JPH0764880B2 - 合成ピレトロイドに対するモノクローナル抗体および合成ピレトロイドを検出する方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は一般的にはモノクローナル抗体に関し、より詳
しくは食物および周囲の環境のサンプル中に発見される
合成ピレトロイドに反応的であるモノクローナル抗体に
関する。

アメリカ合衆国政府は、カルフォルニア大学評議委員会
と合衆国エネルギー省との契約NO.W-7405-ENG-48に従っ
て本発明に権利を有する。

用語の確認 本明細書において使用される略語および定義は次の通り
である。

cELISA,競合エンザイム−リンクド イムノソルベント
アッセイ； BSA,ウシ血清アルブミン； KLH,キーホール リンペット ヘモシアニン； GE/EC,ガスクロマトグラフィ／電子捕獲； ハプテン，抗原決定基を担持する低分子，しかしより大
きなタンパク質担体と化学的に結合するまでは免疫原性
を有しない。ハプテン−担体複合体はその後免疫コンピ
テント細胞を刺激してハプテンおよび複合体に対する抗
体を形成する； HPLC,高圧液体クロマトグラフィ； ソックスレー抽出器，凝縮された溶媒蒸気がサンプルを
繰り返し通過して有機物質を抽出する溶媒抽出蒸留器； 合成ピレトロイド，広いグループの非天然に存在する化
合物，除虫菊、クリサンテン酸およびピレトリン酸のエ
ステルの混合物に関係する，これらは殺虫剤として使用
される。幅広く使用される化合物としてはパーメトリ
ン、シパーメトリンおよびデルタメトリンを含み、さほ
ど一般的には使用されない化合物としてはヘノトリン、
フェンプロパトリン、フルシトラネート、フェンバレレ
ートおよびテトラメトリン等を含む； シパーメトリン，アルファ−シアノ−３−フェノキシベ
ンジル シス，トランス−３−（2,2−ジクロロビニ
ル）−2,2−ジメチル−シクロプロパンカルボキシレー
ト； フェンプロパトリン，アルファ−シアノ−３−フェノキ
シベンジル−2,2,3,3−テトラメチルシクロプロパンカ
ルボキシレート； デルタメトリン，−／＋アルファ−シアノ−３−フェノ
キシベンジル−（＋／−）−シス，トランス−３−（2,
2−ジブロモビニル）−2,2−ジメチル−シクロプロパン
カルボキシレート； フェンバレレート，シアノ（３−フェノキシフェニル）
メチル−４−クロロ−アルファ−（１−メチルエチル）
ベンゼンアセテート； フルシトラネート，シアノ（３−フェノキシフェニル）
メチル（Ｓ）−４−ジフルオロメトキシ）−アルファ−
（１−メチルエチル）ベンゼンアセテート； パーメトリン,3−フェノキシベンジル（1RS），シス，
トランス−３（2,2−ジクロロビニル）−2,2−ジメチル
シクロプロパンカルボキシレート； フェノトリン，フェノキシベンジル（1RS），シス，ト
ランス−クリサンテメート； テトラメトリン,N−（3,4,5,6−テトラハイドロフタル
イミノ）メチル（dl）−シス，トランス−クリサンテメ
ート； 発明の背景 モノクローナル抗体は臨床的、商業的および研究的応用
における診断および治療剤として相当な有用性を持って
いる。1975年にコーラおよびミルスティン（Kohler and
Milstein）により開発されたハイブリドーマ生成のた
めの一般的技術の改良（Nature 256:495-497）は、特異
的抗原決定基を認識することができる大量のモノクロー
ナル抗体を生成することを可能とする。

タンパク質抗原部位に反応的な抗体の開発は知られてお
りかつ反復性があるが、発癌物質、殺虫剤、有毒化学薬
品およびDNA付加物等、低分子有機化学薬品に反応的な
モノクローナル抗体の生成は簡単ではない。低分子の有
機分子に対する抗体の生成はときには、第一にハプテン
と呼ばれる低分子を担体タンパク質に結合することによ
り達成され、且つ免疫反応細胞はこの複合体の抗原決定
基に感応する。低分子ハプテンの最初の化学的処理は、
免疫反応担体タンパク質に結合されることのために要求
される。免疫反応細胞は、（１）ハプテン分子、（２）
担体タンパク質、（３）ハプテン担体複合体、（４）ハ
プテン、連鎖化学的構造（linkage chemistry）および
担体タンパク質のいずれかの組合せ上に位置する種々の
反応部位に対する認識部位を有する抗体を形成するため
に誘発される。特異的反応部位は知られてはおらず、か
つ予想できない。担体タンパク質に対するハプテン結合
の部位および化学的性質は生成された抗体の特異性に影
響を及ぼす。

低分子の有機分子上の反応部位に特異的に結合する抗体
は敏感な指示薬であり、それは化学的異性体を識別する
ために使用される（Stanker et al,Toxicology45:229−
1987）。低分子ハプテンでは、反応基に対する最大の抗
体特異性は、反応基が担体タンパク質に結合する連鎖の
部位から最も遠くにあるときに生じる。合成ピレトロイ
ドを伴うこの研究は、３−フェノキシベンジル基から可
能なかぎり遠いハプテン抗原部位の結合がフェノキシベ
ンジル基を優先的に認識する抗体の生成に都合がよいこ
とを証明する。フェノキシベンジル基は多くの合成ピレ
トロイドにより共有され、かくして合成ピレトロイドの
反応基の一に対して誘発された抗体は、その反応基を担
持する合成ピレトロイドの幾多の部類を認識する。

合成ピレトロイドはアメリカ合衆国および他の国で幅広
く使用される大きなグループの殺虫剤である。アメリカ
合衆国で最も一般に使用される合成ピレトロイドはパー
メトリン、シパーメトリンおよびデルタメトリンであ
り、他の合成ピレトロイドは他の化合物の中にフェノト
リン、フェンプロパトリン、フルシトラネート、フェン
バレレート、およびテトラメトリンを含む。３つの最も
一般に使用される化合物はフェノキシベンジルおよびシ
クロプロパン基の両者を含む。他のわずかに使用される
合成ピレトロイドはこれらの基の少なくとも一つ、また
はフェノキシベンジル基の代わりにフェノキシフェニル
基を含む。1982年において、合成ピレトロイドは世界の
殺虫剤マーケットの30％程に相当した。

合成ピレトロイドは使用状態において、化学構造、毒性
および光安定性に大きな差異がある。歴史的には、アレ
トリンおよびバイオアレトリンのごとき合成ピレトロイ
ドの農業での使用は、これらの化合物が空気および水に
不安定な特性のために限界があった。しかしながら、パ
ーメトリン、シパーメトリンおよびデルタメトリンのご
とき最近開発された合成ピレトロイドはより安定であ
り、大きな農業有用性を有する。これらの化合物は哺乳
動物に対して低い毒性を示す故に、食物を生産する植物
における虫のコントロールのために広く使用されてい
る。これらのより安定な化合物の使用の普及は、殺虫剤
の残留物が食料品および周囲の環境に残るにちがいない
という可能性について懸念することを導いた。シパーメ
トリンおよびパーメトリンの両者はアメリカ環境保護局
により潜在的に発癌性殺虫剤として記録されている（参
照:Regulating Pesticides in Food:The Delaney Parad
ox,National Reserch Council Board on Agriculture,N
ational Academy Press,Washington,D.C.,1987）。

パーメトリン、シパーメトリンおよびデルタメトリンの
ための食肉および脂肪中の残留物の限界はアメリカにお
いて確立されている。多くのピレトロイドのための残留
物の限界は食料・農業機関および世界保険機関により整
えられている。しかしながら、便利で迅速な検出システ
ムの欠如はピレトロイドの環境的同定および定量を妨げ
ている。慣用的な分析は多行程のサンプルの浄化の手順
と、それに続くガスクロマトグラフィを含み、熱に不安
定であるがために検出は電子捕獲（GE/EC）に限界があ
る。高圧液体クロマトグラフィ（HPLC）による分析もま
た記述されているが、この分離技術は種々の合成ピレト
ロイドを十分に溶解できない。検出もまたHPLC分析に伴
う問題である。このような低い範囲の化合物の標準的な
化学的抽出および精製の複雑性は、これらの物質を迅速
かつ特異的に同定すること、および定量することによる
他の手段のための要求を発生させた。抗−ピレトロイド
モノクローナル抗体での分析によるこれらの化合物の存
在と濃度の特異的な特徴付けは、食物および周囲の環境
のサンプル中のこれらの物質の迅速かつ自動的な分析を
可能とする。

