detektert i alle undersøkte vev. Nivået er høyere i morkake, lunge, nyre og bukspyttkjertel enn i hjertet, hjerne, lever og skjelettmuskel.

For å studere ekspresjonen av Ich-lL i l0Pet av utviklingen av museembryoet ble en kvantitativ RT-PCR analyse utviklet ved anvendelse av spesifikke primere som differensierer mellom Ich-lL og Ich-lg. Primerene ble syntetisert og flankerer 61 bp intronsekvensen til Ich-1 g. De to primerene er beliggende i separate eksoner separert med dets 2,8 kb intron i genomisk DNA. Muligheten av genomisk DNA kontaminasjon ble eliminert. Ich-lL°S Ich-lg ble amplifisert samtidig for å produsere DNA fragmenter med 172 bp og 233 bp. cDNA templatene ble revers-transkribert fra mRNA isolert fra thymus, voksent hjerte, voksen nyre, embryonisk 15d hjerne og voksen hjerne. Negativ (uten DNA templat) og positiv (Ich-lg og Ich-^) kontroller ble anvendt. Actinprimere ble anvendt i et sett av hver prøve. Analysene viste at bare ekspresjon av Ich-lL ^an Du detektert i thymus, mens ekspresjonen av både Ich-lL og Ich-lg kan bli detektert i hjerte, nyre og både embryonisk og voksen hjerne. Ekspresjon av Ich-lg ble funnet å være høyest i embryonisk hjerne ifølge denne PCR analysen. Resultatene er i samsvar med northern blot analysene beskrevet ovenfor. Resultatene var reproduserbare blant multiple mRNA preparater.

For å undersøke om Ich-1 og hICE blir uttrykt i samme celler ble et northern blot av THP-1 og U937 cellene analysert med Ich-1 proben, pBSH37. hICE ekspresjon er blitt detektert i disse cellene (Thornberry, N.A. et al, Nature 356:768-774 (1992);; Cerretti, D.P. et al, Science 256:97-100 (1992)). Oppfinnerene oppdaget at Ich-1 kan bli detektert i THP.l og U937 cellene. Både Ich-1 og hICE blir uttrykt i THP.l og U937 cellene.

Ich-lg, Ich-lL°8hICE ekspresjonen ble sammenlignet i humane cellelinjer. Ved anvendelse av en lignende kvantitativ RT-PCR analyse ble ekspresjon av Ich-lL, Ich-lg og hICE sammenlignet i HeLA, Jurkat, THP.l og U937 celler. Ich-lL og Ich-lg ble amplifisert samtidig for å produsere DNA fragmenter med henholdsvis 234 bp og 295 bp. hICE ble amplifisert som et fragment med 191 bp. cDNA templater ble revers-transkribert fra mRNA isolert fra HeLa, Jurkat, THP.l og U937 celler. Negative (uten DNA templat) og positive (hICE cDNA) kontroller ble anvendt. pBSH37 og pBSH30 ble anvendt som positive kontroller for Ich-lL °8 Ich-lg ekspresjon. Kyllingactin cDNA ble anvendt som en positiv kontroll for actin. Ekspresjon av Ich-lg ble detektert i HeLa og Jurkat celler, men ikke i THP.l og U937 celler. Både hICE og Ich-1 transkriptene er tilstede i relativt høye nivåer i HeLa cellene. Nivået av Ich-1 transkriptet er høyere det til hICE transkriptet i Jurkat cellene. Både hICE og Ich-1 ekspresjonen blir detektert i THP.l og U937 celler.

Ved anvendelse av en kvantitativ RT-PCR analyse undersøkte oppfinnerene ekspresjonen av hICE og Ich-1 i normalt levende T-celle hybridom DOl 1.10 celler (Haskins, K. et al, Exp. Med. 157:1149-1169 (1983)) og døende DOl 1.10 celler (uten serum). Ekspresjon av både hICE og Ich-1 kan bli detektert i DOl 1.10 cellene. Det er interessant at ekspresjonsnivåene til både Ich-lL og hICE ser ut til å øke i døende DOl 1.10 cellene.

Overekspresjon av Ich-lL induserer rat-1 fibroblanstdød

For å undersøke funksjonen til Ich-lL ble det samme transientekspresjonssystemet anvendt for ICE (Miura, M. et al, Cell 75:653-660 (1993)) anvendt for å bestemme om overekspresjon av Ich-1 induserer programert celledød. Human Ich-lL cDNA ble fusjonert med E. coli lacZ genet og det fusjonerte genet ble plassert under kontroll av kylling 6-actin promoteren (pBactH37Z). Dette fusjonsgenet ble transfektert inn i Rat-1 cellene ved lipofectamin-mediert genoverføring og ekspresjon av genet ble undersøkt ved anvendelse av X-gal reaksjonen. Resultatene viser at det meste av blå (X-gal positive) Rat-1 celler transfektert transfektert med pPacfH37Z var runde. Disse resultatene ligner de som ble oppnådd med celler transfektert med mICE-lacZ fusjons-sekvensen vist i tabell 2.1 kontrast til dette var de fleste blå cellene transfektert med bare vektor flate og friske. Dette resultatet tyder på at ekspresjon av Ich-lL induserer Rat-1 cellene til å dø.

For å undersøke om celledød indusert av Ich-1 har noen celletypespesifisitet og å sammenligne dets effekt med den til mICE, mICE-lacZ og Ich-1 -lacZ ble fusjons-konstruksjoner transfektert til HeLa celler, Rat-1 celler og COS celler. Disse cellene uttrykker følgelig mICE-lacZ (ppactMlOZ), Ich-1 L-lacZ (pPactH37Z) og Ich-1 g-lacZ (pPactH30Zl) og lacZ kontroll (pactpgal'). Den celledrepende effekten ble analysert som i tabell 2. Resultatene er vist i tabell 3.

mICE-LacZ (ppactMlOZ), Ich-1 L-lacZ (ppactH37Z), Ich-1L (S303C)-IacZ (pp actH37CS), Ich-lL(T352A)-lacZ (ppactH37ZAT), Ich-ls-lacZ (pPactH30Zl) og kontrollvektor alene (pactpgal') ble forbigående transfektert inn i Rat-1 celler, Rat-1 celler uttrykker humane bcl-2, Rat-1 celler som uttrykker kukoppervirus crmA genet, HeLa celler, NG 108-15 celler og COS celler. Cellene ble fiksert lett i 24 timer etter transfeksjon og farget med X-gal i 3 timer. Data (gjennomsnitt ± SEM) vist er prosentandeler av runde blå celler blant totalt antall telte blå celler. Nummerene i parantesene er antall blå celler som er opptelt. Data ble samlet fra minst tre uavhengige eksperimenter. ND = ikke bestemt.

Sammenlignet med kontrollene utviser den cytotoksiske effekten til Ich-1 og mICE

visse celletypespesifisiteter. Ekspresjon av Ich-1 eller mICE dreper rotte-1 cellene og HeLa cellene effektivt (> 90 % døde). NG108 cellene er mere resistente overfor Ich-1

og mICE ekspresjon enn Rat-1 cellene og HeLa cellene (68-80 % døde). Ekspresjon av Ich-1 eller mICE kan ikke drepe COS cellene.

