FI88310C - Foerfarande och medel foer bestaemning av urea - Google Patents

Description

1 883:0

Menetelmä ja testiväline urean määrittämiseksi

Keksinnön kohteena on menetelmä ja testiväline urean määrittämiseksi näytteestä ureaasin, emäksen ja in-5 dikaattorin avulla. Menetelmä soveltuu erityisesti maidon ureapitoisuuden pikamääritykseen.

Märehtijän, kuten lehmän, aineenvaihduntaan vaikuttavat oleellisesti pötsin ja etumahojen toiminnat. Rehujen hyväksikäyttöön vaikuttaa pötsin mikrobien energian ja 10 valkuaisaineiden saanti. Jos energian ja valkuaisaineiden saannit eivät ole tasapainossa, rehuvalkuaisten hyväksikäyttö huononee. Tämä näkyy mm. veren ureatason nousuna ruokinnan jälkeen.

Useissa tutkimuksissa maidossa olevan urean määrän 15 on todettu noudattavan ureamäärän vaihteluja veressä (esim. Oltner & Wiktorsson 1983, Livestock Prod.Sei. 10:457, Refsdal 1983, Acta Vet.Scand. 24:518). Ureamäärän vaihtelu veressä ja myöskin maidossa aiheutuu suurelta osin ruokinnan muutoksista (esim. Refsdal ja Oltner & 20 Wiktorsson, yllä). Tästä syystä maidon ureapitoisuutta on käytetty ruokinnan seurannassa ruokinnan onnistumisen indikaattorina. Normiruokinnalle urea-alueeksi on todettu 20-30 mg ureaa 100 ml:ssa maitoa (Setälä ym. 1987, Karjatalous 10:52 ja 11:54).

25 Urea voidaan määrittää menetelmällä, jossa urea hajotetaan ureaasilla ammoniumkarbonaatiksi ja ammoniumio-nit saatetaan reagoimaan fenolin ja hypokloriitin kanssa spektrofotometrisesti määritettävän sinisen yhdisteen saamiseksi (Fawcett & Scott 1960, J. Clin. Path. 13:156). 30 Menetelmää on myös sovellettu maidolle (esim. Rajamäki & Rauramaa 1984, Finnish Chemical Letters 2:47-48).

Kun ureamäärityksestä halutaan hyötyä mahdollisimman tehokkaasti, ureamääritys tulisi suorittaa lehmien luona navetassa ns. "cow side "-pikatestinä. Siihen yllä 35 mainittu menetelmä ei sovi, koska se on suoritettava labo-

2 38 3 iQ

ratoriossa.

Urea voidaan myös määrittää siten, että ureaa sisältävä näyte saatetaan reagoimaan ureaasin kanssa ja hyd-rolyysituotteen aiheuttama pH:n muutos havaitaan sopivalla 5 indikaattorilla. Menetelmää käytetään esim. veren, plasman ja virtsan ureapitoisuuden määrittämiseksi (GB-patentti-julkaisu 922 665). Tähän perustuvaa liuskatestiä maidolle on esitetty julkaisussa Tierärtzl. Prax. 1985, 13:559.

Liuskatestien haittana on yleisesti se, että ne 10 pystyvät analysoimaan vain äärimmäisen pienen näytemäärän, jolloin saatu tulos jää usein epäluotettavaksi. Tulos vaihtelee pienestä näytemäärästä johtuen ja testin tekijän tavasta pipetoida näyte liuskalle tai kastaa liuska tutkittavaan liuokseen. Tämä ongelma pahenee vielä siitä, 15 että kun testiliuska kastetaan maitoon, maito sinänsä häiritsee värimuutoksen tarkkaa tulkintaa liuskasta. Maidon häiritsevän vaikutuksen poistamiseksi on kehitetty liuskoja, joissa reaktiovyöhyke, joka tulee kosketukseen maidon kanssa, on sijoitettu indikaattorivyöhykkeen viereen 20 (FI-hakemusjulkaisu 891920). Reaktiovyöhyke sisältää ureaasia, emästä, glukoosia ja tensidiä. Liuskaa pidetään vain toisesta päästä suljetussa putkessa kunnes reaktio-vyöhykkestä vapautunut ammoniakki on diffundoitunut indi-kaattorivyöhykkeeseen, mikä on hidasta. Liuskat luetaan 25 edullisesti vasta kahden tunnin päästä.