発明の概要 従って、本発明の目的は、合成ピレトロイドに特異的か
つ鋭敏に反応するようなモノクローナル抗体、およびこ
のようなモノクローナル抗体を形成するハイブリドーマ
を提供することにあり、特にこれらの抗体はフェノキシ
ベンジルまたはシクロプロパン官能基を有する合成ピレ
トロイドの部類のための高度の特異性を有し、さらには
これらの抗体はフェノキシベンジルおよびシクロプロパ
ン官能基を有する合成ピレトロイドの部類のための高度
の特異性を有する。

他の目的は合成ピレトロイド、特にフェノキシベンジル
またはシクロプロパン基を持つ合成ピレトロイド、さら
にはフエノキシベンジルおよびシクロプロパン基を持つ
合成ピレトロイドを同定するモノクローナル抗体の生成
方法を提供することにあり、かつこれらの抗体の形成を
誘発するフェノトリンのシクロプパンジカルボキシリッ
クアシド ハプテンのモノエステルの生成を含む。

他の目的は特異的モノクローナル抗体を結合することに
よるサンプルから、特にフエノキシベンジルまたはシク
ロプロパン官能基を有する合成ピレトロイドの部類か
ら、さらにはフエノキシベンジルおよびシクロプロパン
官能基を有する合成ピレトロイド部類から、合成ピレト
ロイドの特異的かつ鋭敏な検出および分離のための方法
を提供するにある。

他の目的は周囲の環境および食物サンプル中の合成ピレ
トロイドの検出、特にフェノキシベンジルまたはシクロ
プロパン官能基を有する合成ピレトロイド、さらにはフ
ェノキシベンジルおよびシクロプロパン官能基を有する
合成ピレトロイドの検出のための方法を提供するにあ
る。検出システムのキット形態は、表面拭き取りまたは
抽出サンプル（surface wiped or extracted sample）
のフィールド分析（field analysis）のために使用し得
る。

本発明の付加的目的、利益および新規な特徴は後述する
記述に部分的に説明されており、部分的には記述の一部
を形成する引き続く試験、および添付する図面、および
それらの記述にて当業者には明確になろうし、または発
明の実施例により会得され得る。本発明の目的および利
益は、添付された請求範囲において特に指摘された手段
および結合によって実現化され、かつ達成され得る。

前述のかつ他の目的を達成するために、および具体化さ
れかつ本明細書にて広く記述されたごとく本発明の目的
は従えば、本発明はフエノキシベンジルまたはシクロプ
ロパン基を有する合成ピレトロイドに、およびより特異
的にはフェノキシベンジル基およびシクロプロパン環の
両者を有する合成ピレトロイドに特異的に反応するモノ
クローナル抗体および同モノクローナル抗体を生成する
ハイブリドーマに向けられる。そのような化合物は表１
に示された化合物およびそれらの誘導体を含むが、これ
らの化合物に限定されるものではない。本発明はまた、
フェノキシベンジルまたはシクロプロパン基、より好ま
しくはフェノキシベンジルおよびシクロプロパン基を有
する合成ピレトロイドからなる群から選ばれる化合物に
おける抗原決定基に反応的であるモノクローナル抗体の
生成および使用のための方法、およびこれらの抗体を連
続的に生成することができるハイブリドーマ細胞系を提
供する。

本発明に従って合成ピレトロイドに対するモノクローナ
ル抗体を生成するための方法は、本明細書において参考
文献として取り入れられているコーラおよびミルスティ
ンによる一般的方法（1975）から適用される。ピレトロ
イド−特異的抗体の生成は次の手段からなる。合成ピレ
トロイド、フェノトリンのシクロプパンジカルボキシリ
ックアシド ハプテンのモノエステル、およびこれらの
化合物の免疫担体タンパク質複合体からなる群から選ば
れる抗原で適当な動物を免疫化すること；この動物から
選択された抗原に対する抗体を生成できる免疫感受性細
胞を得ること；同種または他の動物種の際限なく再生す
る細胞と免疫感受性細胞を融合すること；ハイブリッド
セルを適当な宿主または培養媒体中で培養すること；感
受性抗原と反応する特異的抗体を連続的に生成するハイ
ブリドーマと呼ばれるハイブリッドセルのクローンを分
解すること；好ましい反応性のモノクローナル抗体を生
成するハイブリドーマを選択すること；これらの抗体を
培養媒体または宿主中で生成すること；培養媒体または
細胞を育成するために使用された宿主から抗体を収穫す
ること；および必要によりモノクローナル抗体を精製す
ること； 本発明の他の特徴によれば、本発明に従って開発された
細胞系は、食物および周囲の環境のサンプル中の合成ピ
レトロイドの存在を識別することができる、高度に特異
的なモノクローナル抗体を生成することができる。これ
らの抗体は組織および表面サンプル中の合成ピレトロイ
ドの敏感な検出のために有用であるように予測される。
特に、使用の主たる方法は合成ピレトロイド化合物のた
めにサンプルの迅速で自動的な選別のために、合成ピレ
トロイドの特異的モノクローナル抗体の使用を提供す
る。生成されたモノクローナル抗体は合成ピレトロイ
ド、特にフェノキシベンジルまたはシクロプロパン官能
基を伴う合成ピレトロイド、さらにはフェノキシベンジ
ルおよびシクロプロパン官能基を伴う合成ピレトロイド
を確認することができる。記述された方法は、周囲の環
境のおよび一般の食物中で発見される合成ピレトロイド
物質の同定および定量のために使用され得る。診断的方
法のキット形態は周囲の環境の表面拭き取りサンプル
（environmental surface wipe samples）のフィールド
テスト（field testing）のために使用され得る。

本発明の方法に従って生成された合成ピレトロイド特異
的抗体は、合成ピレトロイドの濃縮および精製のための
親和性カラムの付着性剤として使用し得る。精製された
抗体はまた、抽出に続く合成ピレトロイドの同定および
定量のための検出剤としての応用を有する。特異的モノ
クローナル抗体分析により分析された食物または周囲の
環境のサンプルのための抽出手順は、サンプルがGE/EC
により分析される場合に使用され得る。

図面の簡単な説明 図１はパーメトリン（１）、シパーメトリン（２）、デ
ルタメトリン（３）およびフェネトリンのために特に構
造を概略的に描いている合成ピレトロイドの一般的化学
構造を示す。

図２は、合成ピレトロイドに対するモノクローナル抗体
を生成するためにマウスを免疫すべく使用された免疫原
のハプテン−担体タンパク質結合の生成のための典型的
な合成行程を提供する。この例では、ピレトロイドハプ
テンはカルボキシリックアシドを介して３−フェノキシ
ベンジル基に結合された。概略的には、クリサンテマム
モノカルボキシリックアシド（４）および３−フエノ
キシベンジルアルコールがフエノトリン（５）を形成す
るために反応された。フェトリン（５）は酸化されてハ
プテン，化合物（６）を形成した。免疫原化合物（７）
は化合物（６）をKLH担体タンパク質に結合することに
より形成された。

図３はパーメトリンが競合物質として使用される場合
の、３つのモノクローナル抗体Py−１（白丸）;Py−３
（黒丸）;Py−４（白三角）のための典型的な競合ELISA
データを示す。バーは＋／−一標準偏差を示す。

図４は競合物質：フェノトリン（白四角）；パーメトリ
ン（黒四角）；デルタメトリン（黒三角）；シパーメト
リン（白三角）；およびフェンバレレート（白丸）で反
応させた場合の抗体Py−１のための競合ELISAデータを
示す。

図５は食肉サンプルにおけるパーメトリンのモノクロー
ナル抗体Py−１による検出を証明する競合ELISAデータ
を示す。500ppbのパーメトリンを加えられた食肉サンプ
ルは黒四角で示され、100ppbのパーメトリンを加えられ
たサンプルは白四角で示される。白三角はサンプル緩衝
剤において分析されたパーメトリンの標準を示す。パー
メトリンの絶対量（ng/well）が分析的標準のためにプ
ロットされる。上記した加えられたサンプルは100％回
収を想定してプロットされ、各ウェルは0.1gの食肉から
の抽出物を示す。

図６は競合ELISAにより分析された、予測されたパーメ
トリンに対する観察されたパーメトリンの比較を示す。
挽肉サンプルを汚染するパーメトリンは500,250,100お
よび50ppb加えられた。ラディオトレーサの研究に基づ
き、62％のパーメトリンの回収が推定される。エラー
バーは、添加濃度当り少なくとも６回の反復試験を伴う
分析からの一標準偏差を示す。