For å bekrefte at celledøden forårsaket av Ich-lL ekspresjon er apoptose undersøkte oppfinnerene den nukleære morfologien til celledød indusert ved Ich-1 ekspresjon. Rotte-1 cellene ble forbigående transfektert med kontroll pactPgal' vektor og 24 timer senere fiksert og farget med anti p galaktosidase antistoff eller med Hoechst fargestoff 33258 ved anvendelse av en protokoll fra Miura et al (1993). Den nukleære morfologien i p galaktosidase uttrykkende celler er normal og ikke-kondensert. Rat-1 cellene ble også forbigående transfektert med pPactH37Z som uttrykker Ich-lL- Kjernen til de runde cellene som uttrykker Ich-1 L-lacZ chimerisk gen ble kondesert og fragmentert. Dette er en av karaktertrekkene til celler som gjennomgår apoptose. Resultatene tyder følgelig på at overekspresjon av Ich-lL, som den til mICE, forårsaker at Rat-1 cellene gjennomgår programert celledød.

For å bestemme strukturen og funksjonen til Ich-lL proteinet ble to mutante Ich-lL fusjonsproteiner dannet: den første er en Ser Cys 303 i det aktive setet og Ich-lL; den andre er en Thr Ala 352 i den antatte PlO subenheten (fig 12A). Alle 352 i PlO er et aminosyreresidie til ced-3 som er konservert i Ich-lL, men ikke 1 ICE. De mutante Ich-lL-lacZ fusjonskonstruksjonene ble transfektert inn i Rat-1 cellene og ekspresjonen ble undersøkt i X-gal reaksjonen.

Analysen viste at S303C (ppactH37ZCS) og T352A (ppactH37ZAT) mutasjonene eliminerte aktiviteten til Ich-lL fullstendig (tabell 3). Disse resultatene tyder på at evnen som Ich-lL har til å forårsake celledød avhenger av dets enzymatiske aktivitet og at bare noen karaktertrekk til ced-3 er konservert i Ich-lL-

Celledøden indusert ved overekspresjon av ICE kan bli inhibert av bcl-2 og crmA (Miura, M. et al, Cell 75:653-660 (1993)). For å undersøke om celledøden indusert ved ekspresjon av Ich-lL også kan bli inhibert av bcl-2 og crmA, ble Ich-lL-lacZ fusjons-konstruksj onen (pPactH37Z) transfektert inn i Rat-1 celler som overuttrykte enten bcl-2 eller crmA. Celledød ble analysert som beskrevet i tabell 3. Resultatene viste at celledød indusert ved overekspresjon av Ich-lL kunne bli effektivt inhibert av bcl-2, men bare marginalt av crmA.

Ekspresjon av Ich-lg beskytter Rat-1 firbroblastdød indusert ved serumfjerning.

På grunn av at Ich-1 g inneholder to åpne lesereammer var det viktig å bestmme hvilken leseramme som blir funksjonelt translatert (figur 1 IA). Ich-lg ble translatert i nærvær av35 S metionin ved anvendelse av in vitro transkribert RNA i et retikulocyttlysat som beskrevet i eksperimentelle prosedyrer. De translaterte produktene ble kjørt på en SDS polyakrylamidgel med molekylvektstandarder. Ich-lg antisens RNA ble anvendt som en negativ kontroll. Resultatene viste at bare den første leserammen ble translatert.

For det andre ble E. coli lacZ genet fusjonert til endende av de første (pPactH30Zl) og andr (pPactH30Z2) åpne leserammer. Konstruksjonene ble separat transfektert inn i Rat-1 cellene og cellene ble analysert for farge ved anvendelse av X-gal reaksjonen. Resultatene viste at når lacZ genet ble fusjonert til enden av den første åpne leserammen kunne blå celler bli detektert. Blå celler ble ikke detektert når lacZ genet var fusjonert til den andre åpne leserammen. Det er følgelig sannsynlig at bare den første åpne leserammen blir anvendt in vivo.

For å karakterisere friksjonen av Ich-lg ble evnen som pPactH30Zl har til å forårsake celledød undersøkt. pPacfH30Zl ble transfektert inn i Rat-1 celler, COS celler, HeLa celler og NG108-15 celler og X-gal reaksjonen ble utviklet som før. Analysen viste at ekspresjon av pPactH30Zl ikke forårsaket celledød (tabell 3).

For å undersøke om Ich-lg har noen beskyttende effekt overfør celledød ble en stabil Rat-1 cellelinje som uttrykker Ich-lg etablert. cDNA Ich-lg ble klonet inn i pBabepuro retroviral ekspresjonsvektor (Morgenstern et al, Nucl. Acids Res. 18:3587-3596 (1990)) og transfektert inn i Rat-1 celler. De stabile transfektantene ble selektert i puromycin og individuelle kloner ble analysert for ekspresjon av Ich-lg ved northern blot analyser. Klonene som uttrykte Ich-lg ble anvendt for å analysering og klonene som ikke uttrykte Ich-lg ble anvendt som negative kontroller sammen med utransfekterte Rat-1 celler. Nomarski mikrografer ble tatt på dagene 0,2, 3 og 4 av kontroll Rat-1 cellene, Ich-lg ikke-uttrykkende Rat-1 celler, crmA uttrykkende Rat-1 celler og bcl-2 uttrykkende Rat-

1 celler i serumfritt medium. Trypan blå analyse ble også utført.

Når sådd ut til ikke-konfluent tetthet og forsiktig vasket døde 90 % av Rat-1 cellene i

det serumfrie mediet. Under disse betingelsene er Rat-1 celler som uttrykker bcl-2 eller crmA resistente overfor dødsfall (fig 13). Når evnen som stabile Rat-1 cellelinjer som

uttrykker human Ich-lg ble testet under serumfrie betingelser ble det oppdaget at de er mer resistente overfor serumdeprivasjon enn parentale Rat-1 celler og negative kontroll-transfektanter som ikke uttrykker Ich-lg (fig 13). Disse eksperimentene tyder på at Ich-lg har evne til å forhindre celledød.

Ich-lg kan forhindre celledød ved inhibering av Ich-lL- Oppfinnerene undersøkte følgelig om Rat-1 cellene uttrykker Ich-1. Ved avendelse av muse Ich-1 cDNA som en probe ble en mRNA art antatt med Ich-1 transkriptet detektert i Rat-1 celler under betingelser med lav stringens.

Diskusjon

Isolering og karakterisering av Ich-1, et pattedyrgen som hører til celledødgenfamilien

av ICE/ced-3 er blitt beskrevet. To bestemte Ich-1 mRNA arter er blitt identifisert (Ich-lL og Ich-lg). Disse to cDNA er forskjellige i 5' regionen rundt translasjonsinitieringen og i midtregionen. Forskjellen i midten er et resultat av den alternative anvendelsen av to forskjellige 5' spleisedonorseter.

Ich-1 genet blir uttrykt i lave nivåer i embryonisk og voksent vev. Ich-lg blir uttrykt i høyere nivåer enn Ich-lL i embryonisk hjerte og hjerne. Det motsatte gjelder i embryonisk lunge, lever og nyre. Ekspresjon av Ich-lg kan bli detektert i alle under-søkte vev unntatt thymus. Ekspresjon av både hICE og Ich-1 kan bli detektert i THP.l celler, HeLa celler, Jurkat celler, U937 celler og DOl 1.10 celler. Ekspresjon av både hICE og Ich-lL ser ut til å Øke i døende celler under serumtappede betingelser. Overekspresjon av Ich-lL 1 rottefibroblastceller forårsaket programert celledød forhindret av bcl-2. Dette tyder på at Ich-1 er et programert celledødgen. Overekspresjon av Ich-lg forårsaker derimot ikke celledød. Stabil ekspresjon av Ich-lg forhindret Rat-1 celledød indusert ved serumdeprivasjon. De kollektive resultatene viser at Ich-1 koder for proteinprodukter som regulerer celledøden positivt og negativt.