Nyt on keksitty urean määritysmenetelmä, joka on luotettavampi kuin maitoon upotettavat liuskat ja nopeampi kuin liuska, jossa indikaattorivyöhyke on sijoitettu maitoon upotettavan reaktiovyöhykkeen viereen ja jota reak-30 tioaikana pidetään toisesta päästä suljetussa putkessa.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle ja testivälineel-le on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksissa esitetään. Menetelmässä näyte saatetaan reagoimaan ureaasin ja emäksen kanssa ja ainakin reaktio emäksen kanssa suorite-35 taan suljetussa tilassa, johon indikaattorijärjestelmä on 3 88310 sijoitettu siten, ettei se ole muiden reagenssien kanssa kosketuksessa. Näyte voidaan ensin saattaa reagoimaan ureaasin kanssa ja sitten vasta emäksen kanssa, jolloin ainakin viimeksi mainittu reaktio suoritetaan mainitussa 5 suljetussa tilassa. Jos näyte sen sijaan saatetaan reagoimaan ureaasin ja emäksen kanssa yhtaikaa koko reaktio suoritetaan suljetussa tilassa. Testiväline käsittää suljetun tilan, jossa ainakin reaktio emäksen kanssa suoritetaan ja jossa indikaattorijärjestelmä sijaitsee siten, et-10 tei se ole kosketuksessa muiden reagenssien kanssa.

Reaktioreagenssit käsittävät ureaasia ja emästä. Ureaasi pilkkoo tutkittavan näytteen urean ammoniumsuo-loiksi ja emäs vapauttaa ammoniakin suoloista. Ammoniakki imeytyy indikaattorijärjestelmään ja aiheuttaa pH-indi-15 kaattorin värinmuutoksen tietyn ajan kuluessa.

Indikaattorijärjestelmä käsittää yhden tai useamman pH-indikaattorin. Indikaattori liuotetaan yleensä sopivaan puskuriin. Voidaan myös käyttää useampia tällaisia puskuri/indikaattori-seoksia, jotka muuttavat väriä eri 20 pH-arvossa. Maidon ureapitoisuuden määritys suoritetaan edullisesti ns. kaksoistestinä. Ko. kaksoistestin pusku-ri/indikaattori-seokset ovat edullisesti sellaiset, että ureapltoisuus <20 mg/100 ml ei vielä aiheuta värinmuutosta kummassakaan puskuri/indikaattoriseoksessa, mutta pitoi-.25 suudella 20-30 mg/100 ml reagoi toinen puskuri/indikaatto-ri-seos ja kun ureaa on enemmän kuin 30 mg/100 ml reagoi kumpikin puskuri/indikaattori-seos.

Edullisesti puskuri/indikaattori-seokset sisältävät kumpikin fosfaattipuskuria, mutta eri pitoisuuksissa. Edulli-30 sesti fosfaattipuskurit sisältävät fenolipunan natriumsuo-laa ja bromtymolsinin natriumsuolaa esimerkiksi painosuhteessa 1:1. Toinen fosfaattipuskuri on edullisesti 0,00025M ja toinen 0,00230M natriumdivetyfosfaattipuskuri.

indikaattorijärjestelmä voi olla joko nestemäisessä 35 tai kiinteässä muodossa. Nestemäisessä muodossa oleva in- 4 88310 dikaattorijärjestelmä voidaan erottaa muista reagensseista kaasua läpäisevällä kalvolla. Kalvo voi olla esimerkiksi teflonputkiteippiä tai teflonsuodatinkalvoa, jonka huokoskoko on 0,5 pm. Indikaattorijärjestelmä voidaan edulli-5 sesti saattaa kiinteään muotoon alginaatin avulla ja/tai imeyttämällä suodatinpaperiin ja kuivaamalla.

Indikaattorijärjestelmä sijoitetaan edullisesti suljettavan astian kanteen. Kansi saattaa olla kaksiosainen, jolloin siihen sijoitetaan kaksi erilaista puskuri/-10 indikaattori-seosta. Astian pohjalle lisätään ureaasi, näyte ja emäs ja kansi suljetaan tiiviisti. Tietyn ajan päästä luetaan indikaattorijärjestelmän värit. Keksinnön mukainen menetelmä soveltuu erityisesti maidon ureapitoi-suuden määrittämiseksi, mutta myös muut näytteet kuten 15 virtsa voivat tulla kysymyksen.