発明の詳細な説明 本発明は、１群のモノクローナル抗体と、この抗体を連
続的に産生するハイブリドーマに向けられたもので、こ
の抗体は、フェノキシベンジルまたはシクロプロパン官
能基を含む前記合成ピレトロイド群に対して特異的に反
応するものであり、より好ましくはフェノキシベンジル
とシクロプロパンの両基を含む合成ピレトロイドと反応
する抗体に向けられたものである。本発明はまた、フェ
ノキシベンジルまたはシクロプロパン基を有する合成ピ
レトロイドと反応し、より好ましくはフェノキシベンジ
ルとシクロプロパンの両基を有する合成ピレトロイドと
反応するモノクローナル抗体を産生する方法を提供す
る。

合成ペプチドは、タンパク質断片と類似体であり、抗体
誘導合成ペプチドによって代表されるように免疫学上認
められたタンパク質の特徴である特異的タンパク質エピ
トープと同一のものであるが、こらによる実験動物の免
疫感作技術は当業者にはよく知られている。しかしなが
ら、抗原化合物が短いペプチド断片または小さな非タン
パク質分子の場合には、これらの化合物の注入によって
は実験主体に適当な免疫反応を生じ損なうおそれがあ
る。ハプテンと呼ばれるモディファイされた小さな分子
を、既知の免疫原または既知の免疫原である担体タンパ
ク質と複合させることができる。小さな分子−タンパク
質複合体への連鎖によって、ハプテンは免疫原性を有す
ることになる。この免疫原性複合体に応答して産生され
た抗体は、時として担体タンパク質から離れた小さな分
子を認識する。担体タンパク質は、免疫原性を有するタ
ンパク質群のいずれからも選ぶことができる。適当な担
体タンパク質には、キーホールリンペットヘモシアニン
（KLM）、ウシ血清アルブミン（BSA）を含む血清アルブ
ミン、チログロブリンを含むグロブリン等が含まれるが
これらに限らない。キーホールリンペットヘモシアニン
（KLM）とウシ血清アルブミン（BSA）が本発明において
便宜的に使用される。

合成ピレトロイドは小さな有機分子であって、このよう
な分子を免疫原性を有するものとする企てにおいては、
この分子を担体タンパク質と複合させることが必要であ
った。この目的を達成するために、合成ピレトロイドの
種々のモディフィケーションを作ることができる。例え
ば、パーメトリンは担体タンパク質と結合可能な官能基
を有しないので、この目的のために、フェノトリンのシ
クロプロパンジカーボキシリックアシドのモノエステル
であるアナログハプテンを合成することが必要であっ
た。パーメトリンのアナログハプテンへの結合のために
選ばれた抗体は、関連したピレトロイド化合物、パーメ
トリン、フェノトリンのほか合成ハプテンに対しても同
様に応答したが、担体タンパク質単独に対しては応答し
なかった。

本発明による、フェノキシベンジルまたはシクロプロパ
ン官能基を有する合成ピレトロイドの存在を識別可能
な、より好ましくはフェノキシベンジルおよびシクロプ
ロパン官能基を有する合成ピレトロイドの存在を識別可
能なモノクローナル抗体の産生方法は、適当な動物、好
ましくはマウス、ねずみ、ハムスタ、うさぎ、やぎ、
羊、牛および馬、さらにより好ましくはマウスを、フェ
ノキシベンジルまたはシクロプロパン官能基を有する前
記合成ピレトロイドからなる群から選択された抗原と、
抗原性担体タンパク質と複合されたフェノトリンのシク
ロプロパンジカーボキシリックアシドハプテンのモノエ
ステルとを用いて免疫感作することからなる。抗原の繰
り返し投与は適当な量、好ましくは約10μｇないし約20
0μｇの間で行い、動物ごと投与ごとに約100μｇ（i.
p.）のピレトロイド担体タンパク質複合体を用いるのが
特に好ましい。抗原は完全フロイントアジュバントと好
ましくは1:1の混合物として混合し、数回好ましくは３
回の免疫感作に対し約２週間の間隔で投与することがで
きる。免疫感作された脾臓細胞またはリンパ球、好まし
くは選択した抗原に対する抗体を今や産生可能となった
感作脾臓細胞を動物から取り出す。感作された脾臓細胞
またはリンパ球は、永久的に生殖する細胞、好ましくは
最初の種または他の動物種の骨髄腫細胞と融合させてハ
イブリッド細胞を生成させる。このハイブリッド細胞を
適当な宿主または倍地中で培養する。ハイブリドーマと
して知られるハイブリッド細胞のクローンは、前記群の
抗原に対して特異的な抗体を連続的に産生または分泌す
るものでこれを分離する。合成ピレトロイドの存在を識
別するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを
選別し、これらのモノクローナル抗体の量を世代交代さ
せ、細胞を増殖させるために用いた倍地または宿主から
抗体を収穫し、所望ならばモノクローナル抗体を分離し
て鈍化し、このようにして産生したモノクローナル抗体
を、合成ピレトロイドの存在に対してサンプルを検定す
るために用いる。ハイブリドーマは、適当な宿主動物中
で増殖させ、または適当な倍地もしくはキャリヤー媒体
中で増殖させることができる。宿主動物としては、マウ
ス、ねずみ、ハムスタ、てんじくねずみ、うさぎ、や
ぎ、羊、牛および馬等を含むが、これらに限らない。適
当な倍地としては、腹水液、ハイブリドーマスーパネイ
タントおよび前記倍地以外のものを含むがこれに限らな
い。

本発明の他の態様により、その対象と目的に従って、Py
−１、Py−３、Py−４と呼ぶハイブリドーマ細胞系を開
発した。これらの細胞系のクローンは、高度に特異的な
モノクローナル抗体を産生することが可能で、フェノキ
シベンジルまたはシクロプロパン官能基を有する前記合
成ピレトロイドの存在を識別し、より好ましくはフェノ
キシベンジルおよびシクロプロパン官能基を有する前記
合成ピレトロイドの存在を識別する。これらの抗体は、
これらが誘導された細胞系と同一の名前が与えられてい
る。これらの細胞系は、アメリカ合衆国メリーランド州
20852ロックビル パークローンドライブ 12301のアメ
リンタイプカルチャーコレクション（ATCC）に寄託さ
れ、次のような受託番号が与えらている:Py−1,ATCC N
O.HB 9996;Py−3,ATCC NO.HB 9997およびPy−4,ATCC N
O.9998。

これらの寄託は、ATCCと本特許出願の譲り受け人との間
の約定よってなされた。ATCCとの約定は、当該寄託を記
載し同定する本出願に関する米国特許が発行されたとき
に、または米国もしくは外国特許出願のいずれかであっ
て最初に発行されまたは公開されたときに、前記株およ
びその子孫の公けに対する永続的入手を規定し、また米
国特許商標局長官によって35 USC 122およびこれによる
同長官の規則（特に886 OG 638に関し37 CFR 1.14を含
む）に従ってその資格があるとされた者に対して前記株
およびその子孫の入手を規定している。本出願の譲り受
け人は、もし寄託にかかる株が適当な条件下で培養され
たときに死に、失われ、または滅びた場合に通告に応じ
て同一の株の生育可能な培養によって速やかに取り替え
ることに同意している。

寄託機関は、ブタペスト条約によって、寄託されたハイ
ブリドーマ細胞系サンプルの授与の最新の請求がATCCに
よって受理された後少なくとも５年間、かついかなる場
合にも寄託の日の後少なくとも30年間は、寄託された前
記培養が生育可能で汚染されないという条件下で保管さ
れることが保証されている。

寄託された株の入手は、いずれかの政府の権限のもとに
その特許法によって許可された権利に違反して発明を実
施できる許諾であると解釈されるべきではない。

また、本発明は寄託した株によって範囲を限定されると
考えるべきではない。というのは、寄託した態様は本発
明の特別の態様の説明のみを意図するものであるからで
ある。これら寄託されたものと機能的に等価ないずれの
ハイブリドーマ細胞系も、本発明の範囲内にあるものと
考えられる。さらに、ここに示し記載したものに加え
て、上記記載から当業者に明らかな種々の変更態様も添
付した請求の範囲内に入るものと考えられる。