Muse nedd-2 genet ble opprinnelig isolert av Kumar et al, (Biochem. & Biophy. Res. Comm. 185:1155-1161 (1992)). nedd-2 genet ble identifisert å ha et transkript med 3,7 kb som blir hyppig uttrykt i embryonisk dag 10 musehjerne og nesten ikke kan detekteres i voksen hjerne, nedd-2 cDNA isolert inneholdende en åpen leseramme med 171 aminosyrer og lange 5' og 3' utranslaterte regioner med stoppkodoner i alle leserammene. 171 aminosyre åpen leseramme er homolog med PlO subenheten til hICE og den C-terminale delen av ced-3 (Yuan J. et al, Cell 75:641-752 (1993)). Aminosyre sekvensen til den C-terminale delen av Ich-lL er 87 % identisk med aminosyresekvensen til muse nedd-2 proteinet fra residiene 42 til 171 (de første 41 aminosyrene er forskjellige på grunn av tilstedeværelse av 61 bp intron). I mus er nedd-2 et unikt gen (L. Wang upubliserte data). Human Ich-1 og muse nedd-2 må følgelig være det samme genet.

I northern blot analysene beskrevet heri er Ich-1 ekspresjonen i human føtal hjerne ikke høy sammenlignet med andre testede vev (hjerte, lunge, lever og nyre) og ser ikke ut til å bli betydelig nedregulert i voksen hjerne. En del av forskjellen kan bli forklart ved forskjellige testede utviklingsstadier: muse E10 mot human 10-20 uker gamle fostre. Ich-1 ekspresjonen kan derimot bli detektert i vev fra voksne mennesker og mus.

I studiene heri ble amplifikasjon av den 5' utranslaterte regionen til muse nedd-2 cDNA som Kumar et al rapporterte ikke oppnådd. Det er mulig at den 5' utranslaterte regionen i Kumar et al klonen var et produkt av ufullstendig prosessert nedd-2 mRNA. Begge Ich-1 mRNA er på omtrent 4 kb på grunn av at cDNA klonene beskrevet heri er 2,5 kb og 2,2 kb for Ich-lL°S Ich-lg, og disse cDNA er ufullstendige. På grunn av at de er fullstendig funksjonelle i analysen rapportert heri bør de fullstendig kodende regionene bli kodet for i disse to cDNA.

Ich-1 er et nytt medlem av ICE/ced-3 familien til celledødgener. Pattedyr ulik C.

elegans må følgelig ha flere medlemmer av ICE/ced-3. Ich-1 er til og med noe mer homolog med ced-3 enn mICE. Celledød indusert ved overekspresjon av Ich-1 ble dårlig inhibert av crmA. Dette resultatet er likt det med ced-3 (Miura, M. et al, Cell 75:653-660 (1993)).

Nukleotidene som tilsvarer de to aminosyreresidiene til ced-3 som er konstruert i Ich-1, men ikke i ICE, ble mutageniserte. Resultatene viste at T352A eliminerte fullstendig evnen som Ich-1 har til å forårsake celledød til tross for det faktumet at den tilsvarende aminosyren i ICE er en Ser. Disse data tyder også på at Ich-1 er mekanisk mer lik ced-3 enn Ich-1 og at Ich-1 og ICE kan ha blitt utviklet uavhengig fra ced-3.

Overekspresjon av ICE og Ich-1 kan drepe Rat-1 celler og HeLa celler effektivt, men NG 108 cellene bare moderat. Det er mulig at NG 108 celler uttrykker et høyere nivå av ICE og Ich-1 inhibitorer. COS celler er fullstendig resistente overfor celledrepende aktivitet til ICE og Ich-1. COS celler kan mangle enten aktivatoren eller substrater av ICE og Ich-1. Dette resultatet tyder også på at de cytotoksiske effektene til ICE og Ich-1 har en viss spesifisitet og sannsynligvis ikke er forårsaket av tilfeldige spaltnings-aktiviteter til proteasene.

Ich-1 koder for proteinprodukter som forhindrer eller forårsaker celledød, avhengig av hvordan mRNA blir prosessert. Lignende regulering er blitt observert med bcl-x, et bcl-2 relatert ge (Boise et al, 1993). bcl-x transkriptene kan også bli prosessert på to forskjellige måter: større mRNA bcl-XL, koder for et bcl-2 relatert proteinprodukt som kan inhibere celledød. Alternativ spleising av bcl-x transkriptet danner et annet mindre transkript, bcl-xg. Dette koder for en indre forkortet versjon av bcl-x som inhiberer evnen som bcl-2 har til å forsterke overlevelsen av vekstfaktordepriverte celler. Kontroll av RNA spleising kan være et viktig regulatorisk punkt i programert celledød.

Ich-1 § kan virke slik at det forhindrer celledød ved inaktivering av aktivatoren av celle-død eller ved direkte inaktivering av Ich-lL-1 den forbigående transfeksjonsanalysen dreper ekspresjonen av Ich-lL-lacZ fusjonsgenet og ICE-lacZ fusjonsgenet de stabile Ich-lg-uttrykkende cellene like effektivt som kontroll Rat-1 cellene (L. Wang, upubliserte data). Ulikt crmA eller bcl-2 kan inhibisjon av celledød ved Ich-lg være sterkt doseavhengig. Dette kan forklare hvorfor ekspresjonen av Ich-lg bare ga delvis beskyttelse til serumdepriverte Rat-1 celler. Det er mulig at bare celler som uttrykker høye nivåer av Ich-lg er beskyttet.

crmA har evne til å undertrykke celledød indusert av overekspresjon av Ich-lL- Aminosyresekvensen til crmA er homolog med medlemmer av serpinsuperfamilien (Pickup et al, 1986) som vanligvis inhiberer serinproteaser ved å virke som pseudosubstrater. Naturen til interaksjon av ICE og cRMA proteinet er sannsynligvis interaksjonen av andre serpin og serinproteaser. Inhibisjon av ICE familimedlemmene ved crmA kan avhenge av både affiniteten og den relative konsentrasjon av ICR og crmA. Det faktum at crmA kan undertrykke en viss prosentandel av celledød indusert ved overekspresjon av Ich-lL tyder på at crmA og Ich-1 kan bli bundet til hverandre. Det er mulig at når Ich-1 konsentrasjonen er lavere kan crmA undertykke celledøden indusert ved Ich-1 i høyere grad. Mikroinjeksjon av crmA ekspresjonskonstruksjonen kan effektivt undertrykke død til dorsale rotganglianeuroner indusert ved nervevekstfaktordeprivasjon (Gagliardini, V. et al, Science 263:826-828 (1994)). En eller flere ICE/ced-3 familiemedlemmer kan være ansvarlig for neuronal celledød. Når crmA ekspresjonskonstruksjonen blir mikroinjisert i neuroner kan den forbigående konsentrasjon av crmA være meget høy. Det er følgelig mulig at crmA kan undertrykke flere medlemmer av ICE/

ced-3 familien under slike betingelser til tross for det fakum at deres affinitet overfor crmA ikke er veldig høy.

På grunn av at ekspresjonen av Ice-1 og ICE kan bli detektert i de samme cellene tyder resultatene beskrevet heri på at flere medlemmer av ICE/ced-3 familien kan bidra til celledød indusert av et enkeltsignal. Det er tre mulige veier hvorved ICE og Ich-1 kan virke for å forårsake celledød. For det første kan Ich-1 aktivere ICE, direkte eller indirekte, for å forårsake celledød. For det andre kan ICE inaktivere Ich-1 direkte eller indirekte, for å forårsake celledød. For det tredje kan ICE og Ich-1 virke parallelt for å forårsake celledød. I det første scenariet vil inhibitoren av ICE inhibere celledød indusert ved Ich-1.1 det andre scenariet inhiberer inhibitoren til Ich-1 celledød indusert ved ICE. For å teste denne hypotesen er spesifikke inhibitorer for hvert medlem av ICH nødvendig. Som angitt ovenfor ser det ut til å være sannsynlig at crmA kan inhibere andre medlemmer av ICE/ced-3 familien. Disse modellene kan bli testet direkte ved "knock-out" mutante mus hvor et spesifikt medlem av ICE/ced-3 familien er mutert.

