NO873774L

NO873774L - Monoklonale eller polyklonale antistoffer.

Info

Publication number: NO873774L
Application number: NO873774A
Authority: NO
Inventors: Kenneth W Hunter
Original assignee: Westinghouse Electric Corp
Priority date: 1986-09-15
Filing date: 1987-09-10
Publication date: 1988-03-16
Also published as: JPS63126494A; IL83419A0; AU7811887A; EP0260829A2; EP0260829A3; NO873774D0

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører monoklonale og polyklonale antistoffer som reagerer med klorerte fenoler, særlig monoklonale antistoffer som reagerer med den toksiske kjemikalie pentaklorfenol. Oppfinnelsen vedrører antistoffene, fremgangsmåter til fremstilling av stoffene, anvendelse av antistoffene i analyse-, diagnose-, undersøkelses-, separerings-og andre metoder, samt preparater som inneholder antistoffene for slike anvendelser. I tillegg vedrører oppfinnelsen hybridomer som produserer monoklonale antistoffer og fremgangsmåte til fremstilling av hybridomene. Endelig vedrører oppfinnelsen immunogene konjugater av klorerte fenoler og en makromolekylær bærer samt fremgangsmåter til fremstilling av slike konjugater.

De klorerte fenoler er en klasse av mye anvendte kjemikalier og er utbredte forurensende stoffer. En av de viktigste klorerte fenoler er pentaklorfenol (PCP), som anvendes mye i hele USA som pesticid og konserveringsmiddel. Som pesticid anvendes det som insekticid, fungicid, herbicid, algicid og desinfiseringsmiddel. PCP anvendes innen mange forskjellige industrier, såsom de som fremstiller trevirke og treprodukter, bygningsmaterialer, lær, papir og tau. Den anvendes også i vannsystemer for å regulere alge- og soppvekst. Størsteparten av pentaklorfenol anvendes ved behandling av treprodukter, primært som et fungicid og bakteri-cid. I bygningsmaterialer kan det finnes i teglstein, takpapp, betong, asbest, press-span, fiberplater og isolasjon. Den anvendes i lær for å hindre ødeleggelse under garving. Den anvendes også som konserveringsmiddel i maling. Tekstilindustrien anvender den for å hindre at det utvikles mugg i fremstilte materialer. Kjemikalien kan også komme i kontakt med matvarer på grunn av dens anvendelse i papir, klebemidler og plast, som anvendes til innpakning.

På grunn av dens anvendelser og fysikalske egenskaper, som øker dens utslipp i omgivelsene er pentaklorfenol en vesentlig forurensningskilde. Den er blitt funnet i husstøv, luft og vann. Som fri fenol absorberes den lett på mange overflater. Natrium-saltet absorberes lett av suspenderte partikler i vann.

Pentaklorfenol er meget toksisk for pattedyr, også mennes-ker. Den finnes på det amerikanske miljøvesens (Enviromental Protection Agency) liste over viktige forurensende stoffer. Det er således viktig å være i stand til å påvise nærvær av pentaklorfenol og andre toksiske klorerte fenoler i vann, jord, matvarer og andre materialer og deretter bestemme mengden kvantitativt.

Analyse av pentaklorfenol, særlig i vann, er vanskelig og kostbar. Den analysemetode som for tiden er godkjent av EPA er gasskromatografi under anvendelse av elektronoppfangings- og/ eller flammeioniseringsdetektorer, se 49 Fed. Reg. 58-66 av 26. oktober 1984. Denne metode er kostbar, tidkrevende og arbeids-krevende. Utstyret er komplisert og kostbart og gjør det nødven-dig med høyt kvalifiserte operatører. Metoden omfatter en omfat-tende ekstraksjons- og renseprosedyre på hver prøve. Det tar derfor vanligvis mer enn én dag å analysere en prøve til en pris på ca. 650 kroner.

Immunologiske forsøk av forskjellige typer er blitt benyttet for påvisning av små konsentrasjoner av forbindelser. De omfatter anvendelser av antistoffer til substansen som skal påvises og er generelt nokså følsomme, spesifikke, akseptabelt pris-effektive og enkle å benytte. Men slike immunologiske forsøk har ikke vært benyttet for påvisning og kvantitativ bestemmelse av klorerte fenoler. Faktisk er antistoffer til pentaklorfenol og andre klorerte fenoler ikke blitt fremstilt før den foreliggende oppfinnelse.

Det er blitt foreslått fremstilling av nye antistoffer som på vilkårlig måte reagerer med klorerte fenoler, særlig penta-klorf enol, idet slike antistoffer dersom de i det hele tatt kunne fremstilles ville tilfredstille mange kritiske behov som ikke er oppfylt med eksisterende analytisk teknologi. Slike antistoffer ville bindes til pentaklorfenol og derved muliggjøre påvisning av denne toksiske kjemikalie ved hjelp av forskjellige hurtige, enkle og pris-effektive immunologiske forsøksmetoder. De ville være særlig nyttige ved analyse av pentaklorfenol i vann idet pentaklorfenol ikke ville måtte ekstraheres først. Dessuten ble det utført fremstilling av nye, selvreproduserende cellelinjer som produserte monoklonale antistoffer til klorerte fenoler, særlig pentaklorfenol. I motsetning til polyklonale antistoffer avledes monoklonale antistoffer fra én eneste B-lymfocyttklon, noe som gjør dem meget spesifikke og homogene. I 1975 beskrev Kohler og Milstein, Nature, 265:495, 1975, først hvordan monoklonale antistoffer rettet mot røde blodceller hos sau kan fremstilles ved fusjon av en spesifikk antistoffproduserende B-lymfocytt med en tumorcelle, noe som resulterer i en "udødelig" selvreproduserende hybridklon (eller "hybridom"), som i et prøverør (in vitro) eller i et dyr (in vivo) kan danne et eneste, monoklonalt antistoff. Et slikt hybridom er faktisk en selvreproduserende celle-"fabrikk" som kan produsere en potensielt ubegrenset mengde av et antistoff med en eneste, forhåndsdefinert spesifisitet .

Slike antistoffer vil således være mer anvendbare enn polyklonale antistoffer som påvisningsreagenser på grunn av deres utmerkede spesifisitet. Likeledes vil denne spesifisitet gjøre slike monoklonale antistoffer mer anvendbare for immunologiske og biokjemiske studier av pentaklorfenol, for affinitetsrensing av pentaklorfenol og for nøytralisering og/eller fjerning av penta-klorf enol fra vann eller andre pentaklorfenolholdige materialer. Dessuten vil, til forskjell fra konvensjonelle polyklonale antistoffer, monoklonale antistoffer som reagerer med pentaklorfenol kunne produseres i en potensielt ubegrenset og homogen mengde og derved unngå problemene med lav immunogenitet hos pentaklorfenol-/proteinkonjugater, variasjon av polyklonal antistoffreaksjon, og de resulterende begrensninger av oppnåelige mengder av anti-pentaklorfenol-antistoffer som er tilgjengelige for miljøanvendelser og andre anvendelser.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører således et monoklonalt antistoff som er reaktivt med et klorert fenol, samt et hybridom som produserer et slikt antistoff. Fortrinnsvis reagerer det monoklonale antistoff med pentaklorfenol.

Oppfinnelsen vedrører dessuten en fremgangsmåte til fremstilling av monoklonale antistoffer som reagerer med et klorert fenol, og fremgangsmåten kjennetegnes ved a) at det dannes et immunogent konjugat av den klorerte fenol og en makromolekylær bærer,

b) at et dyr immuniseres med konjugatet,

c) at det utvinnes antistoffproduserende celler fra dyret,

d) at cellene fusjoneres med tumorceller til dannelse av hybridomer, e) at det blant hybridomene velges minst ett som produserer antistoffer som reagerer med den klorerte fenol, samt f) at de produserte antistoffer utvinnes fra det valgte hybridom.