この抗体の特異性は、スタンカーらの直接結合ELISA測
定法（1986）（J.Immunol.136:4174-4180）によって測
定される。簡単に説明をすると、96−ウェル（well）の
ミクロタイター プレート（バージニア州アレキサンド
リアのダイナテック”イムロン−II"（Dynatech"Immulo
n-II.Alexandria,VA））が、抗原の溶液100μg/mlの100
μl/wellを18時間、４℃でインキュベートすることによ
ってBSAに複合化されたHb（抗原）あるいは合成ペプチ
ドでコーティングされた。次にそのウェルは燐酸緩衝液
（PBS）を用いて３回洗浄され、非特異性のタンパク質
が結合している部位が、１％のオボアルブミン溶液（40
0μl/well）中で１時間、室温にてそのプレートをイン
キュベートすることによってブロックされた。更にPBS
中で洗浄した後、試験培養液あるいは腹水液がそのウェ
ル（50μl/well）に加えられ、そしてプレートが１時
間、37℃にてインキュベートされた。それらは続いて洗
浄剤溶液（0.05％のトウィーン−20）を用いて広範囲に
洗浄された。ペルオキシダーゼ−複合体の抗−マウス血
清（U.S.Biochemicals）がその後加えられて（1/800の
希釈液の50μl/well）、そしてそのプレートが37℃でさ
らに１時間の間インキュベートされた。最後に、2.2ア
ジノ−ジ−（３−エチルベンズチアゾリン スルフォニ
ックアシッド）（2.2azino-si−（３−ethylbenzthiazo
line sulfonic acid）基質が加えられて、酸素活性がタ
イターテック マルチスキャン96-wellマイクロタイタ
ー プレート リーダー（Titertek Multiskan96-well
microtiter plate reader:バージニア州マクレーンのフ
ロー ラボラトリーズ（Flow Laboratories,McLean,V
A）によるマルチプレットスキャニングを用いて測定さ
れた。405nmにおける吸収度測定値が時間の関数として
記憶され、そしてコンピューター解析を行なうことによ
って分析されて、OD405/時間の傾きが線形回帰（linesr
regression）を用いることによって計算されている。
本発明の抗体は、ハイブリドーマスーパネイタントの形
で、または腹水液として、または分離し純化したモノク
ローナル抗体として用いることができる。この測定法の
感度は、ミクロタイタープレートをコートするために用
いられる結合抗原の型に依存する。前記数種の合成ピレ
トロイド抗原のいずれもがミクロタイタープレートをコ
ートするために用いられるが、このなかにはフェノトリ
ンのシクロプロパンジカーボキシリックアシドハプテン
のモノエステルのタンパク質複合体が含まれる。ウシ血
清アルブミン（BSA）と複合させた化合物３−フェノキ
シベンゾイックアシド（３−pba）は好ましい結合抗原
の一つである。

標準および測定サンプルへの抗体の結合特異性は、競合
ELISA測定法によって評価した。競合測定法システムに
おいて、抗原は、立体相互作用によって抗体の構造と正
確に結合可能なタンパク質または炭水化物残遺部分（ca
rbohydrate moieties）を有する大きな分子であって、
試験プレートの反応表面に固定され、また抗原特異的抗
体がサンプル抽出物または標準試験溶液のアリコットと
ともに加えられる。遊離浮遊する抗体は、試験反応表面
に結合した固定された抗原と、溶液中に遊離浮遊する添
加サンプルまたは標準に抗原との間に分離する。反応期
間の経過後、遊離浮遊する抗原−抗体複合物を洗い去
る。プレートを再び洗い、ピレトロイド特異的抗体源で
ある動物種のタンパク質と免疫特異的に結合する酸素標
識した指示分子を用いてインキュベートする。基質と緩
衝液を酸素標識指示分子の反応のために用意する。酸素
基質反応からの光学的信号は、移動不能の抗原と結合し
て反応プレート上に残るピレトロイド特異的抗体の量を
示す。このような反応システムの有用性は、抗原ハプテ
ン−タンパク質複合体の表面結合に依存する。このよう
な結合システムの感度は、酸素反応の終点をビオチン−
アビジン複合体と組み合わせることによって増幅するこ
とができる。最適の酸素感度は、最小量のコーティング
抗原（3-pba-BSA ）が用いられたときに起こる。プレ
ートの全結合容量は非常に大きいので、結合しない余分
の担体タンパク質は結合を損なわない。

本発明はまた、食品または環境サンプル中に存在する他
の化合物の存在において合成ピレトロイドを同定する改
良された方法を提供する。この方法は、合成ピレトロイ
ドおよび他のピレトロイド代謝物の高感度の検出に対し
て有用であると期待される。このモノクローナル抗体の
合成ピレトロイドに対する特異的な親和力は、結合表面
に固定されたときに、サンプルからピレトロイド代謝物
を分離するのに適している。

食品の合成ピレトロイド汚染の評価には、高感度の抗体
検出測定を妨害するおそれのある他の有機物を除くため
の予備のサンプル調製を必要とする。ピレトロイドは脂
肪中に濃縮する傾向がある。これは、100℃に加熱する
ことによって脂肪を溶かし、ピレトロイドを有機／水性
溶媒混合物によって抽出することによって取り出すこと
ができる。食品または組織の測定サンプルは、均質化と
約50-95部対50-5部の割合、特に好ましくは85:15のアセ
トニトリルと水との有機水溶性混合物による予備抽出に
よって準備する。脂肪層はチリングによって除去し、次
いで上部相は分離漏斗によるヘキサンを用いて抽出す
る。水性洗浄層の分離を改善するために塩溶液を加え、
次いでさらに蒸留水で洗浄する。ヘキサン留分は無水硫
酸ナトリウムを通してドレインしかつその上で乾燥する
ことによって回収する。ピレトロイド成分は、予備処理
したアルミナカラムに結合されることによってヘキサン
抽出物から取り出す。ピレトロイド成分は、アルミナカ
ラムからベンゼンを用いて溶離させ、ベンゼン溶媒を蒸
発させ、サンプルをアセトニトリル中に再溶解させる。
サンプルのピレトロイド含量は次いで競合ELISA手法に
よって水性緩衝液中で測定する。

本発明のモノクローナル抗体の前記合成ピレトロイドに
対する結合特異性は、結合カラムにおいて前記合成ピレ
トロイドまたはピレトロイド代謝物を選択的に識別する
ために用いることができる。３−フェノキシベンジルお
よびシクロプロパン官能基との化合物は、本発明によっ
て産生されカラムに固定されたモノクローナル抗体に可
逆的に特異的に結合することができる。固定されたモノ
クローナル抗体のカラムへのピレトロイド化合物の特異
的結合は、これらの化合物を取り出し、純化し、または
濃縮するために用いることができる。例示の分離方法
は、カラムのイオン濃度の変更による化合物の結合およ
び開放である。

例証として提示した以下の実施例は、本発明をさらに詳
細に説明するために役立つ。これらの実施例は、本発明
を開示されたそのままの形またはモードに限定するもの
と解釈すべきではない。実際に、いくつかの改良と変形
が可能である。このような改良と変形は添付の請求の範
囲に含まれるということが意図されている。

実施例 1.ピレトロイドハプテンの合成 合成ピレトロイド化合物であるパーメトリンは低分子で
あり、それ自体は免疫原性はない。関連のあるハプテン
は反応性のある官能基を付加することによって形成さ
れ、免疫性の担体タンパク質と結合することが可能にな
って免疫性が付与される。選択的な認識部位、即ち３−
フェノキシベンジル基から最も離れた結合部位に担体タ
ンパク質が結合すると、数種の異なった合成ピレトロイ
ドを認識できる抗体を誘出するハプテンが形成される。

図２に示したハプテンの合成は、メチレンクロライド20
ml中にクリサンテマムモノカルボキシリック アシッド
（化合物４）（1.28g、7.6mM、異性体混合物）を懸濁し
たところから達成される。そこへオキサリル クロライ
ド（740μｌ、8.4mM）を加え、次いでジメチルホルムア
ミドを一滴、滴下した。その混合物を室温で２時間撹拌
した。それから３−フェノキシベンジルアルコール（2.
00g、10mM）とピリジン（2ml）を加えて更に12時間撹拌
した。エーテルを加えた後、その混合物を重炭酸ナトリ
ウム水で洗浄し、続いて水で洗浄した。そして有機層を
無水硫酸ナトリウムで乾燥して、エバポレートし、中性
のアルミナ（ベンゼンで希釈されている）カラムクロマ
トグラフィーで精製化して2.2gのフェノトリン（化合物
５）を得た。

オゾンと酸素（3:97w/w）の混合ガス（Welsbach Ozone
Systems,Sunnyvale,CA＃T-408）が、200mlの酢酸エチル
（4mM）と10mlの蟻酸に1.40gのフェノトリン（化合物
５）を含有する溶液中を、1.21/minの速度で20分間、０
℃にて通された。その溶液中に30％の過酸化水素（3.0m
l）を加え、12時間４℃を保ちつつ混合した。その溶液
を水で二度抽出し、続いて2MのNaOHで抽出した。その水
層を12MのHClで酸性にした後、メチレンクロライドで抽
出した。その有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥したの
ち、エバポレートした。残ったオイルをシリカゲル（メ
タノール／クロロホルム、3:97）のカラムクロマトグラ
フィーにかけて精製化して、オイルとして360mg（26
％）の収率で化合物６を得た。フェノトリン−ハプテン
の組成はさまざまな物理的分析により証明された。図２
には、免疫感作のために用いられるタンパク質−ハプテ
ン複合体を構成するためのフェノトリン−ハプテンの合
成経路を示している。