Ekspreimentelle prosedyrer

Kloning og konstruksjon av plasmider

Muse nedd-2 cDNA ble isolert ved anvendelse av embryonisk musehjerne cDNA og primer par spesifikt for 5' og 3' utranslaterte regioner og den kodende regionen. Primerene nedd2/l (5'CAACCCTGTAACTCTTGATT-3') og nedd2/2 (5'-ACCTCTTTGGAGCTACCAGAA-3') ble anvendt for amplifisering av den 5' utranslaterte regionen. Primerene nedd2/3

(5' -CCAGATCTATGCTAACTGTCCAAGTCTA-3') og nedd 2/4 (5' AAGAGCTCCTCCAACAGCAGGAATAGCA-3') ble anvendt for amplifisering av nedd-2 kodende region. Primer nedd2/5 (agaagcacttgtctctgctc) og nedd 2/6 (5'TTGGCACCTGATGGCAATAC-3') ble anvendt for amplifisering av den 3' utranslaterte regionen. 0,5 kb PCR produktet til nedd-2 kodende region ble klonet inn i pBluescript plasmidvektor som skulle bli anvendt som en probe (Strategene).

To humane føtal hjerne cDNA bibliotek og et muse embryonisk 1 l,5d cDNA bibliotek ble screenet med murin nedd-2 cDNA probe ved lav stringens og et museembryonisk 11.5d cDNA bibliotek. Filtrene ble hybridisert i 5 x SSPE, 30 % formamid, 1 x Denhardfs oppløsning, 1 % SDS ved 42°C over natt og vasket i 1 x SSPE og 0,5 % SDS, to ganger ved romtemperatur og to ganger ved 45°C (20 min). Human Ich-lg

(pBSH30) ble isolert fra de positive klonene ved anvendelse av et BamHI-Sall fragment av murin nedd-2 cDNA, et 70 bp fragment som inneholder 52 bp av 61 bp intronet, som en probe under de samme hybridiserings- og vaskebetingelsene beskrevet ovenfor. Fagklonene (pBSH37 for Ich-lL, pBSH30 for Ich-lg) ble tatt ut in vivo for å oppnå plasmider ved en in vivo uttakningsprotokoll (Stratagene). For å konstruere ekspresjons-konstruksj onene ble PCR utført ved anvendelse av syntetiske primere.

Hl (5'-GATATCCGCACAAGGAGCTGA-3') og H2

(5'-CTATAGGTGGGAGGGTGTCC-3') ble anvendt for Ich-1L konstruksjon.

H3 (5'-GATATCCAGAGGGAGGGAACGAT-3'), som tilsvarer sekvensene i 5' regionen til Ich-1 s cDNA og H4 (5'-GATATCAGAGCAAGAGAGGCGGT-3'), som tilsvarer sekvensene i 3' regionen av første åpne leseramme (ORF) Ich-1 § ble anvendt for første ORF av Ich-lg konstruksjonen H3 og H5

(5'-GATATCGTGGGAGGGTGTCCT-3') tilsvarer sekvenser i 3' regionen av andre ORF til Ich-lg ble anvendt for andre ORF av Ich-lg konstruksjonen. pBSH37 og pBSH30 ble anvendt som templater hvor hensiktsmessig. Tre PCR produkter ble skutt inn i EcoRV setet til pBluescript II og innskuddene til disse subklonene, pBSIIh.37, pP SIIh30.1 og pPSIIh30.2 ble isolert ved spaltning med Smal og Kpnl og klonet inn i Smal-Kpnl setene til BSLacZ (Miura, M. et al, Cell 75:653-660 (1993)). Noti linkere

ble tilsatt til Kpnl setet ved spaltning med Kpnl, buttendedannelse ved T4 polymerase og ligering i nærvær av overskudd Noti linker. Disse konstruksjonene, BSh37Z, BSh30Zl og BSh30Z2 ble spaltet med Noti og individuelt klonet inn i pPactstneoB (som anvender kylling p-actinpromoter) (Miyawaki, A. et al, Neuron 5:11-18 (1990)). De endelige plasmidene ble betegnet ppactH37Z, pPactH30Zl og ppactH30Z2. pBabeH30 plasmidet, anvendt for etablering av stabile Rat-1 cellelinjer inneholdende Ich-lg, ble konstruert ved innskudd av fullengde Ich-lg cDNA inn i Sali setet til pBabe/puro vektoren (Morgenstern, J.P. et al, Nucl. Acids Res. 18:3587-3596 (1990)).

For å mutagenisere Cys 303 til et Ser residie i den aktive domenen til Ich-lL °g Ala 352 til et Thr residie i P10 subenheten til Ich-lL, ble primere inneholdende mutante seter syntetisert som følger:

(HM1 tilsvarer HM2 og HM3 tilsvarer HM4. PCR ble utført i to trinn. For å danne Cys 303 til Ser mutasjonen, i første PCR runde, ble fragmenter fra N-terminusen til mutasjonssetet til Ich-1 l og fra det mutantet setet til C-terminusen til Ich-lL syntetisert ved anvendelse av to primerpar, T3 og HM1, HM2 og T7, og PBSH37 som et templat. I den andre PCR runden ble to PCR fragmenter dannet i den første reaksjonen anvendt som templater og T7 og T3 ble anvendt som primere. To slike runder med PCR dannet fullengde Ich-lL mutant. Den andre mutasjonen ble dannet på lignende måte ved anvendelse av T3 og HM3, HM4 og T7, for Ala 352 til Thr mutasjon, som primere for første PCR. PCR produktene ble skutt inn i EcoRV setet til pBluescript II og sekvensert. Mutante cDNA innskudd ble klonet inn i ekspresjonsvektorene som beskrevet ovenfor. De muterte klonene ble betegnet p(3actH37ZCS og pPactH37ZAT.

Cellekultur og funksjonelle studier

COS celler, Rat-1 celler, HeLa celler og NG108-15 celler ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagle's medium (DMEM) supplementert med 10 % føtalt kalveserum (FCS). Dagen før transfeksjonen ble cellene sådd ut i en tetthet på omtrent 2,5 x 10<5>i hver av 6-brønnskålene. For hver brønn ble 0,7-1 fig av lacZ chimerisk konstruksjon og 10 ug lipofectamin reagens anvendt ifølge en protokoll fra GIBCO BRP (Gaithersburg, MD). Cellene ble inkubert i 3 timer i serumfritt medium inneholdende DNA og lipofectamin. Deretter ble et likt volum vekstmedium inneholdende 20 % serum tilsatt uten å fjerne transfeksjonsblandingen og inkubasjonen ble fortsatt i 24 timer. Ekspresjon av det chimeriske genet i celler i kultur ble detektert som tidligere beskrevet (Miura M. et al, Cell 75-653-660(1993)).

