JPS63126494A - モノクロナル又はポリクロナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、塩素化フェノール類と反応するモノクロナル
抗体類及びポリクロナル抗体類に関し、特に有毒な化学
物質であるペンタクロロフェノールと反応するモノクロ
ナル抗体類に関する。本発明は、上記の抗体類、上記抗
体類の製造方法、上記抗体類を使用する分析法、診断法
、研究法、分離法及びその他の方法、並びに上記のごと
き使用に供する抗体類含有組成物に関する。更に、本発
明は、上記のごときモノクロナル抗体類を生産するハイ
ブリドマ類（ｈｙｂｒｆｄｏｍａｓ）及びハイブリドマ
類の製造方法に関する。又、本発明は、塩素化フェノー
ル類と巨大分子との免疫原複合体類及びこれらの免疫原
複合体類の製造方法に関する。

［関連する技術］ 塩素化フェノール類は、広く使用されている化学物質で
あると共に、広く分布している環境汚染物である。塩素
化フェノール類のうち最も重要なものの１つはペンタク
ロロフェノール（以下、ＰＣＰと略記する）であり、ｐ
ｃｐは米国全土で殺虫殺草剤及び防腐剤として広く使用
されている。殺虫殺草剤としては、殺虫剤、殺菌剤、殺
草剤、殺藻剤及び消毒剤として使用されている。ＰＣＰ
は、木材及び木材製造製造業、建設資材、皮革、紙及び
ローブ製造業を含む広範な工業的用途に用いられている
。又、給水システム中でかび及び藻の抑制のために使用
されている。使用されているＰＣＰの大部分は、木材製
品の処理で主として殺真菌及び殺菌剤として使用されて
いる。建設資材中では、タイル、屋根板、コンクリート
、アスベスト、ブレスポード、壁板及び絶縁体中で使用
されている。なめし作業中での品質低下を防ぐためにＰ
ＣＰは皮革にも用いられる。ペンキ中では防腐剤として
使用されている。繊維業では、白かびの発生（べと病）
防止のための処理剤として使用されている。又、包装に
用いる紙、接着剤及びプラスチック類に塗布されている
ために、ＰＣＰは食品と接触する可能性もある。

使用の程度及び環境中への分散性が高いという物理的特
性のために、ＰＣＰは社会的影響の大きな汚染物である
。ＰＣＰは、家庭内の塵埃、空気及び水中で見い出され
る。遊離フェノールの状態では、多くの物質の表面、特
に土壌上に吸着される。ナトリウム塩は水中に懸温する
粒子状物に容易に吸着される。

ｐｃｐは人を含む哺乳動物に対する毒性が高い。・ｐｃ
ｐは重点汚染物に関する米国環境保護局のリストにも載
っている。従って、水、土壌、食品、その他の物質中の
ｐｃｐ及びその他の有毒な塩素化フェノール類の存在を
検出し、その定量を可能にすることは重要な課題である
。

ＰＣＰの分析、特に水中のｐｃｐの分析は困難で費用を
要する。現在のところ環境保護局が承認している分析法
は、電子捕獲検出器又は炎イオン化検出器（ｆｌａｍｅ
　１ｏｎｆｚａｔｉｏｎ　ｄｅｔｅｃｔｏｒ）を使用す
るガス・クロマトグラフ法である（１９８４年１０月２
６日イ寸の４９Ｆｅｄ、　Ｒｅｇ、　５８−６６参照）
。この方法は、費用がかかり、時間を要し、労働集約的
な方法である。設備は複雑で高価であり、高度に訓練さ
れた作業員が必要である。この方法は、各試料につき広
範囲の抽出及び清浄工程を含む。従って、１つの試料の
分析に１日以上の時間と約１００ドルの費用を要する。

低濃度の化合物類の検出のためには各種の免疫分析法が
利用されている。免疫分析法は検出対象物質の抗体類を
使用し、一般的に極めて高感度で、特定性があり、割り
と経済的で、使用が容易である。しかしながら、塩素化
フェノール類の検出及び定量のために免疫分析法が利用
されたことはなかった。本発明以前には、ＰＣＰ及びそ
の他の塩素化フェノール類に対する抗体類が製造された
こともない。

［発明が解決しようとする問題点］ 塩素化フェノール類、特にペンタクロロフェノールと反
応する新規な抗体類の製造が試みられた。その理由は、
もし実際にそのような新規な抗体類をつくることができ
れば、既存の分析技術によっては満足されなかった多く
の重要な要求が満足されるものと考えられるからである
。この種の抗体類はペンタクロロフェノールと結合して
、種々の迅速・簡単で経済的な免疫分析技術により、有
毒化学物質の検出を可能にする。最初の工程としてＰＣ
Ｐを抽出する必要がなくなるので、水中のＰＣＰの検圧
のために特に有用であると考えられる。

更に、塩素化フェノール類、特にペンタクロロフェノー
ルに対するモノクロナル抗体類を生産する新規な自己再
生産細胞ライン（ｓｅｌｆ−ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　
ｃｅｌｌ　１ｉｎｅ）の製造が試みられねた。ポリクロ
ナル抗体類と比較して、モノクロナル抗体類は単一のＢ
リンパ球クローンから８導され、そのために極めて特定
的で均一である。１９７５年にコーラ及びミルスタイン
（Ｋｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）はＮａｔ
ｕｒｅ。

２６５：４９５　（この文献を本明細書中に引用する）
において、特定の抗体生産Ｂリンパ球を腫瘍細胞と融合
させ、試験管内（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）又は動物内（ｉｎ
　ｖｔｖｏ）で単一のモノクロナル抗体を合成すること
ができる「不死」の（ｉｍｍｏｒｔａｌ）自己再生産混
成りローン［即ち、ハイブリドマ（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ
）　］とすることにより羊赤血球細胞に対する抗体の製
造方法を開示した。

このようなハイブリドマは、阜−の予め定められた特異
性を持つ抗体の潜在的には無制限な供給体を生産するこ
とができる自己繁殖細胞「工場」である。

従って、上記のごとき抗体類は、絶妙な特定性を持つ故
に、検出試薬としてはポリクロナル抗体類よりも有用性
が高い。同様に、Ｐｃｐの免疫学的研究及び生化学的研
究、ｐｃＰの親和高純度化、ｐｃｐの中和又は水その他
のｐｃｐ含有物質からのｐｃｐの除去に当たって、上記
の特定性によってモノクロナル抗体類の有用性が高めら
れる。更に、従来法のポリクロナル抗体類とは異なり、
ＰＣＰと反応するモノクロナル抗体類は潜在的には無限
の均質な供給物中で製造することができ、ＰＣＰ／蛋白
複合体の低免疫原性（ｌｏｗ　ｉｍｍｕｎｏｇｏｎｉｃ
ｉｔｙ）に起因する問題、ポリクロナル抗体反応の変動
性、並びにその結果生じる環境上その他の応用分野への
抗ｐｃｐ抗体類の利用水準又は供給における制約を回避
できる。

［問題点を解決するための手段コ 従って、本発明は、塩素化フェノールと反応するモノク
ロナル抗体及びこのような抗体を生成するハイブリドマ
（混成種）に関する。好ましくは、ハイブリドマはペン
タクロロフェノールと反応する。

本発明は、更に、塩素化フェノールと反応するモノクロ
ナル抗体類の製造方法であって、前記塩素化フェノール
と巨大分子担体との免疫原複合体をつくり、動物を前記
複合体に免疫にし、前記動物から抗体生産細胞を得、前
記細胞と腫瘍細胞とを融合してハイブリドマ類を得、前
記のハイブリドマ類から前記塩素化フェノールと反応す
る抗体類を生産する少なくとも１種のハイブリドマを選
択し、選択されたハイブリドマから生産された抗体類を
回収することを特徴とする方法を含む。

本発明は、又、塩素化フェノールと反応するモノクロナ
ル抗体類の生体内製造方法であって、前記抗体類を製造
するハイブリドマを組織競合性ないし免疫抑制ホストの
腹腔内に入れ、前記ホストの腹水から生産された抗体類
を回収することを特徴とする方法を提供するものである
。

本発明は、更に、塩素化フェノールに対するモノクロナ
ル抗体類を生産する連続細胞ラインを製造する方法であ
って、前記塩素化フェノールと巨大分子担体との免疫原
複合体をつくり、動物を前記複合体に対して免疫にし、
前記動物から抗体生産細胞を得、前記抗体生産細胞を腫
瘍細胞と融合させてハイブリドマ類をつくり、前記ハイ
ブリドマ類から前記の塩素化フェノールと反応する抗体
を生産するハイブリドマを選択し、選択された前記ハイ
ブリドマを無性生殖的にふやして細胞ラインにすること
を特徴とする方法を提供するものである。

本発明は、更に、試料中の塩素化フェノールの存在又は
濃度を測定する方法であって、前記試料に前記塩素化フ
ェノールと反応するモノクロナル抗体を添加し、モノク
ロナル抗体を試薬として用いる免疫分析によって塩素化
フェノールの存在又は濃度を測定することを特徴とする
方法を提供するものである。