2.動物の抗原による免疫感作 免疫感作のために用いられるハプテン−タンパク質複合
体は、フェノトリンハプテン（図２における化合物６）
をキーホール リムペット ヘモシアニン（keyhole li
mpet hemocyanin）（KLH）と複合化してpy-KLHに形成
し、またエルランガー（Erlanger）らの無水物を混合す
る方法（1959）（J.Biol.chem.234:1090-4）を用いるこ
てで牛血清アルブミン（BSA）と複合化してpy-BSAに形
成することによって生成された。この手法によって、イ
ソ−ブチルクロロカーボネートは化合物６と反応し、酸
無水物の中間体を形成して、タンパク質の無置換のアミ
ノ基にすばやく結合する。

担体タンパク質に直接ハプテンを結合させる同程度に有
用な方法は、次のように行った。：二度蒸留した水の50
mlに、担体タンパク質50mgを溶解し、そこへ5mlの水に
溶解したハプテン50mgを加えた。希釈したNaOHを滴下し
てpHを7.0に調整した。EDC（１−エチル３−（３′−ジ
メチルアミノプロピル）カルボジイミド ハイドロクロ
ライド）50mgを加えてその混合物を室温で一晩撹拌し、
燐酸緩衝塩（0.01M燐酸、0.155MNaCl、pH7.2）を４度変
えて、48時間かけて透析した。KLH複合体は免疫性物質
として用いられ、BSA複合体はハイブリドーマ クロー
ンをスクリーニングするELISAに用いられた。ピレトロ
イド抗体は、合成ピレトロイド−キーホール リムペッ
ト ヘモシアニン複合体（py-KLH）をテストする動物に
繰り返し注射することによって産生できた。好ましい手
法として、合成ピレトロイド−キーホール リムペット
ヘモシアニン複合体（py-KLH）は、完全なフロイント
のアジュバンド（Freund′s adjuvant）と1:1にミック
スした100μｇのpy-KLHを、６カ月のBALB/cBklマウスの
腹膜内に注射することにより、そのマウスを免疫獲得さ
せるのに使われる。そのマウスは一週間おきに３回１本
ずつの注射を受けた。

3.ハイブリドーマの製法 リンパ球融合の４日前に、マウスのハプテン特異性血清
の力価は、中性塩に含まれる100μｇの合成ピレトロイ
ド−ウシ血清アルブミン複合体（py-BSA）を脾内注射す
ることで高められた。SP/0骨髄腫細胞へのリンパ球のハ
イブリドーマ融合は、通常の方法（See Brigbee,W.L.et
al.Molecular Immunology 20;1353-1362（1983）参
照）でなされる。即ちこの融合実験はオイとハイゼンベ
ルグによって記述されている（1981）実験を変形したも
のであった。簡単に言うと、4.75mlのポリエチレングリ
コール（PEG 1540）（ペンシルバニア州 ウォリントン
ポリサイエンス社（Polysciences,Warrington,PA））
が、5mlの血清−フリーのSDMEM、0.75mlのジメチルスル
ホキサイド（DMSO）、及び50μｌの1M-NaOH溶液と混合
された。NaOHは、SEMEM中でフェノールレッドによって
判定されるように約pH7.8にその混合物を調節するため
に用いられる。脾臓リンパ球（約10⁸個の細胞）と約10⁷
logフェーズの骨髄腫細胞が、50-mlの円錐形の遠心分離
用チューブ（ニューヨーク州コーニングのコーニング社
製）の中で共に遠心分離され、そしてペレットにされ
た。そのペレットは、１分間以上かけて1mlの50％ PEG
溶液中に再懸濁された。スリラー状の細胞は更に数分間
の間撹拌され、続く２分間で2mlの血清−フリーのSDMEM
が添加された。その結果得られた10-mlの懸濁液は、2.5
％のRSと１μＭのアミノプテリンとを含有するSDMEM中
に50mlになるように希釈された。全ての溶液はあらかじ
め37℃に加温され、37℃のTemp-Blok（アイルランド州
エバンストンのアメリカン サイエンティフィック プ
ロダクト社（American Scientific Products.Evanston,
IL））を用いることで融合を行っている間、その温度近
くに維持された。続いてハイブリドーマ融合は、スタン
カーら（Stanker et al..（1986）（J.immunol.136:417
4-4180））によって行われた条件の下で成長が行われ
た。この融合された細胞は続いて3096−ウェルのマイク
ロカルチャープレート上に塗られ、40μＭのアミノプテ
リン及び２％の仔牛胎児の血清を含有するM3倍地及びハ
ンナの血清−フリー倍地（カルフォルニア州バークレー
のハンナバイオロジカス社（Hannna Biologicals,Berke
ley,CA））の等量部分からなる倍地中において、37℃で
10日から14日間、湿度のある５％のCO₂雰囲気の下で成
長が行われ、その後抗体−産生ハイブリドーマについて
スクリーニングが行われた。融合はSP2/0骨髄腫細胞を
用いることに限られるものではなく、この発明の目的の
範囲内にあると考えられる他の不滅の繁殖性細胞を用い
てもよい。融合に続き、ハイブリドーマは、これが作っ
た抗体が特有のBSA−ハプテン複合体を認識する能力に
よって、直接的なERISAでスクリーンされた。

4.ELISA検定による抗体の特徴付け 直接結合形ELISAは、増殖過程にあるハイブリドーマの
培養流体中の抗合成ピレトロイド抗体をスクリーンする
ために用いられた。Stankerら、（1986）（J.Immunol.1
36:4174-4180）による直接結合形ELISAの方法は次に示
すよに変更が加えられた。： 96−ウェルのイムロン−IIミクロタイター プレート
（ダイナテック ラボレイトリイズ アレキサンドリア
VA（Dynatech Laboratories,Alexandria,VA））はピ
レトロイドハプテン−タンパク質複合体で被覆された。
その複合体は、ウェルあたり約0.002-0.5μｇ（好まし
くはウェルあたり0.2μｇ）の好ましくは３−フェノキ
シ ベンゾイック アシッド−牛血清アルブミン複合体
（3-pba-BSA）であり、４℃で18時間、炭酸−重炭酸緩
衝液（pH9）中で被覆し、１％のオボアルブミン溶液で
室温下、１時間ブロックし、その後、ハイブリドーマの
上清とともに37℃で１時間培養した。そのプレートは注
意深く、界面活性剤物質溶液、特に好ましくは水に溶解
した０・05％のトウィーン−20^TM（ポリオキシエチレン
ソルビタン モノラウリレート）を使用して洗浄した。
マウスから得たピレトロイド−特異性抗体の結合を視覚
化するために、ヤギの抗マウス抗血清で複合化したペル
オキシダーゼ（United States Biochemicals,Clevelan
d,OH）を複合希釈緩衝液（0.005M、0.075N NaCl、0.001
％トウィーン−20、pH7.2）で500分の１に希釈して、そ
れぞれのウェルに添加した。37℃で１時間二度目の培養
の後、再びそのプレートを洗浄した後、基質である2,2
−アミノ−ジ−３−エチルベンズチアゾリン スルフォ
ニック アシッド（ABTS）を添加した。405nmにおける
吸光度を時間経過に沿つて測定し、得られたデータをマ
ッキントシュ コンピューターに移してから、スレザッ
ク（Slezak）ら、（1983）（J.Immunol.Methods 65:83-
95）によって示された”シベルドーマ（Cyberdoma）"EL
ISAソフトウェアを用いて分析した。色彩の反応に関与
した酸素はウェル内で結合しているマウス抗体の存在を
表示するものである。ELISAスクリーンで正の反応を示
すウェルから得られたハイブリドーマ細胞は、増殖され
てかつその単一細胞の起源を保障すべく制限付の希釈を
することによって二度サブクローン化された。腹水の液
体はスタンカー（Stanker）ら（1986）（J.Immunol.Met
hods 136:4174-4180）に従って照射されたマウスから得
られたもので、モノクローナル抗体はヒドロキシラパタ
イト（hydrixylapatite）クロマトグラフィー（Stanker
et al.（1985）J.Immunol.Methods 76:157-169）によ
り、腹水から精製単離された。イソタイプはマウスの重
鎖及び軽鎖の特異的な抗血清（Southen Biotechnology
Assoc.,Birmingham,AL）を用いてELISAを行うことで決
定された。