Keksintöä havainnollistetaan seuraavien esimerkkien avulla.

Esimerkki 1.

Puskuri/indikaattori-seosta I, joka sisältää 25 mg 20 fenolipunan natriumsuolaa, 25 mg bromtymolsinin natrium-suolaa ja 3g alginaattia 100 ml:ssa 0,00025M natriumdive-tyfosfaattia imeytetään suodatinpaperiin. Puskuri/indi-kaattori-seosta II, joka on samanlainen kuin I paitsi, että natriumdivetyfosfaatin pitoisuus on 0,00230M imeyte-25 tään toiseen suodatinpaperiin. Paperit kuivataaan 90eC:ssa 60 min. ja sijoitetaan sitten 10 ml:n tiiviskannellisen astian kaksiosaiseen kanteen siten, että papereita erottaa kannessa oleva väliseinä. Astian pohjalle laitetaan ureaa-sia (noin 60 - 250 U) kiinteänä tai liuoksena. Astiaan li-30 sätään 1 ml maitoa ja 2,5 minuutin kuluttua 0,5 - 1 ml 0,1M NaOH ja suljetaan kansi. 2,5 minuutin kuluttua luetaan testiastian kanteen muodostuneet puskuri/indikaatto-ri-seosten I ja II värit. Tulokset verrataan värikarttaan ja tulkitaan seuraavasti: i 5 88319

Testiastian kannen Näytteen ureapitoisuus väriyhdistelmä mg/100 ml keltainen/keltainen < 20 5 oranssi-punainen/keltäinen 20 - 30 oranssi-punainen/oranssi-punainen > 30

Esimerkki 2 10 Ureapitoisuudet määritettiin 118 maitonäytteestä esimerkin 1 mukaisella menetelmällä ja spektrofotometri-sella referenssimenetelmällä ( Fawcett & Scott 1960, J. Clin. Path. 13:156). Tulokset on esitetty taulukossa 1.

15

Taulukko 1. Maitonäytteiden jakautuminen (kpl) eri ureapitoisuusluokkiin

Ureaa mg/100ml < 20 20-30 > 30 20 _ <20 17 3 20-30 2 34 3 > 30 - 8 51 • 25 Ref.menetelmä yht./kpl 19 45 54 118

Keksinnön mukaisella menetelmällä arvioitiin 86,4 30 % näytteistä oikeaan luokkaan referenssimenetelmään ver rattuna. Taulukossa 2 on esitetty vastaava näytejakautuma, kun huomioidaan referenssimenetelmän sisäinen hajonta (+ 5 %). Tällöin oikeaan luokkaan arvioitujen näytteiden osuus on 94,1 %.

/ 35 6 8 8 3' ι Ο

Taulukko 2. Maitonäytteiden jakautuminen (kpl) eri ureapitoisuusluokkiin

Ureaa mg/100ml < 20 20-30 > 30 5 _ < 20 18 1 20-30 1 40 1 > 30 - 4 53 10 Re f.menetelmä yht./kpl 19 45 54 118

Esimerkki 3.

15 Tilakäyttöön tarkoitetuilla testiliuskoilla (S)

Azostix (Tierärtzl. Prax. 1985, 13:559), yllä mainitulla referenssimenetelmällä sekä keksinnön mukaisella menetelmällä määritettiin ureapitoisuudet 64 maitonäytteestä. Tulokset on esitetty taulukoissa 3 ja 4.

20

Taulukko 3. Maitonäytteiden jakautuminen (kpl) eri ureapitoisuusluokkiin testiliuskalla 25 Ureaa mg/100ml < 20 20-30 > 30 <20 7 20-30 6 21 5 >30 - 1 24 30 _

Ref.menetelmä yht./kpl 13 22 29 64 35 Testiliuskalla arvioitiin 82,8 % näytteistä (53/64) 7 88310 oikeaan luokkaan.

Taulukko 4. Maitonäytteiden jakautuminen eri ureapitoi- 5 suusluokkiin keksinnön mukaisella menetelmällä

Ureaa mg/100 ml < 20 20-30 > 30 <20 13 2 10 20-30 - 17 2 > 30 - 3 27

Ref.menetelmä yht. /kpl 13 22 29 64 15

Keksinnön mukaisella menetelmällä arvioitiin 89,1 % näytteistä (57/64) oikeaan luokkaan.