本発明は、更に、試料中の塩素化フェノールの存在又は
濃度を測定するための組成物であって、有効量の前記塩
素化フェノールと反応するモノクロナル抗体が許容でき
る担体に担持された組成物から成ることを特徴とする組
成物を提供するものである。

本発明は、更に、モノクロナル抗体を使用することを特
徴とする塩素化フェノールに対する特異抗体の選択的免
疫反応に基づく混合物からの塩素化フェノールの単離又
は除去を行なう免疫学的手法を提供するものである。

本発明は、更に、塩素化フェノールを含有する混合物か
ら前記塩素化フェノールな単離又は除去するための組成
物であって、前記塩素化フェノールと反応するモノクロ
ナル抗体の有効量を含有し、前記モノクロナル抗体が許
容できる基質に固定されているか、あるいは許容できる
担体と混合されていることを特るポリクロナル抗体類を
提供するとともに、塩素化フェノールと反応するポリク
ロナル抗体類の製造方法であって、前記塩素化フェノー
ルを巨大分子担体との免疫原複合体をつくり、動物を前
記複合体に免疫にし、前記動物から血を抜き取り、前記
の血から血清を分離し、前記血清から抗体類を回収する
ことを特徴とする方法を提供するものである。

本発明は、更に、巨大分子担体に配位結合した塩素化フ
ェノールから成る免疫原複合体を提供するとともに、塩
素化フェノールと巨大分子担体との免疫原複合体をつく
る方法であって、前記巨大分子担体に化学的架橋剤を配
位結合させ、反応基を有する前記塩素化フェノールの８
導体を前記の化学的架橋剤に配位結合させることにより
免疫原複合体を形成させることを特徴とする方法を提供
するものである。

従って、本発明は、塩素化フェノール類と反応する抗体
類に関する。本明細書中で使用する「塩素化フェノール
」なる語句は、ベンゼン核の２位〜６位の１箇所又はそ
れ以上の位置に塩素が結合しているフェノールを意味す
る。

本発明の一実施例においては、抗体類は塩素化フェノー
ル類と反応するポリクロナル抗体類である。別の好まし
い実施例においては、抗体類は塩素化フェノール特にペ
ンタクロロフェノールと反応するモノクロナル抗体類で
ある。

特に好ましい実施例においては、本発明のモノクロナル
抗体は、ハイブリドマ細胞ラインＡＴＣＣＨＢ　　９１
９７及びＡＴＣＣＨＢ　　９１９８、又はこれらの突然
変異腫もしくは変種によって生産されるモノクロナル抗
体の特性を持つ、ＡＴＣＣＨＢ　　９１９７及びＡＴＣ
ＣＨＢ　　９１９８は、米国、メリーランド州、ロック
ビル、バークローン・ドライブ、１２３０１　（郵便番
号：２０８５２）のアメリカン・タイプ・カルチャー・
コレクション（ＡＴＣＣ）の永久Ｘ　ｉ　物から人手で
きる微生物学的に純粋な培養菌であり、１９８６年９月
１２日に寄託されたものである。ＡＴＣＣＨＢ　　９１
９８はラットのＢリンパ球とラットの骨髄腫細胞との融
合によってつくられたものであり、ＡＴＣＣＨＢ　　９
１９７はマウスのＢリンパ球とマウスの形質細胞腫細胞
との融合によってつくられたものである。これらのハイ
ブリドマ類によって生産される免疫グロブリン類（抗体
類）はＩｇＧクラスの抗体類である。ＡＴＣＣＨＢ　　
９１９７及びＡＴＣＣＨＢ　　９１９８のモノクロナル
性（ｍｏｎｏｃｌｏｎａＨｔｙ；単一分岐性）は、これ
らを生産するハイブリドマの再阜性生殖（ｒｅ−ｃｌｏ
ｎｉｎｇ）によって確認された。

本発明は、更に、塩素化フェノール類に対する抗体類を
製造ないし生産するハイブリドマ及び連続細胞ラインを
も包含する。好ましくは、本発明のハイブリドマ及び連
続細胞ラインはＰＣＰに対するモノクロナル抗体類を生
産する。最も好ましくは、本発明の連続細胞ラインは、
ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ　　９１９７及びＨＢ　　９１９
８のハイブリドマ細胞ライン又はこれらの細胞ラインの
突然変異種もしくは変種の特性を持つ。本発明のモノク
ロナル抗体を生産する細胞ライン又は連続細胞ラインの
個々の細胞も本発明の技術的範囲に含まれる。

当業者は、ＡＴＣＣＨＢ　　９１９７又はＡＴＣＣＨＢ
　　９１９８の突然変異種もしくは変種をつくる既知の
技術を用いることができる。このような突然変異種もし
くは変種は、ＰＣＰと反応するモノクロナル抗体を生産
するものであれば、本発明の技術的範囲に包含される。

又、当業者は当該技術分野で公知の技法及び本明細書に
開示された教示を利用して、ＡＴＣＨＢ　　９１９７も
しくはＡＴＣＣＨＢ　　９１９８又はこれらの細胞ライ
ンによって生産される抗体類とは異なる特性を持つＰＣ
Ｐと反応するモノクロナル抗体類並びにモノクロナル抗
体生産細膓ラインをつくり出すことができる。しかしな
がら、上記のごときモノクロナル抗体類及びこれらの抗
体類を生産するハイブリドマ又は細胞ラインは本発明の
技術的範囲に含まれる。ＡＴＣＣＨＢ　　９１９７もし
くはＡＴＣＣＨＢ９１９８によって生産されるモノクロ
ナル抗体類は、他のハイブリドマ類によって生産され、
ＰＣＰと反応する可能性を持つ多種のモノクロナル抗体
類がＰＣＰと反応するのを妨げる。上記の多種のモノク
ロナル抗体類も、本発明の技術的範囲に包含される。

本発明のハイブリドマ類及び連続細胞ラインは、以下の
方法によって製造することができる。

（ａ）巨大分子担体と、モノクロナル抗体の対象物質で
ある特定の塩素化フェノールとの免疫原複合体を生成さ
せ； （ｂ）動物を前記複合体に対して免疫にし；（Ｃ）免疫
になった動物から抗体生産細胞を得； （ｄ）抗体生産細胞を腫瘍細胞と融合させて複数のハイ
ブリドマを生成させ； （ｅ）前記の複数のハイブリドマから塩素化フェノール
と反応する抗体類を生産するハイブリドマを選択する。

上記のようにして選択された単−又は複数のハイブリド
マを単性生殖させて細胞ラインをつくる。

単性生殖により連続細胞ラインをつくる前、あるいはつ
くった後に選択された単−又は複数のハイブリドマから
本発明のモノクロナル抗体類を回収することができる。

既に述べたように、本発明の好ましい実施例においては
、塩素化フェノールはＰＣＰである。従って、好ましい
モノクロナル抗体類は、ＰＣＰに対するモノクロナル抗
体類である。

変形例においては、塩素化フェノールに対する抗体を生
産する細胞と腫瘍細胞との融合によって本発明のハイブ
リドマ類を製造することができる。この変形例で製造さ
れるハイブリドマ類は、適当な培地中で培養し培地から
抗体類を回収することにより、本発明のモノクロナル抗
体類の製造に利用することができる。

分子量約１０００又はそれ未満の物質、たとえばペンタ
クロロフェノール（分子量２６６）は、通常は抗体類の
生成を誘起しない、即ち非免疫原である。しかしながら
、この種のハブテン（ｈａｐｔｅｎ；　　不完全抗原）
と呼ばれる物質に小さな物質に対する抗体類の生産を誘
起するために、炭水化物又は蛋白質のような大きな抗体
類担体分子を化学的に付着させることができる。ハブテ
ンと巨大分子担体との免疫原複合体を製造するための一
般的な技法は、本技術分舒では公知である。たとえば、
１９８４年７月２６日イ寸でスターク（ｓｔａｒｋ）に
付与された米国特許第４，４５６，６９１号明細書及び
＾１ｂｒｏ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｔｏｘｉｃｏｌ　Ａｐｐ
ｌ、　Ｐｈａｒｍａｃｏｔ、、　５０．１３７〜１４６
　（１９７９年）を参照されたい。

アルプロ等（＾１ｂｒｏ　ａｔ　ａｌ）による方法又は
スターク（ｓｔａｒｋ）による方法は、化学的な架橋剤
又は架橋基によりハブテンを巨大分子担体に共有結合さ
せる方法である。化学的な架橋剤は、両端に反応性の基
を持つ二官能性分子である。化学的な架橋剤の反応性の
基が巨大分子及びハブテンの反応性の基と結合し、化学
的な架橋剤の一端部が巨大分子と共有結合し、化学的な
架橋剤の他方端がハブテンと共有結合する。アルプロ等
又はスタークの方法においては、最初に化学的架橋剤を
ハブテンに付加し、得られた化合物を化学的架橋剤の他
端部の反応性の基を介して巨大分子に付加する。