融合して得られたハイブリドーマは、96ウェルのミクロ
培養皿、30個で培養された。500近くのウェルでBSA自体
ではなく、Py-BSA複合体を認識する抗体を分泌している
のが観察された。最も強い応答性と特異性（250近く）
を示すこれらの細胞は、更に拡張されてPy-BSA、Py-KL
H、BSA及びKLHに対してテストされた。ハプテン複合体
は両方とも認識できるが、担体タンパク質はどちらも認
識できない抗体は29ウェルで観察された。これらのうち
の13はサブクローン化されて、競合的ELISAで複合化さ
れていないパーメトリンやシパーメトリンを認識できる
能力によって評価された。13のハイブリドーマの３種だ
けから得られる抗体が複合化されていない化合物を認識
した。これらの抗体はPy-1、Py-3、及びPy-4と命名され
た。

モノクローナル抗体のイソタイプは、イソタイプ−特異
性抗血清（Southern Biotech,Mobile,AL）を用いた直接
結合型ELISAによって決定された。これら３つの全ての
抗体はκ（kappa）軽鎖を有するIgG2a抗体であることが
確認された。

5.競合エンザイム−リンクト イムノアブソーベントア
ッセイ 競合エンザイム リンクト イムノアブソルベントアッ
セイ（c-ELISA）は溶液中のパーメトリンの標準物を定
量したり、さまざまな天然の、あるいは合成ピレトロイ
ドに対する抗体の特異性を評価したりするために開発さ
れた。数種のコーティング抗原を用いることができた
が、測定法の感度を最高にするために予備的な作業によ
って、ELISAプレート上で合成ピレトロイドコーティン
グ抗原として用いたフェノトリン−ウシ血清アルブミン
を、BSAに複合した３−フェノキシベンゾイックアシッ
ド（3-pba）で置換を行うと飛躍的に感度が向上するこ
とが判明した。その3-pba複合体は置換反応試薬としてE
DC（１−エチル−３−（３′−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド）を用いることで合成できた。3-pb
a複合体はこの後の全ての実験のコーティング試薬とし
て、使用された。ミクロタイター プレートは0.5μg/w
ell3-pba-BSAでコートされ、オボアルブミンでブロック
される。

競合ELISAでは、競合物質はアセトニトリル中に溶解さ
れ、燐酸緩衝液（PBS）とトウィーンの混合緩衝液に加
えられて、結果的にその溶液は６％のアセトニトリル溶
液となっていた。それぞれのwellは６％アセトニトリル
−PBS溶液中100μｌの競合物質を含んだものとなってい
るように、競合物質を加えた。モノクローナル抗体を含
むPBSの等量体積が加えられて、最終的な濃度は抗体と
競合物質を含む分析緩衝液中において３％のアセトニト
リル溶液中に200ngの抗体/wellの濃度となっていた。こ
れらの抗体は活性を失活することなく５％のアセトニト
リルにまで許容できる。そのプレートは37℃で１時間培
養され、終点はヤギの抗マウス抗体に結合したアルカリ
フォスファターゼにより活性化されるｐ−ニトロフェニ
ルフォスフェート置換基の色の変化を観察することで評
価された。

c-ElISAの感度は、用いた特異性のあるアンチ−ハプテ
ン抗体の量と、固定化した抗原の量とに影響されるの
で、これらのパラメーターは両方とも最適にした。好適
な手法としては、ミクロタイター プレートをコートす
るのに用いた抗原の量を10-0.5μg/wellに変化させ、更
に好ましい量として0.5μg/wellとする。プレートに抗
原を塗布する方法はアッセイにとって重要である。抗原
は４℃で一晩中wellに載せて吸着させるか、あるいは37
℃でwellに載せた抗原溶液をエバポレートするかして得
られた。Py-1抗体と競合物質としてのパーメトリンを用
いて、抗原をウェル上でエバポレートした際に最も高い
感度が得られた。ミクロタイター プレートを得る好適
な方法としては、37℃でコーティング抗原（3-pba-BS
A）の５μ/ml溶液の100μｌを蒸発させることであっ
た。

しかし、コートする抗原の限られた量を検出するため
に、シグナルは更に増幅されなくてはならない。酸素触
媒化され、光学的に検出されるシグナルの増幅の好まし
い方法としては、アビジン−ペルオキシダーゼ／ビオチ
ン−アンチ−マウス イムノグロビン系を用いることで
あり、プレート化された抗原の低バックグラウンドレベ
ルで遂行した場合にイムノアッセイの感度を改良する。
アビジン−ペルオキシダーゼ／ビオチン−アンチ−マウ
ス イムノグロビン系は、ビオチンが抗体や酵素の活性
を失活させることなしに抗体や酵素に容易に結合するこ
とができるので、酵素結合イムノアッセイの効果を改良
するために用いられる。ビオチンに対してアビジン（10
¹⁵/M）の例外的に高い結合親和性はビオチン化された分
子間で橋渡し構造の複合体を結果的に与えることにな
る。特異的に結合するモノクローナル抗体とペルオキシ
ダーゼ指示系は両方ともビオチンと結合する。ビオチン
分子のアビジンとのリンケージは、指示分子の複合体を
結果的に与えることになり、スペクトルのシグナルの感
度のよい検定が増幅された。

合成ピレトロイド特異的抗体は、従来法でビオチンに結
合でき、それはP.Tijssen in Chapter 3 of"Practice a
nd Theory of Enzyme Immunoassays"（R.H.Burdon and
P.H.Vanknippenberg,Eds.,Elsevier,Amsterdam（198
5））に記載された方法である。ビオチン化−Ｎ−ヒド
ロキシ サクシンイミド（BNHS）エステルは、合成ピレ
トロイド特異的抗体と反応してビオチン化された免疫反
応生成物を形成する。好ましい方法として、合成ピレト
ロイド特異的抗体は、抗体にビオチン化された抗マウス
IgGイムノグロビンを結合することによって同定され
る。ビオチン化されたペルオキシダーゼ、ベクタステイ
ン（Vector Laboratories,Burlingame,CA）は、アビジ
ン−ビオチンの増幅複合体に橋渡し構造を行った後、検
出シグナルとして用いられる。

抗体Py-1は、直接的結合性ELISAにおいて固定化された
抗原（0.5μｇ抗体/well）に対して滴定された。0.02μ
g/wellのPy-1抗体濃度、それは次のcELISA分析で用いら
れるレベルであるが、プラトー反応性の40％に達してい
る。プラトー反応性が同様に"50％”に達するために、
抗体Py-3とPy-4では未精製の培養液を1/200に希釈した
溶液として用いられた。好ましい方法においては、洗浄
剤としてトウィーン−20^TMが約０・0001-0.01％の濃度
範囲で、好ましくは0.001％の濃度で慣例的に用いられ
た。洗浄剤の濃度が0.015％以上になると抗体活性が妨
げられるが、洗浄剤を全く用いないと非特異的な結合反
応が増加してしまった。

競合的ELISAのデータでは、抗体が競合物質の存在して
いない状態で固相の抗原（3-pba-BSA）と結合している
ウェル中での光学強度を100％の活性であると標準化さ
れた。テストウェルでは、それぞれに含まれる競合物質
の量を変化させ、100％活性ウェルに対して標準化され
た。阻害のパーセントは100％から標準化された活性の
パーセントを差し引いて計算される。

図３は、競合物質としてパーメトリンを用い、３種のモ
ノクローナル抗体、Py-1、Py-3及びPy-4の競合性ELISA
のデータを示している（誤差を示す線は＋／−１の標準
偏差を表している。）。この評価において抗体活性の50
％の阻害（I₅₀）を引き起こすパーメトリンの濃度は、
すべての３種の抗体に対して低い値のナノグラムの範囲
内である。５カ月間の評価試験を行って得た、パーメト
リンによるPy-1抗体の49サンプルにおける平均I₅₀は、
1.55ng＋／−0.6ngである。