For å etablere Rat-1 cellelinjer som overuttrykker Ich-1§ble pBabeH30 transfektert inn

1 Rat-1 celler ved anvendelse av lypofectaminmediert genoverføring. Resistente celler ble selektert ved anvendelse av 3 ug/ml puromycin i omtrent 10 dager. Cellene ble analysert for ekspresjon av Ich-1§ved northern blot analyser. For å undersøke om Ich-lg kan gjøre Rat-1 cellene resistente for apoptose under betingelser med serumdeprivasjon, ble Rat-1 celler som overuttrykker Ich-1§, utransfekterte kontroll Rat-1 celler, transfekterte negative kontroll Rat-1 celler og Rat-1 celler som overuttrykker bcl-2 eller crmA sådd ut i 24-brønnskåler med 5 x IO4 celler i 500 ul DMEM inneholdende 10 % FCS i 24 timer, vasket en gang med serumfritt DMEM og overført i 500 (il serumfritt DMEM. Cellene ble høstet ved daglige intervaller og farvet med 0,4 % trypanblå i 5 min ved romtemperatur. Antall døde og levende celler ble opptelt ved anvendelse av et haemocytometer.

Jurkat celler, THP.l celler og U937 celler ble dyrket i RPMI 1640 medium (GIBCO) med 10 % føtalt kalveserum.

RNA analyser

Multiple vevs northern (MTN) blotmembran av humane føtale og voksne vev

(Clontech) ble probet ved anvendelse av human Ich-lL cDNA eller intron av Ich-lg cDNA (for føtalt vev) i 5x SSPE, 10x Denhardfs oppløsning, 50 % formamid, 2 % SDS og 100 ug/ml laksesperm DNA ved 42°C over natt. Blottene ble vasket to ganger i 2x SSPE og 0,05 % SDS ved romtemperatur og to ganger i 0,1 x SSPE og 0,1 % SDS i 20 minutter ved 50°C.

Multiple vevs northern (MTN) blotmembran av humant føtalt vev ble probet med et 1,3 kb fragment fra innskudd pBSH37, som hybridiserer til både Ich-lL og Ich-lg. Blottet ble eksponert i to dager og utviklet. Deretter ble blottet strippet ved koking av filtret i H20 to ganger i 20 minutter. Etter stripping ble filteret igjen eksponert i 3 dager for å forsikre at strippingen var fullstendig. Filtret ble deretter rehybridisert med 70 bp BamHI-Sall fragmentet avledet fra muse nedd-2 genet. Dette fragmentet inneholder 52 bp av 61 bp intronet (som er identisk med humant Ich-lg intronet; og gjenværende 18

bp er fra et ekson og 5 av 18 bp er forskjellige fra den humane Ich-1 sekvensen). Northern blot av THP.l cellene og U936 cellene ble utført under de samme betingelsene. For å detektere Ich-1 ekspresjon i Rat-1 cellene ble hybridiseringen utført i 25 % formamid og under ellers identiske betingelser.

Kloning av murin Ich-1

Et murint Ich-1 cDNA ble klonet i to trinn ved PCR. Et 5' murint Ich-1 cDNA fragment ble amplifisert ved anvendelse av en primer avledet fra pBSH37 5' endesekvensen (5'ATTCCGCACAAGGAGCTGATGGCC 3') og en primer fra muse nedd-2 etter aktiv setesekvensen (5' GCTGGTCGACACCTCTATC 3') ved anvendelse av museembryo cDNA bibliotek som templat (en gave fra D. Nathan). Det resulterende 945 bp fragmentet ble klonet inn i EcoRV setet til plasmid pBSKII og sekvensert. Et 3' murint Ich-1 cDNA fragment ble amplifisert ved anvendelse av en human Ich-1 primer videre nedstrøms (5' CAAGCTTTTGATGCCTTCTGTGA 3' og en nedd-2 primer nedstrøms fra den kodende regionen (5' CTCCAACAGCAGGAATAGCA 3'). Det resulterende fragmentet ble også klonet i pBSKII og sekvensert. De to fragmentene ble deretter koblet sammen ved anvendelse av et Sali sete ved nukleotid 930 fra begynnelsen av den kodende regionen.

Kloning av kylling Ich-1

Et kylling Ich-1 cDNA fragment ble oppnådd ved anvendelse av murine Ich-1 degenererte primere. 5' primeren var fra murin Ich-1 nukleotid 241 til 268 bp:

5' GC(G ATC)TT(TC)GA(TC)GC(GATC)TT(TC)TG(TCG)GA( AG)GC3'.

3' primeren fra murin Ich-1 nukleotid 883 til 908 bp: 5' CA(GATC)GC(CT)TG(TAG)AT(AG)AA(AG)AACAT(CT)TT(GATC)GG3'. Det

resulterende DNA fragmentet ble anvendt som en probe for å screene et kylling embryonisk bibliotek (Clontech) ved høy stringenshybridisering.

Kvantitativ PCR analyse

mRNA ble isolert ved anvendelse av et MicroFast mRNA isoleringssett fra Invitrogen. 1 til 2 ug mRNA ble anvendt fra revers transkripsjon ved tilfeldig priming (Invitrogen) ved anvendelse av MMLV (Molone murin leukemivirus) revers transkriptase (Invitrogen). Primerene anvendt for å amplifisere murin Ich-1: 5' primer (5' ATGCTAACTGTCCAAGTCTA 3') og 3' primeren

(5' CTCTCATCTTCATCAACTCC 3'). Primerene anvendt for å amplifisere human Ich-1: 5' primer (5' GTTACCTGCACACCGAGTCACG 3') og 3' primeren

(5' GCGTGGTTCTTTCCATCTTGTTGGTCA 3'). Primerene anvendt for å amplifisere hICE: 5' primer (5' ACCTTAATATGCAAGACTCTCAAGGAG 3') og 3' primeren (5' GCGGCTTGACTTGTCCATTATTGGATA 3'). Muse p-actin primere ble anvendt som kontroller for å amplifisere et 350 bp actinfragment fra muse og humant vev. 5' p-actin primeren: 5' GACCTGACAGACTACCTCAT 3'. 3' p-actin primeren: 5' AGACAGCACTGTGTTGGCAT 3'. Følgende betingelser ble anvendt for PCR reaksjonene: 1 x reaksjonsbuffer (Promega) 1,5 mm MgCl2,200 um dNTP, 2 um av hver primer, 1 enhet Taq DNA polymerase (Promega) i et totalvolum på 50 (il. DNA ble denaturert i 4 minutter ved 94°C før 26 PCR sykluser (94°C, 1 min/55°C, 1 min/ 72°C, 2 min). I noen av eksperimentene ble Vent polymerase (Biolab) anvendt.

In vitro transkripsjon og translasjon av Ich-lg

For å bestemme hvilken åpen leseramme av Ich-lg som ble uttrykt ble pBluescript-plasmid inneholdende Ich-lg (pBSFDO) linearisert ved 3' multipelt kloningssete med Xhol, renset og transkribert med T3 RNA polymerase i 2 timer ved 37°C ved anvendelse av en protokoll fra Stratagene. Plasmidet ble også linearisert ved 5' multipelt kloningssete med Noti, renset og transkribert med T7 polymerase som en antisens kontroll. De resulterende dannede transkriptene ble ekstrahert med fenol-kloroform og etanol presipitert. In vitro translasjon ble utført med kaninretikulocytt lysat (Promega) i nærvær av<35>S-metionin i 1 time ved 30°C. 5 ul lysat ble blandet med likt volum 2x SDS gel appliseringsbuffer og utsatt for SDS-polyakrylamid gelelektroforese (12 %). Gelen ble tørket og eksponert for røntgenfilm.