当業者には公知のごとく、担体蛋白質と複合された小さ
な化学化合物に対して生じた抗体は、当該化学物質の構
造のみならず化学物質と蛋白質の中間の架橋剤の構造を
も認識させ、架橋剤が付加した位置に隣接する蛋白質の
構造をも認識させるものである。このような付随的な構
造の認識の結果として、抗体は遊離の化学物質との結合
能力を失うか或いは、遊離の化学物質との結合能力が著
しく低下する。これは、特にモノクロナル抗体類の持つ
問題点である。モノクロナル抗体類を定量分析に使用で
きるようにするためには、上記の問題点を克服しなけれ
ばならない。適当な複合及び選択法を採用することによ
り、遊離物質即ち、未結合の物質と結合するモノクロナ
ル抗体類を調製し、同定することができる。

本発明においては、塩素化フェノールを巨大分子担体に
付加するためにアルプロ等又はスタークによる一般的な
方法は採用しない。

塩素化フェノールの場合には水酸基を保存しておいて、
対象抗体類との反応に利用する。

塩素基は反応性を持たないから、ベンゼン核の２位〜６
位の何らかの位置の反応性の基を利用しなければならな
い。しかしながら、スターク又はアルプロ等の方ン去を
採用すると、出発原料である塩素化フェノールの重合と
沈殿が起こる。

−以　　下　　余　　白　　− 従って、本発明の方法においては、化学的架橋剤を最初
に巨大分子担体に共有結合によって付着させ、次いで塩
素化フェノールの８導体を化学的架橋剤の他端部に付着
させることにより、免疫原複合体を形成させる。好まし
くは、塩素化フェノール話導体の水酸基に対してメタ又
はバラ位置に反応性の基をつける。従って、化学的架橋
剤／蛋白結合体を塩素化フェノールに付着させると、抗
体との反応に水酸基を利用することができる。塩素化フ
ェノールと巨大分子との中間部分の架橋部分の所望長さ
に応じて、種々の化学的架橋剤を用いることができる。

当業者は、本明細書の教示に照らして容易に適当な架橋
剤を選択できる。化学的架橋剤、塩素化フェノール誘導
体及び巨大分子担体上の好ましい反応基の例としては、
アミノ基、水酸基及びカルボキシル基を挙げることがで
きる。

免疫原複合体がつくられた後においては、本技術分野で
公知の技術により、ホスト（宿主）動物を免疫にするこ
とができる。公知の技術は、通常は接種によるものであ
るが、その他の投与法によってもよい。ホスト動物に免
疫反応を起こさせるに充分な量の複合体を投与する。

複合体に対する抗体類をつくり出す動物であれば、何を
用いてもよい。従来法で用いられている動物は、うさぎ
類並びにラット又はマウス等の冨歯類動物である。本発
明においては、好ましい動物はマウス及びラットである
。

動物が免疫になり、複合体に対する抗体の生産を開示す
るに充分な時間が経過した後に、公知の技術によりポリ
クロナル抗体類を回収する。一般的な方法は、動物から
血を抜き取り、血から血清を分離する方法である。

複合体製造時にハブテンとして使用する塩素化フェノー
ルに対する抗体類を含有する血清を塩素化フェノールに
対する抗血清として使用することができる。別法として
、血清から抗体類を回収することもできる。血清から塩
素化フェノールに対する高純度のポリクロナル抗体類を
回収する方法として好ましい技法は、親和高純度化法（
ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｐｕｒｉｆｉｃａ−ｔｉｏｎ）であ
る。

モノクロナル抗体類についての本発明の実施例において
は、免疫動物から抗体生産細胞を回収する。どの抗体生
産細胞を用いてもよいが、好ましいものは動物の牌臓か
ら得られるＢリンパ球である。

抗体生産細胞を腫瘍細胞と融合させてハイブリドマをつ
くる。本明細書で使用する「腫瘍細胞」なる語句は、抗
体生産細胞と融合して混成「不死」細胞、即ち試験管内
で成長を続けることができる細胞を作りだすことができ
る細胞を意味する。好ましい腫瘍細胞は、変態して免疫
グロブリン生産能力を失なう抗体生産細胞である。この
種の細胞の例としては、ラットの骨髄腫細胞及びマウス
の形質細胞腫細胞を挙げることができる。特に好ましい
ものは、ハイポキサンチン、アミノプテリン及びチミジ
ンを含有する培地で成長させたときに融合していない抗
体生産細胞又は形質細胞腫細胞からハイブリドマの選択
を許容する酵素ハイポキサンチンーグアミン・ホスホリ
ボシル・トランスフェラーゼ（ｅｎｘｙｍｅ　ｈｙｐ。

ｘａｎｔｈｉｎｅ−ｇｕａｎｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｒ
ｉｂｏｓｙｌ　ｔｒａｎｓｆｅｒＢｓｅ；　ＨＧＰＲＴ
）の欠如したマウスの形質細胞腫細胞である。

抗体生産細胞との融合に使用できる種々の腫瘍細胞は、
当業者には公知であり容易に入手できる。この種の細胞
の一例は、ケルニー（ｋｅａｌｎｅｙ）　　によりＪ、
　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第１２３巻、１５４８頁（１
９７９年）に記載されたマウスの形質細胞腫細胞ライン
Ｐ３−Ｘ６３−　Ａ　ｇ　８．６５３である。もう１つ
の細胞ラインとしては、ミルスタイン・ジュニア（Ｍｉ
ｌｓｔｅｉｎ、　Ｊ＝）によりＣｅ４１　Ｂｉｏｌｏｇ
ｙの　９３＋５７６〜５８２（１９８２年）に記載され
たラットの骨髄腫細胞ラインＹ　Ｂ　２１０である。こ
れらの細胞ラインは、メリーランド州、ロックビルのア
メリカン・タイプ・カルチュア・コレクシミン（Ａｍｅ
ｒｉｃａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔ
ｉｏｎ。

Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ）から入手で
き、同所ではＡＴＣＣＣＲＬ　　１５８０及びＡＴＣＣ
ＣＲＬ　　１６６２で夫々分類されている。

ここで、抗体生産細胞と腫瘍細胞とは異なる動物種から
得られることに注意されたい。

これについては、たとえば、ノウインスキー等（Ｎｏｗ
ｉｎｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ、）の５ｃｉｅｎｃｅ、　２１
０：５３７　（１９８０年）収載の報文を参照されたい
。

既述の如く、細胞融合後に、ハイブリドマを融合しなか
った細胞から分離する必要がある。抗体生産細胞は一般
に数日間培養中に死んでしまうが、腫瘍細胞は「不死」
である。

しかしながら、ＨＧＰＲＴが欠如した腫瘍細胞を使用し
、ハイポキサンチンとアミノプテリンとチミジンとを含
有する培地で融合細胞を成長（繁殖）させることにより
、Ｍ瘍細胞は上記のような培地上では生き残ることがで
きないので、当然の結果としてハイブリドマ（即ち融合
細胞）を選択することができる。

しかしながら、その他の既知の選択技術を採用してもよ
い。

ハイブリドマを選択した後に、評価を行ない塩素化フェ
ノールに対する抗体を生産するハイブリドマを特定する
。ハイブリドマの培養上澄み液の評価を行なうに当たっ
ては、当業者に公知の種々の免疫分析法を使用すること
ができる。塩素化フェノール・巨大分子担体に対するモ
ノクロナル抗体類ではなく塩素化フェノールのみに対す
るモノクロナル抗体類を生産するハイブリドマ類を同定
するように注意しなければならない。換言すると、所望
する有用な本発明のモノクロナル抗体類は、遊離状態即
ち、複合体を形成していない未結合の塩素化フェノール
類と反応するモノクロナル抗体類なのである。

好ましい選択技法は、酵素免疫分析（ＥＩＡ）によって
、複合体又は塩素化フェノールに対する抗体類を生産す
るハイブリドマ類を同定する初期スクリーン法（ｉｎｌ
ｔｉａ、ｌ　５ｃｒｅｅｎ）である。初期スクリーンに
よって選択されたハイブリドマを、次に、ＰＣＰ等の遊
離塩素化フェノールの能力を評価してモノクロナル抗体
類とフェノール／蛋白質担体との結合を阻害する競合阻
害酵素免疫分析（ＣＩ　Ｅ　ＩＡ）によって選別する。

ＣＩＥＩＡは、ハンター等（Ｈｕｎｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ
、）によりＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ。

１４９：１４７〜１５１（１９８２年）に開示された方
法によって実施する。

モノクロナル抗体生産ハイブリドマを選択ないし選別し
た後、公知の技法でハイブリドマから抗体を回収するこ
とができる。一般に、１種又はそれ以上のモノクロナル
抗体生産ハイブリドマを単性生殖させて多量のモノクロ
ナル抗体の生産に使用できる連続細胞ラインにするのが
よい。

本発明のモノクロナル抗体製造のための既述の方法は、
試験管内（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）方法である。本発明は、
塩素化フェノール類に対するモノクロナル抗体類を製造
する生体内（ｉｎｖｆｖｏ）方法を含む。抗体類を生産
するハイブリドマを組織適合性を持つホスト又は免疫抑
制ホストの腹腔内に投与することによって抗体類を製造
する。投与の結果、ホストは腹水腫瘍を起こし、ハイブ
リドマによって生産された抗体類を含有する腹水がつく
られる。充分な量の抗体類が生産される時間が経過した
後に、公知の技術により抗体類を回収する。