20

Esimerkki 4.

4 ml:n astiaan lisättiin 0,5 ml esimerkissä 1 mainittua puskuri/indikaattori-seosta I, joka oli nestemäisessä muodossa ts. se ei sisältänyt alginaattia. Astian 25 suu peitettiin teflonkalvolla, jonka huokoskoko oli 0,5 pm. Toiseen samanlaiseen astiaan lisättiin 0,2 ml maitoa ja noin 15 U ureaasia. 2,5 minuutin kuluttua siihen lisättiin 200 μΐ 0,1 M NaOH. Puskuri/indikaattori-seosta sisältävä astia ja näytteen ja muut reagenssit sisältävä astia 30 yhdistettiin suut vastakkain teipillä siten, että saatiin täysin suljettu tila, jossa kaasua läpäisevä kalvo erotti puskuri/indikaattori-seoksen muista reagensseista. Näin yhdistetyt astiat sekoitettiin 1 minuutti, minkä jälkeen indikaattoriseoksen väri luettiin. Tehtiin rinnakkaismää-35 ritys, jossa käytettiin nestemäistä esimerkissä 1 mainit- β 88310 tua puskuri/indikaattori-seosta II. Tulokset tulkittiin kuten esimerkissä 1. 24 maitonäytteen ureapitoisuudet määritettiin. Oikeaan luokkaan arvioitiin 87,5 % näytteistä. Tulokset on esitetty taulukossa 5.

5

Taulukko 5. Maitonäytteiden jakautuminen (kpl) eri ureapitoisuusluokkiin 10 Ureaa mg/100ml < 20 20-30 > 30 <20 6 20-30 18 1 >30 - 1 7 15

Ref.menetelmä yht./kpl 79 8 24

Claims (10)

1. 9 8 8 3 i O
2. 1. Menetelmä maidon ureapitoisuuden määrittämiseksi ureaasin, emäksen ja indikaattorin avulla, t u n - 5. e t t u siitä, että ainakin reaktio emäksen kanssa suoritetaan suljetussa tilassa, johon indikaattorijärjestelmä on sijoitettu siten, ettei se ole kosketuksessa muiden reagenssien kanssa.
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että ainakin reaktio emäksen kanssa suoritetaan suljetussa astiassa, jonka kanteen indi-kaattorijärjestelmä on sijoitettu.
4. 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että määritys suoritetaan kaksois- 15 testinä käyttäen indikaattorijärjestelmää, joka käsittää kaksi puskuri/indikaattori-seosta, jotka muuttavat väriä eri pH-arvossa.
5. 4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että toinen puskuri/indikaattori- 20 seos muuttaa väriä ureapitoisuuden ollessa vähintään 20 mg/100 ml ja toinen puskuri/indikaattori-seos muuttaa väriä ureapitoisuuden ylittäessä 30 mg/100 ml.
6. 5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että puskuri/indikaattori-seokset 25 sisältävät kahta eri pitoisuutta olevaa fosfaattipuskuria.
7. 6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että fosfaattipuskurit sisältävät fenolipunan natriumsuolaa ja bromtymolsinin natriumsuolaa painosuhteessa 1:1. . 30 7. Testiväline maidon ureapitoisuuden määrittämi seksi ureaasin, emäksen ja indikaattorin avulla, tunnettu siitä, että se käsittää suljetun tilan, jossa ainakin reaktio emäksen kanssa suoritetaan ja jossa indikaattori järjestelmä sijaitsee siten, ettei se ole koske- ·. 35 tuksissa muiden reagenssien kanssa. 10 8 8 3 Ί 0
8. 8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen testiväline, tunnettu siitä, että indikaattorijärjestelmä on kiinteässä muodossa.
9. 9. Patenttivaatimuksen 7 mukainen testiväline, 5 tunnettu siitä, että se käsittää suljettavan astian, jossa indikaattorijärjestelmä on kannessa ja muut reagenssit pohjassa.
10. 10. Patenttivaatimuksen 7 mukainen testiväline, tunnettu siitä, että se käsittää kaksoistestiin 10 tarvittavat patenttivaatimuksessa 3, 4, 5 tai 6 mainitut reagenssit. i H 8831 0