EKSEMPEL 6

Eksperimentelle prosedyrer

Celler og vevskultur

HeLa cellene ble dyrket i Dulbecco's modifiserte Eagle's medium (DMEM) med 10 % føtalt bovint serum (FBS). HeLa cellene ble transfektert med pHD1.2 crmA ekspresjonsvektor (Gagliardini, V. et al, Seiene 263:826-828 (1994)) ved kalsiumfosfat-presipitasjon og to dager etter transfeksjonen ble 600 ug/ml G418 (Gibco) tilsatt for seleksjon. Resistente kolonier ble klonet ved begrenset fortynning. Doseringsresponsen til HeLa og HeLa/crmA cellene overfor TNF- behandling ble testet som følger. Cellene ble sådd i DMEM pluss 10 % føtalt kalveserum i en 24 brønn skål i en tetthet på 4 x 10<4>celler pr brønn. Etter over natt inkubasjon ble cellene vasket to ganger med serumfritt DMEM. Medikamentene ble deretter tilsatt til totalvolum på 0,2 ml serumfri DMEM og cellene ble inkubert i 24 timer. Cellene ble deretter trypsinert og døde celler registrert på et hemocytometer ved trypan blå eksklusjon (Sigma, St. Louis, MO). Minst 200 celler ble registrert pr brønn. Hver konsentrasjon ble testet i duplikat hver gang.

Western blotting

Cellene ble lysert i SDS prøvebuffer og cellelysatet ble utsatt for 15 % SDS-PAGE.

Etter elektroblotting av proteinene til en Immobilon nylonmembran (Millipore) ble membranen blokkert med 4 % ikke-fet melk 25 mM Tris-HCl pH 7,5,150 mM NaCl, 0,2 % Tween (TBST). Membranen ble inkubert med anti crmA antistoff (Gagliardini et al, Science 263:826-828 (1994)) (5 (ig/ml) i 1 time ved romtemperatur og deretter vasket fem ganger med TBST. Membranen ble inkubert med HRP-konjugert geite anti-kanin IgG (1/1000 fortynning, Amersham) i 30 minutter og vasket fem ganger med TBST. crmA protein ble detektert med et ECL deteksjonssett (Amersham).

DNA transfeksjon

En dag før transfeksjonen ble cellene sådd ut i en tetthet på omtrent 2 x 105 pr brønn i 6-brønnskåler. For hver brønn ble 1 ug plasmid DNA og 10 ug lipofectaminreagens tilsatt ifølge protokollen til Gibco BRL. Cellene ble inkubert i 3 timer i serumfritt medium inneholdende DNA og lipofectamin, og deretter ble mediet skiftet til DMEM inneholdende 10 % FBS og inkubasjon ble fortsatt i 24 timer. Ekspresjon av chimerisk gen ble detektert som tidligere beskrevet. (Muira et al. Cell 75:653-660 (1993)).

Deteksjon av IL-ip produksjon fra HeLa celler

HeLa cellene ble dyrket over natt inneholdende 10 % føtalt kalveserum og deretter ble mediet skiftet til et serumfritt DMEM med eller uten medikamenter. Etter 24 timer ble cellene skrapet av og presipitert. Kondisjonert medium ble samlet, dialysert mot destillert vann ved 4°C over natt, lyofilisert og resten løst opp i destillert vann. Celle-presipitatet ble ekstrahert med ekstraheringsbuffer (20 mM HEPES-NaOH, pH 7,4, 10 mM Kcl, 1,5 mM MgC12,0,5 mM EDTA, 10 ug/ml PMSF, 10 ug/ml E64, 2 ug/ml pepstatin, 1 ug/ml leupeptin, 0,5 ug/ml aprotinin, 1 % NP-40). Uoppløselige materialer ble fjernet ved sentrifugering. Proteinene ble separert ved 15 % SDS-PAGE og IL-1 f3

ble detektert ved immunblotting ved anvendelse av antihumant IL-1 P antistoff (1/300 fortynning, Calbiochem).

Resultater

Etablering av crmA-uttrykkende HaLa celler

For å teste hypotesen om at aktivering av ICE er ansvarlig for TNF-a indusert apoptose etablerte oppfinnerene første HeLa cellelinjer som konstitutivt uttrykker kukoppervirus crmA protein. Dette proteinet er et viralt serpin som kan spesifikt inhibere ICE aktivitet (Ray CA. et al, Cell 69:597-604 (1992)).

HeLa cellekloner som uttrykker crmA ble analysert ved western blot analyser ved affini-tetsbegrenset anti-crmA. HeLa celler ble transfektert med crmA ekspresjonvektor og

selektert for G418 resistens som beskrevet i "eksperimentelle prosedyrer" ovenfor. Seks forskjellige G418 resistente HeLa cellekloner ble analysert. Som en positiv kontroll ble cellelysatet til en Rat-1 celleklon som uttrykker crmA (Miura, H. et al, Cell 75:653-660

(1993)) applisert på gelen. Flere HeLa cellekloner som stabilt uttrykker crmA ble etablert.

Overekspresjon av Ice/ced-3 familiegenet i HeLa/crmA celler

Cellelinjer ble testet for resistens overfor celledød indusert ved ICE overekspresjon. Overekspresjon av crmA i HeLa celler undertrykte ICE-indusert celledød. HeLa celler som konstitutivt uttrykker crmA ble transfektert med en chimerisk ekspresjonvektor som uttrykker både lacZ og ml CE genet (ppactMlOZ). Transfeksjon er beskrevet ovenfor i eksperimentelle prosedyrer. En av HeLa/crmA klonene som uttrykker høye nivåer crmA kunne effektivt undertryke ICE indusert celledød. En klon som uttrykker crmA i lave nivåer kan også effektivt undertrykker ICE indusert celledød.under de samme betingelsene (levedyktighet 69,8 ± 1,2 %, tabell 4).

Celler ble transfektert og farget som beskrevet heri. Plasmid pactpGal' er en kontroll LacZ genekspresjonsvektor og plasmid pPactMlOZ er en muse Ice/lacZ chimerisk genekspresjonsvektor (Muira, M et al, Cell 75:653-66 (1993)). Plasmid ppactH37Z er et Ich-l/lacZ chimerisk genekspresjonvektor (Lin, W. et al, Cell 78:739-750 (1994)). Data (gjennomsnitt ± SEM) vist er prosentandel runde blå celler blant det totale antallet blå celler som er opptelt. For å undersøke effektene av CHX (20 ug/ml) og TNF-a (5 ng/ml) ble cellene behandlet med medikamenter i 24 timer og cellelevedyktigheten ble målt ved trypan blå farge eksklusjon. Data (gjennomsnitt ± SEM) vist er prosentandel døde celler. Data ble samlet for minst tre uavhengige eksperimenter.

CrmA er en potent og meget spesifikt serpin for ICE. Celledød indusert ved overekspresjon av ced-3 blir derimot dårlig undertrykt av crmA (Miura, M. et al, Cell 75:653-660 (1993)). Ich-1 (nedd-2) har blitt beskrevet ovenfor som et tredje medlem av ICE/ced-3 genfamilien (se også Kumar, S. et al, Genes Dev. 8:1613-1626 ( 1994)). Som med ICE induserer overekspresjon av Ich-1 Rat-1 og HeLa celledød effektivt. Ich-1 indusert celledød blir derimot svakelig undertrykt ved overekspresjon av crmA i HeLa celler (tabell 4) og Rat-1 celler. crmA ser følgelig ikke ut til å være en generell inhibitor av ICE-/Ced-3 familieproteasen.