たとえば、腹水を抜き取り、親和高純度化（ａｆｆｉｎ
ｉｔｙ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）によって、高純度
のモノクロナル抗体類を回収することができる。この方
法は、商業規模で使用するに充分な量のモノクロナル抗
体類の製造に特に適した方法である。

塩素化フェノール類と反応するモノクロナル抗体類の製
造に利用できるシステム及び方法も多種多様であるから
、後述の実施例に示したものとは異なる多種多様なモノ
クロナル抗体類が得られる。しかしながら、本明細書の
教示によって製造できる多種多様なモノクロナル抗体類
は本発明の技術的範囲に含まれるものであることは明ら
かである。本発明の目的に合致する上記のごとき抗体類
の顕著な特徴は、モノクロナリテイ（ｍｏｎｏｃｌｏｎ
ａｌｉｔｙ）を持つことに加えて、製造に用いられたハ
イブリドマの系統、複基準、分子特定性、親和性、製造
方法及び特定の型の如何にかかわらず、塩素化フェノー
ル類との反応性を持つことである。

本発明のモノクロナル抗体類及びポリクロナル抗体類は
、試料中に含有されている塩素化フェノール類、特にＰ
ＣＰの同定のために用いることができ、試料中の塩素化
フェノール類の濃度測定に用いることもできる。対象試
料物質としては、土壌、水、食品及び体液を挙げること
ができる。塩素化フェノールの存在又は濃度を測定する
ための種々の免疫分析法における試薬として使用した場
合、本発明の抗体類の使用により分析法は改善される。

検出は更に簡便になり、迅速且つ鋭敏になり、特定性が
高くなる。本発明の抗体類を使用する免疫分析法として
は、放射線免疫分析、競合免疫沈殿分析、酵素連鎖免疫
吸収分析及び免疫蛍光分析を挙げることができるが、こ
れらの免疫分析法のみに限定されるものではない。一般
的には、本発明のモノクロナル抗体類のほうが好ましい
抗体類ではあるが、成る種の応用例においてはポリクロ
ナル抗体類のほうが好ましい場合もある。

試料物質中の塩素化フェノールの存在又は濃度を検定な
いし測定する本発明による組成物は、化学物質の存在を
検定するために有効な濃度の抗体又は化学物質の量の定
量を行なうために有効な濃度の抗体を含有している。

ラテックス粒子又はプラスチック・マイクロタイター・
プレートのような適宜な担体と抗体とを混合してもよく
、抗体をこれらの担体に付着させておいてもよい、用い
る免疫学的手法に応じて、抗体に酵素もしくは色素を配
合することもでき、放射能標識を付すこともできる。従
って、塩素化フェノール類と反応するモノクロナル又は
ポリクロナル抗体類を用いる分析法は全て本発明の技術
的範囲に包含される。

本発明のモノクロナル又はポリクロナル抗体類は、選択
的免疫反応に基づいて複雑な混合物又は溶液から塩素化
フェノール類を単離、純化、中和及び／又は除去するた
めに使用できる。塩素化フェノールと反応する抗体類の
使用により、従来法は改善される。

ポリクロナル抗体類を使用した場合と比較すると、本発
明によるモノクロナル抗体類の使用により上記のごとき
応用において特に有用性が発揮される。このような有用
性の発揮は、顕著な特定性と、大規模な工業的ないし商
業的規模での使用を可能にする実際上量的に無制約に入
手できることによるものである。たとえば、ＰＣＰに対
するモノクロナル抗体類を用いて、その他の塩素化フェ
ノール類又は類似有機化合物類の混合物からｐｃｐを分
離し、純度を高めることができる。混合物を固定化され
たＰＣＰに対するモノクロナル抗体と接触させると、抗
体と結合したＰＣＰの固定複合体が形成されてＰＣＰが
混合物から分離される。混合物を除去した後、ＰＣＰを
抗体から分離し、公知の技術により高純度のＰＣＰを回
収する。

複雑な混合物から塩素化フェノールを純化ないし回収す
るために用いる本発明による組成物は、許容できる基質
上に固定するか或いは許容できる担体と混合させ、塩素
化フェノールとの反応及び結合が可能な状態に保った有
効量の本発明によるモノクロナル抗体を含有する。しか
しながら、混合物によっては、ポリクロナル抗体類のほ
うが好ましい場合もある。

本発明のモノクロナル抗体類は、塩素化フエノール類、
特にペンタクロロフェノールの構造及び作用機能に関連
する研究のための有用な試薬でもある。本発明の抗体類
の持つ鋭敏な特定性のために、上記の化学物質（塩素化
フェノール類、特にＰＣＰ）の免疫化学的分析及び構造
活性分析に使用することが可能になり、特定性に乏しい
ポリクロナル抗体類と比較して、上記の如き応用により
通したものとなる。

研究試薬として使用する本発明による組成物は、塩素化
フェノールとの混合及びそれに続く分析によって情報を
提供する効果を発揮する量のモノクロナル抗体を含有す
る。特定の研究目的の達成に必要な抗体量は、特定の研
究の型式によって定まり、これは研究を行なう研究者の
技術的常識の範囲内で容易に決定できることである。

次に、実鹿例を挙げて、本発明を説明 する。

衷−Ｕ−１ ＰＣＰに対する免疫反応の発現に この工程では、先ず最初に、蛋白質を無水琥珀酸で処理
し、テトラクロロハイドロキノンの水酸基の１つでエス
テル化することができる未結合のカルボン酸基を導入し
た。この工程により、ラットの免疫システムに対してＰ
ＣＰと類似する構造を持つ付加物が生成する。

白　へのこはく酸イ・加 テトラクロロハイドロキノンはオルト位置及びバラ位置
のどちらにも反応するから、テトラクロロハイドロキノ
ンにこはく酸を付加し、次いで蛋白質と複合させると、
出発原料物質の重合と沈殿が起こる。この問題を回避す
るために、蛋白質に琥珀酸を付加しておけば、テトラク
ロロハイドロキノンとの反応により、出発原料物質の沈
殿量を少なくして、充分な量のテトラクロロハイドロキ
ノン・蛋白質複合体が生成される。手順は以下の通りで
ある。

４５．２　ｍｇ（０，００１ミリモル）の牛血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）を３ｍｌの脱イオン水に溶解した。室温
で絶えず攪拌しながら、４２０　ｍｇ（４，２ミリモル
）の無水琥珀酸を少しずつ添加した。ＰＨを監視し、０
．ＩＮの水酸化ナトリウム液を添加してＰＨを７〜８の
間に保った。

最後の無水琥珀酸を添加しＰＨが安定した後、３０分間
反応を継続させた。この時点で、１．ＯＮ塩酸を用いて
ＰＨを２．５に調整し、１晩蛋白質溶液を蒸溜水で透析
した。透析した蛋白質は親液性化（ｌｙｏｐｈｉ　ｌ　
１ｚｅｄ）されていた。この方法で豚の甲状腺グロブリ
ン及び山羊の免疫グロブリンもうまく処理できた。

４０ｍｇの琥珀酸付加牛血清アルブミン（約、２　ｘ　
１０−’モル）を１５ｍ１の乾燥ＤＭＳＯに溶解した。

室温で攪拌しながら、１２．４ｍｇ（５，Ｏｘ　１０″
′Ｓモル）のテトラクロロハイドロキノンと、１５０　
ｍｇ（７，８ｘ　１０−’モル）の３−メチル−アミノ
プロピルカルボジイミドと、１ｍｇのジメチルアミノピ
リジンとを蛋白′Ｊｉｔ溶液に添加した。４時間反応さ
せた後、混合物を２ｘ４リツトルの蒸溜水で４℃で１８
時間透析した。透析した蛋白′Ｘ溶液は親液性化されて
いた。収率は、ＢＳＡ複合体として３８ｍｇであった。

この方法により、豚甲状腺グロブリンもうまく処理でき
た。

エピトープ濃　（ｅ　１ｔｏｐｅ　ｄｅｎｓｉｔｙ）測
０、ｒＮ　ＮａＯＨ中２７０．４　ｎｍにおける同一濃
度の誘導体化（ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ）蛋白質及び非
誂導体化（ｕｎｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ）蛋白質の光学
濃度の相違を利用して、エピトープ濃度を分光光度法に
よって測定した。上記の波長におけるテトラクロロハイ
ドロキノンの吸光係数を利用して、蛋白質対ハイドロキ
ノン残留物のモル比を算定したところ、豚甲状腺グロブ
リンの場合は１２３、牛血清グロブリンの場合は５５で
あった。

ＰＣＰの免疫分析の感度を向上させるために、ＰＣＰに
対する架橋反応協同作用物としては弱い作用を示す複合
体を調製した。複合体・抗ｐｃｐ相互作用の親和性（結
合力）を低下させることにより、低濃度の遊ＭＰＣＰの
競合効果を高めることができた。従って、この方法によ
り、ＰＣＰに対する競合阻害酵素免疫分析の感度が高く
なった。