Oppfinnelsen vedrører også en fremgangsmåte til in vivo fremstilling av monoklonale antistoffer som reagerer med et klorert fenol, hvorved det i en vevforenelig eller immunosuppre-siv vert intraperitonialt anbringes et hybridom som produserer slike antistoffer, og de produserte antistoffer utvinnes fra vertens ascitesvæske.

Oppfinnelsen vedrører også en fremgangsmåte til fremstilling av en kontinuerlig cellelinje som produserer monoklonale antistoffer til en klorert fenol, kjennetegnet ved at det dannes et immunogent konjugat av den klorerte fenol og en makromolekylær bærer, at et dyr immuniseres med konjugatet, at antistoffproduserende celler utvinnes fra dyret, at de antistoffproduserende celler fusjoneres med tumorceller til dannelse av hybridomer, at det blant hybridomene utvelges et hybridom som produserer antistoffer som reagerer med den klorerte fenol, og at det valgte hybridom ved kloning oppformeres til en cellelinje.

Oppfinnelsen vedrører også en fremgangsmåte til påvisning av, eller bestemmelse av konsentrasjonen av en klorert fenol i en prøve, kjennetegnet ved at monoklonale antistoffer som reagerer med den klorerte fenol tilsettes til prøven og nærværet av, eller konsentrasjonen av den klorerte fenol bestemmes ved en immunologisk test hvori de monoklonale antistoffer anvendes som reagens.

Oppfinnelsen vedrører også et preparat til bestemmelse av nærværet eller konsentrasjonen av en klorert fenol i en prøve, kjennetegnet ved at det inneholder en effektiv mengde av et monoklonalt antistoff som reagerer med den klorerte fenol i en akseptabel bærer.

Oppfinnelsen vedrører også en immunologisk fremgangsmåte til isolering eller fjerning av en klorert fenol fra en blanding på basis av en selektiv immunologisk reaksjon med et antistoff som er spesifikt for den klorerte fenol, kjennetegnet ved at et monoklonalt antistoff som reagerer med den klorerte fenol anvendes som antistoffet.

Oppfinnelsen vedrører også et preparat for isolering eller fjerning av en klorert fenol fra en blanding som inneholder den, kjennetegnet ved at det inneholder en effektiv mengde av et monoklonalt antistoff som reagerer med den klorerte fenol immobilisert på en akseptabel grunnmasse eller i blanding med en akseptabel bærer.

Oppfinnelsen vedrører også polyklonale antistoffer som reagerer med en klorert fenol, og en fremgangsmåte til fremstilling av slike antistoffer, hvorved det dannes et immunogent konjugat av den klorerte fenol og en makromolekylær bærer, et dyr immuniseres med konjugatet, blod fjernes fra dyret, serum separeres fra blodet og antistoffene utvinnes av serumet.

Oppfinnelsen vedrører dessuten et immunogent konjugat som inneholder en klorert fenol kovalent bundet til en makromolekylær bærer, samt en fremgangsmåte til fremstilling av et slikt konjugat ved at et kjemisk bindeledd bindes kovalent til den makromolekylære bærer, og et derivat av den klorerte fenol, som inneholder en reaktiv gruppe, bindes kovalent til det kjemiske bindeledd til dannelse av det immunogene konjugat.

Oppfinnelsen vedrører således antistoffer som reagerer med de klorerte fenoler. Med klorert fenol menes her en fenol hvor et kloratom er bundet til én eller flere av stillingene 2 - 6 i benzenringen. I en utførelsesform er antistoffene polyklonale antistoffer som reagerer med en klorert fenol. I en annen og foretrukket utførelsesform er antistoffene monoklonale antistoffer som reagerer med en klorert fenol, særlig pentaklorfenol.

I en særlig foretrukket utførelsesform har de monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen kjennetegnene til de monoklonale antistoffer som er produsert ved hjelp av hybridomcellelinjene ATCC HB 9197 og ATCC HB 9198 eller mutanter eller varianter derav. ATCC HB 9197 og ATCC HB 9198 er biologisk rene kulturer som er tilgjengelige fra den permanente samling hos American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA 20852 og som ble deponert 12. september 1986. ATCC HB 9198 ble fremstilt ved fusjon mellom en B-lymfocytt fra rotte og en rotteryggmargcelle, og ATCC HB 9197 ble fremstilt ved fusjon mellom en B-lymfocytt fra mus og en plasmacytomcelle fra mus. Immunglobelinene (antistoffene) som ble dannet av disse hybridomer er av IgG-klassen. Monoklonaliteten til antistoffene ATCC HB 9197 og ATCC HB 9198 ble sikret ved rekloning av hybridomene som produserte dem.

Oppfinnelsen vedrører også hybridomer og kontinuerlige cellelinjer som produserer monoklonale antistoffer i klorerte fenoler. Fortrinnsvis produserer disse hybridomer og cellelinjer monoklonale antistoffer til pentaklorfenol. Helst har de kontinuerlige cellelinjer ifølge oppfinnelsen kjennetegnene til hybri-domcellelin j ene som har ATCC-aksesjonsnumrene HB 9197 og HB 9198 eller mutanter eller varianter av disse cellelinjer. Oppfinnelsen omfatter også individuelle celler av den cellelinje eller enhver kontinuerlig cellelinje som produserer de monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen.

Fagfolk på området kan benytte kjente metoder til fremstilling av mutanter eller varianter av ATCC HB 9197 eller ATCC HB 9198. Oppfinnelsen omfatter slike mutanter eller varianter så lenge disse produserer monoklonale antistoffer som reagerer med pentaklorfenol. Dessuten vil fagfolk på området som benytter kjente metoder og det som er beskrevet her, være i stand til å produsere monoklonale antistoffer som reagerer med pentaklorfenol, samt hybridomer og cellelinjer som produserer slike monoklonale antistoffer med andre kjennetegn enn ATCC HB 9197 eller ATCC HB 9198 eller antistoffene som produseres av slike cellelinjer. Ikke desto mindre ligger slike monoklonale antistoffer og hybridomene eller cellelinjene som produserer dem innenfor rammen av oppfinnelsen. De monoklonale antistoffer som produseres av ATCC HB 9197 eller ATCC HB 9198 vil hindre andre monoklonale antistoffer som ellers ville ha reagert med pentaklorfenol og som er blitt produsert av andre hybridomer, i å reagere med penta-klorf enol. Slike andre monoklonale antistoffer ligger også innenfor rammen av oppfinnelsen.

Hybridomene og de kontinuerlige cellelinjer ifølge oppfinnelsen kan fremstilles ved: a) fremstilling av et immunogent konjugat av en makromolekylær bærer og den klorerte fenol som det søkes et monoklonalt

antistoff for,

b) immunisering av et dyr ved konjugatet,

c) fremstilling av antistoffproduserende celler fra dyret,

d) fusjon av de antistoffproduserende celler med tumorceller til dannelse av hybridomer, og e) utvelgelse blant disse hybridomer av et hybridom som produserer antistoffer som reagerer med den klorerte fenol.

Det valgte hybridom eller de valgte hybridomer kan deretter klones til dannelse av en cellelinje.

De monoklonale antistoffer ifølge den foreliggende oppfinnelse kan utvinnes fra det valgte hybridom eller de valgte hybridomer før eller etter de ved kloning utvikles til en kontinuerlig cellelinje. Som nevnt ovenfor er i en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen den klorerte fenol pentaklorfenol. De foretrukne monoklonale antistoffer er således monoklonale antistoffer til pentaklorfenol.

I en alternativ utførelsesform kan hybridomene ifølge oppfinnelsen fremstilles ved fusjon av en tumorcelle med en vilkårlig celle som produserer antistoffer til en klorert fenol. Hybridomene som dannes ved denne utførelsesform kan anvendes til fremstilling av de monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen ved å dyrke dem i et egnet medium og utvinne antistoffene fra mediet.