Suppresjon av TNFa indusert apoptose ved crmA

Effekten av crmA ekspresjon på TNF-indusert apoptose ble testet. TNF indusert cytotoksisitet ble undertrykket ved overekspresjon av crmA. HeLa celler eller HeLa/crmA celler ble behandlet med en cykloheksimid (CHX) (20 ug/ml, Sigma), TNF-a (5 ng/ml, Sigma), eller en kombinasjon av begge medikamenter. Cellene ble fotografert 24 timer etter medikamentbehandlingen. Kontroll HeLa og HeLa/crmA cellene ble testet for evne til å motstå økte mengder av TNF-a i nærvær av 10 ug/ml CHX (figur 18). I nærvær CHX induserte TNF-a effektivt HeLa celledød (White, E. et al, Mol. Cell. Biol. 12:2570-2580 (1992)). Under de samme betingelsene er HeLa celler som uttrykker crmA i høye nivåer resistente overfor TNF-a celledød stimuli (tabell 4). En klon av HeLa/crmA celler som uttrykker lavere nivåer av crmA var også resistente under de samme betingelsene (% døde celler = 30,2 ± 1,2 %). Doserespons til crmA-uttrykkende HeLa celler overfor økte mengder TNF-a i nærvær av 10 (ig/ml CHX ble testet. HeLa/ crmA cellene er resistente overfro 0,01 pg/ml til 100 ng/ml TNF a (figur 16). Etter 24 timers inkubasjon i nærvær av 100 ng/ml TNF-a døde 83 % av kontroll HeLa cellene sammenlignet med 23 % HeLa/crmA celler.

Aktivering av endogen ICE etter TNF stimulering

Oppfinnerene har detektert ekspresjon av både ICE og Ich-1 i HeLa celler (Lin, W. et al, Cell 78:739-750 (1994)). På grunn av at Ich-1 indusert celledød bare svakt blir undertrykt av crmA og crmA ser ut til å være meget effektiv når det gjelder å forhindre celle-død inusert ved TNF og CHX behandling, kan ICE-mediert celledødreaksjonsvei bli aktivert ved TNF stimulering og kan spille en rolle ved HeLa celledød. Dersom dette er tilfelle bør TNF stimulering aktivere endogen ICE i HeLa celler.

Pro-IL-1 P er det eneste kjente endogene substratet for ICE. Aktiv ICE er et oligometrisk enzym med p20 og plO subenheter (Thronberry, N.A. et al, Nature 356:768-774 (1992); Cerretti, D.P. et al, Science 256:97-100 (1992)). Disse subenhetene er avledet fra en p45 forløperform av ICE (Thornberry, N.A. et al, Nature 356:768-774 (1992)); Cerretti, D.P. et al, Science 256:97-100 (1992)). Dersom ICE blir aktivert etter TNF stimulering bør endogen 33 kd pro-IL-1 p bli prosessert og moden 17,5 kd IL-1 P skilt ut i mediet.

For å detektere moden IL-1 p ble kondisjonert medium samlet fra HeLa celler med eller uten TNF stimulering. Prosessering av pro-IL-1 P ble analysert ved western blot. Prosessering av IL-1 p ble observert etter bare induksjon av apoptose ved TNF-a/CHX i HeLa celler. Følgende prøver ble sammenlignet: renset moden human IL-ip, celle-lysater (10 (ag protein/kolonne), kondisjonert medium (5 ug/kolonne), serumfrie kontroller, LPS (10 ug/ml, Sigma) behandling, cykloheksimid (20 (ig/ml) og TNF 15 ng/ml).

Prosedyren for detektering av IL-ip beskrevet ovenfor under eksperimentelle prosedyrer. Cellelevedyktigheten ble målt ved trypan blå fargeekslusjon (97,4 ± 1,5 % for serumfri kontroll, 97,4 ± 0,2 % for LPS behandling, 56,3 ± 2,2 % for CHX/TNF-a behandling). Dataene viste at moden IL-1 p ble bare observert etter induksjon av apoptose ved TNF. Disse resultatene tyder på at TNF stimulering induserer apoptosen ved aktivering av ICE-avhengig celledødreaksjonsvei.

Diskusjon

Oppfinnerene har demonstrert heri at overekspresjon av ICE induserer Rat-1 celler til å gjennomgå apoptose (Miura et al, Cell, 75:653-660 (1993)) og ekspresjon av crmA kan forhindre kylling DRG neuroner fra celledød indusert ved trofisk faktor deprivasjon (Gagliardini, V. et al, Science, 263:826-828 (1994)). Disse resultatene viser at ICE har evne til å indusere celledød og at inhibisjon av ICE aktiviteten kan forhindre programert celledød. Resultatene viser derimot ikke at ICE ble aktivert i løpet av den programerte celledøden. Ved anvendelse av pro-IL-1 P prosessering som en indikator har oppfinnerene demonstrert at ICE blir aktivert når HeLa cellene blir indusert til å dø med TNF-a og CHX.

ICE har unik substratspesifisitet som krever en Asp i Pl posisjonen (Sleath et al, J. Biol. Chem. 265:14526-14528 (1990)). Bare to eukaryotiske proteaser er rapportert å bli spaltet etter Asp. Den andre er granzym B, en serin protease i cytotoksiske granuler til killer T lymfocytter (Odake et al, Biochemistry 30:2217-2227 (1991)). I THP.l cellene og HeLa cellene ble ekspresjon av både ICE og Ich-1 detektert (Wang et al, Cell 78:739-750 (1994)). Affinitetsmerking av THP.l cellelysatene med en konkurrerende, irreversibel ICE inhibitor, biotinylert tetrapeptid (acykloksy) metylketon, resulterte i bare merking av ICE (Thornberry et al, Biochemistry 33:3934-3049 (1994)). Dette tyder på at ICE er det eneste enzymet som spalter proIL-P i den humane monocyttiske celle-linjen, THP.l. Disse studiene viser at crmA ikke kan forhindre celledød indusert ved Ich-1 i HeLa celler.

Hvordan CHX potensierer TNF cytotoksisiteten i ikke-transformerte celler er uklart. De fleste cellelinjene, inkludert HeLa cellene, NIH3T3 cellene, og TA1 cellene, blir ikke drept av TNF alene, men blir drept ved den kombinerte virkningen av TNF og CHX (Reid et al, J. Biol. Chem. 264:4583-4589 (1991); Reid et al, J. Biol. Chem. 266:16580-16586 (1991)). TNF-a er et pleiotrofisk cytokin som kan indusere mer enn en cellulær respons i en enkelt celle. Tilstedeværelse av CHX kan inhibere syntesen av visse signaliserende molekyler og følgelig potensiere drepeaktiviteten til THF. CHX kan alternativt inhibere syntesen av en generell celleoverlevelsesfaktor og følgelig muliggjøre at cellene blir mere sensitive overfor TNF cytotoksisitet.

HeLa celler uttrykker hovedsakelig p55 TNF reseptor antatt å være ansvarlig for celle-dødsignalisering (Engelmann et al, J. Biol. Chem. 265:14497-14504 (1990); Thoma et al, J. Exp. Med. 72:1019-1023 (1990)). TNF p55 reseptoren utløser aktivering av fosfolypase A2, proteinkinase C, sphingomyelinase, fosfatidylkolin-spesifikk fosfolypase C og NF-kB (Weigmann et al. J. Biol. Chem. 267:17997-18001 (1992); Schutze et al, Cell 71:765-776 (1992)). I TNF p55 reseptor "knockout" mus blir TNF-mediert induksjon av NK-kB forhindret i tymocytter. (Pfeffer et al, Cell 73:457-467

(1993)). TNF p55 reseptor "knockout" mus var resistente overfor letale doser av enten lipopolysakkarider eller S. aureus enterotoxin B. Dette tyder på at TNF p55 reseptoren medierer hepatocytt nekrose (Pfeffer et al, Cell 73:457-467 (1993)). Etter stimulering av HeLa celler ved TNF-oc/CHX ble ikke alle proIL-1 p omdannet til moden IL-1 p. ICE aktiviteten er nært kontrollert i cellene. En liten mengde aktiv ICE kan være tilstrekkelig for induksjon av apopotse. Selv i moden IL-1 P produserende monocyttisk cellelinje, THP. 1 er det meste av ICE i p45 inaktiv form. I ikke-LPS-stimulerte THP. 1 cellene er bare 0,02 % ICE i aktiv form. I stimulerte celler er den maksimale mengden aktiv ICE mindre enn 2 % av total ICE (Ayala et al, J. Immunol. 153:2592.2599 (1994). THP.l cellene kan ha en viss beskyttende mekanisme for å forhindre at aktivert ICE induserer apoptose. LPS induserer syntese av en stor mengde pro-IL-1 P som kan utvise beskyttelse på THP.l celler på grunn av at substrater vanligvis er gode kompetitive inhibitorer av enzymene.