Ｍａｒｔｉｎ、　Ｊ、　Ａ＋ｎ、　（：ｈｅｍ、　Ｓａ
ｃ、、　３８　、１４３８　（１９３６年）の方法によ
り、４−（４−ヒドロキシ−３，５−ジクしロフェニル
）ブチル酸を調製した。１８０　ｍｇ（１ミリモル）の
４−（４−ヒドロキシフェニル）ブチル酸を１．５　ｍ
ｌの塩化スルフリルに入れて室温で１時間攪拌した。生
成した沈殿を濾渦して３５ｍｇの４−（４−ヒドロキシ
−３，５−ジクロロフェニル）ブチル酸を得た。この物
質のＮＨＲ分析結果は以下の通りであった。

ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄｏ　） φ１．７３（２ｔ（、ｂｒｏａｄ　ｑｕｉｎｔｅｔ、Ｊ
・７１（ｚ、　−ＣＨ２−）２．１７（２Ｈ，ｔｒｉｐ
ｌｅｔ、　ＪＪ）ｌｚ、　：”Ｃ−（：Ｈ２−）２．５
０（２）１．−Ｃ）１２−Ｃｏ）５．８０（ＩＨ，ｂｒ
ｏａｄ、　Ｄ、Ｏで交換、−ＣＯ２１１）７．１０（２
Ｈ，５ｉＢｌｅｔ、芳香環のＨ）２ｍｌのジオキサンに
７　ｍｇ（０，０２８ミリモル）の４−（４−ヒドロキ
シ−３，５−ジクロロフェニル）ブチル酸を溶解した溶
液に、２４マイクロリツトル（０，１ミリモル）のトリ
ーｎ−ブチルアミンと１３マイクロリツトル（０゜１ミ
リモル）のイソブチルクロロホルメートとを加えた。室
温で０．５時間攪拌した後、上記の溶液１　　ｍｌを、
１００　ｒｎｇのＢＳＡを０．１　ｍｌのＩＮ水酸化ナ
トリウムと２　　ｍｌの水と２ｍｌのジオキサンとから
成る混合溶媒に溶解し、攪拌しながら氷冷している溶液
に滴下した。得られた混合物を水浴中で１時間攪拌し、
更に室温で１時間攪拌した。得られた琥珀酸４−ヒドロ
キシ−２，３，５，６−チトラクロロフエノール／ＢＳ
Ａを１晩脱イオン水で透析した後、凍結乾燥した。

完全フロイント補薬（ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｆｒｅｕｎｄ
’５ａｄｊｕｖａｎｔ）に乳濁させた５００マイクログ
ラムの琥珀酸４−ヒドロキシ−２，３，５，６−チトラ
クロロフエノル／ＢＳＡを６週齢の雌性スブラーグ・ド
ーレイ（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットに筋肉
注射した。３週間後に、５０マイクログラムの上記と同
一の複合体を０．１５　Ｍ　Ｎａｃｌに乳濁させた液を
追加投与した。最後の免疫接種の３日後に、頚部脱臼に
よりドナー・ラットを殺し、牌臓を無菌除去して、５ｍ
ｌの冷却したダルベツコの最低必須培地（Ｄｕｌｂｅｃ
ｃｏ’ｓ旧ｎｉｍａｌ　Ｅｓ５ｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉ
ｕｍ；以下ＤＭＥＭと略記する）を入れた３５ｍプラス
チック製ベトリ皿に入れた。牌臓を分離して単一細胞懸
濁液にし、冷却したＤＭＥＭで２度洗浄し、同じ培地に
再び懸濁させた。融合の相手として、ミルスタイン（Ｍ
ｉｌｓｔｅｔｎ）によってＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｅ
１ｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　９３：５７８〜５８２　　（
１９８２年）に開示されている酵素ハイポキサンチン・
グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（ＨＧ
ＰＲＴ−、ＥＣ２，４，２，８）の欠如した免疫グロブ
リン非分泌ラットの骨髄腫細胞ライン（ＹＢ２１０）を
用いた。この細胞ラインは、メリーランド州、ロックビ
ルのアメリカン・タイプ・カルチュア・コレクションか
ら入手でき、ＡＴＣＣＣＲＬ　　１６６２の分類番号が
付されている。１０％の牛胎児血清を含有し、２　ｍＭ
のし一グルタミンと、１％のピルビン酸ナトリウムと、
１％の非必須アミノ酸類と、１００　　ＩＩＪ／ｍｌの
ペニシリンと、１００マイクログラム／ｍｌのストレプ
トマイシンとを添加したＤＭＥＭ中に上記の骨髄腫細胞
ラインを保存した。ＨＧＰＲＴ＋リバータント（ｒｅｖ
ｅｒｔａｎｔ）を殺すために、融合前の３日間、０．１
　ｍＭの８−アザグアニンを骨髄腫細胞に添加した。融
合日に７５ｃｍ”の培養フラスコから骨髄腫細胞を採取
し、−回洗浄し、血清を含有しないＤＭＥＭ中に再懸濁
させた。骨髄腫と予め採取しておいた牌臓細胞とを数え
て、トリパン・ブルー染料空室法（Ｔｒｙｐａｎ　ｂｌ
ｕｅ　ｄｙｅ　ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）によって、これら
の細胞の生存能力を評価した。

用いた融合法は、ゲルター等（Ｇｅｆｔｅｒ　ｅｔａｌ
、）によりＳｏｍａｔｉｃ　Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ、　３：２３１　（１９７７年）に記載された方法の
修正法である。以下に記載するのは、ＡＴＣＣＨＢ９１
９８を製造した融合実験であり、同様の方法に従って行
なった他の幾つかの融合実験により、他の幾つかのハイ
ブリドマ・クーロン類を製造した。

融合の相手として、ケルニー（にｅａｒｎｅｙ）によっ
てＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　Ｈ
３：１５４８　　（１９７９年）に開示された）ＩＧＰ
ＲＴの欠如した免疫グロブリン非分泌マウス形質細胞腫
細胞ライ’、ｉ　（Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．Ｇ５３）　
ヲ用イテ、同様の方法でＡＴＣＣＨＢ　　９１９７等の
マウス・ハイブリドマ・クーロン類を製造した。上記の
細胞ラインは、メリーランド州、ロックビルのアメリカ
ン・タイプ・カルチュア・コレクションから入手でき、
ＡＴＣＣＣＲＬ１５８０の分類番号が付されている。

殺菌した５０ｍ１入りの円錐形プラスチック製試験管ニ
、１．Ｏｘ　１０’個のｍｙａ細胞と、１．０×１０７
個の骨髄腫細胞とを入れた。骨髄腫−牌臓細胞懸濁液を
室温で１０分間２５０　ｇ　（重力の２５０倍）で遠心
分離し、培地を傾斜除去により、はぼ乾燥状態にした。

指先で打って（ｆｌｉｃｋｉｎｇ）、細胞ベレットを穏
やかに緩め、血清を含有しない５０％ポリエチレングリ
コール（分子量：　１４００）のＤＭＥＭ溶液１　　ｍ
ｌを加えた。この工程中、試験管を穏やかに攪拌した。

１分後に、更に２　ｍｌのＤＭＥＭを２分間かけて添加
した。次の２分間の間に、更に２０ｍ１のＤＭＥＭを追
加し、室温で１０分間２５０　ｇで遠心分離して、細胞
をベレットにした。

流体を傾斜除去し、４０　ｍｌの富化選択培地（ｅｎｒ
ｉｃｈｅｄ　５ｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｍｅｄｉｕｍ）を添
加した。添加した培地は、１０％の牛胎児血清を含有す
るＤＭＥＭであり、２　ｍＭのし一グルタミンと、１％
のピルビン酸ナトリウムと、１％の非必須アミノ酸類と
、１００　　Ｈｌ／ｍｌのペニシリンと、１００マイク
ログラム／ｍｌのストレプトマイシンと、１　　ｍＭの
オキサル酢酸と、１０％のＮＣＴＣ１０９と、０．２マ
イクログラム／ｍｌの牛バンクレアチン・インシュリン
（ｂｏｖｉｎｅ　ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　１ｎｓｕｌｆ
ｎ）　　とを補充したものである。この培地は、更に１
．ＯＸ　１０−’　Ｍのハイポキサンチンと、４．Ｏｘ
　１０−’　Ｍのアミノプテリンと、１．６　ｘ　１０
−’　Ｍのチミジン（ＨＡＴ）とを含有するものであっ
た。アミンプテリンは酵素ＨＧＰＲＴの欠如した細胞に
対する毒性を示し、従って融合しなかった骨髄腫細胞全
部を殺す。融合した細胞（即ち、ハイブリドマ）は、融
合相手であるＢリンパ球（牌臓細胞）から）ＩＧＰＲＴ
を取得しているから、ＨＡＴ中でも行きのびる。

火−ｉＪ粗−１ ＰＣＰに対するモノクロナル抗体類を 生産するハイブリドマの′　尺 ５゜Ｏｘ　１０’個の細胞を含有する０、２　ｍｌずつ
の容積を実施例３で製造した混合物から数枚の殺菌した
平底マイクロタイター・プレートの多孔に移した。ＣＯ
２６％、空気９４％から成る湿った雰囲気中で、３７℃
で各プレートに接種した。これに続く１４日間の間、１
日おきに、新しい選択培地を添加した。