Substanser med molekylvekter på ca. 1000 eller mindre, såsom pentaklorfenol (molekylvekt 266) induserer vanligvis ikke dannelse av antistoffer, dvs. at de er ikke-immunogene. Men slike substanser kan bindes kjemisk til større immunogene bærermole-kyler, såsom et karbohydrat eller et protein, for å indusere dannelse av antistoffer mot den mindre substans, som er kjent som en hapten. De generelle metoder til fremstilling av et immunogent konjugat av en hapten og en makromolekylær bærer er kjent, se f.eks. US-patentskrift 4.456.691 og Albro et al., Toxicol Appl. Pharmacol., Vol 50, 1979, p. 137-146.

Ved fremgangsmåten til Albro et al. eller ifølge ovennevnte US-patentskrift bindes haptenen kovalent til en makromolekylær bærer gjennom et kjemisk bindeledd. Det kjemiske bindeledd er et bifunksjonelt molekyl som inneholder reaktive grupper i motstående ender. Disse reaktive grupper gjør det mulig for det kjemiske bindeledd å reagere med reaktive grupper i makromolekylet og i haptenen, slik at det kjemiske bindeledds ene ende blir bundet kovalent til makromolekylet og dets annen ende kovalent bundet til haptenen. Ved nevnte fremgangsmåter bindes det kjemiske bindeledd først til haptenen, og den resulterende forbindelse bindes deretter til den makromolekylære bærer via den reaktive gruppe i det kjemiske bindeledds annen ende.

Det er kjent av fagfolk på området at antistoffer rettet mot små kjemiske forbindelser konjugert til bærerproteiner er tilbøy-elig til å gjenkjenne ikke bare kjemikaliens struktur, men også strukturene til bindeleddet mellom kjemikaliene og proteinet og også strukturene til proteinet ved bindestedet til bindeleddet. Resultatet av slik gjenkjennelse av slike ekstra strukturer er manglende evne, eller markert nedsatt evne, hos antistoffene til å binde seg til den frie kjemikalie. Dette er særlig et problem for monoklonale antistoffer. Dette problemet må overvinnes dersom monoklonale antistoffer i kjemikalier skal være anvendbare for kvantitativ analyse. Med hensiktsmessige konjugatdannelses- og utvelgelsesmetoder kan monoklonale antistoffer som bindes til den frie eller ubundne substans fremstilles og identifiseres.

I den foreliggende oppfinnelse benyttes ikke den generelle metode til Albro et al. eller ifølge ovennevnte US-patentskrift

for å binde et klorert fenol til en makromolekylær bærer. Når det gjelder en klorert fenol må hydroksylgruppen bevares slik at den er tilgjengelig for reaksjon med antistoffene som skal fremstilles. Idet klorgruppene er ureaktive må det anvendes en reaktiv gruppe i én av 2-6-stillingene i benzenringen. Men anvendelse av metoden ifølge ovennevnte US-patentskrift eller ifølge Albro et al. resulterer i polymerisasjon og utfelling av den klorerte utgangsfenol.

Av den grunn bindes ifølge den foreliggende oppfinnelse først det kjemiske bindeledd kovalent til den makromolekylære bærer, og derivatet av den klorerte fenol bindes deretter til det kjemiske bindeledds annen ende og danner derved det immunogene konjugat. Fortrinnsvis er den reaktive gruppe i meta- eller para-stilling i forhold til hydroksylgruppen i det klorerte fenolderivat. Når således enheten av kjemisk bindeledd og protein bindes til den klorerte fenol til dannelse av konjugatet er hydroksylgruppen lett tilgjengelig for omsetning med antistoffer. Det kan anvendes forskjellige kjemiske bindeledd avhengig av leddlengden som ønskes mellom den klorerte fenol og makromolekylet. Valget av slikt bindeledd vil være åpenbart for fagfolk på området på basis av det som er beskrevet her. Fortrinnsvis omfatter de reaktive grupper i det kjemiske bindeledd, i det klorerte fenolderivat og i den makromolekylære bærer amino-, hydroksyl- og karboksyl-grupper.

Når det immunogene konjugat er blitt fremstilt anvendes det til immunisering av et vertsdyr ved i og for seg kjente metoder. Disse metoder omfatter vanligvis inokulering, men de kan omfatte andre administreringsmåter. En tilstrekkelig mengde av konjugatet administreres for å frembringe en immunogen reaksjon i verts-dyret .

Enhver vert som produserer antistoffer til konjugatet kan anvendes. Vanlig anvendte dyr er kaniner og gnagere, såsom rotter eller mus. Ifølge den foreliggende oppfinnelse foretrekkes mus.

Når dyret er blitt immunisert og det har gått tilstrekkelig tid for det til å begynne å produsere antistoffer til konjugatet, kan polyklonale antistoffer utvinnes på kjent måte. Den vanlige metode omfatter fjerning av blod fra dyret og separering av serumet fra blodet. Serumet, som inneholder antistoffer til den klorerte fenol som anvendes som haptenen ved fremstillingen av konjugatet, kan anvendes som antiserum til den klorerte fenol. Alternativt kan antistoffene fjernes fra serumet. Affinitetsrensing er en foretrukket metode til utvinning av rensede polyklonale antistoffer til en klorert fenol fra serumet.

Når det gjelder monoklonale antistoffer utvinnes antistoffproduserende celler fra det immuniserte dyr. Selv om det kan anvendes vilkårlige antistoffproduserende celler, foretrekkes B-lymfocytter oppnådd fra dyrets milt.

De antistoffproduserende celler fusjoneres med tumorceller, hvorved det dannes hybridomer. Med "tumorcelle" menes her hver celle som er i stand til å fusjoneres med en antistoffproduserende celle til dannelse av en "udødelig" celle, dvs. en som er i stand til kontinuerlig vekst in vitro. Foretrukne tumorceller er antistoffproduserende celler som er blitt transformert og som har mistet sin evne til å produsere immunglobulin. Slike celler omfatter ryggmargceller fra rotter og plasmacytomceller fra mus. Særlig foretrukne er plasmacytomceller fra mus eller ryggmargceller fra rotter som har utilstrekkelig av enzymet hypoxantin-guanin-fosforribosyltransferase (HGPRT), som muliggjør utvelgelse av hybridomer fra ikke-antistoffproduserende celler eller plasma-cytom- eller ryggmargceller ved dyrking på et medium som inneholder hypoxantin, aminopterin og tymidin.

Det er kjent forskjellige tumorceller for fusjon med anti-stof fproduserende celler, og de er lett tilgjengelige for fagfolk på området. En slik type celler er museplasmacytomcellelinjen P3-X63-Ag8.653, som er beskrevet av Kearney, J. Immunology, Vol 123, 1979, p. 1548. En annen cellelinje er rotteryggmargcellelinje YB2/0, som er beskrevet av Milstein, J. Cell Biology, Vol 93, 1982, p. 576-582. Disse cellelinjer er tilgjengelige fra American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, hvor de er betegnet henholdsvis ATCC CRL 1580 og ATCC CRL 1662.

Det skal bemerkes at den antistoffproduserende celle og tumorcellen kan være fra forskjellige dyrearter, se f.eks. Nowinski et al., Science, 1980, 210:537.

Som nevnt ovenfor er det når cellene er fusjonert nødvendig å separere hybridomene fra de ikke-fusjonerte celler. De anti-stof f produserende celler vil vanligvis dø etter noen få dager i kultur, men tumorcellene er "udødelige". Men ved å anvende tumorceller som har utilstrekkelig HGPRT og dyrke cellene på et medium som inneholder hypoxantin, aminopterin og tymidin vil hybridomene naturlig velges ut, idet tumorcellene ikke er i stand til å overleve på et slikt medium. Det kan imidlertid også benyttes andre utvelgelsesmetoder.

Etter at hybridomene er valgt, evalueres de for å bestemme hvilke som produserer antistoffer til den klorerte fenol. Forskjellige immunologiske metoder som er kjent for fagfolk på området kan benyttes for å evaluere hybridomenes oppåliggende kulturvæsker. Man må passe på å identifisere hybridomer som produserer monoklonale antistoffer bare til den klorerte fenol og ikke til fenolen og den makromolekylære bærer, dvs. at de monoklonale antistoffer som er ønskelige, anvendbare og frembrakt ifølge den foreliggende oppfinnelse er de som reagerer med frie, dvs. ukonjugerte eller ubundne, klorerte fenoler.