I tillegg til utskillelse av moden IL-1 P var det et betydelig fall av proIL-ip nivåer i cellelysatet dannet fra TNF-ct/CHX behandlede celler. Dette kan være resultatet av sekresjon av moden IL-1 P, inhibisjon av biosyntesen til proIL-ip eller økning av den proteolyttiske aktiviteten i døende celler. Dersom oppfinnerens hypotese er korrekt (dvs at pro-Il-1 p virker som en konkurrerende inhibitor av ICE), vil en reduksjon i nivået av pro-IL-1 p representere en ytterligere reduksjon i det cellulære forsvaret overfor apoptose og kan være en av grunnene for at CHX kan øke cytotoksisiteten til TNF-a.

TNF er en sentral komponent i pattedyr vertsinflammatorisk respons (Tracey, K.G. et al, Ann. Rev. Cell. Biol. 9:317-343 (1993)). I modeller med septisk sjokk induserer induksjon av endotoksin (LPS) hurtig TNF, IL-1 og IL-6 (Ford, Y. et al, J. Exp. Med. 170:1627-1633 (1989)). Under disse betingelsene ser sekresjon av IL-1 P ut til å være avhengig av TNF på grunn av passiv immunisering med TNF monoklonale antistoffer i løpet av endotoksemi in vivo attenuerer forekomst av IL-1 p (Fong, Y. et al, J. Exp.

Med. 170:1627-1633 (1989)). Resultatene heri viser at TNF spiller en rolle ved aktivering av ICE som er nøkkelenzymet ved prosessering av IL-1 p\

Ekspresjon av mitokondrial mangansuperoksiddismutase har blitt vist å fremme overlevelsen av tumorceller eksponert for TNF (Hirose, K. et al, Mol. Cell. Biol. 13:3301-3310 (1993)). Dette tyder på at dannelsen av frie radikaler spiller en rolle i celledød indusert av TNF. Det er flere rapporter som omfatter at TNF cytotoksisiteten er relatert til dannelsen av frie radikaler og lipidperoksider (Hermet, T. et al, Biochem. J. 289:587-592 (1993); Schulze-Osthoff, K. et al, J. Biol. Chem. 267:5317-5323 (1992)). Dersom det er tilfelle kan ICE bli aktivert direkte eller indirekte av frie radikaler.

HeLa celledød indusert av TNF blir også undertrykt av bcl-2 overekspresjon (leve-dyktigheten er 83,7 ± 2,3 % under de eksperimentelle betingelsene beskrevet for tabell 4). Bcl-2 er blitt foreslått å ha evne til å enten inhibere produksjon av frie radikaler (Kane, D.J. et al, Science 262:1274-1277 (1993)) eller forhindre frie radikaler fra å skade cellene (Hockenberry, D.M. et al, Cell 75:241-251 (1993)). I HeLa kan bcl-2 og crmA undertrykke celledød indusert av TNF gjennom en enkelt biokjemisk reaksjonsvei til programert celledød.

Fas/Apo (ref)-antigen er et medlem av TNF reseptorfamilien (Itoh, N. et al, Cell 66:233-243 (1991)). Apoptose kan bli indusert ved stimulering av Fas-antigen ved anti-Fas/anti-Apo-antistoff (Yonehara, S. et al, J. Exp. Med. 169:1747-1756 (1989)) eller Fas-ligand (Suda, T. et al, Cell 75:1169-1178 (1993)), et type II transmembranprotein homologt med TNF. Celledød signalisering etter stimulering av Fas-antigenet er stort sett ukjent. Fas-mediert celledød blir beskyttet ved overekspresjon av Eib (Hashimoto, S. et al, Intern. Immun. 3:343-351 (1991)) eller bcl-2 (Itoh, N. et al, J. Immun. 151:621-627

(1993)). Dataene presentert heri tyder på at stimulering av Fas-antigenet også kan aktivere ICE/ced-3 celledødreaksjonsveien.

Claims

1. Fremgangsmåte for å forhindre programert celledød i virveldyr, karakterisert ved å inhibere den enzymatiske aktiviteten til interleukin-1 p omdannende enzym.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte enzymatiske aktivitet blir inhibert av en interleukin-1P omdannende enzym-spesifikk antiprotease.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at nevnte antiprotease blir kodet av crmA genet.

4. Fremgangsmåte for å fremme programert død i virveldyrceller, karakterisert ved å øke den enzymatiske aktiviteten til interleukin-ip omdannende enzym i nevnte celler.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at nevnte virveldyrceller er cancerceller.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at nevnte cancerceller overuttrykker onkogenet bcl-2.

7. Vesentlig rent gen, karakterisert ved at det fortrinnsvis blir uttrykt i thymus og morkakeceller og koder for et protein som forårsaker programert celledød.

8. Gen ifølge krav 7, karakterisert ved at nevnte protein har aminosyresekvensen vist i figur 6.

9. Gen ifølge krav 8, karakterisert ved at nevnte gen har cDNA sekvensen vist i figur 6.

10. Ekspresjonsvektor, karakterisert ved at den har genet ifølge enten krav 8 eller krav 9.

11. Vertcelle, karakterisert ved at den er transformert med vektoren ifølge krav 10.

12. Vesentlig rent protein, karakterisert ved at nevnte protein blir fortrinnsvis uttrykt i thymus eller morkakeceller og forårsaker at nevnte celler dør.

13. Protein ifølge krav 12, karakterisert ved at nevnte protein har aminosyresekvensen vist i figur 6.

14. Funksjonelt derivat, karakterisert ved at det er av proteinet ifølge krav 13.

15. Fremgangsmåte for å fremme programert celledød i thymus eller morkakeceller, karakterisert ved å øke aktiviteten til proteinet ifølge krav 7.

16. Vesentlig rent DNA molekyl, karakterisert ved at det omfatter en cDNA sekvens som blir valgt fra gruppen bestående av cDNA sekvensen vist i figurene 10A og 10B.

17. Ekspresjonsvektor, karakterisert ved at det har DNA ifølge krav 16.

18. Vertcelle, karakterisert ved at den er transformert med vektoren ifølge krav 17.

19. Vesentlig rent protein, karakterisert ved at det omfatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av aminosyresekvensen vist i figurene 10A og 10B.

20. Funksjonelt derivat, karakterisert ved at det er av proteinet ifølge krav 19.

21. Vesentlig rent DNA molekyl, karakterisert ved at det omfatter cDNA sekvensen vist i figur 14.

22. Ekspresjonsvektor, karakterisert ved at den har DNA ifølge krav 21.

23. Vertcelle, karakterisert ved at den er transformert med vektoren ifølge krav 22.

24. Vesentlig rent protein, karakterisert ved at det omfatter aminosyresekvensen vist i figur 14.

25. Funksjonelt derivat, karakterisert ved at det er proteinet ifølge krav 24.

26. Fremgangsmåte for å regulere interleukin-1 (3 omdannende enzym, karakterisert ved å regulere nivåene eller aktiviteten til tumornekrosefaktor.