１４日目に、以下に記載する酵素免疫分析法（ＥＩＡ）
により、微小培養上澄み液についてＰＣＰと反応する抗
体類の試験を行なった。純度を高めた琥珀酸４−ヒドロ
キシ−２゜３．５．６−チトラクロロフエニル／Ｔｈｙ
複合体を塗布緩衝液（燐酸塩緩衝剤を含有する塩液（Ｐ
ＢＳ）、ＰＨ７，４）中に１　　ｍｌ当たり１０マイク
ログラムの濃度になるように溶解し、９６大のポリ塩化
ビニル製マイクロタイター・プレート［バージニア州、
チャンティリーのダイナチク・ラボラトリ−社（Ｄｙｎ
ａｔｅｃｈ　Ｌａｂ。

ｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ
、　ＶＡ）］に５０マイクロリットルずつ分注した。４
℃で１晩培養した後、複合体溶液を取り出し、８孔をＰ
ＢＳ−Ｔｗｅｅｎ　（０，５ｍｌ／１のＴｗｅｅｎ−２
０を含有）で５回洗浄した。５０マイクロリツトルの試
験試料を各穴に添加し、プレートを４℃で３０分間培養
し、次いでＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで５回洗浄した。ＰＢＳ
−Ｔｗｅｅｎ洗浄によって分割される最後の２工程は次
のようにして行なった。酵素アルカリ・ホスホラーゼ［
モンタナ州、セントルイスのジグＶ−ケミカル社（Ｓｉ
ｇｍａ　ＣｈｅｍｉｃａｌＧｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｔ
ｓ、　ＭＯ）］と複合させた山羊抗ラットＩｇＧ／Ｉｇ
Ｍのｌ：５００稀釈物５０マイクロリツトルを加えて４
℃で３０分間培養し；１０％ジェタノールアミン中に１
　　ｍｇ／ｍｌの濃度に溶解したＰ　Ｈ９，８のＰ−ニ
トロフェニル・ホスフｚ−ト（Ｓｉｇｍａ−１０４）を
５０ｍ１添加し、２５℃で３０分間培養した。バイオ・
チクのマイクロＥ　Ｉ　Ａ　（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ　ｍ１ｃ
ｒｏ−ＥＩＡ）分光光度形［バーモント州、ウイノスキ
ーのバイオ・チク・インスツルメント社（Ｂｉｏ−Ｔｅ
ｋＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｉｎｃ、、　Ｗｉｎｏｏｓ
ｋｉ、　ＶＴ）］を用い、４０５ｎｍでの吸収を読み取
った。

更に、抗体類が、琥珀酸４−ヒドロキシ−２，３，５，
６−チトラクロロフエニル／Ｔｈｙ複合体とばかりでな
く、ＰＣＰとも反応するものであることを確認するため
に、培養上澄み液を１、Ｏｘ　１０”’　ＭのＰＣＰと
予備培養した。この競合阻害酵素免疫分析（ＣＩＥＩＡ
）と呼ばれている分析の結果、流体相のＰＣＰにより抗
体の固相結合複合体への結合が阻害された。１９２の培
養個所のうち１６個所がＥＩＡに陽性（ｐｏｓｉｔｉｖ
ｅ）−であった（８％）のに対し、ＣＩＥＩＡに陽性な
のは、僅かに５個所（２，１）だけであった（即ち、１
．Ｏｘ　１０−３ＭのＰＣＰにより、少なくとも５０％
の阻害が認められた）。陽性培養物を展開して数量を増
大させ、３５ｃｍ”容のフラスコに移した。

これらの培養物から得た培地を再試験し、抗体分泌性を
維持しているものを冷凍保存し、液体窒素蒸気相中で一
１７９℃で貯蔵した。

え−五−里−１ ＰＣＰに対するモノクロナル抗体類を 生産するハイブリドマ培養物の 単性生殖（ｃｌｏｎｉｎ） 実施例４に記載の陽性ハイブリドマ培養物の１つを選択
して、制限稀釈（ｌｉｍｉｔｉｎｇ　ｄｆｌｕｔｉｏｎ
）により単性生殖（ｃｌｏｎｉｎｇ）させた。０〜１個
の細胞を含む１００マイクロリツトルずつの部分標本を
、ハイブリドマの「フィーダＪ　（ｆｅｅｄｅｒ）細胞
として働く殺菌平底マイクロタイター・プレートの数百
の８孔に移した。２１日後に、ＥＩＡ及びＣＩＥＩＡを
用いて単性生殖させた培養物のＰＣＰに対する抗体反応
性を再試験し、更に研究を進めるために、陽性クーロン
の１つを選択した。アメリカン・タイプ・カルチュア・
コレクションに受付番号ＡＴＣＣＨＢ　　９１９８で寄
託されている単性生殖又は単性培養ハイブリドマを展開
し、数量を増やして冷凍保存し、得られたハイブリドマ
を誘導したもとの親細胞ラインと同様にして貯蔵した。

え−五−１−１ ＰＣＰに対するモノクロナル抗体類の 試　　　　　°゛ 実施例３に記載の補充物を加えたＤＭＥＭを入れた７５
ｃｍ２容の培養フラスコ中でＡＴＣＣＨＢ　　９１９８
を静置培養した。６％ＣＯ２の存在下、３７℃で、５〜
７日間培養した後、１　　ｍｌ当たり約１０マイクログ
ラムの抗ｐｃｐ抗体を含有する培養流体１〜２リツトル
を取得した。

医−ｍ　　（Ｗｌｌ−ヱ ＰＣＰに対するモノクロナル抗体類の 生体　製゛告 多量のモノクロナル抗体類を取得するための生体内製造
法は、ＡＴＣＣＨＢ　　９１９８を腹水腫として成長な
いし、繁殖させる適応化（ａｄａｐｔａｔｉｏｎ）を含
む方法である。０．５　ｍｌのブリスタン（２，６，Ｉ
Ｏ，１４−テトラメチルペンタデカン）を腹腔内に注入
することにより、雌性スブラーグ・ドーリイ・ラッ）・
をプライム化（Ｐｒｉｍｅｄ）　Ｌ／た。ブリスタンは
、ラットの腹腔内で成長培地として作用する漿水の分泌
（腹水腫）を誘起する殺菌刺激剤である。ブリスタン注
入後、約７〜１０日後に、実施例６で記載した試験管内
培養物から取得した５、Ｏｘ　１０’個の成長活性を持
つハイブリドマ・クーロンを含有する部分標本をプライ
ム化されたラットの腹腔に接種した。腹水腫が形成され
、形成された腹水腫はラットの腹腔の流体マイクロ雰囲
気（ｆｌｕｉｄ　ｍ１ｃｒｏ　ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ
）中で速やかに成長し、多量の（たとえば、２〜１０　
　ｍｇ／ｍｌ）のｐｃｐと反応するモノクロナル抗体類
を分泌した。吸引により、各ラットから１５〜２０ｍ１
の腹水を毎日採取した。遠心分離により、抗体含有流体
相から抗体分泌腫瘍細胞を分離した。

及−五一里−１ ＰＣＰに対するモノクロナル抗体類の 聚和化 親和純化（ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏ
ｎ）の目的は、ＰＣＰに対するモノクロナル抗体類を含
有する流体から異質蛋白質類を除去し、高純度の抗ＰＣ
Ｐ抗体類を得ることである。

本実施例においては、下記の化学薬品類を使用した。塩
化ナトリウム、エタノールアミン塩酸、プロピオン酸、
グリシン塩酸、琥珀酸４−ヒドロキシ−２，３，５，６
−チトラクロロフエニル／Ｔｈｙ複合体を０．９％Ｎａ
Ｃ１溶液中に５．０〜７．５　ｍｇ／ｍｌの濃度に乳濁
させた液、グルタルジアルデヒドで活性化したシリカか
ら成る親和吸着剤（ａｆｆｉｎｉｔｙ　ａｄｓｏｒｂｅ
ｎｔ）。

又、本実施例においては、下記の装置を使用した。ブフ
ナー泪斗、回転機、アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）濃縮機（
超遠心分離攪拌セル）、上記の装置で用いるＹＭ５０及
びＹＭ３００フイルタ（５０ｋＤ及び３００ｋＤカツト
オフ・フィルタ、窒素）。

親和純化又は親和高純度化のために用いる抗体をＡＴＣ
ＣＨＢ　　９１９８から調製するために、ＰＣＰに対す
るモノクロナル抗体類を分泌している細胞から約６００
ｍ１の上澄み液を取り、これを窒素圧力を印加して３０
０ｋＤカツトオフ・フィルタを通して約３００　　ｍｌ
に濃縮した。濾拝液及び濃縮された上澄み液の両方につ
いて、ＣＩＥＩＡ法における抗体活性を試験した。次に
、窒素圧力を印加して５０ｋＤフイルタを通過させる濾
過を行なって、抗体含有部分を１０倍〜２０倍に？Ｉ４
縮した。次に、濃縮物をＣＩＥＩＡで試験して抗体活性
を確認し、抗体含有部分を４℃で１晩ＰＢＳで透析した
。

親和吸着剤を調製するために、９〜１０ｍ１の複合体溶
液をグルタルジアルデヒドで活性化したシリカから成る
親和吸着剤３ｇと混合し、４℃で１晩回転機上で回転処
理した。