Den foretrukne utvelgelsesmetode er en innledende screening ved hjelp av et enzymimmunitetsforsøk (EIA) for identifisering av hybridomer som produserer antistoffer til konjugatet eller til den klorerte fenol. Disse hybridomer screenes deretter ved hjelp av en sammenlignende inhiberingsenzymimmunitetsmetode (CIEIA) hvor det evalueres en fri klorert fenol såsom pentaklorfenols evne til å inhibere binding mellom monoklonale antistoffer og fenol/proteinbærer. Metoden utføres slik som beskrevet av Hunter et al., FEBS Lett. Vol 149, 1982, p. 147-151.

Når hybridomene som produserer monoklonale antistoffer er blitt valgt, kan antistoffene utvinnes fra hybridomene ved kjente metoder. Generelt er det nyttig å klone ett eller flere av hybridomene som produserer monoklonale antistoffer for å oppfor-mere det til en kontinuerlig cellelinje som kan anvendes til å produsere monoklonale antistoffer i mengder.

De ovenfor beskrevne metoder til produksjon av de monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen er in vitro-metoder. Oppfinnelsen omfatter også en in vivo-metode til produksjon av monoklonale antistoffer til klorerte fenoler. Slike antistoffer produseres ved å anbringe et hybridom som produserer antistoffene intraperitonealt i en vevforenelig eller immunundertrykket vert. Dette bevirker at verten danner ascitestumorer, som på sin side danner en væske som inneholder de monoklonale antistoffer som produseres av hybridomet. Etter at et tilstrekkelig tidsrom er medgått til at antistoffene er blitt produsert i tilstrekkelige mengder, kan de utvinnes ved kjente metoder. F.eks. kan ascites-væsken fjernes og det monoklonale antistoff utvinnes i ren form ved affinitetsrensing. Denne fremgangsmåte er særlig egnet for produksjon av monoklonale antistoffer i kommersielt anvendbare mengder.

På samme måte som forskjellige systemer og metoder kan benyttes for å produsere monoklonale antistoffer som reagerer med klorerte fenoler, dannes det derved monoklonale antistoffer som er forskjellige fra det antistoff som er omtalt i eksempelet nedenfor. Imidlertid er slike monoklonale antistoffer, hvis fremstilling er muliggjort ved fremgangsmåten som er omtalt her, også klart innenfor rammen av oppfinnelsen. Det tydelige trekk hos slike antistoffer er for formålene ifølge oppfinnelsen i tillegg til deres monoklonalitet deres reaktivitet på vilkårlig måte med klorerte fenoler, uavhengig av opprinnelse, isotype, molekylær-spesifisitet, affinitet, fremstillingsmåte eller den spesielle type hybridom som anvendes for fremstillingen.

De monoklonale og polyklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen kan anvendes for å identifisere klorerte fenoler, særlig pentaklorfenol, i materialer og til å bestemme konsentrasjonen av kjemikalien i disse materialer. Slike materialer er f.eks. jord, vann, matvarer og kroppsvæsker. Anvendt som et reagens i forskjellige immunitetsforsøk for bestemmelse av nærværet eller konsentrasjonen av en klorert fenol, gir de monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen er bedre metode. Påvisning er mer hen-siktsmessig, hurtig, følsom og spesifikk. Immunitetsforsøkene hvor antistoffene ifølge oppfinnelsen kan anvendes omfatter, men er ikke begrenset til, radioimmunologiske forsøk, sammenlignende immunutfellingsforsøk, enzymbundne immunabsorbsjonsforsøk samt immunfluoressensforsøk. De monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen er generelt de foretrukne antistoffer, selv om de polyklonale antistoffer foretrekkes i visse anvendelser.

Et preparat ifølge den foreliggende oppfinnelse for påvisning av nærværet eller konsentrasjonen av en klorert fenol i materiale inneholder en konsentrasjon av antistoffer som er effektiv når det gjelder å påvise nærværet av kjemikalien eller å angi dens mengde kvantitativt. Antistoffene kan blandes med eller bindes til en egnet bærer, såsom en latexpartikkel eller en plastmikrotiterplate. De kan også være konjugert med et enzym eller et fargestoff eller radioaktivt merket, avhengig av hvilken immunologisk metode som benyttes. Følgelig ligger ethvert prøve-system som anvender monoklonale eller polyklonale antistoffer som reagerer med klorerte fenoler, også pentaklorfenol, innenfor rammen av oppfinnelsen.

De monoklonale og polyklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen er også anvendbare for isolasjon, rensing, nøytralisasjon og/eller fjerning av klorerte fenoler fra kompliserte blandinger eller løsninger, på basis av en selektiv immunologisk reaksjon. Anvendelsen av antistoffene som reagerer med en klorert fenol representerer en forbedring i forhold til kjente metoder.

Egenskapene til de monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen gjør dem særlig anvendbare for disse anvendelser, sammenlignet med polyklonale antistoffer. Disse egenskaper omfatter deres høye spesifisitet og deres tilgjengelighet i stort sett ubegren-sede mengder, noe som gjør det mulig å anvende dem i stor, indu-striell eller kommersiell skala. For eksempel er monoklonale antistoffer til pentaklorfenol anvendbare til separering og rensing av pentaklorfenol fra en blanding av andre klorerte fenoler eller lignende organiske forbindelser. Blandingen bringes i kontakt med immobiliserte monoklonale antistoffer til pentaklorfenol, noe som skiller pentaklorfenolen fra blandingen ved at det dannes immobiliserte komplekser av pentaklorfenol bundet til antistoffet. Etter at fjerningen av blandingen fraskilles pentaklorfenolen fra antistoffene og utvinnes i renset form ved kjente metoder.

Et preparat ifølge oppfinnelsen som er anvendbart til rensing eller fjerning av en klorert fenol fra kompliserte blandinger inneholder en effektiv mengde av det monoklonale antistoff ifølge oppfinnelsen immobilisert på en akseptabel grunnmasse eller i blanding med en akseptabel bærer, for å muliggjøre reaksjon med og binding til den klorerte fenol. Imidlertidig kan for visse blandinger polyklonale antistoffer være å foretrekke.

De monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen er også nyttige reagenser i forskning vedrørende strukturen og funksjonen til klorerte fenoler, særlig pentaklorfenol. Deres utmerkede spesifisitet gjør det mulig å anvende dem i immunokjemiske ana-lyser og struktur-aktivitetsanalyser for disse kjemikalier og gjør dem mer anvendbare for disse anvendelser enn mindre spesifikke, polyklonale antistoffer.

Et preparat ifølge oppfinnelsen anvendbart som et undersøk-elsesreagens inneholder monoklonalt antistoff i en mengde som er tilstrekkelig til å frembringe informasjon ved blanding med en klorert fenol og etterfølgende analyse. Bestemmelse av mengden antistoff som er nødvendig for å oppnå et spesielt undersøkelsesmål avhenger av de spesielle typer undersøkelser det gjelder og kan på lettvint måte bestemmes av en fagmann på området.

Oppfinnelsen vil nå bli nærmere forklart ved hjelp av de etterfølgende eksempler.

Eksempel 1

Fremstilling av tetraklorhydrokinon- proteinkonjugater anvendt for å frembringe en immunitetsreaksjon til pentaklorfenol

Ved denne fremgangsmåte ble protein først behandlet med ravsyreanhydrid for å innføre frie karboksylsyregrupper som kan forestres med en av hydroksylgruppene i tetraklorhydrokinon. Det oppnås derved et addukt, som har liknende struktur som pentalor-fenol, for rottens immunsystem.

Proteinsuccinylering.

