NO891756L - Teststrimler for bestemmelse av urinstoff og deres anvendelse. - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrører en teststripe og deres anvendelse til rask kvantitativ bestemmelse av drivstoff, fortrinnsvis fra melk. Den kan umiddelbart bli anvendt så vel i landbruks-vitenskap som i den melkebearbeidende industri.

For den kvantitative bestemmelsen av urlnstoffinnhold fra melk er forskjellige metoder kjent, f.eks. enzymatisk spaltning av urinstoffet med urease og titrimetrisk bestemmelse av den dermed dannede ammoniakken, den koiorimetriske målingen av det dannede blå fargestoffet ved omsetning av urinstoffet med fenol og alkalihypokloritt (Thaler, H. og Sturm, W., Deut. Lebensm. Rundsch. 61 (1966) 35-40; Krom, M.D., Analyst 105 (1980 ) 305-316; Broderick, G.A., Kang, J.H., Linow, F. og Schaffner, B. , Nahrung 24 (1980) 85-87; Behringer, G. og Klostermeyer, H.K., Lebensmittel Unters. Forsch. 172 (1981) 362-364) eller fargereaksjonen mellom urlnstoff og p-dimetylaminobenzaldehyd (Brown, H.H. , Anal. Chem. 31 (1959) 1844-1846; Mc Dowell, A. K. R., J. Dairy Res. 39 (1972) 27-33) henholdsvis diacetylmonoksim (Vignon, B., Dissertation, Université Nancy I (1976 ); Siast, G. , Ann. Biol. Clin. 26 (1968) 431-448).

Den foreslåtte hurtigbestemmelsen fra firmaet Boehringer baserer seg på spaltning av urlnstoff ved enzymet urease og den tilknyttede omsetning av den dannede ammoniakken med alfa-ketoglutarat i nærvær av glutamatdehydrogenase, hvorved omsetningen av forbrukt mengde NaOH blir spektrofotometrisk bestemt.

Anvendelsen av denne analysefremgangsmåten forutsetter imidlertid omstendelig og tidkrevende laboratorieanalyser, som en rask bestemmelse av urlnstoffinnholdet, eksempelvis i landbruksvitenskapelige industriområder, umulig kan utføre.

Den utviklede teststrimmelfremgangsmåte fra firmaet Boehringer for bestemmelse av urlnstoffinnhold i blod, serum og plasma baserer seg på en utnyttelse av fargereaksjonen og krever anvendelse av et refleksjonsfotometer til bestemmelse av fargeintensiteten, som er proporsjonal med urinstoff-konsentrasj onen.

Den fra firmaet Merck Darmstadt forhandlede teststrimmel for urlnstoff tillater bestemmelse av urinstoffinnhold i blod, men ikke i melk.

Det samme gjelder også for urinstoffbestemmelse ifølge DD-PS 137 384.

På grunn av den høye buffervirkning i melk, blir den enzymureasedannede ammoniakk i reaksjonssonen fastholdt og diffunderer ikke i indikatorsjiktet. Fuktningsproblemer mellom melk og teststrimmelen forhindrer delvis også en riktig påvisning.

Målet med oppfinnelsen er å utvikle en økonomisk og rask fremgangsmåte for kvantitativ bestemmelse av urinstoffinnhold i melk, som ved hjelp av en egnet teststrimmel overvinner ulempene ved kjente fremgangsmåter.

Oppfinnelsen legger oppgaven til grunn å utvikle en økonomisk og rask test til kvantitativ bestemmelse av urinstoffinnhold i melk, som kan anvendes under betingelsene til det landbruksvitenskapelige husdyrhold. Oppgaven til oppfinnelsen ligger deri begrunnet, å oppnå frisetting av ammoniakken fra reaksjonssonen, uten at aktiviteten til enzymet urease vesentlig blir påvirket.