図４は競合物質としてフェノトリン、パーメトリン、デ
ルタメトリン、シパーメトリン及びフェンバレレートを
それぞれ反応させた時の抗体Py-1に対する競合性ELISA
のデータを示している。これらの競合物質に対して測定
されたI₅₀の値はそれぞれ1.5、15、30及び350ng/wellで
あった。モノクローナル抗体Py-1、Py-3及びPy-4の特異
性は、次の競合物質との反応で測定されたI₅₀の値によ
り表１に示されたとおりである。競合物質とはハプテン
（図２の化合物６）、パーメトリン（異性体の混合
物）、パーメトリン（トランス型異性体）、３−フェノ
キシベンゾイック アシッド、３−フェノキシベンズア
ルデヒド、フェノトリン、デルタメトリン、フェンバレ
レート、シパーメトリン、フェンプロパトリン、テトラ
メトリン、フルシトラネート、及びクリサンテミック
アシッドである。反復分析の標準偏差は一般的に0.2以
下である。３種のモノクローナル抗体はパーメトリンに
対して以下のように類似の50％阻害値を示す。Py-1では
競合物質1.5ng、Py-3では1.7ngそしてPy-4では12ngであ
る。抗体Py-1及びPy-3は類似の反応性を有しているが、
抗体Py-4ではハプテンを除くテストした全ての競合物質
に対して感度が低い。I₅₀の値が小さいほど、化合物に
対する抗体の相対的親和性が高いことを示している。

I₅₀の値は競合的ELISAのデータからグラフにより算定し
た。50％の阻害が達成できないときは、テストした競合
物質の最高水準の値が大きい（＞）の記号を伴って報告
されている。表１に挙げた値は少なくとも12回の独立し
た分析を行って得た値を平均した値である。

6.食肉サンプルでの免疫評価においてモノクローナル抗
体の特異性 食肉の構成成分がパーメトリンの抗体複合性、またはイ
ムノアッセイを阻害するかどうかを調べるために、商業
上の牛挽肉のサンプルの抽出物をブラウン（Braun）と
ステイネック（Stanek）の方法（1982）（Asoc.Off.Ana
l.Chem.65:685-689）を変形した手法で準備し、分析系
に添加した。

次に手短かに述べる。牛挽肉（5g）をアセトニトリルと
水（85:15）の混合溶媒50mlと混ぜて、２分間８セット
でポリトロン（Polytron）（Brinkman Instruments,Wes
tbury,NY）で均質化した。沈殿物を遠心分離機で２分間
100×Ｇの重力をかけ、かつ脂肪を集めるために数時間
凍らせるこによって分離した。上層のアセトニトリル
フラクションの部分8.5mlを採取し、分離ロート中で30
秒間10mlのヘキサンと混合した。２％のNaCl（40ml）の
溶液を加え、１分間振盪後、２分間静置した。ヘキサン
のフラクションを再び5mlの水で30秒間抽出した。ヘキ
サンフラクションを回収した後、ロートを5mlのヘキサ
ンを加えてすすぎ、ヘキサンフラクションを集めて、無
水の硫酸ナトリウムで乾燥した。集めたヘキサンフラク
ションを1cmの前もって処理をした酸化アルミニウムカ
ラム（AG4）（100-200mesh）（Bio-Rad Laboratories,R
ichmond,CA）にかけて、その後ヘキサンですすいだ。カ
ラムはあらかじめソックスレー抽出機中で24時間メチレ
ンクロライドで洗浄し、130℃で24時間乾燥して110℃で
保管した。結合したピレトロイドは10mlのベンゼンを流
すことによって、カラムから遊離し、そのフラクッショ
ンは静かな窒素気流下で乾燥された。そのサンプルを60
μｌのアセトニトリルに再び懸濁し、続いて0.001％の
トウィーン−20^TMの濃度にした燐酸緩衝塩（PBS）964μ
ｌを加えた。こうして得られたサンプルを前述したcELI
SAに用いた。

食肉内のパーメトリンの検出をするために、食肉サンプ
ルをアセトニトリル−水溶液で抽出し、ヘキサンで分離
してアルミニウムカラムで精製した後、前述したcELISA
の方法で分析した。サンプルには所定量のパーメトリン
が加えられて、そのcELISA分析のカーブは、分析用緩衝
液中でパーメトリンと反応させた標準の競合物質のカー
ブと比較検討された。図５には食肉サンプルのcELISAの
データが描かれている。その食肉サンプルにはパーメト
リンの分析用標準物質が加えられ、モノクローナル抗体
Py-1で分析された。分析用標準物質の濃度は500ppb（黒
の四角形印）と100ppb（白の四角形印）を食肉サンプル
に加えて、それからモノクローナル抗体で評価するため
に抽出した。白の三角形印はサンプル緩衝液中で分析し
たパーメトリンの標準物質を表している。そのままの抽
出物やヘキサン分画物質で、パーメトリンが加えられた
ものを分析した場合には、食肉中の未知の物質によっ
て、抗体が競合を受けることはなかった。ベンゼン抽出
物にパーメトリンを添加した場合には、パーメトリンの
標準物質で観察された場合と同じ競合なカーブが得られ
てた。パーメトリンの標準物質はクロマトグラフィーや
アルミナカラムの分離過程で失われることはなかった。

牛挽肉サンプルを抽出手順に従って抽出する過程でのパ
ーメトリンの働きは、¹⁴Ｃでラベルしたパーメトリンの
回収の分析によりさらに確認された。添加されたサンプ
ル（ごく微量の放射性ラベルづけされたパーメトリンに
よって標識されたパーメトリンの500ng/g）の分析によ
ると、アセトニトリル抽出物（脂肪を取り除いた後の）
ではパーメトリンが72％＋／−1.7示され、ヘキサンフ
ラクションでは65.5％＋／−3.5示され、また最終的な
ベンゼンフラクションではトータルの放射性ラベルの62
％＋／−2.9が回収された。

7.食品サンプル中のピレトロイドの評価 上述の方法によって生産された抗体は、日常の飲食物で
ある食品中に含まれる合成のピレトロイドの存在を検定
するためにテストスクリーンにて用いられる。一団の異
なる抗体は、ごく一般に知られているペレトロイド殺虫
剤の存在を識別するのに利用される。

ここに示したデータは、先に示した方法で開発された抗
体がパーメトリンの500及び100ppbを加えられた牛挽肉
サンプル中のピレトロイドの検出をするのに有効である
ことを示している（図５）。50ppb以上含む添加された
全てのサンプルにおいて、パーメトリンの見積りと測定
レベルとの間には強い相関関係が認められた（図６）。
抗体は食肉中の他の構成成分とは反応しなかった。62％
の回収を仮定した場合には、パーメトリン汚染の予期し
たレベルが、添加サンプルにおいての観察結果とよく相
関していた。

食品サンプル中のピレトロイドの評価の感度は、サンプ
ルの成分を予備的なHPLC分離と免疫検定を組み合わせる
ことによって改良することができる。HPLC上で一定の展
開時間が経過すると、HPLCにおいて、一定の距離を移動
する化合物に対して高度に選択的な検出因子として抗体
を用いることができた。免疫化学の交差反応性は合成ピ
レトロイドの構造的な類似性を反映するであろう。HPLC
の展開時間と免疫化学検出法を組み合わせることは、合
成ピレトロイドの量を測定する基礎として役にたつであ
ろう。２種の単離方法を組み合わせると、新規な化合物
やピレトロイドの代謝産物の同定にも役立つであろう。

8.ピレトロイドの精製方法 ここで発見された抗体はカラムに共有結合をしており、
食品や周囲の環境にある材料のサンプルからピレトロイ
ドを抽出するのに利用でき、それはカラムを通して溶出
されてくる。続いて溶出を行い、また繰り返して抽出す
ることによって、一層価値を高めるためにピレトロイド
と代謝産物を濃縮することができる。

9.ピレトロイドの現場検出用キット ここに記載したモノクローナル抗体は、キットフォーマ
ット中に組み入れられたときに、ピレトロイド殺虫剤の
残留物の検出用として迅速で、現場的、簡便な分析を行
うために用いることができる。現場の検査官が行うキッ
トを用いた分析は、ここに述べた抗体を含むピレトロイ
ド特異性抗体を使用するもので、最終的な抗体の結合反
応の終点を検出するために、非常に複雑な光学装置を使
用する必要がないであろう。

このキットは反応容器やプレートの表面に固定化された
ピレトロイド特異性のモノクローナル抗体を備えてい
る。固定化表面はあらかじめ被覆された使い捨ての管や
多孔性表面の厚紙上に形成され、そこで抗体は吸収性の
材料に接触させたり、塗られたりしている。ピレトロイ
ド特異性モノクローナル抗体はタンパク質Ａの橋かけを
することで、あるいは類似のタンパク質結合複合体によ
って固定化できる。この結合試薬は選択された感度を有
しており、特異的なモノクローナル抗体とピレトロイド
との結合を妨げることはない。