På grunn av at tetraklorhydrokinon kan reagere både via orto- og parastilligene resulterte forsøk på å succinylere denne forbindelse for etterfølgende konjugatdannelse med protein i polymerisasjon og utfelling av utgangsforbindelsen. For å unngå dette problem ble proteinet succinylert og ga ved reaksjon med tetraklorhydrokinon en betydelig mengde tetraklorhydrokinon-proteinkon jugat , med mindre utfelling av utgangsforbindelsen. Dette ble utført på følgende måte: 45,2 ml (0,01 m mol) av storfeserumalbumin (BSA) ble løst i 3 ml avionisert vann. 420 ml (4,2 m mol) ravsyreanhydrid ble tilsatt i små porsjoner med konstant omrøring ved romtemperatur. pH ble overvåket og holdt på mellom 7 og 8 ved tilsetning av 1,0 N natriumhydroksidløsning.

Etter at den siste porsjon ravsyreanhydrid var tilsatt og pH stabilisert, fikk reaksjonen fortsette i 30 minutter. På dette tidspunkt ble pH regulert til 2,5 med 1,0 N saltsyre, og protein-løsningen ble dialysert mot destillert vann natten over. Det dia-lyserte protein ble lyofilisert. Tyroglobulin (Thy) fra gris og immunglobulin fra geit ble også behandlet på denne måte med godt resultat.

Forestring av tetraklorhydrokinon til frie ravsyrekarboksyl-grupper

_7 40 mg suksinylert serumalbumin fra storfe (ca. 6,2 x 10 mol) ble løst i 15 ml tørt dimetylsulfoksid. Under omrøring ved romtemperatur ble 12,4 ml (5,0 x 10 _ 5 mol) tetraklorhydrokinon, 150 ml (7,8 x 10 -4) 3-dimetyl-aminopropanolkarbodiimid og 1 mg dimetylaminopyridin tilsatt til proteinløsningen. Reaksjonen foregikk i 4 timer, hvoretter blandingen for dialyse ble anbrakt mot 2x4 liter destillert vann ved 4°C i 18 timer. Den dialy-serte proteinløsning ble lyofilisert. Utbyttet var 38 ml BSA-konjugat. Tyroglobulin fra gris ble også behandlet med godt resultat ved denne fremgangsmåte.

EpitoptetthetsbestemmeIser

Epitoptettheter ble bestemt spektrofotometrisk ved å benytte forskjellen i optisk tetthet mellom like store konsentrasjoner av derivatisert protein og uderivatisert protein i 0,1 N NaOH ved 270,4 nm. Ved å benytte tetraklorhydrokinons ekstinksjonskoeffi-sient ved denne bølgelengde viste de molare forhold mellom

protein og hydrokinonrester for tyroglobulin og serumalbumin fra storfe seg å være henholdsvis 123 og 55.

Eksempel 2

Fremstilling av alternivt konjugat.

For å bedre immunitetsforsøkets følsomhet ovenfor pentaklorfenol ble det fremstilt et konjugat som oppviste en svakt kryss-reagerende forbindelse liknende pentaklorfenol. Ved å senke affiniteten (bindingsstyrken) i vekselvirkningen mellom konjugat og antipentaklorfenol, kunne fri pentaklorfenol konkurrere mer effektivt i lavere konsentrasjoner. Denne fremgangsmåte økte derfor følsomheten i det konkurrerende inhiberingsenzymimmuni-tetsforsøk for pentaklorfenol.

4-(4-hydroksy-3,5-diklorfenyl)smørsyre ble fremstilt ved fremgangsmåten til Martin, J. Am. Chem. Soc., Vol 38, 1936, p. 1438. 180 mg (lm mol) av 4-(4-hydroksyfenyl)smørsyre ble omrørt i 1,5 ml sulfurylklorid i romtemperatur i en time. Bunnfallet som ble dannet ble avfiltrert, hvorved det ble oppnådd 35 ml 4-(4-hydroksy-3,5-diklorfenyl)smørsyre. H NMR (DMSO-dg) ø 1,73 (2H, bred kvintett, J = 7 Hz, -CH2~), 2,17 (2H, triplett, J = 6 Hz, C-CH2-), 2,50 (2H, -CH2-C0), 5,80 (1H, bred utbytting med D20, -C02H), 7,10 (2H, singlett, aromatisk H).

Til 7 mg (0,028 m mol) 4-(4-hydroksy-3,5-diklorfenyl)smør-syre løst i 2 ml dioksan ble det tilsatt 24 mikroliter (0,1 m mol) tri-n-butylamin og 13 mikroliter (0,1 m mol) isobutylklor-formiat etter tur. Løsningen ble omrørt ved romtemperatur i en halv time, deretter ble 1 ml dråpevis tilsatt til en omrørt, is-avkjølt løsning av 100 mg BSA i 0,1 ml 1 N natriumhydroksid, 2 ml vann og 2 ml dioksan. Den resulterende blanding ble omrørt i en time i isbad og en time ved romtemperatur. Det resulterende 4-hydroksy-2,3,5,6-tetraklorfenylsuksinat-BSA ble dialysert i avionisert vann natten over og deretter frysetørket.

Eksempel 3

Fremstilling av hybridomer

Seks uker gamle Sprague-Dawley hunnrotter ble injisert intramuskulært med 500 mikrogram 4-hydroksy-2,3,5,6-tetraklor-fenylsuccinat-BSA emulgert i komplett Freunds medium. Etter 3

uker ble ytterligere 50 mikrogram av samme konjugat i 0,15 M NaCl gitt til rottene. Giverrottene ble avlivet ved knekking av halsen 3 dager etter den siste immuniseringen. Milten ble fjernet asep-tisk og anbrakt i en 35 mm petriskål av plast i 5 ml kaldt Dulbecco's Minimal Essential Medium (DMEM). Milten ble fordelt i en eneste cellesuspensjon, og cellene ble vasket to ganger med kaldt DMEM og resuspendert i samme medium.

En immunglobulin, ikke-utsondrende rotteryggmargcellelinje (YB2/0) som hadde mangel på enzymet hypoksantin-guaninfosforibosyltransferase (HGPRT-, EC 2.4.2.8), slik som beskrevet av Milstein, Journal of Cell Biology, Vol 93, 1982, p.576-582, ble anvendt som fusjonspartner. Denne cellelinje er tilgjengelig fra American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, hvor den er betegnet ATCC CRL 1662. Ryggmargcellelinjen ble oppbevart i DMEM som inneholdt 10% storfefosterserum og ytterligere supple-mentert med 2 mM L-glutamin, 1% natriumpyruvat, 1% ikke-essensielle aminosyrer, 100 IU/ml penicillin samt 100 mikrogram per milliliter streptomysin. I tre dager før fusjonen ble 0,1 mM 8-azaguanin tilsatt til ryggmargcellene for å drepe eventuelle gjenværende HGPRT+. På fusjonsdagen ble ryggmargcellen høstet fra 75 cm 2 dyrkingsflasker, vasket en gang og resuspendert i serumfritt DMEM. Ryggmargcellene og de tidligere høstede miltceller ble talt og deres levedyktighet bestemt ved eksklusjon med Trypan blått fargestoff.

Fusjonsmetoden som ble benyttet var modifisert fra metoden til Gefter et al., Somatic Cell Genetics, Vol 3, 1977, p. 231. Nedenfor er fusjonsforsøket beskrevet som gav ATCC HB 9198. Andre fusjonsforsøk utført på samme måte produserte andre rottehybri-domkloner.

Musehybridomkloner, såsom ATCC HB 9197, ble fremstilt på liknende måte ved anvendelse av en immunglobulin, ikke-utsondrende museplasmacytomcellelinje (P3-X63-Ag8.G53) som hadde mangel på HGPRT, slik som beskrevet av Kearney, Journal of Immunology, Vol 123, 1979, p. 1548, som fusjonspartner. Denne cellelinje er tilgjengelig fra American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, hvor den er betegnet ATCC CRL 1580.