Oppgaven blir ifølge oppfinnelsen løst ved at urinstoff-innholdet i melkeprøven blir bestemt med en urinstoff-teststrimmel, som består av en reaksjonssone og en indikatorsone, som er påført en bærer. Det er funnet at gjennom impregnering av et absorberende bærermateriale med urease-enzym, glukose, en base og et tensid oppstår en reaksjons sone, som bevirker en enzymatisk spaltning av urinstoffet av den derpå påførte melk.

Bærermaterialet i reaksjonssonen kan bestå av naturlig eller også syntetiske faser, hvorved bærermaterialet ikke har noen innvirkning på omsetningen og tilstrekkelig absorbsjon foregår. Filterpapir blir fordelaktig anvendt, der vekten ligger mellom 60 og 400 g/m<2>. Som baser for oppbygning av reaksjonssonen er natronlut, kalilut, fortrinnsvis salte svake syrer, som kaliumkarbonat, natriumkarbonat, magnesiumkarbonat eller natriumcitrat, anvendbare. Basen må ikke være for sterk (lut), og dermed henholdsvis ikke ødelegge enzymet og at systemet ikke forlater det optimale pH-området. På den andre siden må naturligvis melken være bufret, slik at ammoniakk overhodet kan drives ut.

Det har vist seg at gjennom innsatsen fra ikke-ionogene tensider, som kanskje alkylfenylpolyetylenglykol eller alkylpolyglykoletersulfat, henholdsvis fra aniontensider som f.eks. alkylsulfater, blir en god løsning med melke-eksisterende proteiner og kalsium oppnådd. Det oppnås en god fuktbarhet for den fastgjorte reaksjonssonen med melk som prøvevæske, mens det oppnås en dårligere fuktbarhet av kationiske tensider.

På reaksjonssonen blir impregneringen påført i følgende konsentrasj oner: urease i en konsentrasjon fra 0,30 til 0,90 mg/cm<2>, fortrinnsvis 0,70 mg/cm<2>,

glukose i en konsentrasjon på 0,05 til 0,30 mg/cm<2>, fortrinnsvis 0,17 mg/cm<2>,

tensid i en konsentrasjon på 0,25 til 1,30 mg/cm<2>, fortrinnsvis 0,63 mg/cm<2>,

base i en konsentrasjon på 0,2 til 0,4 mg/cm<2>, fortrinnsvis 0,28 mg/cm<2>.

Ved anvendelsen av en av de nevnte basene i det angitte konsentrasjonsområdet vil aktiviteten til urease ikke påvirkes. På denne måten lykkes frigivelsen av ammoniakk fra saltet av melk og diffusjonen i indikatorsonen.

Tilsatsen av et tensid ifølge oppfinnelsen muliggjør fuktbarheten i den fastgjorte reaksjonssonen, slik at definert mengde med prøvevæske kan opptas.

På et underlag som består av et hydrofobt materiale, fortrinnsvis av vannugjennomtrengelig plastmateriale, er den oppnådde reaksjonssone ved den ene enden og dertil tilknyttet ammoniakk i den andre ende, i og for seg bekjent måte anordnet den oppnådde indikatorsone. Målene er fortrinnsvis for bæreren (underlag) 70 x 6 mm, reaksjonssonen 6x6 mm, indikatorsonen 40 x 6 mm, hvorved avstand fra reaksjons- til indikatorsone utgjør 5 mm. Reaksjons- og indikatorsonen er fiksert på underlaget med en vannuløselig klebemiddel. En slik teststripe befinner seg til påvisningsformål i den ene siden i et lukket rør, hvorved reaksjonssonen befinner seg i den lukkede enden.

Fordelen med teststrimlene ifølge oppfinnelsen består i den enkle bruk i betjening i landbruksvitenskapelig praksis uten anvendelse av spesielle apparater eller måleredskaper.