レポーター分子として用いられる指標となる酵素を複合
したハプテンは、表面に結合したピレトロイド特異性抗
体と最適に結合し、及び最適に解離するように選択され
る。数種の抗原アナログの一種に結合する指標となる酵
素は、表面に結合した抗体に結合したり、表面に結合し
た抗体から解離する機能を有している。特に好ましくは
指示酵素３−pba抗原複合体を用いる。酵素抗原複合体
は、テストサンプルあるいは既知の標準サンプルの添加
よりも前に、抗体上にあらかじめ載せることができる。
またはそれはテストサンプルと同時に施してもよい。指
示酵素抗原複合体、テストサンプル、及び／または標準
溶液は、その後抗体結合部位に対して競合することにな
る。好適な手法において、指示酵素抗原複合体は前もっ
て載せられている。そしてピレトロイドを含有するテス
トサンプルを添加すると、それらは固定化された抗体上
の結合部位に対して指示酵素複合ハプテンと競合する。
基質を加えて、固定化された抗体に結合したままになっ
ている指示酵素に反応させる。吸光度測定は、テストサ
ンプルにより置換された指示酵素複合体の量を測定する
ために用いられる。

このキットは前もって包装されたサンプル収集用吸収パ
ッドを備えてもよい。そのパッドは、露出した環境表面
からのテストサンプルを可溶化するため、有機溶媒を含
んでいる。

上述した実施例では、Py-1、Py-3及びPy-4と称されるハ
イブリドーマにより産生されたモノクローナル抗体が、
フェノキシベンジル基またはシクロプロパン基を持つ合
成ピレトロイドに対して高い特異性を有し、かつ特にフ
ェノキシベンジル基及びシクロプロパン基を持つ合成ピ
レトロイドに対して特異性を有すること、並びにこのモ
ノクローナル抗体が類似の結合活性を有する化合物を識
別することが可能であることが確認された。結合の値は
これらの抗体によって認識される通常のエピトープの存
在も示唆している。低いI₅₀の値は、モノクローナル抗
体Py-1によるパーメトリン、フェノトリン及びハプテン
（図２の化合物６）の認識割合が類似であることを示し
ている。ベンジル基部分のα炭素上の水素原子をシアノ
基に置換することは、抗体結合を減少することと相関関
係があり、デルタメトリンやシパーメトリンでは10分の
１に抗体結合が減少する。このグループのモノクローナ
ル抗体にピレトロイドの選択的な結合が起きることは、
これらの抗体が、食品や周囲の環境にあるサンプル中に
合成ピレトロイドが低い濃度で存在していることを簡単
かつ簡便に同定するのに用いることが可能であることを
示すものである。

このように本発明は、合成ピレトロイドの存在を識別可
能なモノクローナル抗体を提供する。この発明はまた、
これらのモノクローナル抗体を連続的に分泌する細胞ラ
イン、及びそれらの生産方法を提供する。この発明のモ
ノクローナル抗体は合成ピレトロイドに特異的に結合
し、フェノキシベンジル基を含む化合物でかつシクロプ
ロパン基を持つ化合物まで識別できる。これらのモノク
ローナル抗体は、食品や周囲の環境にあるサンプルで他
の物質も存在しているものの中に合成ピレトロイドが含
まれているかどうかを確認したい場合を含み、診断用と
して用いられる。ここに述べたモノクローナル抗体は、
ピレトロイド殺虫剤による汚染に対して、食料品や周囲
環境のサンプルをモニタリングするのに役立つことが予
期される。

以上に述べた具体例は、この発明の原理及び実際的応用
を最もよく説明するために一部が選択されて記載された
ものであり、よって当業者にとっては意図された特別の
使用のために好ましいような種々の他の具体例及び変形
例において本発明を利用し得るものである。本発明のあ
る好ましい具体例の前述の記載は、従って本発明の記述
及び実施例を意図してのみ提示されたものである。本発
明を網羅し、または本発明を開示された厳密な形に限定
することを意図するものでもなく、それらの多くの変更
例及び変形例が本明細書の記載の教示及び開示事項から
当業者にとっては明確になろう。本発明の範囲は添付さ
れた「請求の範囲」により最適に規定されることが意図
されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ // Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 9161−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ワトキンス ブルース イー. アメリカ合衆国 カリフォルニア州 94550 リバーモア フンボルトウェイ 582 (72)発明者 バンエモン ジーネット エム. アメリカ合衆国 ネバダ州 89014 ヘン ダーソン ガーミッシコート 144 (72)発明者 ビッグビー キャロリン エル. アメリカ合衆国 ネバダ州 94550 リバ ーモア エリカウェイ 5043

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】フェノキシベンジル官能基またはフェノキ
   シフェニル官能基を有する合成ピレトロイドに属する化
   合物に対して特異的な親和性を持ち、かつ受託番号HB99
   96、HB9997、及びHB9998としてそれぞれATCCに寄託され
   るPy−１、Py−３、及びPy−４からなるグループから選
   択されるハイブリドーマによって産生されるモノクロー
   ナル抗体であって、前記ハイブリドーマが、フェノトリ
   ンのイソブテニル基をカルボキシル基に置換してなるハ
   プテンの前記カルボキシル基と免疫原性のキャリアプロ
   テインのアミノ基とがアミド結合した免疫原を用いて非
   ヒト動物を免疫獲得させることを経て作成した抗体産生
   細胞と不滅の繁殖性細胞とを細胞融合させることによっ
   て産生したハイブリドーマであることを特徴とするモノ
   クローナル抗体。
2. 【請求項２】フェノキシベンジル官能基またはフェノキ
   シフェニル官能基を有する合成ピレトロイドに属する化
   合物に対して特異的な親和性を持つモノクローナル抗体
   を産生するハイブリドーマあるいはそのハイブリドーマ
   の前記モノクローナル抗体を産生する性質を有する子孫
   であって、前記ハイブリドーマは、受託番号HB9996、HB
   9997、及びHB9998としてそれぞれATCCに寄託されるPy−
   １、Py−３、及びPy−４からなるグループから選択さ
   れ、かつフェノトリンのイソブテニル基をカルボキシル
   基に置換してなるハプテンの前記カルボキシル基と免疫
   原性のキャリアプロテインのアミノ基とがアミド結合し
   た免疫原を用いて非ヒト動物を免疫獲得させることを経
   て作成した抗体産生細胞と不滅の繁殖性細胞とを細胞融
   合させることによって産生したことを特徴とするハイブ
   リドーマあるいはそのハイブリドーマの前記モノクロー
   ナル抗体を産生する性質を有する子孫。
3. 【請求項３】サンプル中のフェノキシベンジル官能基ま
   たはフェノキシフェニル官能基を有する合成ピレトロイ
   ドに属する化合物を検出する方法であって、その検出方
   法が下の段階、即ち： アセトニトリル及び水で前記サンプルを抽出して、有機
   物質フラクションを得る段階； 前記有機物質フラクションをヘキサンで抽出して、ヘキ
   サン−可溶性物質を分離する段階； 前記ヘキサン−可溶性物質を、ソックスレー抽出器中に
   てメチレンクロライドで洗浄されたアルミナカラムにか
   ける段階； 前記アルミナカラムをベンゼン溶媒を用いて抽出する段
   階； 前記ベンゼン溶媒を蒸発させて、有機物フラクションの
   残渣を得る段階； 前記有機物フラクションの残渣を、水溶液に溶解する段
   階； 前記有機物フラクションの残渣の水溶液を、抗原がコー
   トされている反応プレートに付着させる段階； 受託番号HB9996、HB9997、及びHB9998としてそれぞれAT
   CCに寄託されるPy−１、Py−３、及びPy−４からなるグ
   ループから選択されたハイブリドーマによって産生され
   る合成ピレトロイドに特異性のあるモノクローナル抗体
   を付着させる段階； 検出可能なスペクトルシグナルが得られるラベルされた
   指示基質と反応させることによって、結合している合成
   ピレトロイド特異性のモノクローナル抗体を可視化する
   段階、 からなることを特徴とする合成ピレトロイドに属する化
   合物を検出する方法。
4. 【請求項４】フェノキシベンジル官能基またはフェノキ
   シフェニル官能基を有する合成ピレトロイドを検出する
   ためのテストキットであって、そのテストキットが以下
   の構成要素、即ち、： 反応プレートの表面に固定化された合成ピレトロイド抗
   原； サンプルを溶解するための溶液； 酸素を複合化した指示物質；及び 受託番号HB9996、HB9997、及びHB9998としてそれぞれAT
   CCに寄託されるPy−１、Py−３、及びPy−４からなるグ
   ループから選択されたハイブリドーマによって産生され
   る合成ピレトロイドに特異性のあるモノクローナル抗体
   であって、固定化された抗原と溶液中の抗原を区画する
   モノクローナル抗体； 指示シグナルを得るために固定化された抗体に結合して
   いる酸素複合指示物質と反応させる基質溶液、 からなることを特徴とする合成ピレトロイドを検出する
   テストキット。