I et sterilt, 50 ml konisk plastrør ble det anbrakt 1,0 x

8 7 10 miltceller og 1,0 x 10 ryggmargceller. Ryggmarg-miltcelle-suspensjonen ble sentrifugert ved 250 g i 10 minutter ved romtemperatur, hvoretter mediet ble dekantert til nesten tørr tilstand. Celleplaten ble løsnet ved forsiktig slåing på røret, og 1 ml 50% polyetylenglykol med molekylvekt 14 00 i DMEM, uten serum, ble

dråpevis tilsatt i løpet av 45 minutter. Røret ble rystet forsiktig under denne prosess. Ett minutt senere ble ytterligere 2 ml DMEM tilsatt i løpet av 2 minutter. Ytterligere 20 ml DMEM ble tilsatt i løpet av de neste 2 minutter, og cellene ble pelletert ved sentrifugering ved 250 g i 10 minutter ved romtemperatur.

Væsken ble dekantert, og 40 ml anriket utvelgelsesmedium ble tilsatt. Dette medium besto av DMEM som inneholdt 10% storfefosterserum supplert med 2 mM L-glutamin, 1% natriumpyruvat, 1%

ikke-essensielle aminosyrer, 100 IU/ml penicillin, 100 mikrogram per milliliter streptomysin, 1 mM oksaleddiksyre, 10% NCTC 109 og 0,2 mikrogram per milliliter storfebukspyttinsulin. Mediet inneholdt ogsa 1,0 x 10 M hypoxantin, 4,0 x 10 M aminopterin og 1,6 x 10 - 5 M tymidin (HAT). Aminopterin er giftig for celler som mangler enzymet HGPRT og dreper derfor alle ufusjonerte ryggmargceller. Fusjonerte celler (hybridomer) overlever i HAT på grunn av at de får HGPRT fra B-lymfocytt-(miltcelle) fusjonspartneren.

Eksempel 4

Utvelgelse av hybridomer som produserer monoklonale antistoffer til pentaklorfenol

Prøver på 0,2 ml inneholdende 5,0 x IO<5>ble overført fra blandingen fremstilt i eksempel 3 til individuelle brønner i adskillige sterile, flatbunnete mikrotiterplater. Platene ble inkubert ved 37°C i en fuktig atmosfære som besto av 6% C02og 94% luft. Friskt utvelgelsesmedium ble tilsatt på alternerende dager i de neste 14 dager. På den 14. dag ble de oppåliggende mikrokulturvæsker testet på antistoffer som reagerer med pentaklorfenol ved følgende enzymimmunitetsforsøk (EIA): Renset 4-hydroksy-2,3,5,6-tetraklorfenylsuksinat-Thy-konjugat ble løst i en konsentrasjon på 10 mikrogram per milliliter i en fosfatbufret saltløsning, PBS, pH 7,4 og dispensert i 50 mikroliter prøver i polyvinylkloridmikrotiterplater med 96-brønner (Dynatech Laboratories, Inc., Chantilly, VA). Etter inkubering natten over ved 4°C ble konjugatløsningen fjernet og brønnene vasket 5 ganger med PBS-Tween (0,5 ml/lTween-20). 50 mikroliter testprøver ble tilsatt til brønnene, platene ble inkubert ved 4°C i 30 minutter og deretter vasket 5 ganger med PBS-Tween. De avsluttende to trinn, adskilt med vasking med PBS-Tween, var som følger: tilsetning av 50 mikroliter av en 1:500 fortynning av geit/anti-rotte IgG/IgM konjugert med enzymet alkalisk fosfatase (Sigma Chemical Co., St. Louis., MO) etterfulgt av inkubering ved 4°C i 30 minutter, deretter tilsetning av 50 mikroliter p-nitrofenyl-fosfatsubstrat (Sigma-104), 1 mg/ml i 10% dietanolamin, pH 9,8, og inkubering ved 25°C i 30 minutter. Absorbsjonen ble avlest ved 405 nm i et Bio-Tek mikro-EIA spektrofotometer (Bio-Tek Instruments, Inc., Winooski, VT).

For å bekrefte at antistoffene virkelig reagerte med penta-klorf enol og ikke bare med 4-hydroksy-2,3,5,6-tetraklorfenyl-suksinat-Thy-konjugatet, ble kulturvæskene på forhånd inkubert med 1,0 x 10 — 3 M pentaklorfenol. Dette såokalte konkurrerende inhiberingsenzymimmunitetsforsøk (CIEIA) resulterte i inhibering av antistoffbinding til det bundne konjugat i fast fase med pentaklorfenol i væskefase. Mens 16 av 192 kulturer var positive ved EIA (8%), var bare 5 positive ved CIEIA (2,6%, som viste minst 50% inhibering med 1,0 x 10 M pentaklorfenol). Positive kulturer ble oppformert i antall og overført til 35 cm 2 kolber. Mediet fra disse kulturer ble testet igjen, og de hybridomer som bibeholdt antistoffsekresjon ble konservert i kulde og lagret ved

-179°C i en dampfase av flytende nitrogen.

Eksempel 5

Kloning av hybridomkultur som produserer monoklonale antistoffer til pentaklorfenol

En av de positive hybridomkulturer som er beskrevet i eksempel 4 ble valgt for kloning ved begrensende tynning. 100 mikro-liters prøver som inneholdt 0-1 celler ble overført til adskillige hundre individuelle brønner i sterile, flatbunnede mikrotiterplater hvor det på forhånd var blitt anbrakt musetymocytter som funksjonerte som forceller for hybridomene. Etter 21 dager ble de klonete kulturer testet igjen ved EIA og CIEIA på antistoffer som reagerer med pentaklorfenol, og én positiv klon ble valgt for videre studium. Denne klonede hybridom, som har vært deponert i American Type Culture Collection under aksesjons-nummeret ATCC HB 9198, ble oppformert i antall, konservert i kulde, og lagret på samme måte som modercellelinjene som den var avledet fra.

Eksempel 6

Produksjon in vitro av monoklonale antistoffer til pentaklorfenol

2 Stasjonære kulturer av ATCC HB 9198 ble dyrket i 75 cm kulturkolber som inneholdt DMEM supplert slik som beskrevet i eksempel 3. Etter 5-7 dagers inkubering ved 37°C under 6% CC^ble det oppnådd 1-2 liter av kulturvæsken, som inneholdt ca. 10 mikrogram per milliliter anti-pentaklorfenol antistoff.

Eksempel 7

Produksjon in vivo av monoklonale antistoffer til pentaklorfenol

En in vivo metode for å oppnå store mengder monoklonale antistoffer omfattet tilpasning av ATCC HB 9198 slik at dette vokste som en "ascites" tumor. Sprague-Dawley hunnrotter ble "preparert" ved intraperitonial injeksjon av 0,5 milliliter "pristane" (2,6,20,14-tetrametylpentadekan). "Pristane" er et sterilt irritament som stimulerer til kraftig sekresjon ("ascites") i rottenes bukhule, som funksjonerer som et vekst-medium. Ca. 7-10 dager etter pristaneinjeksjonen ble prøver som inneholdt 5,0 x 10 aktivt voksende hybridomceller, uttatt fra in vitro kulturer slik som beskrevet i eksempel 7, inokulert i buk-hulene til de preparerte rotter. Det ble dannet ascites-tumorer som vokste hurtig i væskemikromiljøet i rottens bukhule og ut-skilte store mengder (f.eks. 2-10 mg/ml) monoklonale antistoffer som reagerte med pentaklorfenol. Rutinemessig ble 15-20 milliliter ascitesvæske fjernet fra hver rotte ved aspirasjon. De antistoffutskillende tumorceller ble separert fra den antistoffholdige væskefase ved sentrifugering.

Eksempel 8

Affinitetsrensing av monoklonale antistoffer til pentaklorfenol

Formålet med affinitetsrensingen var å fjerne fremmede pro-teiner fra væsker som inneholdt monoklonale antistoffer til pentaklorfenol og fremstille antiklorpentaklorfenolantistoffer i ren form.