Bestemmelsen blir gjennomført slik at teststrimlene med reaksjonssonen blir senket ned i melkeprøven i 3 sekunder eller 15 jjI av prøveløsningen blir opp-pipettert. Det er vesentlig at med denne bruk av reaksjonssonen, blir den undersøkende prøven dosert i en mengde fra 0,040 til 0,070 ml/cm<2>, fortrinnsvis 0,056 ml/cm<2>. I den tilknytning bringer man strimmelen i det ensidig lukkede røret, slik at reaksjonssonen befinner seg på gulvet av det horisontalt liggende røret. Etter 120 minutter måler man lengden av fargingen til indikatorsonen, som er proporsjonal med urinstoffmengden på forhånd i melkeprøven.

Bestemmelsen av urinstoffkonsentrasjonen skjer en gang gjennom sammenligning av lengden til den fargede indikatorsonen med verdien i henhold til en annen metode bestemt justeringstabell.

På den annen side er det i tillegg mulig å gjennom en prøvefarget indikatorsone å behandle en indikatorsone med en urinstoffoppløsning med kjent konsentrasjon (f.eks. 10 mg/100 ml) i vann. Ved måling av de fargede utsnitt til indikatorsonen oppnår man i begge størrelser

x = lengde utsnitt prøve

y = lengde utsnitt standard,

og regner urinstoffkonsentrasjonen etter formelen:

Med eksempler blir testmaterialet ifølge oppfinnelsen og dens anvendelse nærmere forklart.

I?5 f? F. eksempel

Eksempel 1

I et glasskår med målene 300 x 40 x 30 mm blir 200 ml av en etanolisk oppløsning av 0,161 g vinsyre og 100 ml av en etanolisk oppløsning av 0,256 g bromkresolgrønt tilsatt. Med denne oppløsning impregnerer man ved neddypping (1 minutt), lufttørking og etterfølgende tørking i tørkeskap ved 70" C i en time, 37 papirstrimler med målene 300 x 40 mm, fra disse blir indikatorsonen fremstilt ved skjæring av strimler til 6 mm brede og 40 mm lange.

I et glasskår blir 75 ml av en vandig oppløsning av 1,2 g urease-enzym og 0,3 g glukose, så vel som 0,450 ml av en mettet kaliumkarbonatoppløsning i vann så vel som 1,12 g alkylpolyglykoletersulfat tilsatt. Med denne oppløsning impregnerer man ved neddypping (1 minutt) og lufttørking 15 papirstrimler med målene 300 x 40 mm. Etter skjæring av papirstykkene i målene 6 x 6 mm, oppnår man den ferdige reaksj onssonen.

På en vannugjennomtrengelig plaststrimmel med målene 70 x 6 mm, kleber man således et stykke reaksjonssone og indikatorsone, at ved enden av strimmelen befinner reaksjonssonen seg i en avstand fra 5 mm fra indikatorsonen. Det er dertil å legge merke til at det blir klebet med et vannuløselig klebemiddel med kaustisk basis.

I en melkeprøve dypper man teststrimmelen ca. 3 sekunder til fullstendig fuktighet i reaksjonssonen. Den overflødige væsken tørker man vekk. Deretter blir strimmelen skjøvet inn i det ensidige lukkede glassrøret med en diameter på 6,5 mm, slik at reaksjonssonen befinner seg i den lukkede enden. Etter 120 minutter blir lengden på den fargede indikatorsonen målt. Fra en justeringstabell blir verdien av urinstoffkonsentrasjonen bestemt. Oppstillingen av justeringstabellen foregår etter en annen urinstoffmetode (f.eks. Conway-bestemmelsen). Justeringstabellen er gyldig for en fullstendig ladning av teststrimler.

Eksempel 2

På reaksjonssonen til en etter eksempel 1 fremstilt teststrimmel, blir 15 pl melk utpipettert. Teststrimmelen som beskrevet i eksempel 1, blir skjøvet inn i et glassrør. På analog måte behandler man to urinstoffoppløsninger med kjent konsentrasjon (20 mg/100 ml og 30 mg/100 ml) i vann. Ved utmåling av det fargede utsnittet av indikatorsonen oppnår man de begge størrelsene x og y som skal anvendes i henholdsvis formel I og formel II.

