SE512818C2 - Förfarande och testanordning för bestämning av urea - Google Patents

Description

15 20 25 30 35 512 818 2 bestämningen, bör den utföras hos korna i ladugården som en sk. "cow side"-snabbtest. Ovannämnda förfarande lämpar sig inte för sådant, eftersom det bör utföras i ett laboratorium.

Urea kan även bestämmas så att ett prov som innehåller urea reageras med ureas, och en ändring i pH som hydrolysprodukten åstadkommer observeras med hjälp av en lämplig indikator. Förfarandet används för bestäm- ning av ureahalten i t.ex. blod, plasma och urin (GB- patentskriften 922 665). Härpå baserade teststickor för mjölk anförs :L publikationen Tierärtzl. Prax. 1985, l3:559.

Teststickorna har allmänt den nackdelen att man med dem kan analysera enbart en mycket liten provmängd, varvid det erhållna resultatet ofta blir otillförlit- ligt. Resultatet varierar på grund av den ringa prov- mängden och testutövarens sätt att pipettera provet på stickan eller doppa stickan i lösningen som skall under- sökas. Detta problem blir värre av att då teststickan doppas i mjölk, stör mjölken i sig den exakta tolknin- gen av färgändringen på stickan. För att eliminera mjöl- kens störande verkan har man utvecklat stickor i vilka engreaktionszon som kommer i kontakt med'mjölken är placerad intill en indikatorzon (FI-ansökningsskrift 891920). Reaktionszonen innehåller ureas, bas, glukos och tensid. Stickan hålls i ett rör, som är slutet en- bart i ena änden, tills ammoniaken som frigörs från reaktionszonen diffunderat i indikatorzonen, vilket tar lång tid. Stickorna avläses företrädesvis först efter två timmar.

Man har nu uppfunnit ett förfarande för be- stämning av urea, vilket förfarande är tillförlitligare än i mjölk nedsänkbara stickor och snabbare än stickor med indikatorzonen placerad intill den nedsänkbara reak- tionszonen och som under reaktionstiden hålls i ett rör 10 15 20 25 30 35 512 818 3 vars ena ända är tillsluten.

Förfarandet och testanordningen enligt uppfin- ningen kännetecknas av det som anges i patentkraven. I förfarandet reageras provet med ureas och bas, och åt- minstone reaktionen med basen utförs i ett slutet utrym- me, vari indikatorsystemet är placerat så att det inte berör övriga reagenser. Provet kan först bringas att reagera med ureas och först därefter med bas, varvid åtminstone den sistnämnda reaktionen utförs i nämnda slutna utrymme. Om provet däremot reageras samtidigt med ureas och bas, utförs hela reaktionen i slutet utrymme.

Testanordningen omfattar ett slutet utrymme, vari åt- minstone reaktionen med basen utförs och vari indikator- systemet är beläget så att det inte kommer i kontakt med övriga reagenser.

Reaktionsreagenserna omfattar ureas och bas.

Ureasen sönderdelar provet som skall undersökas till ammoniumsalter, och basen frigör ammoniaken från salter- na. Ammoniaken absorberas i indikator-systemet och åstad- kommer en färgändring i pH-indikatorn inom en given tid.

Indikatorsystemet omfattar en eller flera pH- indfkatorer. I allmänhet löses indikatorn i'en lämplig buffert. dylika buf- fert/indikatorblandningar som ändrar färg vid olika pH- Man kan även använda flera värden. Bestämningen av mjölkens ureahalt utförs före- trädesvis i form av en sk. dubbeltest. Företrädesvis är den ifrågavarande dubbeltestens buffert/indikator- blandningar sådana att ureahalten < 20 mg/100 ml ännu inte åstadkommer någon färgändring i nágondera buf- fert/indikatorblandningen, men vid en halt av 20 - 30 mg/IOO ml reagerar den ena buffert/indikatorblandningen, och då urea finns i en mängd över 30 mg/100 ml reage- rar båda buffert/indikatorblandningarna.

Företrädesvis innehåller vardera buffert/indi- 10 15 20 25 30 35 512 818 4 katorblandningen fosfatbuffert, men av olika koncentra- tion. Företrädesvis innehåller fosfatbuffertarna nat- riumsalt av fenolrött och natriumsalt av bromtymolblått t.ex. i viktförhållandet 1:1. Den ena fosfatbufferten är företrädesvis en 0,00025M och den andra en 0,00230M natriumdivätefosfatbuffert.