＃１濾紙を入れたブフナー漏斗上のカラムにつめて、溶
出液が蛋白質を含まなくなるまで（０，Ｄ、　２８０．
０．００５未満）　！、５９６ＮａＣＬで洗滌した。０
．３Ｍのエタノールアミン塩酸（ｐＨ７，５）　と混合
し、回転機上で室温で１時間回転させてカラム充填物を
充填した。次に、ブフナー漏斗上で０．９！ｌ；　Ｎａ
Ｃ１溶液、０．５Ｍプロピオン酸溶液、更に０．鯖Ｎａ
Ｃ１溶液を記載の順に使用してカラム充填物を洗滌した
。

５０ｍ１容の試験管中でカラム充填物に３０　　ｍｌの
抗体溶液を添加して、カラム充填物に抗体を結合させた
。試験管を４℃で１晩回転させた。次に、底部にガラス
・ウールを詰めた２０ＣＣ容の注射器に結合基質を注ぎ
込んだ。溶出流が蛋白質を含有しなくなるまで、カラム
を３％・ＮａＣ１溶液で洗滌した。

ｐＨ２，０の０．２Ｍグリシン塩酸で抗体を溶出し、３
〜４　　ｍｌの分別試料を採取し、各分別試料のＯ，Ｄ
、２８０を測定した。Ｏ，Ｄ、（光学濃度）が０．２よ
り大きな分別試料をプールしておいた。ｌＮＮａ０）１
を用いてｐＨを７．０に上げた後、４℃で１晩溶液なＰ
ＢＳで透析した。

夾−ＪＬ」粗一旦 ＰＣＰに対するモノクロナル抗体類を 分析に用いた土台の有　性を示す　ｇＩＡＴＣＣＨＢ　
　９１９８から得られる抗体類が遊離のＰＣＰと反応す
ることを確認し、ｐｃｐの水準（濃度又は含有量）の定
量に上記抗体類を使用できることを実例で示すために、
ＣＩＥＩＡを行なった。この分析は、種々の濃度のＰＣ
Ｐとともに抗体を予備培養したこと以外は、実施例４で
記載した直接ＥＩＡと同様にして実施した。抗体が溶液
中のＰＣＰと反応するために、固体相上の複合体と抗体
との結合が阻害され、その結果、最終段階の発色反応が
少なくなった。濃度を変化させたＰＣＰを２５％メタノ
ールを用い、ＰＢＳ−Ｔ中で親和純化した抗ｐｃｐ抗体
（実施例８に記載の方法で調製したもの）０．９マイク
ログラム／ｍｌとともに予備培養した後、４マイクログ
ラム／ｍｌの琥珀酸４−ヒドロキシー３．５−ジクロロ
フェニル／ＢＳＡを塗布しておいたＰｖＣプレートに予
備培養混合物を分注した。３０分間培養した後、プレー
トを洗滌し、ＥＩＡの場合について実施例４で記載した
と同様の処理を加えた。

−以　　下　　余　　白　　− 第１図に示す本実施例の結果は競合阻害酵素免疫分析（
ＣＩ　Ｅ　Ｉ　Ａ）が行なわれることを示しており、本
発明のモノクロナル抗体と遊離のペンタクロロフェノル
（ｐｃｐ）との結合が行なわれることを示し、本発明の
抗体類をペンタクロロフェノールの定量分析に使用でき
ることを示している。発色反応（４０５ｎｍにおけるＯ
、Ｄ、）は、ＰＣＰ濃度と逆比例の関係にある。又、図
に示された曲線の直線部分は、ｐｃｐ濃度が約１０００
　ｐｐｂから約２０ｐｐｂにわたっている。上記の曲線
を４パラメータ・ログ・ロレット法（４−ｐａｒａｍｅ
ｔｅｒ　ｌｏｇ−１ｏｇｉｔ　ｍｅｔｈｏｄ）で分析す
ると、使用できるＯ、Ｄ、範囲の９０％で算出した濃度
は１３ｐｐｂが最低検出可能水準になる。未知濃度の試
料について同様の処理を行なって、得られるＯ、Ｄ、の
値を既知の標準曲線と比較した。このようにして、モノ
クロナル抗ＰＣＰ抗体類を使用してＰＣＰの水準（濃度
又は含有量）を定量することができる。得られた結果を
ＰＣＰ分析に用いられている標準ガスクロマトグラフ法
の感度と比較しても、良好な感度と言える。尚、この点
に関して、必要ならば１９８４年１０月２６日付のフェ
デラル・レジスター（Ｆｅｄｅｒａｌ　Ｒｅｇｉｓ−ｔ
ｅｒ）、第４９巻、第２０９号を参照されたい。

ＡＴＣＣＨＢ　　９１９８から得られた抗体の特定性を
知るために行なフた試験の結果を表１に示す。ここで、
特定性とは、抗ＰＣＰ抗体と極めて近縁関係にある化学
化合物類との交叉反応性（ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖ
ｉｔｙ）を意味する。表１に示す結果はＩＣ，。モル濃
度（Ｍｏ１．ａｒＩＣｓｏ）で示しであるが、ＩＣ３゜
モル濃度とは抗ＰＣＰと塗布プレートとの結合を５０％
阻害するモル濃度を各化学物質について測定した結果を
示す指数である。ＰＣＰのＩＣ５ｏモル濃度を１００％
にしたときの各化合物の交叉反応性百分率 を比較値として示しである。表かられかるように、２．
３，５．６−チトラクロロフエノールはＡＴＣＣ３ＨＢ
　　９１９８から得られた抗体の４２％の交叉反応性を
示し、２，４．６−　トリクロロフェノールは１２％、
２，３．６−トリクロロフェノールは８％の交叉反応性
を示している。これらのデータからの明らかなように、
抗ＰＣＰ抗体と相当程度の交叉反応性を持つためには、
化合物は２位又は６位に塩素を持つフェノールでなけれ
ばならない。ペンタクロロフェノールとは原子１つだけ
しか相違しないペンタクロロベンゼンは、抗ペンタクロ
ロフェノール抗体（抗ＰＣＰ抗体）とは反応しないこと
に注意されたい。

表１：ＰＣＰモノクロナル抗体の特　性ペンタクロロフ
ェノール　　　　　　２．２　（±０．３）ｘｌＯ−’
　　　　−２，３，５，６−テトラクロロ　　　５．３
　（±０．６）ｘＬＯ−’　　　４２．０フエノール テトラクＤｏハイドロキノン　　　　２．８　（±　０
．１）ＸＩＯ−’　　　　０．８２．４．６−）ジクロ
ロフェノール　１．８　（±　０．３）ｘｌＯ−’　　
　１２．０２．３．６−）ジクロロフェノール　２．５
　（±０．１）ｘｌＯ−’　　　　８．８２．６−ジク
ロロフェノール　　　　１．２　（±０．１）ｘｌＯ−
’　　　　１．２２．３．４−）ジクロロフェノール　
４，５　（±　０．３）ｘｌｏ″”　　　　０．５２．
３．５−）ジクロロフェノール　４．３　（±０．３）
ｘｌＱ−’　　　　０．５２．４−ジクロロフェノール
　　　　　　　　　　Ｎｌ　　　　　　　　　　　　０
２．５−ジクロロフェノール　　　　　　　　　　Ｎｌ
　　　　　　　　　　　　０３．５−ジクロロフェノー
ル　　　　　　　　　　ＮＩ　　　　　　　　　　　　
０３．４−ジクロロフェノール　　　　　　　　　　Ｎ
Ｉ　　　　　　　　　　　　０２．３−ジクロロフェノ
ール　　　　　　　　　　ＮＩ　　　　　　　　　　　
　０４−クロロフェノール　　　　　　　　　　　　　
ＮＩ　　　　　　　　　　　　Ｏフェノール　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　ＮＩ　　　　　　　　　
　　　　Ｏペンタクロロアニリン　　　　　　　　　　
　　　ＮＩ　　　　　　　　　　　　Ｏペンタクロロベ
ンぞン　　　　　　　　　　　　　ＮＩ　　　　　　　
　　　　　０２．３−ジニトロトルエン　　　　　　　
　　　　ＮＩ　　　　　　　　　　　　０２．４−ジニ
）Ｉｌｌ）ルエン　　　　　　　　　　　　ＮＩ　　　
　　　　　　　　　　０２．４．５−）ジクロロニトロ
ベンゼン　　　　　ＮＩ　　　　　　　　　　　　　Ｏ
（註）ＮＩ：阻害せず。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の抗体を用いてｐｃｐの濃度を測定し
た結果を示す標準検知曲線であり、横軸は試験試料中の
ＰＣＰ濃度（ｐｐｂ）を対数目盛で示し、縦軸にはＣＩ
ＥＩＡ　（競合阻害酵素免疫反応）を行なわせた後に発
色させた各試験試料の０．Ｄ、（光学濃度）をプロット
しである。 Ｆｉｇ、１