Følgende kjemikalier ble derved anvendt: Natriumklorid, etanolamin-HCl, propionsyre, glycocol-HCl, 4-hydroksy-2,3,5,6-tetraklorfenylsuksinat-Thy-konjugat i mengde på 5,0 - 7,5 mg/ml i 0,9% NaCl, samt gluterdialdehyd - aktivt silica som affinitets-absorbent.

Følgende apparatur ble anvendt: Buchner-trakt, rotator, Amicon-konsentreringsanordning (ultrafiltrerings omrørt celle), YM50- og YM300-filtre for ovennevnte (50 kD og 300 kD filtre) samt nitrogen.

For å fremstille antistoffet ATCC HB 9198 for affinitetsrensing ble ca. 600 milliliter av den oppåliggende væske fra

celleutskillende monoklonale antistoffer til pentaklorfenol konsentrert til ca. 30 milliliter under nitrogentrykk gjennom et 300 kD filter. Både filtratet og den konsentrerte væske ble testet i CIEIA vedrørende antistoffaktivitet. Den antistoffholdige konsentrasjon ble deretter konsentrert 10-20x ved filtrering under

nitrogentrykk gjennom et 50 kD filter. Konsentratet ble testet ved CIEIA for å fastslå antistoffaktivitet, og den antistoffholdige fraksjon ble dialysert natten over ved 4°C mot PBS.

For å fremstille affinitetsadsorbenten ble mellom 9 og 10 milliliter konjugatløsning blandet med 3 gram adsorbent av gluterdialdehyd og aktivt silika og rotert natten over ved 4°C. Søylematerialet ble deretter vasket med 1,5% NaCl i en Buchner-trakt med filterpapir nr. 1 inntil eluatet var proteinfritt (optisk tetthet ved 280 nm mindre enn 0,005). Søylematerialet ble fylt ved at 0,3 M etanolamin.HC1 (pH 7,5) ble innblandet på rota-toren ved romtemperatur. Søylematerialet ble deretter vasket etter tur med 0,9% NaCl, 0,5 M propionsyre og 0,9% NaCl i en Buchner-trakt.

Antistoffet ble koplet til søylematerialet ved tilsetning av ca. 30 milliliter antistoffløsning til søylematerialet i et 50 milliliter rør. Røret ble rotert natten over ved 4°C. Den koplede grunnmasse ble deretter helt i en 20 cm 3 sprøyte med en glassull-plugg i bunnen. Søylen ble vasket med 3% NaCl inntil eluerings-midlet var proteinfritt. Antistoffet ble eluert med 0,2 M gly-kokoll.HCl, pH 2,0, og 3-4 milliliter prøver ble oppsamlet og den optiske tetthet ved 280 nm bestemt for hver. De prøver som hadde optisk tetthet på over 0,2 ble samlet. pH ble økt til 7,0 med 1 N NaOH, og deretter ble løsningen dialysert natten over ved 4°C mot

PBS.

Eksempel 9

Demonstrasjon av analytisk anvendbarhet av monoklonale antistoffer til pentaklorfenol

For å bevise at antistoffene ATCC HB 9198 samvirket med fri pentaklorfenol, og for dessuten å vise at disse antistoffer vil kunne anvendes til kvantitativ bestemmelse av pentaklorfenolkonsentrasjoner ble det utført et CIEIA. Dette forsøk lignet EIA som er beskrevet i eksempel 4 med unntagelse av at antistoffene ble preinkubert i én time med forskjellige konsentrasjoner av pentaklorfenol. Vekselvirkning mellom antistoffene og pentaklorfenol i løsning inhiberte deres binding til konjugat i fast fase og minsket derved den endelige fargereaksjon. Forskjellige konsentrasjoner av pentaklorfenol i PBS-T med 25% metanol ble preinkubert med 0,9 mg/ml affinitetsrenset antipentaklorfenol-antistoff (fremstilt som beskrevet i eksempel 8) i én time ved romtemperatur, hvoretter prøver av blandingene ble overført til PVC-plater belagt med 4 mg/ml 4-hydroksy-3,5-diklorfenyl-succinat-BSA. Etter 30 minutters inkubering ble platene vasket og bearbeidet videre slik som omtalt i eksempel 4 for EIA.

Resultatene av denne prosess, som vist i fig. 1, viser et konkurrerende inhiberingsenzymimmunitetsforsøk (CIEIA), som viser bindingen mellom de monoklonale antistoffer ifølge oppfinnelsen og fri pentaklorfenol og viser anvendbarheten av de monoklonale antistoffer ved kvantitativ analyse av pentaklorfenol. Fargereak-sjonen (optisk tetthet ved 405 nm) var omvendt proposjonal med pentaklorfenolkonsentrasjonen. Det lineære parti av kurven går fra over 1000 deler pr. milliard til under 20 deler pr. milliard. Ved analyse av denne kurve ved den logaritmiske fireparameter-metode var den beregnete konsentrasjon i 90% av det anvendbare område av optisk tetthet 13 deler pr. milliard, noe som svarer til en minimal påvisbar konsentrasjon. Ukjente prøver ville bli utført på samme måte, og den resulterende optiske tetthet ville bli sammenlignet med den kjente standardkurve. På denne måte kan de monoklonale antipentaklorfenolantistoffer anvendes for kvantitativ bestemmelse av pentaklorfenolkonsentrasjoner. Resultatene er gunstige når det gjelder følsomhet i forhold til standard gasskromatografiske metoder for pentaklorfenolanalyse, se Federal Register, Vol 49, nr. 209 av 26. oktober 1984.

Tabell 1 viser resultatene av forsøk utført for å bestemme spesifisiteten til antistoffene fra ATCC HB 9198. Her er spesifisitet kryssreaktivitet for antipentaklorfenolantistoffer med nær beslektede kjemiske forbindelser. Resultatene i tabell 1 er uttrykte som Molar IC^ q, definert som den molare konsentrasjon av en spesiell kjemikalie som inhiberer 50% av bindingen av anti-pentaklorf enol til den belagte plate. Med molar IC^Qfor pentaklorfenol som 100% blir hver forbindelse sammenlignet ved en prosentvis kryssreaktivitet (IC50PCP/IC50forbindelse x 100). Det fremgår at 2,3,5,6-tetraklorfenol hadde en kryssreaktivitet på 42% med antistoffet fra ATCC HB 9198, og at 2,4,6-triklorfenol og 2,3,6-triklorfenol hadde henholdsvis 12% og 8%. Av disse data fremgår det at for betydelig kryssreaktivitet med antipentaklorfenolantistoffet må forbindelsen være en fenol med to kloratomer i 2— og 6-stillingene. Det bemerkes at pentaklorbenzen, som av-viker fra pentaklorfenol med ett eneste atom, ikke reagerer med antipentaklorfenolantistoffet.

Claims

1. Fremgangsmåte til fremstiling av monoklonale antistoffer som reagerer med et klorert fenol, karakterisert ved a) at det dannes et immunogent konjugat av den klorerte fenol og en makromolekylær bærer, b) at et dyr immuniseres med konjugatet, c) at det utvinnes antistoffproduserende celler fra dyret, d) at cellene fusjoneres med tumorceller til dannelse av hybridomer, e) at det blant hybridomene velges minst ett som produserer antistoffer som reagerer med den klorerte fenol, samt f) at de produserte antistoffer utvinnes fra det valgte hybridom.

2. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1, karakterisert ved at den klorerte fenol er pentaklorfenol.

3. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1 eller 2, karakterisert ved at det immuniserte dyr er en gnager.

4. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1, 2 eller 3, karakterisert ved at tumorcellene er museplasmacytom-eller rotteryggmargceller.

5. Fremgangsmåte i samsvar med et av kravene 1-4, karakterisert ved at hybridomene har kjennetegnene til ATCC HB 9197 eller ATCC HB 9198 eller mutanter eller varianter derav.