Indikatorsystemet kan vara i fast eller flytan- de form. Ett indikatorsystem i flytande form kan avskil- jas från övriga reagenser med en gasgenomsläpplig folie.

Folien kan vara t.ex. teflonrörtejp eller teflonfilter- folie med en porstorlek av 0,5 pm. Indikatorsystemet kan företrädesvis bringas i fast form med hjälp av alginat och/eller genom att låta det absorberas i ett filtrer- papper och torka.

Indikatorsystemet placeras företrädesvis i locket av ett tillslutbart kärl. Locket kan vara två- delat, varvid två olika buffert/indikatorblandningar placeras i det. Ureasen, provet och basen appliceras på kärlets botten och locket tillsluts tätt. Efter en given tid avläses indikatorsystemets färger. Förfarandet en- ligt uppfinningen lämpar sig speciellt för bestämning av ureahalten i mjölk, men även andra prov, såsom urin- gprov, kan komma i fråga.

Uppfinningen belyses med hjälp av följande icke-restriktiva exempel.

Exempel 1.

Buffert/indikatorblandning I, som innehåller 25 mg natriumsalt av fenolrött, 25 mg natriumsalt av bromtymolblått och 3 g alginat per 100 ml 0,00025M nat- riumdivätefosfat, absorberas i ett filtrerpapper. Buf- fert/indikatorblandning II, som är lik I förutom att natriumdivätefosfatetskoncentrationärCL00230M,absor- beras i ett annat filterpapper. Pappren torkas vid 90 °C 10 15 20 25 30 35 512 818 5 i 60 min. och placeras därefter i ett tvádelat lock av ett 10 mlzs kärl med tätt-slutande lock sålunda att pappren skiljs åt av en mellanvägg i locket. Ureas (ca 60 - 250 U) i fast eller flytande form appliceras på kärlets botten. I kärlet tillsätts l ml mjölk och efter 2,5 minuter 0,5 - 1 ml 0,lM NaOH, och locket läggs pà.

Efter 2,5 minuter avläses de i testkärlets lock bildade färgerna av buffert/indikatorblandningarna I och II.

Resultaten jämförs med en färgkarta och tolkas enligt följande: Färgkombinationen Provets ureahalt i testkärlets lock mg/100 ml gul/gul < 20 orange-röd/gul 20 - 30 orange-röd/orange-röd > 30 Exempel 2.

Ureahalterna i 118 mjölkprov bestämdes enligt förfarandet enligt exempel 1 och medelst ett spektro- fotometriskt referensförfarande (Fawcett & Scott 1960, SJ. Clin. Path. l3:l56). Resultaten visas i tabell 1.

Tabell 1. (st.) olika ureahaltsklasser Fördelning av mjölkproven i Urea mg/100 ml < 20 20-30 > 30 < 20 17 3 - 20-30 2 34 3 > 30 - 8 51 Referensförfarande totalt/st. 19 45 54 118 10 15 20 25 512 818 6 Medelst förfarandet enligt uppfinningen klassi- ficerades 86,4 % av proven i rätt klass jämfört med referensförfarandet. I tabell 2 visas en motsvarande provfördelning med beaktande av den inre deviationen (: 5 %) i referenšförfarandet. Härvid är andelen rätt klas- sificerade prov 94,1 %.

Tabell 2. Fördelning (st.) av mjölkproven i olika ureahaltsklasser Urea mg/100ml < 20 20-30 > 30 < 20 18 1 - 20-30 1 40 1 > 30 - 4 - ß 53 Referensförfarandet totalt/st. 19 45 54 118 Exempel 3.

Ureahalterna i 64 mjölkprov bestämdes med hjälp “av för gàrdsbruk avsedda teststickor Azostix“(Tierärzl.

Prax. 1985, 13:559), ovannämnda referensförfarande samt förfarandet enligt uppfinningen. Resultaten 'visas i tabellerna 3 och 4. 10 15 20 25 30 35 512 818 7 Tabell 3. Fördelning (st.) av mjölkproven i olika ureahaltsklasser medelst test- stickan Urea mg/100ml < 20 20-30 > 30 < 20 7 - - 20-30 6 21 5 > 30 - l 24 Referensförfarandet totalt/st. 13 22 28 64 Med hjälp av teststickan klassificerades 82,8 % av proven (53/64) i rätt klass.