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、塩素化フェノールと反応するモノクロナル抗体類の
   製造方法であって、前記塩素化フェノールと巨大分子担
   体との免疫原複合体をつくり、動物を前記複合体に免疫
   にし、前記動物から抗体生産細胞を得、前記細胞と腫瘍
   細胞とを融合してハイブリドマ類を得、前記のハイブリ
   ドマ類から前記塩素化フェノールと反応する抗体類を生
   産する少なくとも１種のハイブリドマを選択し、選択さ
   れたハイブリドマから生産された抗体類を回収すること
   を特徴とする方法。 ２、塩素化フェノールがペンタクロロフェノールである
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３、免疫にする動物が齧歯類動物であることを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項又は第２項に記載の方法。 ４、腫瘍細胞がマウスの形質細胞腫又はラットの骨髄腫
   細胞であることを特徴とする特許請求の範囲第１項、第
   ２項又は第３項に記載の方法。 ５、ハイブリドマ類が、ＡＴＣＣ　ＨＢ　９１９７もし
   くはＡＴＣＣ　ＨＢ　９１９８又はこれらの突然変異種
   もしくは変種の特性を持つことを特徴とする特許請求の
   範囲第１項乃至第４項の何れかに記載の方法。 ６、ペンタクロロフェノールと反応するモノクロナル抗
   体類の製造方法であって、前記ペンタクロロフェノール
   と蛋白質との免疫原複合体をつくり、マウスを前記複合
   体に免疫にし、前記マウスの脾臓から抗体生産細胞を回
   収し、前記抗体生産細胞と酵素ハイポキサンチン−グア
   ニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼの欠如した
   マウスの形質細胞腫又はラットの骨髄腫細胞と融合させ
   てハイブリドマ類を形成させ、ハイポキサンチンとアミ
   ノブテリンとチミジンとから成る培地で培養することに
   より前記ハイブリドマ類から少なくとも１種のハイブリ
   ドマを選択し、前記ペンタクロロフェノールに対する抗
   体と生産する前記の少なくとも１種のハイブリドマを遊
   離の状態即ち、複合体を形成していない状態で同定し、
   前記の同定されたハイブリドマを培養して回収可能な量
   の前記抗体を製造し、培養した前記ハイブリドマによっ
   て生産された抗体を回収することを特徴とする方法。 ７、ＡＴＣＣ　ＨＢ　９１９７もしくはＡＴＣＣ　ＨＢ
   　９１９８又はこれらの突然変異種もしくは変種の特性
   を持つハイブリドマを培地中で培養し、前記培地から抗
   体を回収することを特徴とするペンタクロロフェノール
   に対するモノクロナル抗体の製造方法。 ８、塩素化フェノールと反応するモノクロナル抗体類の
   生体内製造方法であって、前記抗体類を製造するハイブ
   リドマを組織競合性ないし免疫抑制ホストの腹腔内に入
   れ、前記ホストの腹水から生産された抗体類を回収する
   ことを特徴とする方法。 ９、塩素化フェノールがペンタクロロフェノールである
   ことを特徴とする特許請求の範囲第８項に記載の方法。 １０、ホストが齧歯類動物であることを特徴とする特許
   請求の範囲第８項又は第９項に記載の方法。 １１、ハイブリドマがＡＴＣＣ　ＨＢ　９１９７もしく
   はＡＴＣＣ　ＨＢ　９１９８又はこれらの突然変異もし
   くは変種の特性を持つことを特徴とする特許請求の範囲
   第８項、第９項又は第１０項に記載の方法。 １２、塩素化フェノールに対するモノクロナル抗体類を
   生産する連続細胞ラインを製造する方法であって、前記
   塩素化フェノールと巨大分子担体との免疫原複合体をつ
   くり、動物を前記複合体に対して免疫にし、前記動物か
   ら抗体生産細胞を得、前記抗体生産細胞を腫瘍細胞と融
   合させてハイブリドマ類をつく り、前記ハイブリドマ類から前記の塩素化フェノールと
   反応する抗体を生産するハイブリドマを選択し、選択さ
   れた前記ハイブリドマを無性生殖的によりふやして細胞
   ラインにすることを特徴とする方法。 １３、塩素化フェノールがペンタクロロフェノールであ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１２項に記載の方
   法。 １４、抗体が塩素化フェノールと反応することを特徴と
   するモノクロナル抗体製造ハイブリドマ。 １５、塩素化フェノールがペンタクロロフェノールであ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１４項に記載のハ
   イブリドマ。 １６、前記ハイブリドマがＡＴＣＣ　ＨＢ ９１９７、ＡＴＣＣ　ＨＢ　９１９８又はこれらの突然
   変異種もしくは変種の特性を持つことを特徴とする特許
   請求の範囲第１４項又は第１５項に記載のハイブリドマ
   。 １７、抗体が塩素化フェノールと反応することを特徴と
   するモノクロナル又はポリクロナル抗体。 １８、塩素化フェノールがペンタクロロフェノールであ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１７項に記載の抗
   体。 １９、特許請求の範囲第１２項又は第１３項に記載の方
   法によって製造した細胞ラインから回収されたものであ
   ることを特徴とするモノクロナル抗体。 ２０、モノクロナル抗体がハイブリドマから回収される
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１７項又は第１８項
   に記載の抗体。 ２１、ハイブリドマがＡＴＣＣ　ＨＢ　９１９７もしく
   はＡＴＣＣ　ＨＢ　９１９８又はこれらの突然変異種も
   しくは変種の特性を持つことを特徴とする特許請求の範
   囲第２０項に記載の抗体。 ２２、免疫分析法により試料中の塩素化フェノールの存
   在又は濃度を測定する方法であって、前記免疫分析法に
   おける試薬として前記塩素化フェノールと反応するモノ
   クロナル抗体を使用することを特徴とする方法。 ２３、モノクロナル抗体がペンタクロロフェノールと反
   応する特徴とする特許請求の範囲第２２項に記載の方法
   。 ２４、試料中の塩素化フェノールの存在又は濃度を測定
   する方法であって、前記試料に前記塩素化フェノールと
   反応するモノクロナル抗体を添加し、モノクロナル抗体
   を試薬として用いる免疫分析によって塩素化フェノール
   の存在又は濃度を測定することを特徴とする方法。 ２５、モノクロナル抗体を使用することを特徴とする塩
   素化フェノールに対する特異抗体の選択的免疫反応に基
   づく混合物からの塩素化フェノールの単離又は除去を行
   なう免疫学的手法。 ２６、塩素化フェノールを含有する物質を塩素化フェノ
   ールと反応する固定モノクロナル抗体類と接触させるこ
   とにより、前記抗体と前記塩素化フェノールとの固定複
   合体を形成させて前記物質から固定モノクロナル抗体類
   を分離し、前記固定抗体類から前記塩素化フェノールを
   分離して高純度の塩素化フェノールを回収することを特
   徴とする塩素化フェノールの高純度化方法。 ２７、塩素化フェノールの生化学的、免疫学的、機能的
   又はその他の研究分析法であっ て、前記塩素化フェノールと反応するモノクロナル抗体
   を前記分析に有効な量を使用することを特徴とする方法
   。 ２８、試料中の塩素化フェノールの存在又は濃度を測定
   するための組成物であって、有効量の前記塩素化フェノ
   ールと反応するモノクロナル抗体が許容できる担体に担
   持された組成物から成ることを特徴とする組成物。 ２９、塩素化フェノールがペンタクロロフェノールであ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第２８項に記載の組
   成物。 ３０、塩素化フェノールを含有する混合物から前記塩素
   化フェノールを単離又は除去するための組成物であって
   、前記塩素化フェノールと反応するモノクロナル抗体の
   有効量を含有し、前記モノクロナル抗体が許容できる基
   質に固定されているか、あるいは許容できる担体と混合
   されていることを特徴とする組 成物。 ３１、塩素化フェノールの高純度化に用いる組成物であ
   って、前記塩素化フェノールと反応するモノクロナル抗
   体が許容できる支持体又は担体に固定されて成ることを
   特徴とする組成物。 ３２、塩素化フェノールの生化学的、免疫学的、機能的
   、又はその他の研究分析法で用いる組成物であって、前
   記塩素化フェノールの有効量が許容できる担体に担持さ
   れて成ることを特徴とする組成物。 ３３、塩素化フェノールと反応するポリクロナル抗体類
   の製造方法であって、前記塩素化フェノールを巨大分子
   担体との免疫原複合体をつくり、動物を前記複合体に免
   疫にし、前記動物から血を抜き取り、前記の血から血清
   を分離し、前記血清から抗体類を回収することを特徴と
   する方法。 ３４、塩素化フェノールがペンタクロロフェノールであ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第３３項に記載の方
   法。 ３５、免疫分析により試料中の塩素化フェノールの存在
   又は濃度を測定する方法であっ て、免疫分析において前記塩素化フェノールを試薬とし
   て使用することを特徴とする方 法。 ３６、塩素化フェノールと巨大分子担体 との免疫原複合体をつくる方法であって、前記巨大分子
   担体に化学的架橋剤を配位結合させ、反応基を有する前
   記塩素化フェノールの誘導体を前記の化学的架橋剤に配
   位結合させることにより免疫原複合体を形成させること
   を特徴とする方法。 ３７、塩素化フェノールがペンタクロロフェノールであ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第３６項に記載の方
   法。 ３８、巨大分子担体に配位結合した塩素化フェノールで
   あることを特徴とする合成抗原。