6. Fremgangsmåte til fremstilling av monoklonale antistoffer som reagerer med pentaklorfenol, karakterisert ved a) at det dannes et immunogent konjugat av pentaklorfenol og et protein, b) at en mus immuniseres med konjugatet, c) at det utvinnes antistoffproduserende celler fra musens milt, d) at de antistoffproduserende celler fusjoneres med museplasmacytom- eller rotteryggmargceller som har mangel på enzymet hypoxantin-guaninfosforibosyltransferase til dannelse av hybridomer, e) at minst ett av hybridomene utvelges ved dyrking i et medium som inneholder hypoxantin, aminopterin og tymidin, f) at minst ett av hybridomene som produserer et antistoff til pentaklorfenol i fri eller ukonjugert form identifiseres, g) at det identifiserte hybridom dyrkes til dannelse av antistoffet i en utvinnbar mengde, samt h) at antistoffene som er produsert av det dyrkede hybridom utvinnes.

7. Fremgangsmåte til fremstilling av monoklonale antistoffer til pentaklorfenol, karakterisert ved dyrking av et hybridom som har kjennetegnene til ATCC HB 9197 eller ATCC HB 9198 eller mutanter eller varianter derav i et dyrkingsmedium, og at antistoffene utvinnes av mediet.

8. Fremgangsmåte til in vivo fremstilling av monoklonale antistoffer som reagerer med et klorert fenol, karakterisert ved at det i en vevforenelig eller imminosuppresiv vert intraperitonialt anbringes et hybridom som produserer antistoffene, og at de produserte antistoffer utvinnes fra vertens ascitesvæske.

9. Fremgangsmåte i samsvar med krav 8, karakterisert ved at den klorerte fenol er pentaklorfenol.

10. Fremgangsmåte i samsvar med krav 8 eller 9, karakterisert ved at verten er en gnager.

11. Fremgangsmåte i samsvar med krav 8, 9 eller 10, karakterisert ved at hybridomet har kjennetegnene til ATCC HB 9197 eller ATCC HB 9198 eller mutanter eller varianter derav.

12. Fremgangsmåte til fremstilling av en kontinuerlig cellelinje som produserer monoklonale antistoffer til en klorert fenol, karakterisert ved a) at det dannes et immunogent konjugat av den klorerte fenol og en makromolekylær bærer, b) at et dyr immuniseres med konjugatet, c) at det utvinnes antistoffproduserende celler fra dyret, d) at cellene fusjoneres med tumorceller til dannelse av hybridomer, e) at det blant hybridomene velges minst ett som produserer antistoffer som reagerer med den klorerte fenol, samt f) at det valgte hybridom ved kloning oppformeres til en kontinuerlig cellelinje.

13. Fremgangsmåte i samsvar med krav 12, karakterisert ved at den klorerte fenol er pentaklorfenol.

14. Hybridom som produserer et monoklonalt antistoff, karakterisert ved at antistoffet reagerer med en klorert fenol.

15. Hybridom i samsvar med krav 14, karakterisert ved at den klorerte fenol er pentaklorfenol.

16. Hybridom i samsvar med krav 14 eller 15, karakterisert ved at det har kjennetegnene til ATCC HB 9197 eller ATCC HB 9198 eller mutanter eller varianter derav.

17. Monoklonalt eller polyklonalt antistoff, karakterisert ved at det reagerer med en klorert fenol.

18. Antistoff i samsvar med krav 17, karakterisert ved at den klorerte fenol er pentaklorfenol.

19. Monoklonalt antistoff, karakterisert ved at det er utvunnet fra cellelinjen fremstilt ved fremgangsmåten ifølge krav 12 eller 13.

20. Antistoff i samsvar med krav 17 eller 18, karakterisert ved at det monoklonale antistoff er utvunnet av et hybridom.

21. Antistoff i samsvar med krav 20, karakteisert ved at hybridomet har kjennetegnene til ATCC HB 9197 eller ATCC HB 9198 eller mutanter eller varianter derav.

22. Fremgangsmåte til påvisning av bestemmelse av konsentrasjonen av en klorert fenol i en prøve ved anvendelse av et immuni-tetsf orsøk, karakterisert ved at det som reagens i immunitetsforsøket anvendes et monoklonalt antistoff som reagerer med den klorerte fenol.

23. Fremgangsmåte i samsvar med krav 22, karakterisert ved at det monoklonale antistoff reagerer med pentaklorfenol.

24. Fremgangsmåte til påvisning eller bestemmmelse av konsentrasjonen av en klorert fenol i en prøve, karakterisert ved at antistoffer som reagerer med den klorerte fenol tilsettes til prøve, og at nærværet eller konsentrasjonen av den klorerte fenol bestemmes ved et immunologisk forsøk hvor de monoklonale antistoffer anvendes som et reagens.

25. Fremgangsmåte til immunologisk isolering eller fjerning av en klorert fenol fra en blanding, på basis av en selektiv immono-logisk reaksjon med et antistoff som er spesifikt for den klorerte fenol, karakterisert ved at det anvendes et monoklonalt antistoff.

26. Fremgangsmåte til rensing av en klorert fenol, karakterisert ved at et materiale som inneholder den klorerte fenol bringes i kontakt med immobiliserte monoklonale antistoffer som reagerer med den klorerte fenol for separering av denne fra materialet ved at det dannes immobiliserte komplekser av antistoffet og den klorerte fenol, og at den klorerte fenol separeres fra de immobiliserte antistoffer, slik at den klorerte fenol utvinnes i renset form.

27. Fremgangsmåte til biokjemisk, immunologisk, funksjonell eller annen analyse av en klorert fenol, karakterisert ved at det anvendes et monoklonalt antistoff som reagerer med den klorerte fenol i en mengde som er effektiv og resulterer i analysen.

28. Preparat til bestemmelse av nærværet eller konsentrasjonen av en klorert fenol i en prøve, karakterisert ved at det inneholder en effektiv mengde av et monoklonalt antistoff som reagerer med den klorerte fenol i en akseptabel bærer.

29. Preparat i samsvar med krav 28, karakterisert ved at den klorerte fenol er pentaklorfenol.

30. Preparat for isolering eller fjerning av en klorert fenol fra en blanding som inneholder den, karakterisert ved at den inneholder en effektiv mengde av en monoklonalt antistoff som reagerer med den klorerte fenol og som er immobilisert på en akseptabel grunnmasse eller i blanding med en akseptabel bærer.

31. Preparat for biokjemisk, immunologisk, funksjonell eller annen analyse av en klorert fenol, karakterisert ved at det er en effektiv mengde av et monoklonalt antistoff som reagerer med den klorerte fenol og som er i en akseptabel bærer.

32. Preparat for biokjemisk, immunologisk, funksjonell eller annen analyse av en klorert fenol, karakterisert ved at det inneholder en effektiv mengde av et monoklant antistoff som reagerer med den klorerte fenol og som befinner seg i en akseptabel bærer.

33. Fremgangsmåte til fremstilling av polyklonale antistoffer som reagerer med en klorert fenol, karakterisert ved at det dannes et immunogent konjugat av den klorerte fenol og en makromolekylær bærer, at et dyr immuniseres med konjugatet, at blod fjernes fra dyret, at serum separeres fra blodet, og at antistoffene utvinnes av serumet.

34. Fremgangsmåte i samsvar med krav 33, karakterisert ved at den klorerte fenol er pentaklorfenol.

35. Fremgangsmåte til bestemmelse av nærværet eller konsentrasjonen av en klorert fenol i en prøve ved et immunitetsforsøk, karakterisert ved at det som reagens i immuni-tetsforsøket anvendes et polyklonalt antistoff som reagerer med den klorerte fenol.

36. Fremgangsmåte til fremstilling av et immunogent konjugat av en klorert fenol og en makromolekylær bærer, karakterisert ved at et kjemisk bindeledd bindes til den makromolekylære bærer, og at et derivat av den klorerte fenol inneholdende en reaktiv gruppe, bindes kovalent til det kjemiske bindeledd til dannelse av det immunogene konjugat.

37. Fremgangsmåte i samsvar med krav 36, karakterisert ved at den klorerte fenol er pentaklorfenol.

38. Syntetisk antigen, karakterisert ved at materialet er en klorert fenol kovalent bundet til en makromolekyær bærer.