I tilfelle med melk med et urinstof f innhold på 25 mg/100 ml oppnås etter 120 minutters reaksjonstid følgende måleverdier:

Melk: X = 8,5 mm

20 mg/100 ml: y = 9,5 mm ) gjennomsnitt

30 mg/100 ml: y = 13,0 mm ) 25 mg/100 ml: y = 11,25 mm

Claims (12)

1. Teststrimler til bestemmelse av urlnstoff ved hjelp av urease, hvorpå det i et rør på en bærer er anordnet en reaksjons- og en indikatorsone, karakterisert ved at det på en hydrofob bærer som er anordnet i et rør som er lukket I den ene enden, ved siden av en i og for seg kjent indikatorsone som slår om i det sure området, er anordnet en reaksjonssone med et reaksjonssystem som består av urease, glukose, base og ikke-ionogent tensid, henholdsvis aniontensid.

2. Teststrimler ifølge krav 1, karakterisert ved at reaksjonssonen inneholder konsentrasjoner av: urease fra 0,30 til 0,90 mg/cm <2> , fortrinnsvis 0,70 mg/cm <2> , glukose fra 0,05 til 0,30 mg/cm <2> , fortrinnsvis 0,17 mg/cm <2> , base fra 0,2 til 0,4 mg/cm <2> , fortrinnsvis 0,28 mg/cm <2> , tensid fra 0,25 til 1,30 mg/cm <2> , fortrinnsvis 0,63 mg/cm <2> .

3. Teststrimler ifølge krav 1 og 2, karakterisert ved at reaksjonssystemet som base inneholder natrunlut, kalilut, men fortrinnsvis salte svake syrer, som kaliumkarbonat, natriumkarbonat, magnesiumkarbonat eller natriumcitrat.

4. Teststrimler ifølge krav 1 og 2, karakterisert ved at reaksjonssystemet inneholder som ikke-ionogent tensid alkylfenylpolyetylenglykol eller alkylpolyglykoletersulfat.

5. Teststrimler ifølge krav 1 og 2, karakterisert ved at reaksjonssystemet inneholder som aniontensid alkylsulfat.

6. Teststrimler ifølge krav 1 til 5, karakterisert ved at reaksjonssonen er anordnet i enden av det lukkede røret.

7, Teststrimler ifølge krav 1 til 6, karakterisert ved at reaksjonssonen og indikatorsonen er forbundet med en hydrofob bærer ved hjelp av vannuløselig klebemiddel.

8. Teststrimler ifølge krav 1 til 7, karakterisert ved at bæreren oppviser målene 70 x 6 mm, reaksjonssonen 6 x 6 mm og indikatorsonen 40 x 6 mm, hvorved reaksjons- og indikatorsonen til bæreren oppviser en lavere avstand, fortrinnsvis 5 mm.

9. Fremgangsmåte for anvendelse av en teststrimmel til bestemmelse av urlnstoff ifølge krav 1 til 8, karakterisert ved at man på reaksjonssonen bringer en prøve, fører inn teststrimmelen med reaksjonssonen først i et vannrett liggende rør som er lukket i den ene enden, måler fargen i indikatorsonen og konsentrasjonen av urlnstoff med en komparator eller i sammenligning med en vandig urinstoff-standard etter formelen:

der x = lengde utsnitt prøve y = lengde utsnitt standard

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at man bringer opp en prøve i en mengde fra 0,040 til 0,070 ml ml/cm <2> , fortrinnsvis 0,056 ml/cm <2> .

11. Fremgangsmåte ifølge krav 9 og 10, karakterisert ved at man bringer opp prøven ved å dyppe den i reaksjonssonen i 3 sekunder eller ved utpipettering av ca. 15 pl.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 9 til 11, karakterisert ved at man måler fargen i indikatorsonen etter 120 minutter.