Tabell 4. Fördelning av mjölkproven i olika ureahaltsklasser medelst förfarandet enligt uppfinningen Urea mg/100ml < 20 20-30 > 30 “< 2077 13 2 - 20-30 - 17 2 > 30 - 3 27 Referensförfarandet totalt/st. 13 QZ 29 64 Medelst förfarandet enligt uppfinningen klassi- fiserades 89,1 % av proven (57/64) i rätt klass.

Exempel 4.

I ett 4 mlzs kärl tillsattes 0,5 ml av den i 10 15 20 25 30 512 818 8 exempel 1 nämnda buffert/indikatorblandningen I i fly- tande form, dvs. utan alginat. Kärlets mynning täcktes med en teflonfolie med en porstorlek av 0,5 pm. I ett annat likadant kärl tillsattes 0,2 ml mjölk och ca 15 U ureas. Efter 2,5 minuter tillades 200 ul O,lM NaOH.

Kärlet med buffert/indikatorblandningen och kärlet med provet och de övriga reagenserna förenades med tejp så att mynningarna ställdes mot varandra och ett helt till- slutet utrymme erhölls, i vilket utrymme en gasgenom- släpplig folie skilde buffert/indikatorblandningen fràn de övriga reagenserna. De sålunda förenade kärlen blan- dades i. l minut, varefter indikatorblandningens färg avlästes. En parallell bestämning utfördes med den i exempel 1 nämnda buffert/indikatorblandningen II i fly- tande form. Resultaten tolkades på samma sätt som i exempel 1. Ureahalter för 24 mjölkprov bestämdes. 87,5 % av proven klassificerades i rätt klass. Resultaten visas i tabell 5.

Tabell 5. (st.) olika ureahaltsklasser Fördelning av mjölkproven i 'Urea mg/l00ml < 20 20-30 > 30* < 20 6 - - 120-30 l 8 1 > 30 _ - 1 Referensförfarandet totalt/st. 7 9 8 24

Claims (8)

10 15 20 25 30 35 512 818 9 Patentkrav

1. Förfarande för bestämning av ureahalten i ett prov, speciellt i mjölk, med hjälp av ureas, bas och en indikator, k ä n n e t e c k n a t därav, att åt- minstone reaktionen med basen utförs i ett slutet kärl, i vars lock ett indikatorsystem placerats så att det inte kommer i kontakt med övriga reagenser.

2. Förfarande enligt patentkravet 1, k ä n - n e t e c k n a t därav, att bestämningen utförs som en dubbeltest genonl att använda ett indikatorsystem som omfattar två buffert/indikatorblandningar som ändrar färg vid olika pH-värden.

3. Förfarande enligt patentkravet 2, k ä n - n e t e c k n a t därav, att den ena buffert/indikator- blandningen ändrar färg då ureahalten är minst 20 mg/100 ml och den andra buffert/indikatorblandningen ändrar färg då ureahalten överstiger 30 mg/100 ml.

4. Förfarande enligt patentkravet 3, k ä n - n e t e c k n a t därav, att buffert/indikatorblandnin- garna innehåller två fosfatbuffertar av olika koncent- ration. “ 5. n e t e c k n a t därav, att fosfatbuffertarna innehål-

5. Förfarande enligt patentkravet 4, k ä n - ler natriumsalt av fenolrött och natriumsalt av brom- tymolblått i viktförhållandet 1:1.

6._ Testanordning för bestämning av urea med bas och en indikator, k ä n n e - hjälp av ureas, t e c k n a t därav, att den omfattar ett slutet kärl, i vilket åtminstone reaktionen med basen utförs och i vars lock ett indikatorsystem är placerat så att det inte kommer i kontakt med övriga reagenser.

7. Testanordning enligt patentkravet 6, k ä n- n e t e c k n a t därav, att indikatorsystemet är i fast form. 512 818 10

8. Testanordning enligt patentkravet 6, k ä n- n e t e c k n a t därav, att den omfattar för en dub- beltest erforderliga j. patentkraven 2, 3, 4 eller 5 omnämnda reagenser.